Dpep, hüceyrə membranını keçə bilən və ATF5, CEBPB ilə CEBPD adlı bZIP transkripsiya faktorlarının funksiyasını pozmaq üçün hazırlanmış hüceyrəyə nüfuz edən decoy peptiddir. Bu tədqiqat Dpep-in təkbaşına təsirini yenidən qiymətləndirməkdən daha çox, Dpep-in pro-apoptotik BH3-mimetic ABT-263 və hipometilləşdirici dərman decitabine ilə birləşdirilməsinin müxtəlif xərçəng hüceyrələrində daha güclü təsir yaradıb-yaratmadığını və bu kombinasiyaların Dpep-ə davamlılıq inkişaf etdirmiş hüceyrələrdə də işləyib-işləmədiyini araşdırır. Tədqiqat insanlarda müalicə sınağı deyil; əsas təcrübələr hüceyrə kulturasında aparılmış, Dpep + ABT-263 kombinasiyası əlavə olaraq A375 melanoma hüceyrələrindən yaradılmış immun çatışmazlığı olan siçan xenograft modelində sınaqdan keçirilmişdir.

İn vitro təcrübələrdə melanoma mənşəli A375-ATCC, kolon xərçəngi mənşəli HCT116, glioblastoma mənşəli T98G, döş xərçəngi mənşəli MCF7, xroniki miyeloid leykemiya mənşəli K562 və kəskin miyeloid leykemiya mənşəli MOLM-14 hüceyrələri qiymətləndirilmişdir. Dpep təkbaşına A375-ATCC, HCT116, T98G və MCF7 hüceyrələrində təxminən 20 µM; K562-də təxminən 9 µM və MOLM-14-də təxminən 10 µM IC50 dəyərləri göstərmişdir. ABT-263 ilə Dpep kombinasiyası araşdırılan altı əsas hüceyrə xəttinin hamısında əhəmiyyətli sinerjik təsir göstərmişdir. Dpep + decitabine kombinasiyası A375-ATCC, HCT116, T98G, MCF7 və K562-də əhəmiyyətli sinerji göstərmiş; MOLM-14-də isə sinerji istiqamətində meyl bildirilmişdir.

Tədqiqatçılar uyğun doza kombinasiyaları ilə kulturadakı şiş hüceyrələrinin böyük hissəsini aradan qaldırmağı hədəfləmişlər. Dpep + ABT-263 kombinasiyasında altı əsas hüceyrə xəttinin dördündə 20–40 µM Dpep ilə 1–2 µM ABT-263 istifadə olunaraq hüceyrə sayında %90-dan çox azalma əldə edilmişdir. ABT-263-ə xüsusilə həssas MOLM-14 hüceyrələrində 20 µM Dpep + 10 nM ABT-263 ilə %90-dan çox hüceyrə itkisi müşahidə edilərkən, ABT-263-ə nisbətən davamlı K562 hüceyrələrində 10 µM Dpep + 2 µM ABT-263 ilə təxminən %80 hüceyrə itkisi görülmüşdür.

Dpep + decitabine + ABT-263 üçlü kombinasiyalarında da hüceyrə xəttindən asılı dozalar istifadə edilərək araşdırılan bütün əsas hüceyrə xətlərində hüceyrə sayında %90-dan çox azalma yaradan ən azı bir kombinasiya müəyyən edilmişdir. Altı xəttin beşində ən azı bir üçlü kombinasiya üçün əhəmiyyətli sinerji görülmüş; MOLM-14-də isə sinerji istiqamətində statistik meyl bildirilmişdir. Buna qarşılıq ABT-263 + decitabine ikilisi K562 istisna olmaqla sınaqdan keçirilən hüceyrə xətlərində əhəmiyyətli sinerji göstərməmişdir. Bu nəticə üçlü kombinasiyalardakı təsirin yalnız ABT-263 ilə decitabine-in bir-birinin təsirini gücləndirməsindən ibarət olmadığını dəstəkləyir.

Tədqiqatın mühüm hissəsi dərman davamlılığına ayrılmışdır. HCT116 hüceyrələri in vitro şəraitdə 5 µM-dan başlayıb 10, 15 və 20 µM-a yüksəldilən Dpep təzyiqi altında seçilərək davamlı hala gətirilmiş; bu hüceyrələrin Dpep IC50 dəyəri təxminən 20 µM-dan >40 µM-a yüksəlmişdir. Buna baxmayaraq, Dpep + ABT-263 və Dpep + decitabine kombinasiyaları davamlı HCT116 hüceyrələrində güclü sinerjik cavab yaratmış və üçlü kombinasiyalarla davamlı hüceyrə sayında %90-dan çox azalma verən şərtlər tapılmışdır. A375 melanoma hüceyrələrindən in vivo Dpep və ya Dpep123 müalicəsi altında yenidən böyüyən şişlərdən törədilmiş iki fərqli davamlı hüceyrə xəttində də oxşar şəkildə kombinasiya müalicələri Dpep davamlılığını aşa bilmişdir.

Siçan melanoma xenograft təcrübəsində Dpep və ABT-263 ayrı-ayrılıqda şiş böyüməsini yavaşlatmış və sağqalımı uzatmış; kombinasiya isə hər iki monoterapiyadan daha güclü şiş basqılanması və daha uzun sağqalım təmin etmişdir. Dpep + ABT-263 qrupunda 10 siçanın 4-ü 60 günlük müalicənin sonuna çatmışdır. Müalicə daha sonra dayandırılmış və heyvanlar daha 30 gün izlənmişdir; 60-cı gündə sağ olan heyvanlarda izləmənin sonunda palpasiya və ya histologiya ilə şiş aşkar edilməmişdir. Məqalənin Highlights bölməsi bu nəticəni dırnaq içində “%40 cure rate” adlandırsa da, bu ifadə yalnız həmin siçan xenograft təcrübəsinə aiddir və insanlarda klinik sağalma nisbəti kimi şərh edilə bilməz.

Tədqiqat Dpep-in klinik müalicə kimi insanlarda effektiv və ya təhlükəsiz olduğunu göstərmir. Nude mouse xenograft modeli tam immun sisteminə malik deyil; yalnız bir şiş növü Dpep + ABT-263 kombinasiyası ilə in vivo sınaqdan keçirilmiş və xəstə şişlərindən birbaşa əldə edilmiş nümunələr araşdırılmamışdır. Tədqiqatın nəticəsi kombinasiyaların preklinik baxımdan daha ətraflı araşdırılmağa dəyər olduğunu dəstəkləyir; insanlarda sübut edilmiş müalicə effektivliyini göstərmir.

Tədqiqatın əsas problemi nədir?

Xərçəng hüceyrələrinin böyüməsi yalnız bir siqnal yolundan asılı deyil. Hüceyrə yaşamını dəstəkləyən transkripsiya proqramları, anti-apoptotik zülallar və epigenetik dəyişikliklər eyni vaxtda işə düşə bilər. Bu vəziyyət tək hədəfli müalicə başlanğıcda effektiv olsa belə, zamanla davamlılığın inkişafına səbəb ola bilər.

