Dpep, hücre zarını geçebilen ve ATF5, CEBPB ile CEBPD adlı bZIP transkripsiyon faktörlerinin işlevini bozmak üzere tasarlanmış bir hücreye nüfuz eden decoy peptittir. Bu çalışma Dpep'in tek başına etkisini yeniden değerlendirmekten çok, Dpep'in pro-apoptotik BH3-mimetic ABT-263 ve hipometilleyici ilaç decitabine ile birleştirilmesinin çeşitli kanser hücrelerinde daha güçlü etki oluşturup oluşturmadığını ve bu kombinasyonların Dpep'e direnç geliştirmiş hücrelerde de işe yarayıp yaramadığını incelemektedir. Araştırma insanlarda tedavi denemesi değildir; ana deneyler hücre kültüründe gerçekleştirilmiş, Dpep + ABT-263 kombinasyonu ayrıca A375 melanoma hücrelerinden oluşturulan immün yetmezlikli fare xenograft modelinde sınanmıştır.

İn vitro deneylerde melanoma kökenli A375-ATCC, kolon kanseri kökenli HCT116, glioblastoma kökenli T98G, meme kanseri kökenli MCF7, kronik miyeloid lösemi kökenli K562 ve akut miyeloid lösemi kökenli MOLM-14 hücreleri değerlendirilmiştir. Dpep tek başına A375-ATCC, HCT116, T98G ve MCF7 hücrelerinde yaklaşık 20 µM; K562'de yaklaşık 9 µM ve MOLM-14'te yaklaşık 10 µM IC50 değerleri göstermiştir. ABT-263 ile Dpep kombinasyonu incelenen altı ana hücre hattının tamamında anlamlı sinerjik etki göstermiştir. Dpep + decitabine kombinasyonu A375-ATCC, HCT116, T98G, MCF7 ve K562'de anlamlı sinerji göstermiş; MOLM-14'te ise sinerji yönünde eğilim raporlanmıştır.

Araştırmacılar uygun doz kombinasyonlarıyla kültürdeki tümör hücrelerinin büyük bölümünü ortadan kaldırmayı hedeflemiştir. Dpep + ABT-263 kombinasyonunda altı ana hücre hattının dördünde 20–40 µM Dpep ile 1–2 µM ABT-263 kullanılarak hücre sayısında %90'ın üzerinde azalma sağlanmıştır. ABT-263'e özellikle duyarlı MOLM-14 hücrelerinde 20 µM Dpep + 10 nM ABT-263 ile %90'ın üzerinde hücre kaybı görülürken, ABT-263'e görece dirençli K562 hücrelerinde 10 µM Dpep + 2 µM ABT-263 ile yaklaşık %80 hücre kaybı görülmüştür.

Dpep + decitabine + ABT-263 üçlü kombinasyonlarında da hücre hattına bağlı dozlar kullanılarak incelenen bütün ana hücre hatlarında %90'ın üzerinde hücre sayısı azalması sağlayan en az bir kombinasyon tanımlanmıştır. Altı hattın beşinde en az bir üçlü kombinasyon için anlamlı sinerji görülmüş; MOLM-14'te ise sinerji yönünde istatistiksel eğilim raporlanmıştır. Buna karşılık ABT-263 + decitabine ikilisi, K562 hariç test edilen hücre hatlarında anlamlı sinerji göstermemiştir. Bu sonuç, üçlü kombinasyonlardaki etkinin yalnız ABT-263 ile decitabine'in birbirini güçlendirmesinden ibaret olmadığını desteklemektedir.

Çalışmanın önemli bölümü ilaç direncine ayrılmıştır. HCT116 hücreleri in vitro ortamda 5 µM'dan başlayıp 10, 15 ve 20 µM'a yükseltilen Dpep basıncı altında seçilerek dirençli hale getirilmiş; bu hücrelerin Dpep IC50 değeri yaklaşık 20 µM'dan >40 µM'a çıkmıştır. Buna rağmen Dpep + ABT-263 ve Dpep + decitabine kombinasyonları dirençli HCT116 hücrelerinde güçlü sinerjik yanıt oluşturmuş ve üçlü kombinasyonlarla dirençli hücre sayısında %90'ın üzerinde azalma sağlayan koşullar bulunmuştur. A375 melanoma hücrelerinden in vivo Dpep veya Dpep123 tedavisi altında yeniden büyüyen tümörlerden türetilmiş iki farklı dirençli hücre hattında da benzer biçimde kombinasyon tedavileri Dpep direncini aşabilmiştir.

Fare melanoma xenograft deneyinde Dpep ve ABT-263 tek başlarına tümör büyümesini yavaşlatmış ve sağkalımı uzatmış; kombinasyon ise her iki monoterapiden daha güçlü tümör baskılanması ve daha uzun sağkalım sağlamıştır. Dpep + ABT-263 grubunda 10 farenin 4'ü 60 günlük tedavi sonuna ulaşmıştır. Tedavi daha sonra kesilmiş ve hayvanlar 30 gün daha izlenmiştir; 60. günde hayatta olan hayvanlarda takip sonunda palpasyon veya histolojiyle tümör saptanmamıştır. Makalenin Highlights bölümü bu sonucu tırnak içinde “%40 cure rate” olarak adlandırsa da bu ifade yalnız bu fare xenograft deneyine aittir ve insanlarda klinik kür oranı olarak yorumlanamaz.

Çalışma Dpep'in klinik tedavi olarak etkili veya güvenli olduğunu insanlarda göstermemektedir. Nude mouse xenograft modeli tam bağışıklık sistemine sahip değildir; yalnız tek tümör tipi Dpep + ABT-263 kombinasyonuyla in vivo test edilmiştir ve hasta tümörlerinden doğrudan elde edilmiş örnekler incelenmemiştir. Çalışmanın sonucu, kombinasyonların preklinik olarak daha ileri araştırılmaya değer olduğunu desteklemektedir; insanlarda kanıtlanmış tedavi etkinliği göstermez.

Araştırmanın temel problemi nedir?

Kanser hücrelerinin büyümesi yalnız tek bir sinyal yoluna bağlı değildir. Hücre yaşamını destekleyen transkripsiyon programları, anti-apoptotik proteinler ve epigenetik değişiklikler aynı anda devreye girebilir. Bu durum tek hedefli bir tedavi başlangıçta etkili olsa bile zaman içinde direnç gelişmesine yol açabilir.

