Histolojik iskeletleştirme (skeletonization), ikili bir görüntüdeki nesneleri temel bağlantı ve topolojik yapılarını mümkün olduğunca koruyarak bir piksel genişliğindeki çizgisel temsillere indirgeyen bir bilgisayarlı görü yöntemidir. Bu retrospektif gözlemsel araştırma, hematoksilen-eozin (H&E) ile boyanmış dijital histoloji görüntülerinde skeletonization kullanarak diffüz büyük B hücreli lenfomanın (Diffuse Large B-Cell Lymphoma, DLBCL) iki boyutlu topolojik heterojenliğini incelemiştir. Çalışmada 110 DLBCL olgusu ve karşılaştırma için 43 reaktif lenfoid doku olgusu olmak üzere toplam 153 hasta değerlendirilmiştir.

İlk bakışta önemli görünen iki sonuç aslında farklı karşılaştırmalara aittir. DLBCL dokusunun ortalama skeletonization alanı reaktif lenfoid dokudan daha düşüktür: 5665,20 ± 1012,82'ye karşı 6341,16 ± 548,23; fark p < 0,001'dir. Ancak yalnız DLBCL olguları kendi içlerinde karşılaştırıldığında yüksek skeletonization grubunun genel sağkalımı düşük skeletonization grubundan daha kötüdür. Yüksek skeletonization için raporlanan hazard değeri 2,484'tür; %95 güven aralığı 1,362–4,531 ve p = 0,003'tür.

Yüksek skeletonization aynı zamanda ilk iki yıl içinde ölüm, daha yüksek Epstein–Barr virüsü EBER pozitifliği, daha yüksek histolojik entropy ve bazı protein belirteçlerinin daha düşük düzeyleriyle ilişkili bulunmuştur. Düşük skeletonization grubunda ilk iki yıl içinde ölüm 9/45 (%20), yüksek skeletonization grubunda 28/65 (%43,1) olarak raporlanmıştır. EBER pozitifliği ise değerlendirilebilir olgularda sırasıyla 4/44 (%9,1) ve 24/64 (%37,5) olmuştur.

Gen ekspresyonu yalnız 30 DLBCL olgusundan oluşan bir alt kümede değerlendirilmiştir. Bu alt kümede 18 yüksek ve 12 düşük skeletonization olgusu vardır. Yüksek skeletonization grubunda 166 immüno-onkoloji geni, düşük grupta ise 8 gen daha yüksek ekspresyon göstermiştir. Yüksek skeletonization grubuyla ilişkili analizlerde CD274 (PD-L1), NFKB1A, CD68, CSF1R, CCR5, ITGAM ve TGFB1 gibi genler ile IL6–JAK–STAT3, inflamatuvar yanıt, TNF/NFKB, KRAS, apoptoz ve makrofaj fonksiyonlarıyla ilişkili gen kümeleri öne çıkmıştır.

Bu sonuçlar skeletonizationın DLBCL'de histolojik heterojenliği nicelleştirmek ve prognostik araştırmalarda değerlendirmek için potansiyel bir görüntü özelliği olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte çalışma tek merkezli, retrospektif ve sınırlı sayıda olguya dayanmaktadır. Yüksek/düşük skeletonization ayrımında kullanılan sayısal eşik açıkça raporlanmamıştır; bağımsız dış doğrulama ve prospektif klinik kullanım gösterilmemiştir. Bu nedenle skeletonization bugün bu araştırmaya dayanarak tek başına tanı, tedavi seçimi veya bireysel hasta prognozu veren klinik bir test olarak yorumlanamaz.

Diffüz büyük B hücreli lenfoma hangi problemi oluşturuyor?

Diffüz büyük B hücreli lenfoma (DLBCL), büyük neoplastik B lenfositlerin diffüz proliferasyonuyla karakterize, morfolojik ve klinik açıdan heterojen bir lenfomadır. Aynı DLBCL tanı kategorisi içindeki olgular hücre morfolojisi, moleküler özellikler, immünofenotip ve klinik davranış bakımından birbirinden farklı olabilir. Bu heterojenlik, yalnız hücrelerin hangi proteinleri ifade ettiğini veya hangi gen değişikliklerini taşıdığını değil, histolojik dokunun görüntü üzerinde nasıl organize olduğunu da araştırmayı anlamlı hale getirir.

Çalışmanın temel yaklaşımı, patolog tarafından görülebilen mikroskobik karmaşıklığın bir bölümünü bilgisayarlı görü kullanarak sayısal bir topolojik özelliğe dönüştürmektir. Araştırmacılar daha önce DLBCL histolojisindeki rastgelelik ve doku karmaşıklığını entropy ile incelemişlerdir. Bu çalışmada ise farklı bir topolojik özellik olan skeletonization değerlendirilmiştir.

Histolojik Skeletonization Nedir?

Histolojik skeletonization, H&E görüntüsünün ikili görüntüye dönüştürülmesinden sonra görüntüdeki foreground yapıları bir piksel genişliğinde çizgisel bir topolojik iskelete indirgeyen görüntü işleme işlemidir; bu çalışmada amaç tümör miktarını doğrudan ölçmek değil, hücresel sınırlar ve mikroçevre bileşenleriyle oluşan iki boyutlu çizgisel ağın yoğunluğunu bir görüntü özelliği olarak nicelleştirmektir.

Skeletonizationın temel fikrini anlamak için önce “topoloji” kavramını ayırmak gerekir. Topoloji yalnız bir nesnenin büyüklüğüyle ilgilenmez; nesnenin bağlantıları, dallanmaları, boşlukları ve yapısal organizasyonuyla da ilgilenir. İki boyutlu skeletonization işleminde kalın bir görüntü nesnesi merkez çizgisine doğru inceltilirken nesnenin temel bağlantı düzeninin korunması amaçlanır.

Kaynak, skeletonization işleminin nesneleri bir piksel genişliğindeki eğri çizgilere indirdiğini ve topolojiyi ve Euler karakteristiğini korumayı hedeflediğini belirtmektedir. Euler karakteristiği, bir şeklin bağlantılı bileşenleri ve içindeki boşluklar gibi topolojik özelliklerini özetleyen matematiksel bir büyüklüktür. Burada önemli olan, skeletonization işleminin görüntüyü yalnız küçültmemesi; bağlantı yapısını temsil eden daha yalın bir çizgisel yapıya dönüştürmesidir.