Dpep daha əvvəl bir çox şiş hüceyrəsi tipində böyümə və sağqalımı basqılayan eksperimental peptid kimi hazırlanmışdır. Bununla belə, əvvəlki tədqiqatlar Dpep müalicəsinin bəzi şişləri uzun müddət basqılamasına baxmayaraq, şişlərin bir hissəsinin davam edən müalicə altında yenidən böyüyə bildiyini göstərmişdir. Bu vəziyyət Dpep davamlılığının da digər xərçəng müalicələrində görülən davamlılıq problemi kimi araşdırılmalı olduğunu göstərir.

Bu tədqiqatın iki əsas sualı var:

1. Dpep başqa antixərçəng agentləri ilə birləşdirildikdə təkbaşına gözləniləndən daha güclü, yəni sinerjik təsir yarada bilərmi?
2. Bu kombinasiyalar Dpep-ə davamlılıq inkişaf etdirən xərçəng hüceyrələrini də basqılaya bilərmi?

Dpep Nədir və ATF5, CEBPB ilə CEBPD-ni Necə Hədəfləyir?

Dpep hüceyrə daxilinə keçidi təmin edən penetratin ardıcıllığını CEBPD-nin leucine-zipper bölgəsindən törədilmiş decoy ardıcıllığı ilə birləşdirən və ATF5, CEBPB ilə CEBPD-nin funksional dimerləşməsi ilə rəqabət apararaq bu transkripsiya faktorlarının aktivliyini basqılamaq üçün hazırlanmış eksperimental peptiddir.

ATF5, CEBPB və CEBPD nədir?

ATF5, CEBPB və CEBPD, basic leucine zipper — bZIP ailəsinə aid transkripsiya faktorlarıdır. Transkripsiya faktoru müəyyən genlərin nə qədər ifadə olunacağını tənzimləyən zülaldır.

Bu üç zülal gen ekspressiyasını tənzimləyə bilmək üçün leucine zipper bölgələri vasitəsilə bir-biri ilə və ya öz analoqları ilə dimer yaratmalıdır. Başqa sözlə, iki zülal müəyyən struktur interfeysi vasitəsilə cütləşir və funksional kompleks əmələ gətirir.

Dpep bu struktur zərurətdən istifadə edir. Peptid hədəf zülalların leucine zipper bölgələri ilə qarşılıqlı təsir göstərə bilən “decoy”, yəni saxta cütləşmə tərəfdaşı kimi davranacaq şəkildə hazırlanmışdır. Beləliklə, normal ATF5/CEBPB/CEBPD dimerləşmə şəbəkəsini pozaraq onların transkripsion aktivliyini azaltmaq məqsədi daşıyır.

Hüceyrəyə nüfuz edən peptid nə deməkdir?

Zülal və ya peptidlərin çoxu hüceyrə membranını öz-özünə effektiv şəkildə keçə bilmir. Dpep-in N-terminal hissəsində yerləşən penetratin ardıcıllığı peptidin hüceyrə daxilinə çata bilməsini dəstəkləyən cell-penetrating motiv funksiyasını yerinə yetirir.

Bu səbəbdən Dpep iki funksional hissənin birləşməsi kimi düşünülə bilər:

• hüceyrə daxilinə girişi təmin edən penetratin bölgəsi,
• ATF5/CEBPB/CEBPD leucine zipper qarşılıqlı təsirlərini hədəfləyən decoy bölgəsi.

Tədqiqatda istifadə olunan peptidlərin ardıcıllıqları

Peptidlər %10 glycerol olan PBS pH 7,2 içində həll edilmiş, 2 mM aliquotlar şəklində −80 °C-də saxlanmış və təcrübələrdə lazım olan konsentrasiyalara durulaşdırılmışdır.

Dpepmut təcrübəsi niyə vacibdir?

Bir peptidin xərçəng hüceyrələrinin sayını azaltması təkbaşına hədəflənən leucine zipper mexanizminin düzgün olduğunu sübut etmir; peptidin başqa, spesifik olmayan təsirləri də ola bilər.

Bu səbəbdən tədqiqatçılar leucine zipper qarşılıqlı təsirinin kritik amin turşularını pozan Dpepmut-dan istifadə etmişlər. T98G hüceyrələrində Dpepmut təkbaşına Dpep-lə müqayisədə çox daha aşağı aktivlik göstərmiş və ABT-263 ilə sinerji yaratmamışdır.

Müəlliflər bu nəticəni Dpep + ABT-263 sinerjisinin tam ortaya çıxması üçün leucine zipper strukturunun vacib olduğuna və təsirin yalnız ümumi və ya təsadüfi peptid təsiri ilə izah edilə bilməyəcəyinə dəstək kimi şərh edirlər.

Bu təcrübə güclü spesifiklik kontrolu olsa da, bütün mümkün off-target mexanizmləri təkbaşına istisna edən əhatəli molekulyar xəritələmə deyil.

ABT-263 niyə kombinasiya tərəfdaşı kimi seçildi?

ABT-263, digər adı ilə navitoclax, pro-survival BCL2 ailəsindəki BCL2, BCLXL və BCL-W/BCL2L2 zülallarını hədəfləyən BH3-mimetic bir birləşmədir.

Apoptosis hüceyrənin proqramlaşdırılmış ölüm mexanizmidir. Xərçəng hüceyrələri BCL2 ailəsi kimi anti-apoptotik zülallardan istifadə edərək ölüm siqnallarına müqavimət göstərə bilər.

Əvvəlki Dpep tədqiqatlarında pro-apoptotik BMF-nin artdığı və survivin/BIRC5 kimi yaşamı dəstəkləyən zülalların azaldığı bildirilmişdir. Tədqiqatçılar buna görə Dpep-in hüceyrəni apoptosis istiqamətinə yönəltdiyi mühitdə BCL2 ailəsinin ABT-263 ilə əlavə olaraq basqılanmasının daha güclü hüceyrə ölümünə səbəb ola biləcəyini nəzərdə tutmuşlar.

Lakin mövcud tədqiqat bu “apoptotic threshold” izahını ətraflı molekulyar təcrübələrlə birbaşa sübut etməmişdir. Müzakirə bölməsində bu mexanizm açıq şəkildə bir hipotez və bioloji əsaslandırma kimi təqdim olunur.

Decitabine niyə kombinasiya tərəfdaşı kimi seçildi?

Decitabine, DNA methylation səviyyəsini azalda bilən hypomethylating agentdir. Xərçəng hüceyrələrində bəzi şiş basqılayıcı və pro-apoptotik genlərin hypermethylation səbəbindən susdurulması müalicə davamlılığına töhfə verə bilər.

Dpep-ə davamlı A375 hüceyrələrinin transcriptome müqayisəsində müxtəlif şiş basqılayıcı genlərin aşağı tənzimləndiyi və bu genlərin mühüm hissəsinin ədəbiyyatda hypermethylation ilə əlaqəli olduğu görülmüşdür. Bu müşahidə decitabine-in Dpep ilə kombinasiyası üçün bioloji əsas vermişdir.