Dpep daha önce birçok tümör hücresi tipinde büyümeyi ve hayatta kalmayı baskılayan deneysel bir peptit olarak geliştirilmiştir. Bununla birlikte önceki çalışmalar, Dpep tedavisinin bazı tümörleri uzun süre baskılamasına rağmen tümörlerin bir bölümünün devam eden tedavi altında yeniden büyüyebildiğini göstermiştir. Bu durum Dpep direncinin de diğer kanser tedavilerinde görülen direnç sorununa benzer biçimde araştırılması gerektiğini göstermektedir.

Bu çalışmanın iki ana sorusu vardır:

1. Dpep başka antikanser ajanlarla birleştirildiğinde tek başına beklenenden daha güçlü, yani sinerjik etki oluşturabilir mi?
2. Bu kombinasyonlar Dpep'e direnç geliştiren kanser hücrelerini de baskılayabilir mi?

Dpep Nedir ve ATF5, CEBPB ile CEBPD'yi Nasıl Hedefler?

Dpep, hücre içine geçiş sağlayan penetratin dizisini CEBPD'nin leucine-zipper bölgesinden türetilmiş bir decoy dizisiyle birleştiren ve ATF5, CEBPB ile CEBPD'nin işlevsel dimerleşmesine rekabet ederek bu transkripsiyon faktörlerinin aktivitesini baskılamak amacıyla tasarlanmış deneysel bir peptittir.

ATF5, CEBPB ve CEBPD nedir?

ATF5, CEBPB ve CEBPD, basic leucine zipper — bZIP ailesine ait transkripsiyon faktörleridir. Transkripsiyon faktörü, belirli genlerin ne kadar ifade edileceğini düzenleyen proteindir.

Bu üç protein gen ekspresyonunu düzenleyebilmek için leucine zipper bölgeleri üzerinden birbirleriyle veya kendi eşleriyle dimer oluşturmak zorundadır. Başka bir ifadeyle iki protein belirli bir yapısal arayüz üzerinden eşleşir ve işlevsel kompleks meydana getirir.

Dpep bu yapısal zorunluluktan yararlanır. Peptit, hedef proteinlerin leucine zipper bölgeleriyle etkileşebilecek bir “decoy” yani sahte eşleşme ortağı gibi davranacak biçimde tasarlanmıştır. Böylece normal ATF5/CEBPB/CEBPD dimerleşme ağını bozarak transkripsiyonel aktivitelerini azaltması amaçlanır.

Hücreye nüfuz eden peptit ne demektir?

Protein veya peptitlerin çoğu hücre zarını kendiliğinden etkin biçimde geçemez. Dpep'in N-terminal bölümünde bulunan penetratin dizisi, peptidin hücre içine ulaşabilmesini destekleyen cell-penetrating motif görevi görmektedir.

Bu nedenle Dpep iki işlevsel parçanın birleşimi olarak düşünülebilir:

• hücre içine giriş sağlayan penetratin bölgesi,
• ATF5/CEBPB/CEBPD leucine zipper etkileşimlerini hedefleyen decoy bölgesi.

Çalışmada kullanılan peptitlerin dizileri

Peptitler %10 glycerol içeren PBS pH 7,2 içinde çözündürülmüş, 2 mM aliquotlar halinde −80 °C'de saklanmış ve deneylerde gerekli konsantrasyonlara seyreltilmiştir.

Dpepmut deneyi neden önemlidir?

Bir peptidin kanser hücresi sayısını azaltması tek başına hedeflenen leucine zipper mekanizmasının doğru olduğunu kanıtlamaz; peptidin başka, özgül olmayan etkileri de olabilir.

Bu nedenle araştırmacılar leucine zipper etkileşiminin kritik amino asitlerini bozan Dpepmut'u kullanmıştır. T98G hücrelerinde Dpepmut tek başına Dpep'e göre çok daha düşük aktivite göstermiş ve ABT-263 ile sinerji oluşturmamıştır.

Yazarlar bu sonucu, Dpep + ABT-263 sinerjisinin tam olarak ortaya çıkabilmesi için leucine zipper yapısının önemli olduğuna ve etkinin yalnız genel veya rastlantısal bir peptit etkisiyle açıklanamayacağına destek olarak yorumlamaktadır.

Bu deney güçlü bir özgüllük kontrolü olmakla birlikte bütün olası off-target mekanizmaları tek başına dışlayan kapsamlı moleküler haritalama değildir.

ABT-263 neden kombinasyon ortağı olarak seçildi?

ABT-263, diğer adıyla navitoclax, pro-survival BCL2 ailesindeki BCL2, BCLXL ve BCL-W/BCL2L2 proteinlerini hedefleyen BH3-mimetic bir bileşiktir.

Apoptosis, hücrenin programlanmış ölüm mekanizmasıdır. Kanser hücreleri BCL2 ailesi gibi anti-apoptotik proteinleri kullanarak ölüm sinyallerine direnebilir.

Önceki Dpep çalışmalarında pro-apoptotik BMF'nin yükseldiği ve survivin/BIRC5 gibi yaşam destekleyici proteinlerin azaldığı bildirilmiştir. Araştırmacılar bu nedenle Dpep'in hücreyi apoptosis yönüne ittiği bir ortamda BCL2 ailesinin ABT-263 ile ayrıca baskılanmasının daha güçlü hücre ölümü oluşturabileceğini öngörmüştür.

Ancak mevcut çalışma bu “apoptotic threshold” açıklamasını ayrıntılı moleküler deneylerle doğrudan kanıtlamamıştır. Tartışma bölümünde bu mekanizma açıkça bir hipotez ve biyolojik gerekçe olarak sunulmaktadır.

Decitabine neden kombinasyon ortağı olarak seçildi?

Decitabine, DNA methylation düzeyini azaltabilen bir hypomethylating ajandır. Kanser hücrelerinde bazı tümör baskılayıcı ve pro-apoptotik genlerin hypermethylation nedeniyle susturulması tedavi direncine katkıda bulunabilir.

Dpep'e dirençli A375 hücrelerinin transcriptome karşılaştırmasında çeşitli tümör baskılayıcı genlerin aşağı düzenlendiği ve bu genlerin önemli bölümünün literatürde hypermethylation ile ilişkili olduğu görülmüştür. Bu gözlem decitabine'in Dpep ile kombinasyonu için biyolojik gerekçe sağlamıştır.

Fakat çalışma dirençli hücrelerde her bir genin methylation durumunu doğrudan ölçüp “decitabine tam olarak bu geni demetilleyerek direnci kırdı” biçiminde mekanistik zincir göstermemiştir.