Çalışmanın histoloji yorumunda skeleton çizgileri yalnız neoplastik B hücrelerini temsil etmez. Hücresel sınırlar yanında lenfositler, nötrofiller, nekrotik hücreler, apoptozdaki hücreler ve ekstraselüler matriks içindeki başka yapılar da üretilen çizgisel karmaşıklığa katkıda bulunabilir. Bu nedenle skeletonization alanı “kanser hücresi sayısı” veya “tümör yüzdesi” ile eş anlamlı değildir.

Görüntüler skeletonization için nasıl hazırlandı?

DLBCL H&E preparatları NanoZoomer S360 tam slayt görüntüleme sistemiyle dijitalleştirilmiş, NDP.view2 ile görüntülenmiş ve her olgudan 200× büyütmede, 150 dpi JPEG görüntüler dışa aktarılmıştır. Görüntüler daha sonra işlem performansını artırmak için 224 × 224 × 3 boyutunda patch'lere bölünmüştür.

Buradaki “224 × 224 × 3” ifadesinde ilk iki sayı piksel cinsinden görüntü yüksekliği ve genişliğini, üçüncü sayı ise RGB görüntünün üç renk kanalını temsil eder. Dolayısıyla başlangıç patch'i renkli bir görüntüdür.

Her patch tıbbi patolog tarafından manuel olarak yeniden değerlendirilmiştir. Aşağıdaki patch'ler dışlanmıştır:

• 224 × 224 × 3 boyutundan farklı olan görüntüler,
• içeriğinin %80'inden azında doku bulunan patch'ler,
• kırılmış, ezilmiş veya başka teknik artefaktlar içeren bölgeler,
• tanısal olmayan alanlar,
• DLBCL örneklerinde nekroz ve normal lenfoid doku bölgeleri.

Complement ve ikili görüntü neden önemlidir?

Skeletonization algoritması hangi piksellerin “nesne”, hangilerinin “arka plan” kabul edildiğini bilmek zorundadır. Kaynak yöntem metni, ilgilenilen yapıların açık arka plan üzerindeki koyu çizgiler olduğunu ve skeletonization için foreground'un mantıksal olarak beyaz/1, arka planın siyah/0 olması gerektiğini belirtmektedir. Bu nedenle yöntem açıklamasında özgün gri görüntünün complement'inin kullanıldığı ifade edilir.

Kaynak içi uygulama tutarsızlığı: Makalenin Tablo 1'inde yayımlanan MATLAB kod parçalarında rgb2gray, imbinarize ve bwskel çağrıları görünmesine rağmen açık bir imcomplement adımı görünmemektedir. Verianla bu boşluğu yeni kod yazarak kapatmamaktadır. Makalenin metinsel yöntem tarifi ve yayımlanan kodun bu noktada tam olarak örtüşmediği açıkça korunmalıdır.

Pruning neden önemli bir yöntem ayrıntısıdır?

Skeletonization sonrasında bazı görüntülerde ana iskeletten çıkan çok kısa yan dallar veya “spur” yapıları kalabilir. Bazı uygulamalarda bu küçük dallar temizlenerek skeleton sadeleştirilir; buna pruning denir. Bu çalışmada pruning uygulanmamıştır. Dolayısıyla kısa yan dallar da ölçülen skeleton yapısında kalmıştır.

Bu tercih önemlidir; çünkü skeletonization alanını oluşturan piksel yapısı küçük dalları da içerebilir. Başka bir araştırmacı aynı görüntülere pruning uygularsa aynı alan değerlerini elde edeceği varsayılamaz.

Skeletonization alanı nasıl hesaplandı?

MATLAB'da skeletonize edilmiş görüntü üzerinde regionprops(...,"Area") uygulanmış ve elde edilen bölgelerin alanları toplanmıştır. Kaynaktaki kodun matematiksel işlevi öğretici olarak şu biçimde ifade edilebilir:

\[ A_{\mathrm{skel}}=\sum_{k=1}^{m}A_k \]

Burada \(A_{\mathrm{skel}}\) tek görüntü patch'i için toplam skeletonization alanını, \(A_k\) regionprops tarafından tanımlanan \(k\). skeleton bölgesinin görüntü alanını ve \(m\) bulunan bölgelerin sayısını gösterir.

Bu denklem kaynakta numaralandırılmış bir matematik denklemi değildir; yayımlanan MATLAB kodundaki sum([stats.Area]) işleminin öğretici matematiksel gösterimidir.

Birim açısından kritik nokta: Makale skeletonization değerlerini fiziksel mm² veya µm² birimiyle raporlamamaktadır. Dolayısıyla 5665 veya 6341 gibi değerler doğrudan gerçek doku yüzey alanı şeklinde okunmamalıdır. Bunlar kaynak görüntü işleme pipeline'ının ürettiği görüntü-temelli alan değerleridir.

Skeleton çizgileri bir piksel genişliğine indirildiği için yüksek skeletonization alanı genel olarak görüntüde daha fazla veya daha yoğun çizgisel skeleton yapısı bulunduğunu gösterir. Bununla birlikte değer saf bir geometrik “toplam çizgi uzunluğu” metriği olarak tanımlanmamıştır; çalışmanın kullandığı değişken regionprops alan toplamıdır.

4-connectivity ve 8-connectivity arasındaki fark nedir?

Kaynak, son analizde kullanılan bwskel ile test edilen bwmorph(...,"skel") yaklaşımının farklı bağlantı tanımları kullandığını belirtmektedir. Dört bağlantılı bir piksel komşuluğunda temel komşular yukarı, aşağı, sağ ve soldaki piksellerdir; sekiz bağlantılı komşulukta çapraz dört piksel de komşuluk kapsamına girer. Bağlantı tanımı, hangi piksellerin aynı yapının parçası sayıldığı ve dolayısıyla skeleton geometrisinin nasıl oluştuğu üzerinde etkili olabilir.

Kaynak, son analiz için yalnız bwskel fonksiyonunu kullanmıştır. MATLAB sürümü R2026a Update 4 (26.1.0.3312084) olarak raporlanmıştır.

DLBCL Reaktif Dokudan Daha Düşük Skeletonization Gösterirken DLBCL İçinde Yüksek Skeletonization Nasıl Kötü Prognozla İlişkili Olabilir?