Lakin tədqiqat davamlı hüceyrələrdə hər bir genin methylation vəziyyətini birbaşa ölçərək “decitabine məhz bu geni demetilləşdirərək davamlılığı qırdı” şəklində mexanistik zəncir göstərməmişdir.

Bu Tədqiqatda Sinerji Nə Deməkdir?

Sinerji iki və ya üç agentin birlikdə yaratdığı hüceyrə azaldıcı təsirin, agentlər bir-birindən müstəqil hərəkət etsə gözlənilən birləşmiş təsirdən daha güclü olmasıdır; tədqiqat bunu əsasən Bliss independence modeli ilə, Dpep/Bpep–ABT-263 üçün isə əlavə olaraq Chou–Talalay əsaslı CompuSyn isobologramları ilə qiymətləndirmişdir.

Bliss independence yanaşması

Mənbə Bliss modelindən istifadə edir, lakin onu tənlik şəklində yazmır. Aşağıdakı ifadə yalnız metodun necə işlədiyini öyrətmək üçün verilən standart konseptual təqdimatdır; tədqiqatın yeni nəticəsi deyil.

İki müalicədən sonra sağ qalan hüceyrə fraksiyaları 0 ilə 1 arasında \(V_A\) və \(V_B\) olarsa, agentlərin bir-birindən müstəqil işləməsi halında gözlənilən birləşmiş sağqalım təxminən:

\[ V_{A+B,\mathrm{beklenen}}=V_A\times V_B \]

şəklində ifadə olunur.

Məsələn, A müalicəsindən sonra hüceyrələrin %60-ı və B müalicəsindən sonra %50-si qalırsa, müstəqillik altında gözlənilən birgə sağqalım:

\[ 0{,}60\times0{,}50=0{,}30 \]

yəni %30 olur.

Əgər əslində kombinasiyadan sonra bundan nəzərəçarpacaq dərəcədə az hüceyrə sağ qalırsa, təsir yalnız iki müstəqil təsirin üst-üstə düşməsi ilə izah edilə bilməyəcək qədər güclüdür və sinerji lehinə qiymətləndirilir.

Mənbə qrafiklərindəki xətli sütunlar bu müstəqillik fərziyyəsi ilə hesablanan gözlənilən hüceyrə saylarını göstərir. Statistik ulduzlar bir çox paneldə müşahidə olunan kombinasiya nəticəsi ilə bu gözlənilən müstəqil dəyər arasındakı fərqi müqayisə edir.

Chou–Talalay isobologramı nədir?

Tədqiqat T98G və MCF7 hüceyrələrində Dpep/Bpep ilə ABT-263 kombinasiyalarını əlavə olaraq CompuSyn 1.0 proqramı və Chou–Talalay median-effect metodu ilə təhlil etmişdir.

İsobologramda eyni bioloji təsiri təmin edən iki dərmanın müxtəlif doza kombinasiyaları həndəsi şəkildə göstərilir. Məqalənin istifadə etdiyi normalized isobologram şərhində nöqtələrin diaqonal müstəqil/additiv istinad xəttinin solunda yerləşməsi sinerji ilə uyğundur.

Mənbə konkret combination-index dəyər cədvəli bildirmir; buna görə Verianla mənbədə olmayan CI rəqəmləri yaratmır.

IC50 nə deməkdir?

IC50, araşdırılan təcrübə şəraitində bir agentin ölçülən hüceyrə cavabını təxminən %50 azaldan konsentrasiyasıdır. Bu tədqiqatda hüceyrələr 5–6 gün müalicə edilmiş və qalan hüceyrələrin sayı qiymətləndirilmişdir.

Bu səbəbdən burada IC50 birbaşa insanda müalicə dozası demək deyil. Hüceyrə kulturasında istifadə edilən µM vahidində mühit konsentrasiyasıdır.

Hüceyrə canlılığı niyə metabolik test əvəzinə sayımla ölçüldü?

Tədqiqatçılar solid-tumor mənşəli hüceyrələrdə hemocytometer və ya Countess II avtomatik hüceyrə sayğacından istifadə etmişlər. Bunun səbəbi daha əvvəl Dpep-in hüceyrə metabolizmasını dəyişdirdiyinin müşahidə olunmasıdır. Metabolik aktivliyə əsaslanan bəzi viability assay-ləri hüceyrə əslində yaşamağa davam etdiyi halda metabolik vəziyyət dəyişdiyi üçün yanlış şərh edilə bilər.

K562 və MOLM-14 kimi suspenziya hüceyrələrində isə Trypan Blue istifadə edilərək canlı və ölü hüceyrələr birbaşa ayrılmışdır.

Mənbənin tərifinə görə canlılıq faizinin əsas məntiqi:

\[ \text{Canlılık (\%)}= \frac{\text{canlı hücre sayısı}} {\text{toplam hücre sayısı}} \times100 \]

şəklindədir.

“WT” burada nə deməkdir?

Məqalədə istifadə olunan WT — wild type ifadəsi bu kontekstdə əsasən Dpep davamlılığı üçün xüsusi seçilməmiş başlanğıc xərçəng hüceyrə xətlərini davamlı törəmələrdən ayırmaq üçün istifadə olunur. “WT” burada hüceyrələrin normal və ya xərçəngsiz olduğu demək deyil; bunların hamısı xərçəng mənşəli hüceyrə xətləridir.

“Liquid tumor” nə deməkdir?

Mənbənin “liquid tumor” ifadəsi K562 və MOLM-14 kimi hematoloji malignitet mənşəli hüceyrələri bildirir. K562 xroniki miyeloid leykemiya, MOLM-14 isə kəskin miyeloid leykemiya modelidir. “Maye şiş” ifadəsi fiziki olaraq maye şiş kütləsi demək deyil.

Dpep Davamlılığı Necə Yaradıldı və Necə Aşıldı?

Tədqiqat Dpep davamlılığını iki fərqli yolla modelləşdirmişdir: HCT116 hüceyrələri laboratoriyada getdikcə artan Dpep konsentrasiyalarına məruz qoyularaq in vitro seçilmiş, A375 davamlı hüceyrələri isə Dpep və ya Dpep123 altında yenidən böyüyən siçan melanoma xenograftlarından əldə edilmişdir; hər iki modeldə Dpep-in ABT-263 və/və ya decitabine ilə kombinasiyası davamlı hüceyrələri təkbaşına Dpep-dən daha güclü basqılamışdır.

HCT116 davamlılıq modeli

HCT116 hüceyrələri əvvəlcə 5 µM Dpep-ə məruz qoyulmuşdur. Sağ qalan hüceyrələr yenidən sabit proliferasiyaya çatdıqca doza ardıcıl olaraq 10, 15 və 20 µM-a qaldırılmışdır.

Paralel kontrol kultura eyni müddət ərzində eyni pasaj şərtlərində saxlanmış, lakin Dpep əvəzinə %10 glycerol/PBS daşıyıcı almışdır.

Əldə edilən davamlı HCT116 hüceyrələri daha sonra 10 µM Dpep olan mühitdə saxlanmışdır.