Sinerji Bu Çalışmada Ne Anlama Geliyor?

Sinerji, iki veya üç ajanın birlikte oluşturduğu hücre azaltıcı etkinin, ajanların birbirinden bağımsız hareket etmesi halinde beklenen birleşik etkiden daha güçlü olmasıdır; çalışma bunu temel olarak Bliss independence modeliyle ve Dpep/Bpep–ABT-263 için ayrıca Chou–Talalay tabanlı CompuSyn isobologramlarıyla değerlendirmiştir.

Bliss independence yaklaşımı

Kaynak Bliss modelini kullanmakta fakat denklem biçiminde yazmamaktadır. Aşağıdaki ifade yalnız yöntemin nasıl çalıştığını öğretmek için verilen standart kavramsal gösterimdir; çalışmanın yeni bulgusu değildir.

İki tedaviden sonra hayatta kalan hücre fraksiyonları 0 ile 1 arasında \(V_A\) ve \(V_B\) ise, ajanların birbirinden bağımsız çalışması halinde beklenen birleşik hayatta kalma yaklaşık olarak:

\[ V_{A+B,\mathrm{beklenen}}=V_A\times V_B \]

şeklinde ifade edilir.

Örneğin A tedavisinden sonra hücrelerin %60'ı ve B tedavisinden sonra %50'si kalıyorsa, bağımsızlık altında beklenen ortak hayatta kalma:

\[ 0{,}60\times0{,}50=0{,}30 \]

yani %30 olur.

Gerçekte kombinasyondan sonra hücrelerin bundan belirgin biçimde daha azı hayatta kalıyorsa, etki yalnız iki bağımsız etkinin üst üste gelmesiyle açıklanamayacak kadar güçlüdür ve sinerji lehine değerlendirilir.

Kaynak grafiklerindeki çizgili sütunlar bu bağımsızlık varsayımıyla hesaplanan beklenen hücre sayılarını göstermektedir. İstatistik yıldızları birçok panelde gözlenen kombinasyon sonucu ile bu beklenen bağımsız değer arasındaki farkı karşılaştırmaktadır.

Chou–Talalay isobologramı nedir?

Çalışma T98G ve MCF7 hücrelerinde Dpep/Bpep ile ABT-263 kombinasyonlarını ayrıca CompuSyn 1.0 yazılımı ve Chou–Talalay median-effect yöntemiyle analiz etmiştir.

İsobologramda aynı biyolojik etkiyi sağlayan iki ilacın farklı doz kombinasyonları geometrik olarak gösterilir. Makalenin kullandığı normalized isobologram yorumunda noktaların diagonal bağımsız/additif referans çizgisinin solunda yer alması sinerjiyle uyumludur.

Kaynak belirli bir combination-index değer tablosu raporlamamaktadır; dolayısıyla Verianla kaynakta bulunmayan CI sayıları üretmemektedir.

IC50 ne demektir?

IC50, incelenen deney koşullarında bir ajanın ölçülen hücre yanıtını yaklaşık %50 azaltan konsantrasyonudur. Bu çalışmada hücreler 5–6 gün tedavi edilmiş ve kalan hücrelerin sayısı değerlendirilmiştir.

Dolayısıyla burada IC50, doğrudan bir insandaki tedavi dozu anlamına gelmez. Hücre kültüründe kullanılan µM cinsinden ortam konsantrasyonudur.

Hücre canlılığı neden metabolik test yerine sayımla ölçüldü?

Araştırmacılar solid-tumor kökenli hücrelerde hemocytometer veya Countess II otomatik hücre sayacı kullanmıştır. Bunun nedeni daha önce Dpep'in hücre metabolizmasını değiştirdiğinin gözlenmiş olmasıdır. Metabolik aktiviteye dayalı bazı viability assay'leri, hücre gerçekten yaşamaya devam ettiği halde metabolik durum değiştiği için yanlış yorumlanabilir.

K562 ve MOLM-14 gibi süspansiyon hücrelerinde ise Trypan Blue kullanılarak canlı ve ölü hücreler doğrudan ayrılmıştır.

Kaynağın tanımına göre canlılık yüzdesinin temel mantığı:

\[ \text{Canlılık (\%)}= \frac{\text{canlı hücre sayısı}} {\text{toplam hücre sayısı}} \times100 \]

şeklindedir.

“WT” burada ne anlama geliyor?

Makalede kullanılan WT — wild type ifadesi bu bağlamda esas olarak Dpep direnci için özel olarak seçilmemiş başlangıç kanser hücresi hatlarını dirençli türevlerden ayırmak için kullanılmaktadır. “WT” burada hücrelerin normal veya kansersiz olduğu anlamına gelmez; bunların tamamı kanser kökenli hücre hatlarıdır.

“Liquid tumor” ne anlama geliyor?

Kaynağın “liquid tumor” ifadesi K562 ve MOLM-14 gibi hematolojik malignite kökenli hücreleri ifade etmektedir. K562 kronik miyeloid lösemi, MOLM-14 ise akut miyeloid lösemi modelidir. “Sıvı tümör” ifadesi fiziksel olarak sıvı bir tümör kitlesi anlamına gelmez.

Dpep Direnci Nasıl Oluşturuldu ve Nasıl Aşıldı?

Çalışma Dpep direncini iki farklı yolla modellemiştir: HCT116 hücreleri laboratuvarda giderek artan Dpep konsantrasyonlarına maruz bırakılarak in vitro seçilmiş, A375 dirençli hücreleri ise Dpep veya Dpep123 altında yeniden büyüyen fare melanoma xenograftlarından elde edilmiştir; her iki modelde de Dpep'in ABT-263 ve/veya decitabine ile kombinasyonu dirençli hücreleri tek başına Dpep'ten daha güçlü baskılamıştır.

HCT116 direnç modeli

HCT116 hücreleri önce 5 µM Dpep'e maruz bırakılmıştır. Hayatta kalan hücreler yeniden istikrarlı proliferasyona ulaştıkça doz sırasıyla 10, 15 ve 20 µM'a çıkarılmıştır.

Paralel kontrol kültürü aynı süre boyunca aynı pasaj koşullarında tutulmuş fakat Dpep yerine %10 glycerol/PBS taşıyıcı almıştır.

Elde edilen dirençli HCT116 hücreleri daha sonra 10 µM Dpep içeren ortamda korunmuştur.

Kontrol HCT116 hücrelerinde Dpep IC50 yaklaşık 20 µM iken dirençli hücrelerde >40 µM olmuştur. Bu, hücrelerin Dpep'e karşı duyarlılığının belirgin biçimde azaldığını göstermektedir.