Bunlar aynı karşılaştırma değildir: ilk sonuç DLBCL tanı grubunu reaktif lenfoid dokuyla karşılaştırırken, ikinci sonuç yalnız 110 DLBCL olgusunu kendi içlerinde düşük ve yüksek skeletonization gruplarına ayırır; dolayısıyla “DLBCL genel olarak daha düşük” bulgusu ile “DLBCL içinde göreli olarak yüksek değer daha kötü sağkalımla ilişkili” bulgusu birbirine matematiksel veya biyolojik olarak ters değildir.

Reaktif lenfoid doku ortalaması 6341,16 ± 548,23, DLBCL ortalaması 5665,20 ± 1012,82'dir. DLBCL değerleri 3396,12 ile 8176,94 arasında değişmiş ve medyan 5591,65 olarak bildirilmiştir. Bu geniş dağılım, DLBCL olgularının birbirleriyle aynı topolojik yapıya sahip olmadığını gösterir.

Bu sonuç DLBCL'yi reaktif dokudan ayırmak için klinik olarak doğrulanmış bir tanı eşiği sunmamaktadır. Çalışma grup düzeyindeki dağılımları karşılaştırmıştır.

Yüksek ve düşük skeletonization grupları nasıl oluşturuldu?

Kaynak 110 DLBCL olgusunun 45'ini düşük skeletonization (%40,9), 65'ini yüksek skeletonization (%59,1) olarak sınıflandırmaktadır. Ancak yöntem ve sonuç metninde bu sınıflandırmayı oluşturan açık bir sayısal eşik veya karar kuralı raporlanmamıştır.

DLBCL medyanının 5591,65 olarak verilmesi, yüksek/düşük ayrımının medyanla yapıldığının kanıtı değildir. Zaten medyan bölmesi uygulanmış olsaydı iki grubun yaklaşık eşit büyüklükte olması beklenebilirdi; gözlenen 45/65 dağılımı tek başına hangi eşik yönteminin kullanıldığını ortaya koymaz. Bu nedenle Verianla herhangi bir cutoff değeri üretmemektedir.

Yüksek Skeletonization DLBCL'de Sağkalım Açısından Ne Anlama Geliyor?

Bu çalışmadaki DLBCL serisinde yüksek skeletonization grubu düşük gruba göre daha kötü genel sağkalımla ilişkili bulunmuştur; Kaplan–Meier/log-rank karşılaştırmasında p = 0,002, Cox analizinde raporlanan HR/Exp(B) yaklaşık 2,48 ve %95 güven aralığı 1,362–4,531'dir, ancak bu ilişki tek başına skeletonizationın ölüme neden olduğunu veya bireysel hastanın geleceğini kesin olarak belirlediğini göstermez.

Kaplan–Meier eğrisi neyi ölçüyor?

Kaplan–Meier yöntemi, takip süresi boyunca olay gerçekleşmeden hayatta kalma olasılığını tahmin eder. Bu çalışmada olay ölüm, başlangıç zamanı ise tanı ve biyopsi zamanıdır. Hastanın son takipte hayatta olması durumunda gözlem sansürlenebilir; yani o noktaya kadar hayatta olduğu bilinmesine rağmen sonrasındaki gerçek olay zamanı bilinmez.

Kaynak Şekil 4'te yüksek skeletonization grubunun sağkalım eğrisi daha hızlı düşmektedir. Log-rank testi iki sağkalım eğrisinin tüm takip süresi boyunca istatistiksel olarak farklı olup olmadığını değerlendirir ve p = 0,002 sonucu raporlanmıştır.

Verianla bu eğriyi yeniden çizmemektedir; çünkü kaynak bireysel hasta zamanlarını veya Kaplan–Meier basamaklarını sayısal tablo halinde vermemektedir. Görsel eğriden ara zaman noktaları okuyup yeni veri üretmek bilimsel olarak uygun olmaz.

Hazard ratio 2,484 ne demektir?

Cox modelindeki hazard ratio (HR), belirli bir anda olayın gerçekleşme hızının gruplar arasındaki göreli oranını ifade eder. Kaynak “hazard risk” terimini de kullanmaktadır; Cox tablolarında ise sütun HR (Exp(B)) biçimindedir.

HR = 2,484 değeri, modelin koşulları altında yüksek skeletonization grubundaki anlık ölüm hazardının düşük skeletonization grubunun yaklaşık 2,48 katı olarak tahmin edildiğini ifade eder. Bu ifade “yüksek skeletonization hastaların %148 daha fazlasını kesin öldürür” veya “ölüm olasılığı 2,48 kat olur” anlamına gelmez.

%95 güven aralığı 1,362–4,531'dir. Aralığın 1'i içermemesi, bu analizde grup farkının istatistiksel anlamlılığıyla uyumludur. Ancak aralığın genişliği tahminin büyüklüğünde önemli belirsizlik bulunduğunu da gösterir.

Cox hazard ratio yorumunun temel istatistiksel çerçevesinde orantılı hazard varsayımı önemlidir. Kaynak, incelenen bölümlerde bu varsayım için ayrı bir diagnostik test raporlamamaktadır; bu nedenle Verianla varsayımın ayrıca doğrulandığını iddia etmemektedir.

İlk iki yılda ölüm sonucu

Bu tablo gözlemsel bir ilişkiyi gösterir. Skeletonization, hastalara uygulanan bir müdahale değildir; dolayısıyla yüksek skeletonizationın ilk iki yıl içindeki ölüme neden olduğu sonucu çıkarılamaz.

Çok değişkenli Cox analizi neden önemlidir?

Tek değişkenli bir sağkalım ilişkisi başka prognostik faktörlerle karışabilir. Bu nedenle araştırmacılar International Prognostic Index (IPI), Hans hücre kökeni sınıflandırması, EBER ve skeletonization değişkenlerini birlikte içeren Cox modeli kurmuştur.

Bu modelde skeletonization katsayısı istatistiksel anlamlılığını korumuştur. Bu nedenle kaynak, skeletonizationın prognostik ilişkisinin IPI, Hans sınıflandırması ve EBER ile birlikte modellendiğinde de devam ettiğini bildirmektedir.