Kontrol HCT116 hüceyrələrində Dpep IC50 təxminən 20 µM olduğu halda davamlı hüceyrələrdə >40 µM olmuşdur. Bu, hüceyrələrin Dpep-ə həssaslığının nəzərəçarpacaq dərəcədə azaldığını göstərir.

Bununla yanaşı, davamlı HCT116 hüceyrələrinin ABT-263 və decitabine-ə həssaslığı kontrol hüceyrələrinə təxminən bənzər qalmışdır. Dpep + ABT-263 və Dpep + decitabine kombinasiyaları davamlı hüceyrələrdə yenidən güclü sinerji yaratmış; uyğun üçlü kombinasiyalarla hüceyrə sayı %90-dan çox azaldıla bilmişdir.

A375 in vivo davamlılıq modeli

İkinci davamlılıq modeli birbaşa siçanlarda böyüyən A375-ATCC melanoma şişlərindən törədilmişdir.

Dpep və ya C-terminalından 10 amin turşusu qısaldılmış aktiv Dpep123 forması ilə müalicə edilən xenograftlar başlanğıcda basqılanmış, lakin uzun müalicədən sonra bəzi şişlər yenidən böyümüşdür.

Bu şişlərdən kulturlar yaradılaraq:

• A375 Dpep-resistant#1,
• A375 Dpep-resistant#2

xətləri əldə edilmişdir.

Daşıyıcı ilə müalicə edilmiş siçanların şişlərindən isə müqayisə üçün A375 Dpep-responsive#1 və A375 Dpep-responsive#2 kulturları yaradılmışdır.

Hər iki davamlı A375 xəttinin Dpep IC50 dəyəri təxminən 40 µM və ya daha yüksək olduğu halda, decitabine və ABT-263 həssaslıqları başlanğıc hüceyrələrinə daha yaxın qalmışdır.

Dpep-in ABT-263 və/və ya decitabine ilə kombinasiyası bu iki davamlı A375 xəttində də sinerjik cavab göstərmiş və üçlü kombinasiyalarla %90-dan çox hüceyrə itkisi yaradan şərtlər tapılmışdır.

Transcriptome müqayisəsi davamlılıq haqqında nə göstərdi?

Tədqiqatçılar yeni RNA sequencing aparmaq əvəzinə əvvəllər yayımlanmış Plate-seq məlumat dəstini yenidən təhlil etmişlər. A375 Dpep-resistant#1 ilə A375 Dpep-responsive#1 hüceyrələrinin Dpep müalicəsindən əvvəlki və 20 µM Dpep ilə 48 saatlıq müalicədən sonrakı transcriptomları müqayisə edilmişdir.

Davamlılıq Dpep-ə verilən bütün molekulyar cavabların itməsi şəklində inkişaf etməmişdir. A375-ATCC və responsive hüceyrələrdə Dpep-ə cavab verən 37 genin 21-i davamlı hüceyrələrdə də ümumilikdə bənzər cavab göstərmişdir.

Dpep verilməzdən əvvəl resistant və responsive hüceyrələr arasında 200-dən çox diferensial ifadə olunan gen müəyyən edilmiş və bunların təxminən %70-i davamlı hüceyrələrdə daha aşağı ifadə olunmuşdur.

Bundan əlavə, Dpep müalicəsindən əvvəl fərqli olan və yalnız responsive hüceyrələrdə Dpep-ə cavab verərək fərqi daha da artıran 26 gen müəyyən edilmişdir; bunların 20-si davamlı hüceyrələrdə aşağı tənzimlənmişdir.

Davamlı hüceyrələrdə yuxarı tənzimlənmiş genlər arasında ədəbiyyatda oncogene kimi tanınmış 8 gen, aşağı tənzimlənmiş genlər arasında isə tumor suppressor kimi tanınmış 14 gen olmuşdur.

Müəlliflər bu nümunəni Dpep davamlılığının bir hissəsinin pro-survival oncogenic proqramların artması və apoptosis-i dəstəkləyə bilən tumor-suppressor proqramların azalması ilə əlaqəli ola biləcəyinə dəstək kimi şərh edirlər.

Lakin transcriptome müqayisəsi yalnız bir A375 responsive/resistant cütü üçün ətraflı aparılmışdır. Buna görə bu genetik/epigenetik nümunənin bütün Dpep-davamlı xərçənglərdə ortaq mexanizm olduğunu demək olmaz.

NK-92MI təcrübəsi niyə aparıldı?

Natural killer — NK hüceyrələri malign hüceyrələri öldürə bilən anadangəlmə immun sistemi hüceyrələridir. Tədqiqatçıların əvvəlki işi Dpep ilə əvvəlcədən müalicə edilmiş şiş hüceyrələrinin NK-92MI hüceyrələrinin öldürücü təsirinə daha həssas hala gəldiyini göstərmişdir.

Bu tədqiqatda HCT116 hüceyrələri 48 saat ərzində:

• 20 µM Dpep,
• 20 µM Dpep + 1 µM ABT-263,
• 20 µM Dpep + 1 µM decitabine

şərtlərində əvvəlcədən müalicə edilmişdir.

Daha sonra NK-92MI hüceyrələri effector-to-target nisbəti 2,5:1 olacaq şəkildə əlavə edilmiş və eyni dərman şərtlərində daha 24 saat birgə kultura edilmişdir.

ABT-263 və decitabine əvvəlcədən müalicələri təkbaşına HCT116 hüceyrələrini NK-92MI öldürməsinə qarşı Dpep-ə bənzər şəkildə həssaslaşdırmışdır. Dpep + ABT-263 və Dpep + decitabine əvvəlcədən müalicələri isə agentlərin müstəqil təsirlərindən gözləniləndən daha güclü həssaslaşdırma göstərmişdir.

1 µM decitabine və ya ABT-263-ün NK-92MI hüceyrələrinin özləri üzərindəki 24 saatlıq təsiri müvafiq olaraq təxminən %92 ± 2 canlılıq (N=6) və %100 ± 4 (N=3) kimi bildirilmişdir.

NK-92MI hüceyrələrinin decitabine ilə birbaşa əvvəlcədən müalicəsi HCT116 öldürmə nəticəsini əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdirmədiyi üçün müəlliflər decitabine-in həssaslaşdırıcı təsirinin NK hüceyrəsindən çox HCT116 şiş hüceyrəsi tərəfində baş verdiyini şərh etmişlər.

Bu nəticə yalnız HCT116 + NK-92MI sistemi üçün göstərilmişdir; başqa şişlərdə və ya canlı orqanizmdə endogenous NK hüceyrələri ilə eyni təsirin yarandığı bu tədqiqatda göstərilməmişdir.

Tədqiqatın Metodu və Nəticələri

Hüceyrə kulturası şərtləri

A375-ATCC, HCT116, T98G, MCF7 və metod bölməsində bildirilən digər adherent hüceyrələr DMEM + %10 FBS + 100 U/mL penicillin–streptomycin mühitində 37 °C və %5 CO2 şəraitində saxlanmışdır. K562 və MOLM-14 hüceyrələri RPMI 1640 + %10 FBS + penicillin–streptomycin mühitində eyni temperatur və CO2 şəraitində yetişdirilmişdir.