Bununla birlikte dirençli HCT116 hücrelerinin ABT-263 ve decitabine'e duyarlılığı kontrol hücrelerine yaklaşık olarak benzer kalmıştır. Dpep + ABT-263 ve Dpep + decitabine kombinasyonları dirençli hücrelerde yeniden güçlü sinerji oluşturmuş; uygun üçlü kombinasyonlarla hücre sayısı %90'ın üzerinde azaltılabilmiştir.

A375 in vivo direnç modeli

İkinci direnç modeli doğrudan farelerde büyüyen A375-ATCC melanoma tümörlerinden türetilmiştir.

Dpep veya C-terminalinden 10 amino asit kısaltılmış aktif Dpep123 formuyla tedavi edilen xenograftlar başlangıçta baskılanmış, fakat uzun tedaviden sonra bazı tümörler yeniden büyümüştür.

Bu tümörlerden kültürler oluşturularak:

• A375 Dpep-resistant#1,
• A375 Dpep-resistant#2

hatları elde edilmiştir.

Taşıyıcıyla tedavi edilmiş farelerin tümörlerinden ise karşılaştırma için A375 Dpep-responsive#1 ve A375 Dpep-responsive#2 kültürleri oluşturulmuştur.

Her iki dirençli A375 hattının Dpep IC50 değeri yaklaşık 40 µM veya daha yüksekken, decitabine ve ABT-263 duyarlılıkları başlangıç hücrelerine daha yakın kalmıştır.

Dpep'in ABT-263 ve/veya decitabine ile kombinasyonu bu iki dirençli A375 hattında da sinerjik yanıt göstermiş ve üçlü kombinasyonlarla %90'ın üzerinde hücre kaybı oluşturan koşullar bulunmuştur.

Transcriptome karşılaştırması direnç hakkında ne gösterdi?

Araştırmacılar yeni RNA sequencing yapmak yerine daha önce yayımlanan Plate-seq veri setini yeniden analiz etmiştir. A375 Dpep-resistant#1 ile A375 Dpep-responsive#1 hücrelerinin, Dpep tedavisi öncesi ve 20 µM Dpep ile 48 saatlik tedavi sonrası transcriptomları karşılaştırılmıştır.

Direnç Dpep'e verilen bütün moleküler yanıtların kaybolması şeklinde gelişmemiştir. A375-ATCC ve responsive hücrelerde Dpep'e yanıt veren 37 genin 21'i dirençli hücrelerde de genel olarak benzer yanıt göstermiştir.

Dpep verilmeden önce resistant ve responsive hücreler arasında 200'den fazla diferansiyel ifade edilen gen tespit edilmiş ve bunların yaklaşık %70'i dirençli hücrelerde daha düşük ifade edilmiştir.

Buna ek olarak Dpep tedavisi öncesinde farklı olan ve yalnız responsive hücrelerde Dpep'e yanıt vererek farkı daha da büyüten 26 gen belirlenmiştir; bunların 20'si dirençli hücrelerde aşağı düzenlenmiştir.

Dirençli hücrelerde yukarı düzenlenmiş genler arasında literatürde oncogene olarak tanımlanmış 8 gen, aşağı düzenlenmiş genler arasında ise tumor suppressor olarak tanımlanmış 14 gen bulunmuştur.

Yazarlar bu örüntüyü, Dpep direncinin bir bölümünün pro-survival oncogenic programların artması ve apoptosis destekleyebilen tumor-suppressor programların azalmasıyla ilişkili olabileceğine destek olarak yorumlamaktadır.

Ancak transcriptome karşılaştırması yalnız tek bir A375 responsive/resistant çifti için ayrıntılı yapılmıştır. Bu nedenle bu genetik/epigenetik örüntünün bütün Dpep dirençli kanserlerde ortak bir mekanizma olduğu söylenemez.

NK-92MI deneyi neden yapıldı?

Natural killer — NK hücreleri, malign hücreleri öldürebilen doğuştan bağışıklık sistemi hücreleridir. Araştırmacıların önceki çalışması Dpep ile önceden muamele edilmiş tümör hücrelerinin NK-92MI hücrelerinin öldürücü etkisine daha duyarlı hale geldiğini göstermiştir.

Bu çalışmada HCT116 hücreleri 48 saat boyunca:

• 20 µM Dpep,
• 20 µM Dpep + 1 µM ABT-263,
• 20 µM Dpep + 1 µM decitabine

koşullarında ön tedavi edilmiştir.

Daha sonra NK-92MI hücreleri effector-to-target oranı 2,5:1 olacak biçimde eklenmiş ve aynı ilaç koşullarında 24 saat daha birlikte kültür edilmiştir.

ABT-263 ve decitabine ön tedavileri tek başlarına HCT116 hücrelerini NK-92MI öldürmesine karşı Dpep'e benzer biçimde duyarlılaştırmıştır. Dpep + ABT-263 ve Dpep + decitabine ön tedavileri ise ajanların bağımsız etkilerinden beklenenden daha güçlü duyarlılaştırma göstermiştir.

1 µM decitabine veya ABT-263'ün NK-92MI hücrelerinin kendileri üzerindeki 24 saatlik etkisi sırasıyla yaklaşık %92 ± 2 canlılık (N=6) ve %100 ± 4 (N=3) olarak bildirilmiştir.

Decitabine ile NK-92MI hücrelerinin doğrudan ön tedavi edilmesi HCT116 öldürme sonucunu anlamlı biçimde değiştirmediği için yazarlar decitabine'in duyarlılaştırıcı etkisinin NK hücresinden çok HCT116 tümör hücresi tarafında gerçekleştiğini yorumlamıştır.

Bu sonuç yalnız HCT116 + NK-92MI sistemi için gösterilmiştir; başka tümörlerde veya canlı organizmada endogenous NK hücreleriyle aynı etkinin oluştuğu bu çalışmada gösterilmemiştir.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Hücre kültürü koşulları

A375-ATCC, HCT116, T98G, MCF7 ve yöntem bölümünde bildirilen diğer adherent hücreler DMEM + %10 FBS + 100 U/mL penicillin–streptomycin ortamında 37 °C ve %5 CO2 koşulunda tutulmuştur. K562 ve MOLM-14 hücreleri RPMI 1640 + %10 FBS + penicillin–streptomycin ortamında aynı sıcaklık ve CO2 koşullarında yetiştirilmiştir.