Ancak “bağımsız prognostik ilişki” ifadesi nedensel bağımsızlık veya klinik olarak doğrulanmış yeni bir prognostik test anlamına gelmez. Yalnız modele dahil edilen değişkenler kontrol edildiğinde skeletonization katsayısının sıfırdan farklı kaldığını ifade eder.

Entropy ile skeletonization aynı şeyi mi ölçüyor?

Hayır. Entropy görüntüdeki düzensizlik veya rastgelelik dağılımını istatistiksel olarak özetleyen bir görüntü özelliğidir; skeletonization ise ikili görüntünün topolojik çizgisel ağını temsil eder. Bu iki ölçüm birbirinden farklıdır.

Çalışmada skeletonization ile histolojik entropy arasında pozitif fakat sınırlı büyüklükte bir korelasyon bulunmuştur:

\[ r=0{,}28,\quad n=109,\quad p=0{,}003 \]

\(r=0,28\) değeri, iki değişkenin aynı ölçüm olmadığını; ancak artışlarının belirli ölçüde birlikte hareket ettiğini gösterir.

Entropy ve skeletonizationın birlikte yer aldığı Cox modelinde kaynak Tablo 9 şu değerleri vermektedir:

Kaynak içi tutarlılık notu: Bu tablonun hemen öncesindeki metin her iki p değerini “<0,001” şeklinde tanımlamaktadır; ancak yayımlanan Tablo 9'da değerler 0,004 ve 0,003'tür. Verianla sayısal tabloda yayımlanan değerleri aynen korumakta ve bu farkı sessizce düzeltmemektedir.

İmmünohistokimya nasıl nicelleştirildi?

Çalışmada birçok protein belirteci otomatik immunohistochemistry yöntemleriyle değerlendirilmiştir. Bazı boyamalar başlangıçta 0, +1, +2 ve +3 şeklinde ordinal yoğunluk kategorileriyle incelenmiş, daha sonra Fiji/ImageJ kullanılarak pozitif hücre oranını nicelleştirmek için dijital görüntü analizi yapılmıştır.

Kaynakta kullanılan hesaplama:

\[ Pozitiflik\;(\%)= \frac{\text{DAB-pozitif pikseller}} {\text{tüm pikseller}} \times100 \]

DAB, immunohistochemistry'de antikor hedefinin bulunduğu bölgelerde kahverengi reaksiyon ürünü oluşturarak pozitif alanların görüntü üzerinde tanımlanmasını sağlayan kromojenik işaretleme sistemidir.

Formüldeki pay pozitif kabul edilen piksel sayısını, payda değerlendirmeye alınan toplam piksel sayısını gösterir. Sonucun 100 ile çarpılması oranı yüzdeye dönüştürür.

Hans sınıflandırması nasıl oluşturuldu?

Çalışmada DLBCL'nin hücre kökenini immunohistochemistry üzerinden yaklaşık olarak sınıflandırmak amacıyla Hans algoritması kullanılmıştır. Algoritma CD10, BCL6 ve MUM1 ekspresyonunu birlikte değerlendirir. Kaynakta neoplastik B lenfositlerin %30'dan fazlasının pozitif olması ilgili işaretleyicinin pozitif kabul edilmesi için kullanılan eşiktir.

Bu sınıflandırma olguları GCB ve non-GCB gruplarına ayırır. Araştırmacılar kötü prognozla ilişkili yüksek skeletonization grubunun non-GCB ile de ilişkili olabileceğini değerlendirmiş, ancak böyle bir ilişki bulunmamıştır: low grubunda non-GCB 30/44 (%68,2), high grubunda 45/64 (%70,3), p = 0,834.

FISH hangi genleri değerlendirdi?

DNA floresan in situ hibridizasyonu (FISH), MYC, BCL2 ve BCL6 genlerine yönelik break-apart problarla gen yeniden düzenlenmelerini değerlendirmek için kullanılmıştır. Seride MYC rearrangement 5/94 (%5,3), BCL2 rearrangement 3/93 (%3,2) olarak bulunmuş ve double-hit olgu bulunmamıştır.

Skeletonization grupları arasında MYC ve BCL2 rearrangement durumlarında istatistiksel olarak anlamlı fark raporlanmamıştır.

EBER neyi gösteriyor?

EBER, Epstein–Barr virüsünün ürettiği küçük RNA moleküllerinin doku içinde RNA in situ hybridization ile tespit edilmesidir. Bu nedenle EBER pozitifliği, incelenen tümör dokusunda EBV ilişkisini araştırmak için kullanılan bir belirteçtir.

Bu güçlü ilişkiye rağmen yüksek skeletonization yalnız EBV ile açıklanamaz. Ayrıca kaynak tartışmasında “yüksek skeletonization olgularının %72,5'inin EBV ile ilişkili olmadığı” ifadesi yer almaktadır; fakat tablodaki 24/64 pozitif değeri doğrudan kullanıldığında değerlendirilebilir yüksek grup içindeki EBER-negatif oran %62,5'tir. Bu nedenle Verianla %72,5 değerini kesin bir sonuç olarak yeniden kullanmamaktadır.

Hangi protein belirteçleri yüksek skeletonization ile ilişkiliydi?

Bu sonuçlar protein düzeyinde gözlenen grup ilişkileridir. Örneğin BCL2'nin daha düşük olması, BCL2 gen rearrangement'ının daha düşük olduğu anlamına gelmez; protein ekspresyonu ile gen yeniden düzenlenmesi ayrı ölçümlerdir.

Sürekli skeletonization değerleriyle korelasyon ne gösterdi?

Araştırmacılar high/low grup karşılaştırmasının yanında skeletonization alanını sürekli değişken olarak kullanarak Pearson korelasyonları da hesaplamıştır. Bu iki analiz aynı soruyu sormaz. Grup karşılaştırması iki kategorinin ortalama/dağılım farkını incelerken, korelasyon skeletonization değeri arttıkça belirtecin nasıl değiştiğini değerlendirir.

PD-L1 bu ayrımın iyi bir örneğidir. High/low kategorik karşılaştırmasında PD-L1 ortalamaları 8,5 ± 11,7% ve 15,7 ± 18,3% olmasına rağmen p = 0,235 ile anlamlı değildir. Buna karşılık skeletonization sürekli değişken olarak kullanıldığında PD-L1 ile pozitif korelasyon r = 0,309 ve p = 0,002'dir. Bu iki sonucun birbiriyle “çeliştiğini” söylemek doğru olmaz; kullanılan istatistiksel soru ve bilgi kaybı farklıdır.