Müvafiq hüceyrələr mycoplasma baxımından test edilmiş və kontaminasiya olmadığı təsdiqlənmişdir.

Mənbədaxili hüceyrə siyahısı qeydi: Cell Culture bölməsi T98G, A375-ATCC, HCT116, MDA-MB-231 və MCF7 hüceyrələrini sadalayarkən, Cell Viability bölməsindəki siyahı eyni kontekstdə T98G, A375-ATCC, HCT116 əvəzinə A549 adını da ehtiva edir. A549 əsas nəticə şəkillərində yenidən istifadə edilmir; MDA-MB-231 isə Dpep123 təcrübəsində görünür. Bu fərq mənbədə ayrıca izah edilməmişdir.

Hüceyrə canlılığı təcrübələri

Hüceyrələr 96-well lövhələrə əkilmiş və gecə boyunca standart mühitdə saxlanmışdır. Daha sonra mühit %2 FBS olan DMEM və ya RPMI ilə dəyişdirilmiş və Dpep, ABT-263, decitabine və ya onların kombinasiyaları əlavə edilmişdir.

Əsas hüceyrə canlılığı təcrübələrində müalicə müddəti ümumilikdə 5–6 gündür.

Solid-tumor hüceyrələrinin qalan sayı hemocytometer və ya Countess II avtomatik cell counter ilə müəyyən edilmişdir. K562 və MOLM-14 hüceyrələri Trypan Blue exclusion ilə sayılmışdır.

Tək agentlərə verilən cavablar

MOLM-14-ün ABT-263-ə digər hüceyrələrdən çox daha həssas olması kombinasiya təcrübəsində lazım olan ABT-263 dozasının da çox daha aşağı olmasını izah edir.

Dpep + decitabine ikili kombinasiyası

Əhəmiyyətli sinerji:

• A375-ATCC,
• HCT116,
• T98G,
• MCF7,
• K562

hüceyrələrində müşahidə edilmişdir.

MOLM-14 üçün sinerji istiqamətində meyl bildirilmiş, lakin eyni statistik dəqiqlik səviyyəsinə çatılmamışdır.

A375-ATCC, HCT116, T98G və MCF7-də 10–40 µM Dpep ilə 0,5–2 µM decitabine kombinasiyaları vasitəsilə hüceyrələrin %90-dan çoxu aradan qaldırıla bilmişdir.

K562-də 10 µM Dpep + 0,5 µM decitabine və MOLM-14-də 10 və ya 20 µM Dpep + 1 µM decitabine ilə %80-dən çox hüceyrə itkisi görülmüşdür.

Dpep + ABT-263 ikili kombinasiyası

Bu kombinasiya araşdırılan altı əsas hüceyrə xəttinin hamısında əhəmiyyətli sinerjik aktivlik göstərmişdir.

Altı xəttin dördündə 20–40 µM Dpep + 1–2 µM ABT-263 kombinasiyaları hüceyrə sayını %90-dan çox azaltmışdır.

MOLM-14:

20 µM Dpep + 10 nM ABT-263 → %90-dan çox hüceyrə itkisi.

K562:

10 µM Dpep + 2 µM ABT-263 → təxminən %80 hüceyrə itkisi.

T98G və MCF7-də CompuSyn isobologramları da sinerjik qarşılıqlı təsiri dəstəkləmişdir.

Müalicə ardıcıllığı vacib idimi?

A375-ATCC hüceyrələri üçün iki protokol müqayisə edilmişdir:

1. 20 µM Dpep + 1 µM ABT-263 ilə tam 5 günlük birgə müalicə,
2. əvvəlcə 2 gün 20 µM Dpep, sonra 3 gün 20 µM Dpep + 1 µM ABT-263.

İki protokol arasında əhəmiyyətli effektivlik fərqi tapılmamışdır. Bu təcrübə N=3 şərti ilə aparılmışdır.

Bpep nəticəsi

Bpep Dpep-dən fərqli leucine zipper ardıcıllığına malik olsa da, eyni ATF5/CEBPB/CEBPD hədəf qrupuna yönəlib. Bpep + ABT-263 kombinasiyası T98G və MCF7 hüceyrələrində Dpep-ə bənzər sinerjik davranış göstərmişdir.

Bu nəticə hədəf transkripsiya faktoru şəbəkəsinin kombinasiya cavabındakı əhəmiyyətini dəstəkləyir; lakin Dpep və Bpep-in bütün molekulyar təsirlərinin eyni olduğu demək deyil.

ABT-263 + decitabine təkbaşına sinerjik idimi?

Ümumilikdə xeyr. K562 istisna olmaqla sınaqdan keçirilən hüceyrə xətlərində ABT-263 + decitabine ikilisi əhəmiyyətli sinerji göstərməmişdir.

Bu müqayisə vacibdir; çünki Dpep ehtiva edən üçlü kombinasiyaların güclü təsirinin yalnız ABT-263 ilə decitabine-in onsuz da öz-özlüyündə güclü sinerji yaratmasından qaynaqlanmadığını göstərir.

Üçlü Dpep + ABT-263 + decitabine müalicəsi

Üçlü kombinasiyanın təsiri hüceyrə xəttindən və dozadan asılıdır.

Araşdırılan bütün əsas hüceyrə xətlərində uyğun doza kombinasiyası seçildikdə hüceyrə sayında %90-dan çox itki yaradan şərt müəyyən edilmişdir.

Altı xəttin beşində ən azı bir üçlü kombinasiya əhəmiyyətli sinerji göstərmiş, MOLM-14 isə statistik əhəmiyyət istiqamətində meyl göstərmişdir.

Mənbə, hüceyrələrin %90-dan çoxunun aradan qalxdığı bəzi təcrübələrdə geridə çox az hüceyrə qaldığı üçün kombinasiyalar arasındakı fərqin statistik əhəmiyyətə çatmasının çətinləşə bildiyini də qeyd edir.

Dpep123 təcrübəsi

Dpep123 Dpep-in C-terminalından 10 amin turşusu qısaldılmış aktiv formasıdır. A375-ATCC, T98G və MDA-MB-231 hüceyrələrində Dpep123 üçün dose–response təcrübələri aparılmışdır.

Bundan əlavə, A375-ATCC xenograft daşıyan siçanlarda vehicle və ya 10 mg/kg Dpep123 tətbiq edilmişdir. Bu kiçik təcrübədə hər qrup N=3-dür. Mənbə şiş böyüməsi üçün p=0,042, sağqalım üçün p=0,0495 bildirir.

Bu təcrübə Dpep123-ün bioloji aktivliyini dəstəkləyir; kiçik N=3 dizaynı geniş təhlükəsizlik və ya effektivlik ümumiləşdirməsi üçün kifayət deyil.

Siçan Xenograft Təcrübəsindəki “%40 Sağalma” İfadəsi Əslində Nə Deməkdir?