İlgili hücreler mycoplasma açısından test edilmiş ve kontaminasyon olmadığı doğrulanmıştır.

Kaynak içi hücre listesi notu: Cell Culture bölümü T98G, A375-ATCC, HCT116, MDA-MB-231 ve MCF7 hücrelerini listelerken Cell Viability bölümündeki liste T98G, A375-ATCC, HCT116 yerine aynı bağlamda A549 adını da içermektedir. A549 ana sonuç şekillerinde tekrar kullanılmamakta; MDA-MB-231 ise Dpep123 deneyinde görünmektedir. Bu fark kaynakta ayrıca açıklanmamıştır.

Hücre canlılığı deneyleri

Hücreler 96-well plakalara ekilmiş ve gece boyunca standart ortamda bekletilmiştir. Daha sonra ortam %2 FBS içeren DMEM veya RPMI ile değiştirilmiş ve Dpep, ABT-263, decitabine veya bunların kombinasyonları eklenmiştir.

Ana hücre canlılığı deneylerinde tedavi süresi genel olarak 5–6 gündür.

Solid-tumor hücrelerinin kalan sayısı hemocytometer veya Countess II otomatik cell counter ile belirlenmiştir. K562 ve MOLM-14 hücreleri Trypan Blue exclusion ile sayılmıştır.

Tek ajanlara verilen yanıtlar

MOLM-14'ün ABT-263'e diğer hücrelere göre çok daha duyarlı olması kombinasyon deneyindeki gerekli ABT-263 dozunun da çok daha düşük olmasını açıklamaktadır.

Dpep + decitabine ikili kombinasyonu

Anlamlı sinerji:

• A375-ATCC,
• HCT116,
• T98G,
• MCF7,
• K562

hücrelerinde görülmüştür.

MOLM-14 için sinerji yönünde eğilim bildirilmiş fakat aynı istatistiksel kesinlik düzeyine ulaşılmamıştır.

A375-ATCC, HCT116, T98G ve MCF7'de 10–40 µM Dpep ile 0,5–2 µM decitabine kombinasyonlarıyla hücrelerin %90'dan fazlası ortadan kaldırılabilmiştir.

K562'de 10 µM Dpep + 0,5 µM decitabine ve MOLM-14'te 10 veya 20 µM Dpep + 1 µM decitabine ile %80'in üzerinde hücre kaybı görülmüştür.

Dpep + ABT-263 ikili kombinasyonu

Bu kombinasyon incelenen altı ana hücre hattının tamamında anlamlı sinerjik aktivite göstermiştir.

Altı hattın dördünde 20–40 µM Dpep + 1–2 µM ABT-263 kombinasyonları hücre sayısını %90'ın üzerinde azaltmıştır.

MOLM-14:

20 µM Dpep + 10 nM ABT-263 → %90'ın üzerinde hücre kaybı.

K562:

10 µM Dpep + 2 µM ABT-263 → yaklaşık %80 hücre kaybı.

T98G ve MCF7'de CompuSyn isobologramları da sinerjik etkileşimi desteklemiştir.

Tedavi sırası önemli miydi?

A375-ATCC hücreleri için iki protokol karşılaştırılmıştır:

1. 20 µM Dpep + 1 µM ABT-263 ile tam 5 günlük birlikte tedavi,
2. önce 2 gün 20 µM Dpep, ardından 3 gün 20 µM Dpep + 1 µM ABT-263.

İki protokol arasında anlamlı etkinlik farkı bulunmamıştır. Bu deney N=3 koşuluyla gerçekleştirilmiştir.

Bpep sonucu

Bpep, Dpep'ten farklı leucine zipper dizisine sahip olmasına rağmen aynı ATF5/CEBPB/CEBPD hedef grubuna yöneliktir. Bpep + ABT-263 kombinasyonu T98G ve MCF7 hücrelerinde Dpep'e benzer sinerjik davranış göstermiştir.

Bu bulgu hedef transkripsiyon faktörü ağının kombinasyon yanıtındaki önemini desteklemektedir; ancak Dpep ve Bpep'in bütün moleküler etkilerinin aynı olduğu anlamına gelmez.

ABT-263 + decitabine tek başına sinerjik miydi?

Genel olarak hayır. K562 dışında test edilen hücre hatlarında ABT-263 + decitabine ikilisi anlamlı sinerji göstermemiştir.

Bu karşılaştırma önemlidir; çünkü Dpep içeren üçlü kombinasyonların güçlü etkisinin yalnız ABT-263 ile decitabine'in zaten kendi başlarına güçlü bir sinerji oluşturmasından kaynaklanmadığını göstermektedir.

Üçlü Dpep + ABT-263 + decitabine tedavisi

Üçlü kombinasyon etkisi hücre hattına ve doza bağlıdır.

İncelenen bütün ana hücre hatlarında uygun doz kombinasyonu seçildiğinde hücre sayısında %90'ın üzerinde kayıp sağlayan koşul tanımlanmıştır.

Altı hattın beşinde en az bir üçlü kombinasyon anlamlı sinerji göstermiş, MOLM-14 ise istatistiksel anlamlılığa doğru eğilim göstermiştir.

Kaynak, hücrelerin %90'dan fazlasının ortadan kalktığı bazı deneylerde geriye çok az hücre kaldığı için kombinasyonlar arası farkın istatistiksel anlamlılığa ulaşmasının zorlaşabildiğini de not etmektedir.

Dpep123 deneyi

Dpep123, Dpep'in C-terminalinden 10 amino asit kısaltılmış aktif formudur. A375-ATCC, T98G ve MDA-MB-231 hücrelerinde Dpep123 için dose–response deneyleri yapılmıştır.

Ayrıca A375-ATCC xenograft taşıyan farelerde vehicle veya 10 mg/kg Dpep123 uygulanmıştır. Bu küçük deneyde her grup N=3'tür. Kaynak tümör büyümesi için p=0,042 ve sağkalım için p=0,0495 bildirmektedir.

Bu deney Dpep123'ün biyolojik aktivitesini desteklemektedir; küçük N=3 tasarımı geniş güvenlik veya etkinlik genellemesi için yeterli değildir.

Fare Xenograft Deneyindeki “%40 Kür” İfadesi Gerçekte Ne Anlama Geliyor?

Makalenin Highlights bölümündeki tırnak içindeki “%40 cure rate” ifadesi, Dpep + ABT-263 verilen 10 nude farenin 4'ünün 60 günlük tedavi sonuna tümör etik sonlanımına ulaşmadan gelmesi ve hayatta kalan hayvanlarda tedavi kesildikten sonraki 30 günlük takip sonunda palpasyon veya histolojiyle tümör saptanmaması anlamına gelir; bu insanlarda %40 klinik kür oranı değildir.