Skeletonization ile Gen Ekspresyonu Nasıl İlişkilendirildi?

Gen ekspresyonu tüm 110 DLBCL olgusunda değil, 30 olguluk bir alt kümede NanoString tabanlı pan-cancer immune profiling paneliyle ölçüldü; 18 olgu yüksek ve 12 olgu düşük skeletonization grubundaydı ve analiz yüksek skeletonization grubunda 166, düşük grupta 8 daha yüksek ekspresyonlu immüno-onkoloji geni tanımladı.

RNA nasıl hazırlandı ve hangi panel kullanıldı?

RNA, formalinle fikse parafine gömülü (FFPE) doku kesitlerinden çıkarılmıştır. Kesit kalınlığı 10 µm'dir. RNA ekstraksiyonundan önce histoloji yeniden değerlendirilmiş ve en az %80 neoplastik alan içeren olgular seçilmiştir.

Kalite kontrolünden geçen RNA, nCounter PanCancer Profiling Panel kullanılarak analiz edilmiştir. Panel 730 immüno-onkoloji geni ve 40 housekeeping geni içermektedir.

Housekeeping gen normalizasyonu ne yapıyor?

Housekeeping genler, örnekler arasındaki toplam ölçüm ölçeği farklılıklarını normalize etmek için referans olarak kullanılır. Kaynakta her örnek için housekeeping genlerinin geometrik ortalaması hesaplanmış, her genin sayımı bu ortalamaya bölünmüş ve sonuç log₂ ölçeğine dönüştürülmüştür.

Kaynakta verilen işlem şu biçimdedir:

\[ \log_2\left( \frac{\mathrm{normData}_{g,i}} {\mathrm{hkGeoMean}_{i}} \right) \]

ve ölçekleme katsayısı kullanıldığında:

\[ \log_2\left( \frac{\mathrm{normData}_{g,i}} {\mathrm{hkGeoMean}_{i}} \times SF \right) \]

Burada \(\mathrm{normData}_{g,i}\), \(i\) örneğindeki \(g\) geninin normalize edilmekte olan sayımını; \(\mathrm{hkGeoMean}_{i}\), aynı örneğin housekeeping genlerinin geometrik ortalamasını; \(SF\) ise isteğe bağlı ölçekleme katsayısını ifade eder. Kaynak, ölçekleme faktörünün örnek olarak 1000 gibi bir sabit olabileceğini belirtmektedir.

Log₂ dönüşümü geniş dinamik aralıktaki ekspresyon değerlerini sıkıştırır ve kat değişimlerinin daha dengeli gösterilmesine yardımcı olur. Bu matematiksel dönüşüm bir genin biyolojik olarak aktif olduğunu tek başına kanıtlamaz.

Diferansiyel gen ekspresyonunda ne bulundu?

Düşük skeletonization grubunda daha yüksek ekspresyon gösteren sekiz gen BLNK, TNFRSF13B, CD3EAP, ILF3, CD1C, CD37, POU2F2 ve TLR9 olarak raporlanmıştır.

Yüksek skeletonization grubunun fonksiyonel ağ analizinde DLBCL patogeneziyle ilişkili olduğu belirtilen merkezi genler arasında CD274 (PD-L1), NFKB1A, CD68, CSF1R, CCR5, ITGAM ve TGFB1 yer almıştır.

STRING ağı neyi gösteriyor?

STRING v12.0, yüksek skeletonization grubunda artmış genlerin birbirleriyle bilinen veya tahmin edilen fonksiyonel ilişkilerini ağ biçiminde incelemek için kullanılmıştır. Kaynakta minimum etkileşim skoru 0,4 olarak belirlenmiş, Gene Ontology biological process kategorileri kullanılmış, benzerlik ≥ 0,8 olan terimler gruplanmış ve ağ dört K-means kümesine ayrılmıştır.

Bir genin ağın merkezinde çok sayıda bağlantıya sahip olması, o genin fonksiyonel ağ içinde daha bağlantılı olduğunu gösterir; bu durum tek başına o genin hastalığın nedeni olduğunu kanıtlamaz.

Kaynak Şekil 15'in Gene Ontology zenginleşme kısmında sitokin aracılı sinyal, inflamatuvar yanıt, lökosit kemotaksisi, miyeloid lökosit göçü ve diğer immün hücre göç süreçleri görsel olarak öne çıkmaktadır. Bunlar fonksiyonel zenginleşme sonuçlarıdır; doğrudan hücresel mekanizma deneyleri değildir.

GSEA nedir ve bu çalışmada nasıl uygulandı?

Gen Set Enrichment Analysis (GSEA), tek tek genlerin anlamlılığını bağımsız biçimde değerlendirmek yerine, biyolojik olarak tanımlanmış gen gruplarının sıralanmış gen listesinde belirli bir fenotipin bir tarafında sistematik olarak birikip birikmediğini araştırır.

Çalışmada GSEA 4.4.0 build 18 kullanılmıştır. Temel parametreler:

• 1000 permütasyon,
• phenotype permutation,
• weighted enrichment statistic,
• gen sıralaması için signal-to-noise metriği,
• azalan sıralama,
• maksimum gen seti büyüklüğü 1000,
• minimum gen seti büyüklüğü 10,
• MSigDB Hallmark gen kümeleri.

Yüksek skeletonization grubunda kaynak metninin özellikle vurguladığı zenginleşmeler IL6–JAK–STAT3 signaling, inflammatory response, TNF/NFKB signaling, KRAS signaling, apoptosis ve macrophage function'dır. Kaynak GSEA şekli ayrıca epithelial–mesenchymal transition ve diğer immün/göç ilişkili gen kümelerine ait zenginleşme eğrilerini göstermektedir.

GSEA zenginleşmesi, bu biyolojik süreçlerin her birinin bütün tümör hücrelerinde doğrudan ölçülerek aktif olduğunun kanıtı değildir. Sonuç, gen ekspresyonu sıralamasında ilgili gen kümelerinin sistematik dağılımına dayanan istatistiksel bir zenginleşme analizidir.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Çalışma tasarımı

DLBCL örneklerinin 6 mm tissue microarray core'ları, reaktif dokuların ise whole-tissue örnekleri olarak kullanılması yöntemsel bir örnekleme farkıdır. Kaynak bu farkın skeletonization değerlerine etkisini ayrı bir deneyle ölçmemektedir; dolayısıyla Verianla bunu kanıtlanmış bir yanlılık olarak değil, deney tasarımının bilinmesi gereken bir özelliği olarak kaydetmektedir.