Məqalənin Highlights bölməsində dırnaq içində verilən “%40 cure rate” ifadəsi Dpep + ABT-263 verilən 10 nude siçanın 4-nün 60 günlük müalicənin sonuna şişlə bağlı etik sonlanıma çatmadan gəlməsi və sağ qalan heyvanlarda müalicə dayandırıldıqdan sonrakı 30 günlük izləmənin sonunda palpasiya və ya histologiya ilə şiş aşkar edilməməsi deməkdir; bu, insanlarda %40 klinik sağalma nisbəti deyil.

Siçan modeli necə quruldu?

6–8 həftəlik dişi NCR nude siçanların flank bölgələrinə 1 × 10⁶ A375-ATCC melanoma hüceyrəsi subkutan olaraq inyeksiya edilmişdir.

Şiş həcmi 100–200 mm³-ə çatdıqda heyvanlar müalicə qruplarına randomizə edilmişdir.

Dpep + ABT-263 kombinasiya tədqiqatında siçanların flank bölgələrində ümumilikdə üç ayrı A375 xenograft yaradılmışdır.

Şiş həcmi necə hesablandı?

Mənbə şiş həcmini aşağıdakı düsturla hesablamışdır:

\[ V= \frac{\text{uzunluk}\times\text{genişlik}^{2}}{2} \]

Burada \(V\), mm³ vahidində təxmini şiş həcmidir. Uzunluq və en xaricdən ölçülən iki əsas şiş ölçüsüdür.

Düstur iki caliper ölçməsindən şiş həcmini təxmini izləməyə imkan verir; bu, şişin həqiqi üçölçülü həndəsəsinin birbaşa görüntüləmə ilə tam həcm rekonstruksiyası deyil.

Müalicə qrupları

*Mənbədaxili doza uyğunsuzluğu: Metod bölməsi və Şəkil 10 izahı Dpep üçün 20 mg/kg yazır. Nəticələr bölməsinin 3.6 hissəsindəki tək bir cümlədə 20 µg/kg yazılmışdır. Burada iki ayrı mənbə nöqtəsində üst-üstə düşən 20 mg/kg dəyəri göstərilmiş, ziddiyyət ayrıca qorunmuşdur.

İki müstəqil təcrübə aparılmış və hər təcrübənin başlanğıcında ümumilikdə qrup başına 5 heyvan istifadə edilmişdir. Vehicle qrupundakı bir heyvanda şiş əmələ gəlmədiyi üçün həmin heyvan çıxarılmış və yekun vehicle N=9 olmuşdur.

Hər hansı tək bir şiş 1000 mm³ etik sonlanım həcminə çatdıqda müvafiq siçana euthanasia tətbiq edilərək survival analizində sonlanım kimi qəbul edilmişdir.

In vivo şiş böyüməsi və sağqalım nəticələri

Dpep və ABT-263 monoterapiyaları şiş böyüməsini vehicle ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə yavaşlatmış və survival müddətini uzatmışdır.

Kombinasiya şiş böyüməsini həm Dpep, həm də ABT-263 təkbaşına müalicələrindən daha güclü şəkildə basqılamışdır.

60-cı günlük müalicənin sonuna Dpep monoterapiya qrupunda 2/10, Dpep + ABT-263 kombinasiya qrupunda isə 4/10 siçan çatmışdır.

60-cı gündə sağ olan heyvanlarda palpasiya edilə bilən şiş aşkar edilməmişdir. Müalicələr dayandırılmış və heyvanlar daha 30 gün izlənmişdir. Mənbə bu heyvanlarda izləmənin sonunda palpasiya və ya histologiya ilə şiş görülmədiyini və şişlərin eradikasiya olunmuş göründüyünü bildirir.

Mənbə həmçinin Dpep, ABT-263 və ya kombinasiyanın heyvanların orta bədən çəkisinə nəzərəçarpacaq təsir etmədiyini və aşkar yan təsir müşahidə olunmadığını bildirir.

Lakin bədən çəkisinin dəyişməməsi əhatəli toksikoloji analiz deyil. Orqan toksikliyi, hematoloji toksiklik, farmakokinetik təhlükəsizlik və ya insan təhlükəsizliyi bu təcrübədən çıxarıla bilməz.

Statistik təhlillər

Mənbə ümumi hüceyrə kulturası təcrübələrinin müstəqil şəkildə üç təkrar olaraq aparıldığını və nəticələrin orta ± SEM kimi verildiyini bildirir. Şəkillərdəki N dəyərləri eksperimental şərtə görə ayrıca göstərilmişdir.

Əsas testlər:

• iki quyruqlu Student t-testi: hüceyrə kulturası müqayisələri,
• Mann–Whitney testi: Dpep123 və Dpep/ABT-263 xenograft şiş böyüməsi müqayisələri,
• Kaplan–Meier: survival əyriləri,
• log-rank testi: survival əyriləri arasındakı fərq,
• Bliss independence: dərman kombinasiyalarının müstəqillik gözləntisinə görə sinerji qiymətləndirilməsi,
• CompuSyn 1.0 / Chou–Talalay: seçilmiş Dpep/Bpep + ABT-263 kombinasiyalarının isobologram təhlili.

Statistik əhəmiyyət üçün p < 0,05 həddi istifadə edilmişdir.

Tədqiqatın dəstəklədiyi nəticələr

• Dpep araşdırılan altı əsas xərçəng hüceyrə xəttinin hamısında hüceyrə böyüməsini/sağqalımını basqılamışdır.
• Dpep + ABT-263 kombinasiyası altı əsas hüceyrə xəttinin hamısında sinerjik təsir göstərmişdir.
• Dpep + decitabine kombinasiyası beş əsas hüceyrə xəttində əhəmiyyətli sinerji, MOLM-14-də isə sinerji istiqamətində meyl göstərmişdir.
• Uyğun üçlü Dpep + ABT-263 + decitabine kombinasiyaları araşdırılan bütün əsas hüceyrə xətlərində hüceyrə sayında %90-dan çox azalma yarada bilmişdir.
• Dpep-ə in vitro seçilmiş HCT116 və in vivo şişdən törədilmiş A375 davamlı hüceyrələrində kombinasiya müalicələri Dpep monoterapiyasından daha effektiv olmuşdur.
• Dpepmut-un ABT-263 ilə sinerji yaratmaması tam Dpep aktivliyində leucine zipper strukturunun vacib olduğunu dəstəkləyir.
• Bpep + ABT-263 sinerjisi eyni hədəf transkripsiya faktoru şəbəkəsindən istifadə edən fərqli decoy peptidin də kombinasiya təsiri göstərə bildiyini dəstəkləyir.
• Dpep + ABT-263 A375 xenograft siçan modelində hər iki monoterapiyadan daha güclü şiş böyüməsi basqılanması və survival təmin etmişdir.
• Kombinasiya qrupunda 4/10 heyvan 60 günlük son nöqtəyə çatmış və müalicəsiz əlavə 30 günlük müşahidədə sağ qalan heyvanlarda şiş aşkar edilməmişdir.