Fare modeli nasıl kuruldu?

6–8 haftalık dişi NCR nude farelerin flank bölgelerine 1 × 10⁶ A375-ATCC melanoma hücresi subkutan olarak enjekte edilmiştir.

Tümör hacmi 100–200 mm³'e ulaştığında hayvanlar tedavi gruplarına randomize edilmiştir.

Dpep + ABT-263 kombinasyon çalışmasında farelerin flank bölgelerinde genel olarak üç ayrı A375 xenograft oluşturulmuştur.

Tümör hacmi nasıl hesaplandı?

Kaynak tümör hacmini şu formülle hesaplamıştır:

\[ V= \frac{\text{uzunluk}\times\text{genişlik}^{2}}{2} \]

Burada \(V\), mm³ cinsinden yaklaşık tümör hacmidir. Uzunluk ve genişlik dışarıdan ölçülen iki temel tümör boyutudur.

Formül, iki caliper ölçümünden tümör hacmini yaklaşık olarak izlemeyi sağlar; tümörün gerçek üç boyutlu geometrisinin doğrudan görüntüleme ile tam hacim rekonstrüksiyonu değildir.

Tedavi grupları

*Kaynak içi doz tutarsızlığı: Yöntem bölümü ve Şekil 10 açıklaması Dpep için 20 mg/kg yazmaktadır. Sonuç bölümünün 3.6 kısmındaki tek bir cümlede 20 µg/kg yazılmıştır. Burada iki ayrı kaynak noktasının uyuşan değeri olan 20 mg/kg gösterilmiş, çelişki ayrıca korunmuştur.

İki bağımsız deney gerçekleştirilmiş ve her deneyde başlangıçta genel olarak grup başına 5 hayvan kullanılmıştır. Vehicle grubundaki bir hayvanda tümör oluşmadığı için bu hayvan çıkarılmış ve final vehicle N=9 olmuştur.

Herhangi tek bir tümör 1000 mm³ etik sonlanım hacmine ulaştığında ilgili fare euthanasia uygulanarak survival analizinde sonlanım kabul edilmiştir.

In vivo tümör büyümesi ve sağkalım sonuçları

Dpep ve ABT-263 monoterapileri tümör büyümesini vehicle'a göre anlamlı biçimde yavaşlatmış ve survival süresini uzatmıştır.

Kombinasyon tümör büyümesini hem Dpep hem de ABT-263 tek başına tedavilerinden daha güçlü biçimde baskılamıştır.

60. günlük tedavi sonuna Dpep monoterapi grubunda 2/10, Dpep + ABT-263 kombinasyon grubunda ise 4/10 fare ulaşmıştır.

60. günde hayatta olan hayvanlarda palpe edilebilir tümör saptanmamıştır. Tedaviler kesilmiş ve hayvanlar 30 gün daha takip edilmiştir. Kaynak, bu hayvanlarda takip sonunda palpasyon veya histolojiyle tümör görülmediğini ve tümörlerin eradike olmuş göründüğünü belirtmektedir.

Kaynak ayrıca Dpep, ABT-263 veya kombinasyonun ortalama hayvan vücut ağırlığını belirgin biçimde etkilemediğini ve açık yan etki gözlenmediğini bildirmektedir.

Ancak vücut ağırlığının değişmemesi kapsamlı toksikoloji analizi değildir. Organ toksisitesi, hematolojik toksisite, farmakokinetik güvenlik veya insan güvenliği bu deneyden çıkarılamaz.

İstatistiksel analizler

Kaynak genel hücre kültürü deneylerinin bağımsız biçimde üç tekrar halinde yürütüldüğünü ve sonuçların ortalama ± SEM olarak verildiğini belirtmektedir. Şekillerdeki N değerleri deneysel koşula göre ayrıca bildirilmiştir.

Başlıca testler:

• iki kuyruklu Student t-testi: hücre kültürü karşılaştırmaları,
• Mann–Whitney testi: Dpep123 ve Dpep/ABT-263 xenograft tümör büyümesi karşılaştırmaları,
• Kaplan–Meier: survival eğrileri,
• log-rank testi: survival eğrileri arasındaki fark,
• Bliss independence: ilaç kombinasyonlarının bağımsızlık beklentisine göre sinerji değerlendirmesi,
• CompuSyn 1.0 / Chou–Talalay: seçilmiş Dpep/Bpep + ABT-263 kombinasyonlarının isobologram analizi.

İstatistiksel anlamlılık için p < 0,05 eşiği kullanılmıştır.

Çalışmanın desteklediği sonuçlar

• Dpep incelenen altı ana kanser hücre hattının tamamında hücre büyümesi/hayatta kalmasını baskılamıştır.
• Dpep + ABT-263 kombinasyonu altı ana hücre hattının tamamında sinerjik etki göstermiştir.
• Dpep + decitabine kombinasyonu beş ana hücre hattında anlamlı sinerji, MOLM-14'te sinerji yönünde eğilim göstermiştir.
• Uygun üçlü Dpep + ABT-263 + decitabine kombinasyonları incelenen bütün ana hücre hatlarında %90'ın üzerinde hücre sayısı azalması sağlayabilmiştir.
• Dpep'e in vitro seçilmiş HCT116 ve in vivo tümörden türetilmiş A375 dirençli hücrelerinde kombinasyon tedavileri Dpep monoterapisinden daha etkili olmuştur.
• Dpepmut'un ABT-263 ile sinerji oluşturmaması tam Dpep aktivitesinde leucine zipper yapısının önemli olduğunu desteklemektedir.
• Bpep + ABT-263 sinerjisi aynı hedef transkripsiyon faktörü ağını kullanan farklı bir decoy peptidin de kombinasyon etkisi gösterebildiğini desteklemektedir.
• Dpep + ABT-263, A375 xenograft fare modelinde her iki monoterapiden daha güçlü tümör büyümesi baskılanması ve survival sağlamıştır.
• Kombinasyon grubunda 4/10 hayvan 60 günlük son noktaya ulaşmış ve tedavisiz ek 30 günlük gözlemde hayatta kalan hayvanlarda tümör saptanmamıştır.