Hastaların temel klinikopatolojik özellikleri

Kaynak tablo notu: Kaynak Tablo 3'te ECOG performans durumu ≥2 için “11/81 (73,6%)” yazmaktadır. 11/81 oranı matematiksel olarak yaklaşık %13,6 olduğundan bu satır kaynak içinde aritmetik olarak tutarsız görünmektedir. Verianla bu nedenle bu yüzdeyi yukarıdaki özet tabloya taşımamıştır.

Test görüntüleriyle algoritmanın kavramsal kontrolü

Araştırmacılar bwskel ile alan ölçümünün artan topolojik karmaşıklığı izleyip izlemediğini sekiz kavramsal test görüntüsünde kontrol etmiştir. Görüntü 1'den 8'e skeletonization alanları sırasıyla:

0, 40, 100, 215, 526, 857, 1786 ve 2603

olarak raporlanmıştır. Bu test gerçek hasta sonuçlarının doğrulama seti değildir; algoritmanın basitten karmaşığa hazırlanmış örnek görüntülerde beklenen yönde alan üretip üretmediğini gösteren kavramsal kontroldür.

DLBCL ile reaktif doku arasındaki temel sonuç

DLBCL skeletonization alanı 3396,12 ile 8176,94 arasında değişmiştir. Ortalama 5665,20 ± 1012,82, medyan 5591,65'tir. Reaktif lenfoid doku ortalaması 6341,16 ± 548,23'tür. Gruplar arasındaki fark p < 0,001'dir.

Bu bulgu “reaktif doku kanserden daha heterojendir” şeklinde tüm biyolojik heterojenlik türlerine genellenmemelidir. Sonuç yalnız bu görüntü pipeline'ıyla ölçülen iki boyutlu skeletonization özelliğine ilişkindir.

Yüksek skeletonization ile klinik değişkenlerin ilişkisi

Yaş, cinsiyet, anatomik yerleşim, tedavi kategorisi, LDH, hastalık evresi, IPI kategorisi, klinik yanıt, yüksek sIL2R ve B semptomları için high/low skeletonization grupları arasında kaynakta anlamlı fark raporlanmamıştır.

Buna karşılık ilk iki yılda ölüm, EBER pozitifliği, CD5, E2F1, BCL2, ISY1 ve TNFAIP8 ile anlamlı ilişkiler bulunmuştur. Bu çoklu karşılaştırmaların tümü aynı biyolojik anlamı taşımaz; her marker'ın hücresel fonksiyonu ve ölçüm biçimi ayrıdır.

MYC ve BCL2 yeniden düzenlenmeleri skeletonizationı açıkladı mı?

Hayır. Yüksek skeletonization grubunda MYC rearrangement 4/52 (%7,7), düşük grupta 1/42 (%2,4) olarak raporlanmış ve p = 0,376 bulunmuştur. BCL2 rearrangement düşük grupta 0/42, yüksek grupta 3/51 (%5,9) olup p = 0,249'dur.

Dolayısıyla bu veri setinde MYC veya BCL2 yeniden düzenlenmesi ile skeletonization grubu arasında istatistiksel anlamlı ilişki gösterilmemiştir. Seride double-hit olgu da bulunmamaktadır.

Kaynakta EBER–skeletonization Cox modeliyle ilgili tutarsızlık

Makalenin tartışma bölümü, EBER ve skeletonizationın birlikte değerlendirildiği Cox analizinde her ikisinin de bağımsız prognostik belirteç olarak kaldığını ifade etmektedir. Ancak yayımlanan Tablo 10'un başlığı “EBER ve skeletonization dahil” şeklinde olmasına rağmen tablonun görünen satırları:

şeklindedir. Tabloda skeletonization satırı görünmediği için bu özel iki değişkenli modelin skeletonization HR ve güven aralığını Verianla tahmin etmeye veya başka tablodan taşıyarak doldurmaya çalışmamaktadır.

Skeletonizationın EBER, IPI ve Hans sınıflandırmasıyla birlikte bulunduğu açıkça raporlanmış çok değişkenli model ise Tablo 8'dir ve orada skeletonization için HR = 2,21, %95 GA 1,08–4,53 ve p = 0,030'dur.

Gen ekspresyonu alt kümesinin özellikleri

30 olguluk gen ekspresyonu alt kümesinin 18'i yüksek skeletonization, 12'si düşük skeletonization grubundadır. Bu alt kümede 23/30 hasta 60 yaş üzerindedir, 18/30 erkektir, Hans sınıflandırmasında 19/30 non-GCB'dir ve değerlendirilebilir 29 olgunun 8'i EBER pozitiftir.

Bu 30 olgunun 21'inde ölüm olayı, 15'inde ilk iki yıl içinde ölüm raporlanmıştır. Bu alt küme tüm 110 DLBCL olgusundan daha küçüktür; gen ekspresyonu sonuçlarının belirsizliği ve genellenebilirliği buna göre değerlendirilmelidir.

Yüksek skeletonization grubundaki moleküler profil

Yüksek skeletonization grubunda 166 immüno-onkoloji geni daha yüksek ekspresyon göstermiştir. Fonksiyonel ağ analizi özellikle CD274, NFKB1A, CD68, CSF1R, CCR5, ITGAM ve TGFB1 gibi bağlanırlığı yüksek ve DLBCL biyolojisiyle ilişkili genleri vurgulamıştır.

GSEA'da IL6–JAK–STAT3 signaling, inflammatory response, TNF/NFKB signaling, KRAS signaling, apoptosis ve macrophage function zenginleşmeleri raporlanmıştır.

Bu sonuçların önemli yorum sınırı, gen ekspresyonu örnekleminin yalnız 30 olgudan oluşmasıdır. Ayrıca “zenginleşme” bir gen setinin sıralı ekspresyon verilerindeki istatistiksel konumunu ifade eder; söz konusu yolun tek başına skeletonizationın nedeni olduğu sonucunu vermez.