Tədqiqatın dəstəkləmədiyi nəticələr

• Dpep-in insanlarda effektiv xərçəng müalicəsi olduğu sübut edilməmişdir.
• Dpep + ABT-263 kombinasiyasının insanlarda %40 sağalma təmin edəcəyi deyilə bilməz.
• Tədqiqat klinik faza I, II və ya III sınağı deyil.
• Siçanlarda bədən çəkisinin dəyişməməsi insanlarda və ya heyvanlarda əhatəli təhlükəsizlik sübutu deyil.
• Dpep kombinasiyalarının bütün xərçəng növlərində eyni şəkildə işləyəcəyi göstərilməmişdir.
• Transcriptome nəticələri bütün Dpep davamlılıq mexanizmlərinin eyni olduğunu göstərmir.
• Dpep + ABT-263 sinerjisinin dəqiq molekulyar mexanizmi həll edilməmişdir.
• Decitabine-in hansı spesifik tumor-suppressor genlərini demethylate edərək Dpep davamlılığını qırdığı birbaşa göstərilməmişdir.
• NK-92MI həssaslaşdırma nəticəsi yalnız HCT116 sistemi ilə göstərilmiş; canlı orqanizmdə endogenous NK hüceyrələri ilə təsdiqlənməmişdir.
• Cell-line-derived nude mouse xenograft modeli insan şiş heterogenliyini və tam immun mikroətrafı yenidən yaratmır.
• Xəstə şişlərindən yeni əldə edilmiş primer hüceyrələr və ya patient-derived xenograft modelləri bu tədqiqatda istifadə edilməmişdir.

Tədqiqatın əsas məhdudiyyətləri

Kombinasiya tərəfdaşlarının əhatəsi: Tədqiqat əsasən ABT-263 və decitabine üzərində cəmlənmişdir. BCL2 ailəsini hədəfləyən başqa agentlər və alternativ hypomethylating dərmanlar qiymətləndirilməmişdir.

Mexanizmin təhlili məhduddur: Tədqiqatın əsas məqsədi effektiv kombinasiyaları müəyyən etmək olduğuna görə molekulyar sinerji mexanizmləri dərindən sınaqdan keçirilməmişdir.

Davamlılıq modellərinin sayı məhduddur: Yalnız məhdud sayda Dpep-resistant hüceyrə xətti yaradılmışdır.

Transcriptome müqayisəsi məhduddur: Gen tənzimlənməsi fərqləri ətraflı şəkildə yalnız bir A375 responsive/resistant cütündə müqayisə edilmişdir.

In vivo əhatə məhduddur: Resurslar yalnız A375 melanoma və Dpep + ABT-263 kombinasiyası ilə əhatəli xenograft təcrübəsinə imkan vermişdir.

Nude mouse modeli: Cell-line-derived xenograft modeli endogenous insan şişlərinin heterogenliyini, tam şiş mikroətrafını və tam host immune response-u əks etdirmir.

Xəstə materialı yoxdur: Təzə xəstə şişindən əldə edilmiş hüceyrələr və ya xəstə mənşəli xenograftlar sınaqdan keçirilməmişdir.

NK təcrübəsi məhduddur: Dpep/ABT-263/decitabine ilə NK-92MI həssaslaşdırılması yalnız HCT116 hüceyrələrində araşdırılmışdır.

Klinik doza ekvivalentliyi göstərilməmişdir: Tədqiqatçılar ABT-263 və decitabine üçün seçilən kultura konsentrasiyalarının ədəbiyyatdakı insan serum səviyyələri ilə uyğun sərhədlərdə saxlandığını müzakirə edirlər; lakin bu hal Dpep kombinasiyasının insanlarda təhlükəsiz, effektiv və ya eyni farmakodinamik davranışı göstərəcəyini sübut etmir.

Gələcək tədqiqatlar

Müəlliflərin təklif etdiyi növbəti mərhələlərə müxtəlif BCL2-family inhibitorlarının və alternativ hypomethylating agentlərin Dpep ilə sınaqdan keçirilməsi, sinerjinin molekulyar mexanizminin ətraflı araşdırılması, daha çox müstəqil davamlı hüceyrə xəttinin yaradılması və transcriptome təhlilinin genişləndirilməsi daxildir.

Heyvan tərəfdə bir neçə şiş növünün, orthotopic modellərin, patient-derived xenograft materialının və tam immun sisteminə malik syngeneic modellərin istifadəsi təklif olunur.

Bundan əlavə, təzə xəstə şişlərindən əldə edilən heterogen materiallarda kombinasiyaların sınaqdan keçirilməsi və Dpep-in NK hüceyrələrinə qarşı yaratdığı həssaslaşdırmanın in vivo şəraitdə həm NK-92MI, həm də endogenous NK hüceyrələri ilə araşdırılması tələb olunur.

Mənbə və Metod Qeydi

Orijinal başlıq: Dpep, a Cell-Penetrating Peptide Targeting ATF5, CEBPB and CEBPD, Synergistically Combines with ABT-263 and Decitabine to Inhibit Cancer Cell Growth and Overcome Dpep Resistance

Müəlliflər: Qing Zhou; Trang Thi Thu Nguyen; James M. Angelastro; Markus D. Siegelin; Lloyd A. Greene.

Müəllif sırası: Mənbədə yuxarıdakı ardıcıllıqla verilmişdir.

Bərabər töhfə / bərabər birinci müəlliflik: Mənbədə göstərilməmişdir.

Məsul müəllif: Lloyd A. Greene.

Məsul müəllif e-poçtu: lag3@cumc.columbia.edu

Qurum 1: Department of Pathology and Cell Biology, Vagelos College of Physicians & Surgeons, Columbia University Irving Medical Center, New York, USA.

Qurum 2: Ronald O. Perelman Department of Dermatology, Perlmutter Cancer Center, NYU Grossman School of Medicine, NYU Langone Health, New York, USA.

Qurum 3: Department of Molecular Biosciences, School of Veterinary Medicine, University of California Davis, Davis, USA.

Jurnal: Cells.

Bölmə: Cellular Pathology.

Nəşriyyat: MDPI.

Cild / nömrə / məqalə no: 15(9), 826.

DOI: 10.3390/cells15090826.

Göndərilmə: 7 aprel 2026.

Reviziya: 24 aprel 2026.

Qəbul: 27 aprel 2026.

Nəşr: 1 may 2026.

Academic Editor: Alessandro Poggi.

Mənbə növü: Orijinal tədqiqat məqaləsi; əsasən in vitro xərçəng hüceyrəsi kombinasiya tədqiqatı və məhdud preklinik mouse xenograft təsdiqləməsi.

Resenziya: Cells resenziyalı jurnaldır. Jurnalın cari rəsmi siyasəti single-anonymized peer review istifadə edildiyini və peer review mərhələsinə keçən tədqiqatlar üçün ən azı iki rəyçi hesabatı toplandığını bildirir.

Lisenziya: Creative Commons Attribution 4.0 — CC BY 4.0.

Preprint vəziyyəti: Mənbə PDF ayrıca preprint qeydi göstərmir. Hədəfli biblioqrafik yoxlamada eyni başlıq üçün ayrıca preprint qeydi aşkarlanmamışdır.