Çalışmanın desteklemediği sonuçlar

• Dpep'in insanlarda etkili kanser tedavisi olduğu kanıtlanmamıştır.
• Dpep + ABT-263 kombinasyonunun insanlarda %40 kür sağlayacağı söylenemez.
• Çalışma bir klinik faz I, II veya III denemesi değildir.
• Farelerde vücut ağırlığının değişmemesi insanlarda veya hayvanlarda kapsamlı güvenlik kanıtı değildir.
• Dpep kombinasyonlarının bütün kanser türlerinde aynı şekilde çalışacağı gösterilmemiştir.
• Transcriptome sonuçları bütün Dpep direnç mekanizmalarının aynı olduğunu göstermez.
• Dpep + ABT-263 sinerjisinin kesin moleküler mekanizması çözülmemiştir.
• Decitabine'in hangi spesifik tumor-suppressor genlerini demethylate ederek Dpep direncini kırdığı doğrudan gösterilmemiştir.
• NK-92MI duyarlılaştırma sonucu yalnız HCT116 sistemiyle gösterilmiş; canlı organizmada endogenous NK hücreleriyle doğrulanmamıştır.
• Cell-line-derived nude mouse xenograft modeli insan tümör heterojenitesini ve tam bağışıklık mikroçevresini yeniden oluşturmaz.
• Hasta tümörlerinden yeni elde edilmiş primer hücreler veya patient-derived xenograft modelleri bu çalışmada kullanılmamıştır.

Çalışmanın temel sınırlılıkları

Kombinasyon ortaklarının kapsamı: Araştırma ağırlıklı olarak ABT-263 ve decitabine'e odaklanmıştır. BCL2 ailesini hedefleyen başka ajanlar ve alternatif hypomethylating ilaçlar değerlendirilmemiştir.

Mekanizma çözümlemesi sınırlıdır: Çalışmanın ana amacı etkin kombinasyonları belirlemek olduğundan moleküler sinerji mekanizmaları derinlemesine test edilmemiştir.

Direnç modeli sayısı sınırlıdır: Yalnız sınırlı sayıda Dpep-resistant hücre hattı oluşturulmuştur.

Transcriptome karşılaştırması sınırlıdır: Gen düzenleme farkları ayrıntılı olarak yalnız tek A375 responsive/resistant çiftinde karşılaştırılmıştır.

In vivo kapsam sınırlıdır: Kaynaklar yalnız A375 melanoma ve Dpep + ABT-263 kombinasyonuyla kapsamlı xenograft deneyine izin vermiştir.

Nude mouse modeli: Cell-line-derived xenograft modeli endogenous insan tümörlerinin heterojenitesini, tam tümör mikroçevresini ve tam host immune response'u yansıtmaz.

Hasta materyali yoktur: Taze hasta tümörü kökenli hücreler veya hasta kökenli xenograftlar test edilmemiştir.

NK deneyi sınırlıdır: Dpep/ABT-263/decitabine ile NK-92MI duyarlılaştırması yalnız HCT116 hücrelerinde incelenmiştir.

Klinik doz eşdeğerliği gösterilmemiştir: Araştırmacılar ABT-263 ve decitabine için seçilen kültür konsantrasyonlarının literatürdeki insan serum düzeyleriyle uyumlu sınırlar içinde tutulduğunu tartışmaktadır; ancak bu durum Dpep kombinasyonunun insanlarda güvenli, etkili veya aynı farmakodinamik davranışı göstereceğini kanıtlamaz.

Gelecek araştırmalar

Yazarların önerdiği sonraki aşamalar arasında farklı BCL2-family inhibitörlerinin ve alternatif hypomethylating ajanların Dpep ile sınanması, sinerjinin moleküler mekanizmasının ayrıntılı incelenmesi, daha fazla bağımsız dirençli hücre hattının oluşturulması ve transcriptome analizinin genişletilmesi bulunmaktadır.

Hayvan tarafında birden fazla tümör tipi, orthotopic modeller, patient-derived xenograft materyali ve tam bağışıklık sistemine sahip syngeneic modellerin kullanılması önerilmektedir.

Ayrıca taze hasta tümörlerinden elde edilen heterojen materyallerde kombinasyonların test edilmesi ve Dpep'in NK hücrelerine karşı oluşturduğu duyarlılaştırmanın in vivo ortamda hem NK-92MI hem de endogenous NK hücreleriyle incelenmesi gerekmektedir.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün başlık: Dpep, a Cell-Penetrating Peptide Targeting ATF5, CEBPB and CEBPD, Synergistically Combines with ABT-263 and Decitabine to Inhibit Cancer Cell Growth and Overcome Dpep Resistance

Yazarlar: Qing Zhou; Trang Thi Thu Nguyen; James M. Angelastro; Markus D. Siegelin; Lloyd A. Greene.

Yazar sırası: Kaynakta yukarıdaki sırayla verilmiştir.

Eş katkı / eş birinci yazarlık: Kaynakta belirtilmemiştir.

Sorumlu yazar: Lloyd A. Greene.

Sorumlu yazar e-posta: lag3@cumc.columbia.edu

Kurum 1: Department of Pathology and Cell Biology, Vagelos College of Physicians & Surgeons, Columbia University Irving Medical Center, New York, USA.

Kurum 2: Ronald O. Perelman Department of Dermatology, Perlmutter Cancer Center, NYU Grossman School of Medicine, NYU Langone Health, New York, USA.

Kurum 3: Department of Molecular Biosciences, School of Veterinary Medicine, University of California Davis, Davis, USA.

Dergi: Cells.

Bölüm: Cellular Pathology.

Yayınevi: MDPI.

Cilt / sayı / makale no: 15(9), 826.

DOI: 10.3390/cells15090826.

Gönderim: 7 Nisan 2026.

Revizyon: 24 Nisan 2026.

Kabul: 27 Nisan 2026.

Yayın: 1 Mayıs 2026.

Academic Editor: Alessandro Poggi.

Kaynak türü: Özgün araştırma makalesi; ağırlıklı in vitro kanser hücresi kombinasyon çalışması ve sınırlı preklinik mouse xenograft doğrulaması.

Hakemlik: Cells hakemli bir dergidir. Derginin güncel resmî politikası single-anonymized peer review kullanıldığını ve peer review aşamasına geçen çalışmalar için en az iki hakem raporu toplandığını belirtmektedir.

Lisans: Creative Commons Attribution 4.0 — CC BY 4.0.

Preprint durumu: Kaynak PDF ayrı bir preprint kaydı belirtmemektedir. Hedefli bibliyografik kontrolde aynı başlık için ayrı bir preprint kaydı tespit edilmemiştir.