İstatistiksel analizlerin özeti

p değeri burada ne anlatıyor?

p değeri, sıfır hipotezi altında gözlenen veya daha uç bir istatistiksel sonucun elde edilme olasılığıyla ilişkilidir. p < 0,05 sınırı bu çalışmada istatistiksel anlamlılık eşiği olarak seçilmiştir.

Ancak küçük p değeri ilişkinin büyük olduğu, klinik açıdan önemli olduğu veya nedensel olduğu anlamına gelmez. Örneğin skeletonization–entropy korelasyonunda p = 0,003 olmasına rağmen korelasyon katsayısı yalnız r = 0,28'dir. Bu nedenle p değeri ile etki büyüklüğü birbirinden ayrılmalıdır.

Çalışmanın desteklediği sonuçlar

• DLBCL, bu görüntü işleme yönteminde reaktif lenfoid dokudan daha düşük ortalama skeletonization alanı göstermiştir.
• DLBCL grubu içinde yüksek skeletonization daha kötü genel sağkalımla ilişkilidir.
• Yüksek skeletonization grubunda ilk iki yıl içinde ölüm oranı daha yüksektir.
• Yüksek skeletonization EBER pozitifliğiyle ilişkilidir.
• Skeletonization ile histolojik entropy arasında pozitif korelasyon vardır.
• Skeletonization ile E2F1, BCL2, ISY1, TNFAIP8 ve bazı diğer protein ölçümleri arasında negatif ilişkiler görülmüştür.
• Sürekli skeletonization değeri PD-L1 ile pozitif korelasyon göstermiştir.
• 30 olguluk gen ekspresyonu alt kümesinde yüksek skeletonization grubu çok daha fazla sayıda artmış immüno-onkoloji geni göstermiştir.
• Yüksek skeletonization grubunda çeşitli inflamatuvar ve immün sinyal gen kümeleri zenginleşmiştir.
• Skeletonizationın sağkalımla ilişkisi IPI, Hans sınıflandırması ve EBER'in birlikte bulunduğu Cox modelinde istatistiksel anlamlılığını korumuştur.

Çalışmanın desteklemediği sonuçlar

• Skeletonizationın DLBCL'ye neden olduğu gösterilmemiştir.
• Yüksek skeletonizationın ölümün doğrudan biyolojik nedeni olduğu gösterilmemiştir.
• Skeletonizationın bugün tek başına klinik tanı veya tedavi seçimi için kullanılabileceği gösterilmemiştir.
• DLBCL ile reaktif doku arasında klinik amaçlı doğrulanmış bir skeletonization cutoff değeri geliştirilmemiştir.
• Yüksek/düşük DLBCL ayrımı için kullanılan sayısal eşik kaynakta açıkça raporlanmamıştır.
• Gen ekspresyonu sonuçları tüm 110 hastada ölçülmemiştir.
• CD274/PD-L1, NFKB1A, CSF1R veya diğer ağ genlerinden herhangi birinin yüksek skeletonizationın tek nedeni olduğu gösterilmemiştir.
• EBV bütün yüksek skeletonization olgularını açıklamamaktadır.
• MYC ve BCL2 rearrangement skeletonization grubuyla anlamlı ilişki göstermemiştir.
• Prospektif veya bağımsız dış kohort doğrulaması bu makalede raporlanmamıştır.
• Skeletonizationın farklı tarayıcılar, laboratuvarlar veya görüntü ön işleme pipeline'larında aynı sayısal cutoff ile çalışacağı gösterilmemiştir.

Yeniden üretilebilirlik açısından açık kalan noktalar

Birinci nokta: Yüksek ve düşük skeletonization ayrımının sayısal cutoff değeri açıkça verilmemiştir.

İkinci nokta: Yöntem metnindeki complement açıklaması ile yayımlanan MATLAB kodu tam olarak örtüşmemektedir.

Üçüncü nokta: Skeletonization alanının fiziksel birimi raporlanmamıştır; değer görüntü alanı metriği olarak sunulmaktadır.

Dördüncü nokta: Kaynak, Cox modellerinin orantılı hazard varsayımına ilişkin ayrı bir diagnostik sonuç bildirmemektedir.

Beşinci nokta: Gen ekspresyonu yalnız 30 olguda bulunmaktadır ve kaynak daha büyük gen ekspresyonu serilerinin gerekli olduğunu açıkça kabul etmektedir.

Altıncı nokta: Kaynak Tablo 9 ve Tablo 10 ile çevre metin arasında bazı sayısal/etiket tutarsızlıkları vardır; bunlar Verianla tarafından sessizce değiştirilmemiştir.

Yedinci nokta: Kaynakta bazı bölümlerde “Ki69”, yöntem ve ilgili immunohistochemistry şekillerinde ise “Ki67” adı kullanılmaktadır. Verianla bunun yeni bir belirteç olduğu varsayımında bulunmaz ve kaynak içi terminolojik tutarsızlık olarak kaydeder.

Çalışmanın klinik anlamı hangi sınırda tutulmalı?

Araştırma, rutin H&E görüntülerinden çıkarılabilecek topolojik bir görüntü özelliğinin DLBCL'nin morfolojik heterojenliği ve sağkalımıyla ilişki taşıyabileceğini göstermesi açısından önemlidir. H&E preparatlarının klinik patolojide zaten yaygın olarak bulunması, böyle görüntü özelliklerinin gelecekte başka klinik ve moleküler değişkenlerle birlikte değerlendirilmesini araştırmaya değer kılar.

Bununla birlikte mevcut çalışma skeletonizationı onaylanmış bir biyobelirteç veya klinik karar sistemi haline getirmemektedir. Bunun için daha büyük ve bağımsız kohortlarda yeniden üretilebilir cutoff belirlenmesi, farklı görüntüleme sistemlerinde teknik doğrulama, önceden tanımlanmış analiz protokolleri ve prospektif değerlendirme gibi ek aşamalar gerekir. Bunlar bu makalede gerçekleştirilmiş sonuçlar değil, mevcut kanıtın klinik uygulamaya dönüşebilmesi için gerekli doğrulama türleridir.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün başlık: High Histological Skeletonization as a Measure of Heterogeneity Is Associated with Poor Overall Survival and Death Within 2 Years of Diffuse Large B-Cell Lymphoma.