Açar sözlər: cancer; anti-cancer; cell-penetrating peptide; Dpep; Bpep; ABT-263; decitabine; overcoming resistance; apoptosis; combination therapy.

Əsas eksperimental məqsəd: Dpep-in ABT-263 və decitabine ilə kombinasiyalarının müxtəlif şiş hüceyrələrində sinerji yaradıb-yaratmadığını və Dpep davamlılığını aşıb-aşmadığını qiymətləndirmək.

Əsas xərçəng hüceyrə xətləri: A375-ATCC; HCT116; T98G; MCF7; K562; MOLM-14.

Əlavə istifadə olunan hüceyrə xətti: MDA-MB-231, Dpep123 xarakterizasiyasında.

Mənbədaxili hüceyrə xətti hesabat fərqi: Cell Culture bölməsində MDA-MB-231 sadalanarkən Cell Viability siyahısının bir sətrində A549 yer alır; A549 əsas nəticələrdə yenidən görünmür.

Hüceyrə kulturası temperaturu: 37 °C.

CO2: %5.

Əsas müalicə müddəti: 5–6 gün.

Cell viability ölçümü: Solid-tumor hüceyrələrində hemocytometer və ya Countess II ilə birbaşa hüceyrə sayımı; K562 və MOLM-14-də Trypan Blue exclusion.

Synergy metodları: Bliss independence; seçilmiş Dpep/Bpep + ABT-263 təcrübələrində CompuSyn 1.0 və Chou–Talalay median-effect isobologramları.

Statistika: Two-tailed Student's t-test; in vivo şiş böyüməsi üçün Mann–Whitney; survival üçün Kaplan–Meier və log-rank.

Əhəmiyyət həddi: p < 0,05.

GraphPad Prism: 10.4.2.

R: 4.1.2.

Dpep-resistant HCT116 yaradılması: 5 → 10 → 15 → 20 µM Dpep ilə stepwise in vitro selection; davamlı hüceyrələr daha sonra 10 µM Dpep olan mühitdə saxlanmışdır.

A375 davamlılıq modeli: Dpep və ya Dpep123 altında yenidən böyüyən A375-ATCC mouse xenograftlarından kultura yaradılması.

Transcriptome məlumat mənbəyi: Əvvəllər yayımlanmış Plate-seq məlumat dəsti; GEO accession GSE244579.

NK modeli: NK-92MI.

NK co-culture nisbəti: E:T = 2,5:1.

NK təcrübəsində HCT116 əvvəlcədən müalicəsi: 48 saat Dpep və/və ya ABT-263/decitabine, sonra eyni agentlərin iştirakı ilə NK-92MI ilə 24 saat.

In vivo model: 6–8 həftəlik dişi NCR nude siçanlarda A375-ATCC subkutan melanoma xenograftı.

İnokulum: 1 × 10⁶ A375-ATCC hüceyrəsi.

Randomizasiya şiş həcmi: 100–200 mm³.

Dpep + ABT-263 tədqiqatı: Ümumilikdə hər siçan üçün üç flank bölgəsində xenograft.

Vehicle: %10 glycerol/PBS.

Dpep dozası: Metod və Şəkil 10 izahında 20 mg/kg, intraperitoneal, həftədə üç dəfə.

Mənbədaxili Dpep doza uyğunsuzluğu: Nəticələr 3.6 mətnindəki tək cümlədə 20 µg/kg yazılmışdır. Mənbədə bu fərq izah edilməmişdir.

ABT-263 dozası: 50 mg/kg, intraperitoneal, həftədə üç dəfə.

Müalicə müddəti: 60 günə qədər.

Etik şiş sonlanımı: Hər hansı tək bir şişin 1000 mm³-ə çatması.

Əlavə izləmə: 60-cı gündə sağ qalan siçanlarda müalicə dayandırıldıqdan sonra 30 gün.

Kombinasiya sağqalımı: 4/10 siçan 60 günlük müalicənin sonuna çatmışdır.

Dpep monoterapiya sağqalımı: 2/10 siçan 60 günlük müalicənin sonuna çatmışdır.

“40% cure rate” şərh məhdudiyyəti: Məqalənin Highlights bölməsində dırnaq içində istifadə olunan ifadədir; siçan xenograft modelindəki davamlı sağqalım/şiş aşkar edilməməsi nəticəsini bildirir və insan klinik sağalma nisbəti deyil.

Heyvan etik təsdiqi: Columbia University IACUC, protocol AC-AABU1656; təsdiq 28 dekabr 2022.

Informed consent: Tətbiq edilmir; insan iştirakçılı tədqiqat deyil.

Məlumatların əlçatanlığı: İstinad RNA-seq tədqiqatının xam və işlənmiş məlumatları GEO GSE244579 altında; mövcud tədqiqatın xam məlumatları Supplementary File S2-də verilir.

Supplementary File S1: A375 Dpep-resistant#1 və Dpep-responsive#1 transcriptome müqayisələri.

Supplementary Figure S1: Dpep + decitabine və ya Dpep + ABT-263 əvvəlcədən müalicəsinin HCT116 hüceyrələrini NK-92MI öldürməsinə sinerjik şəkildə həssaslaşdırması.

Maliyyələşdirmə: NIH R01NS083795 (J.M.A.), R01NS113793 (M.D.S.), R21NS137660 (M.D.S.) və R01NS072050 (L.A.G.).

Maraqların toqquşması / əqli mülkiyyət: J.M.A. və L.A.G., Bpep və Dpep-i təsvir edən patentdə ixtiraçı kimi göstərilmişdir. J.M.A., Q.Z. və L.A.G., Dpep123-ü təsvir edən patent müraciətində ixtiraçı kimi göstərilmişdir. Müəlliflər maliyyələşdirən tərəflərin tədqiqatın dizaynında, məlumatların toplanmasında, təhlildə, şərhdə, məqalənin yazılmasında və ya nəşr qərarında rol oynamadığını bildirirlər.

Müəllif töhfələri: Conceptualization: Q.Z., M.D.S., L.A.G.; validation: Q.Z.; formal analysis: Q.Z., L.A.G.; investigation: Q.Z., T.T.T.N., J.M.A.; resources: J.M.A., M.D.S.; data curation: Q.Z., L.A.G.; original draft: L.A.G.; review/editing: bütün müəlliflər; visualization: Q.Z., L.A.G.; supervision və project administration: L.A.G.; funding acquisition: J.M.A., M.D.S., L.A.G.

Əsas klinik məhdudiyyət: Dpep və ya Dpep kombinasiyaları bu tədqiqatda insanlarda sınaqdan keçirilməmişdir.

Əsas model məhdudiyyəti: Nude mouse cell-line-derived xenograft modeli insan şiş heterogenliyini, orthotopic mikroətrafı və tam host immune system-i təmsil etmir.

Əsas mexanizm məhdudiyyəti: Dpep + ABT-263 və Dpep + decitabine sinerjisinin ətraflı molekulyar mexanizmi bu tədqiqatda birbaşa həll edilməmişdir.