Anahtar kelimeler: cancer; anti-cancer; cell-penetrating peptide; Dpep; Bpep; ABT-263; decitabine; overcoming resistance; apoptosis; combination therapy.

Ana deneysel hedef: Dpep'in ABT-263 ve decitabine ile kombinasyonlarının çeşitli tümör hücrelerinde sinerji oluşturup oluşturmadığını ve Dpep direncini aşıp aşmadığını değerlendirmek.

Ana kanser hücre hatları: A375-ATCC; HCT116; T98G; MCF7; K562; MOLM-14.

Ek kullanılan hücre hattı: MDA-MB-231, Dpep123 karakterizasyonunda.

Kaynak içi hücre hattı raporlama farkı: Cell Culture bölümünde MDA-MB-231 listelenirken Cell Viability listesinin bir satırında A549 yer almaktadır; A549 ana sonuçlarda tekrar görünmemektedir.

Hücre kültürü sıcaklığı: 37 °C.

CO2: %5.

Ana tedavi süresi: 5–6 gün.

Cell viability ölçümü: Solid-tumor hücrelerinde hemocytometer veya Countess II ile doğrudan hücre sayımı; K562 ve MOLM-14'te Trypan Blue exclusion.

Synergy yöntemleri: Bliss independence; seçilmiş Dpep/Bpep + ABT-263 deneylerinde CompuSyn 1.0 ve Chou–Talalay median-effect isobologramları.

İstatistik: Two-tailed Student's t-test; in vivo tümör büyümesi için Mann–Whitney; survival için Kaplan–Meier ve log-rank.

Anlamlılık eşiği: p < 0,05.

GraphPad Prism: 10.4.2.

R: 4.1.2.

Dpep-resistant HCT116 oluşturma: 5 → 10 → 15 → 20 µM Dpep ile stepwise in vitro selection; dirençli hücreler daha sonra 10 µM Dpep içeren ortamda tutulmuştur.

A375 direnç modeli: Dpep veya Dpep123 altında yeniden büyüyen A375-ATCC mouse xenograftlarından kültür oluşturulması.

Transcriptome veri kaynağı: Daha önce yayımlanmış Plate-seq veri seti; GEO accession GSE244579.

NK modeli: NK-92MI.

NK co-culture oranı: E:T = 2,5:1.

NK deneyindeki HCT116 ön tedavisi: 48 saat Dpep ve/veya ABT-263/decitabine, ardından aynı ajanlar varlığında NK-92MI ile 24 saat.

In vivo model: 6–8 haftalık dişi NCR nude farelerde A375-ATCC subkutan melanoma xenograftı.

İnokulum: 1 × 10⁶ A375-ATCC hücresi.

Randomizasyon tümör hacmi: 100–200 mm³.

Dpep + ABT-263 çalışması: Genel olarak fare başına üç flank bölgesinde xenograft.

Vehicle: %10 glycerol/PBS.

Dpep dozu: Yöntem ve Şekil 10 açıklamasında 20 mg/kg, intraperitoneal, haftada üç kez.

Kaynak içi Dpep doz tutarsızlığı: Sonuç 3.6 metnindeki tek cümle 20 µg/kg yazmaktadır. Kaynakta bu fark açıklanmamıştır.

ABT-263 dozu: 50 mg/kg, intraperitoneal, haftada üç kez.

Tedavi süresi: 60 güne kadar.

Etik tümör sonlanımı: Herhangi tek bir tümörün 1000 mm³'e ulaşması.

Ek takip: 60. günde hayatta kalan farelerde tedavi kesildikten sonra 30 gün.

Kombinasyon sağkalımı: 4/10 fare 60 günlük tedavi sonuna ulaşmıştır.

Dpep monoterapi sağkalımı: 2/10 fare 60 günlük tedavi sonuna ulaşmıştır.

“40% cure rate” yorum sınırı: Makalenin Highlights bölümünde kullanılan tırnak içindeki ifadedir; fare xenograft modelindeki kalıcı sağkalım/tümör saptanmama sonucunu ifade eder ve insan klinik kür oranı değildir.

Hayvan etik onayı: Columbia University IACUC, protocol AC-AABU1656; onay 28 Aralık 2022.

Informed consent: Uygulanamaz; insan katılımcı çalışması değildir.

Veri erişilebilirliği: Referans RNA-seq çalışmasının ham ve işlenmiş verileri GEO GSE244579 altında; mevcut çalışmanın ham verileri Supplementary File S2 içinde verilmektedir.

Supplementary File S1: A375 Dpep-resistant#1 ve Dpep-responsive#1 transcriptome karşılaştırmaları.

Supplementary Figure S1: Dpep + decitabine veya Dpep + ABT-263 ön tedavisinin HCT116 hücrelerini NK-92MI öldürmesine sinerjik biçimde duyarlılaştırması.

Finansman: NIH R01NS083795 (J.M.A.), R01NS113793 (M.D.S.), R21NS137660 (M.D.S.) ve R01NS072050 (L.A.G.).

Çıkar çatışması / fikrî mülkiyet: J.M.A. ve L.A.G., Bpep ve Dpep'i tanımlayan bir patentte mucit olarak listelenmiştir. J.M.A., Q.Z. ve L.A.G., Dpep123'ü tanımlayan bir patent başvurusunda mucit olarak listelenmiştir. Yazarlar fon sağlayıcıların araştırmanın tasarımı, veri toplama, analiz, yorumlama, makale yazımı veya yayın kararında rolü olmadığını bildirmektedir.

Yazar katkıları: Conceptualization: Q.Z., M.D.S., L.A.G.; validation: Q.Z.; formal analysis: Q.Z., L.A.G.; investigation: Q.Z., T.T.T.N., J.M.A.; resources: J.M.A., M.D.S.; data curation: Q.Z., L.A.G.; original draft: L.A.G.; review/editing: tüm yazarlar; visualization: Q.Z., L.A.G.; supervision ve project administration: L.A.G.; funding acquisition: J.M.A., M.D.S., L.A.G.

Temel klinik sınır: Dpep veya Dpep kombinasyonları bu çalışmada insanlarda test edilmemiştir.

Temel model sınırı: Nude mouse cell-line-derived xenograft modeli insan tümör heterojenitesini, orthotopic mikroçevreyi ve tam host immune system'i temsil etmez.

Temel mekanizma sınırı: Dpep + ABT-263 ve Dpep + decitabine sinerjisinin ayrıntılı moleküler mekanizması bu çalışmada doğrudan çözülmemiştir.