Yazarlar: Joaquim Carreras; Yara Yukie Kikuti; Shunsuke Nagase; Giovanna Roncador; Haruka Ikoma; Atsushi Ito; Makoto Orita; Sakura Tomita; Yuki Tanigaki; Akihisa Ueno; Yusuke Kondo; Naoya Nakamura; Yohei Masugi.

Yazar sırası: Kaynaktaki sıra aynen korunmuştur.

Eşit katkı: Kaynakta eşit katkı/eş birinci yazarlık beyanı bulunmamaktadır.

Sorumlu yazar: Joaquim Carreras.

Kurum 1: Department of Pathology, School of Medicine, Tokai University, Isehara, Japan.

Kurum 2: Monoclonal Antibodies Unit, Spanish National Cancer Research Center (CNIO), Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas, Madrid, Spain.

Dergi: Cancers.

Yayıncı: MDPI.

Cilt / sayı / makale numarası: 18 / 17 / 2828.

DOI: 10.3390/cancers18172828.

Gönderim tarihi: 6 Temmuz 2026.

Revizyon tarihi: 11 Ağustos 2026.

Kabul tarihi: 28 Ağustos 2026.

Yayın tarihi: 1 Eylül 2026.

Resmî bağlantı: https://doi.org/10.3390/cancers18172828

Kaynak türü: Hakemli özgün araştırma makalesi; retrospektif gözlemsel dijital histopatoloji, bilgisayarlı görü, immünohistokimya ve gen ekspresyonu çalışması.

Preprint durumu: Kaynak makalede ayrı bir preprint numarası veya önceki preprint sürümü belirtilmemektedir.

Lisans: Creative Commons Attribution (CC BY).

Araştırma örneklemi: 110 DLBCL ve 43 reaktif lenfoid doku olgusu; toplam 153 hasta.

DLBCL örnek dönemi: Tanısal biyopsiler 2007–2011 döneminden seçilmiştir.

Etik kurul: Tokai University School of Medicine Institutional Review Board; protokol IRB20/156; onay tarihi 1 Nisan 2026.

Bilgilendirilmiş onam: Kaynak, çalışmaya dahil edilen tüm kişilerden bilgilendirilmiş onam alındığını bildirmektedir.

Finansman: Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT), Grants-in-Aid for Scientific Research, KAKENHI ve JSPS; grant numaraları 25K10272, 23K06454, 18K15100, 15K19061 ve 24590430.

Veri erişilebilirliği: Kaynak, verilerin makale içinde ve Joaquim Carreras'a talep üzerine erişilebilir olduğunu belirtmektedir.

Çıkar çatışması: Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmiştir.

Yazar katkıları: Kavramsallaştırma, yöntem, yazılım, formal analiz, veri kürasyonu ve yazım Joaquim Carreras tarafından yürütülmüştür. Araştırma faaliyetlerine Joaquim Carreras, Yara Yukie Kikuti, Shunsuke Nagase, Giovanna Roncador, Haruka Ikoma, Atsushi Ito, Makoto Orita, Sakura Tomita, Yuki Tanigaki, Akihisa Ueno, Yusuke Kondo, Naoya Nakamura ve Yohei Masugi katkıda bulunmuştur.

Skeletonization cihaz/yazılım zinciri: H&E preparatları Tissue-Tek Prisma Plus ile boyanmış; NanoZoomer S360 ile dijitalleştirilmiş; NDP.view2 ile görüntülenmiş; PhotoScape v3.7 ile 224 × 224 × 3 patch'lere ayrılmış; final skeletonization MATLAB R2026a Update 4 içindeki bwskel fonksiyonuyla gerçekleştirilmiştir. Küçük spur'lar pruning ile çıkarılmamıştır.

İmmünohistokimya: Leica Bond Max II otomatik boyama sistemi ve çok sayıda antikor paneli kullanılmış; dijital pozitiflik analizi Fiji/ImageJ ile yapılmıştır.

FISH: MYC, BCL2 ve BCL6 break-apart probları kullanılmıştır. EBER, RNA in situ hybridization ile değerlendirilmiştir.

Gen ekspresyonu: 10 µm FFPE kesitlerinden RNA çıkarılmış, en az %80 neoplastik alan içeren örnekler seçilmiş ve nCounter PanCancer Profiling Panel ile 730 immüno-onkoloji geni ve 40 housekeeping geni değerlendirilmiştir.

Fonksiyonel ağ: STRING v12.0; Gene Ontology biological process; benzerlik ≥ 0,8; dört K-means kümesi; minimum interaction score 0,4.

GSEA: GSEA 4.4.0 build 18; 1000 permütasyon; phenotype permutation; weighted enrichment statistic; signal-to-noise ranking; MSigDB Hallmark gen kümeleri.

İstatistik: Mann–Whitney U, Kruskal–Wallis H, Pearson ki-kare, Fisher exact, Pearson korelasyonu, Kaplan–Meier, log-rank ve Cox regresyonu. Anlamlılık eşiği p < 0,05'tir. Analizler IBM SPSS Statistics 27 ile yapılmıştır.

Kaynak içi tutarlılık notları: Yöntem metnindeki complement adımı yayımlanan MATLAB kodunda açıkça görünmemektedir. Tablo 3'te ECOG ≥2 için 11/81 değeri %73,6 olarak yazılmıştır ve aritmetik olarak uyuşmamaktadır. Entropy–skeletonization Cox analizinin çevre metnindeki “p <0,001” ifadesi Tablo 9'daki p = 0,004 ve p = 0,003 değerleriyle uyuşmamaktadır. Tablo 10'un başlığı EBER ve skeletonization modelini tanımlarken görünen satırlar Entropy ve EBER'dir. Bazı bölümlerde Ki69, diğerlerinde Ki67 terminolojisi kullanılmaktadır. Bu noktalar Verianla tarafından sessizce değiştirilmemiştir.

Temel bilimsel sınır: Çalışma skeletonization ile klinikopatolojik özellikler, genel sağkalım ve moleküler profil arasındaki ilişkileri göstermektedir. Retrospektif gözlemsel tasarım nedensellik kanıtlamaz. Yüksek/düşük skeletonization cutoff değeri açıkça raporlanmadığından yöntem mevcut makaleden tek başına klinik karar kuralı olarak yeniden üretilemez.