Mikrogliyadan kelib chiqadigan insulinga oʻxshash oʻsish omili 1 (insulin-like growth factor 1; IGF-1), ushbu tadqiqotda markaziy nerv tizimining rezident immun hujayralari boʻlgan mikrogliyaning virusli neyroyalligʻlanish va demiyelinizatsiya vaqtida immun muvozanatni tartibga solishiga hissa qoʻshuvchi signal omili sifatida oʻrganilgan. Tadqiqotchilar mikrogliyadagi Igf1 genini vaqt jihatidan nazoratli tarzda susaytira oladigan MG-Igf1KO sichqonlarini glial hujayralarni zararlaydigan JHM shtammi mouse hepatitis virus (JHMV) bilan yuqtirib, IGF-1 yoʻqolishining virus nazorati, nevrologik kasallik, miyelin shikastlanishi va orqa miyadagi immun hujayralar tarkibiga taʼsirini tekshirgan.

Tadqiqotning markaziy natijasi ikki jarayonning bir-biridan ajralishidir. Mikroglial IGF-1 yoʻqolishi JHMV ning markaziy nerv tizimidagi replikatsiyasini nazorat qilishni sezilarli ravishda buzmagan; aksincha, MG-Igf1KO sichqonlarida klinik kasallik ogʻirroq kechgan va ayniqsa infeksiyadan 21 kun oʻtgach orqa miya demiyelinizatsiyasi ortgan. Boshqacha aytganda, toʻqimaning ogʻirroq shikastlanishini faqat “virus koʻproq boʻlgani” bilan tushuntirib boʻlmagan.

JHMV, glial hujayralarga tropizm koʻrsatadigan JHM strain of mouse hepatitis virus boʻlib, sichqonlarda oʻtkir ensefalomiyelitdan keyin immun vositali demiyelinizatsiyani yuzaga keltiradi. Ushbu model multipl sklerozning ayrim klinik va gistologik xususiyatlarini taqlid qilgani uchun demiyelinizatsiya tadqiqotlarida qoʻllanadi; biroq JHMV infeksiyasi inson multipl sklerozi bilan bir xil kasallik emas va bu tadqiqot odamlarda IGF-1 davosini sinamaydi.

Sichqonlarda mikroglial Igf1 oʻchirilishi tamoksifen bilan induksiya qilingan. Hayvonlarga 4–6 haftalik yoshda, besh kun davomida kuniga ikki marta va inyeksiyalar orasida olti soat boʻladigan tarzda har bir sichqonga 1 mg tamoksifen berilgan. Sichqonlar 6–8 haftalik boʻlganda intrakranial yoʻl bilan 30 µL HBSS tarkibida 1200 plaque-forming unit (PFU) JHMV bilan yuqtirilgan. Miya va orqa miya namunalari infeksiyadan keyingi 7., 14. va 21. kunlarda baholangan.

Mikrogliyadagi Igf1 transkriptlari nazorat sichqonlariga nisbatan infeksiyadan keyingi 7. kunda taxminan %70, 21. kunda esa taxminan %96 kamaygan. Shunga qaramay, JHMV infeksiyasidan keyingi 21 kunlik kuzatuvda MG-Igf1KO va nazorat guruhlari oʻrtasida yashab qolish boʻyicha sezilarli farq kuzatilmagan. Virus titri va virusli RNA natijalari ham IGF-1 oʻchirilishi asosiy virus nazoratini buzganini koʻrsatmagan.

Buning aksiga, nevrologik kasallik ogʻirligi MG-Igf1KO sichqonlarida ortgan. Nazorat va knockout hayvonlarda 14. kunda demiyelinizatsiya oʻxshash boʻlgan boʻlsa, 21. kunda MG-Igf1KO sichqonlarining orqa miyasida sezilarli darajada koʻproq demiyelinizatsiya aniqlangan. Yuqtirilmagan voyaga yetgan MG-Igf1KO sichqonlarida boshlangʻich miyelin darajasi va myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) konsentratsiyasi nazoratlardan farq qilmagani sababli kech davrdagi ortgan miyelin yoʻqolishi faqat genetik model voyaga yetgan orqa miyada boshlangʻich miyelinni kamaytirgani bilan izohlanmaydi.

Oqim sitometriyasi 21. kunda MG-Igf1KO orqa miyasida umumiy CD8⁺ T-hujayralar soni ortganini; umumiy CD4⁺, virusga xos CD4⁺ T-hujayralari, makrofaglar va mikrogliyaning umumiy sonida xuddi shunday aniq ortish boʻlmaganini koʻrsatgan. Virusga xos CD8⁺ T-hujayralarida ortish tendensiyasi koʻrilgan, ammo bu taqqoslash statistik jihatdan ahamiyatli topilmagan.

CyTOF mass cytometry tahlilida yanada tanlangan immun oʻzgarish aniqlangan. MG-Igf1KO orqa miyasida CD8⁺ Ly6C⁺ effektor T-hujayralarining ulushi ortgan bir paytda, tartibga soluvchi xususiyatlarga mos Tr1-simon CD4⁺ T-hujayra klasteri kamaygan. Shu bilan birga CyTOF namuna hajmi har bir guruh uchun atigi \(n=4\) va 23 metacluster boʻyicha bajarilgan differential-abundance testlarining p-qiymatlari manbada izlanish xususiyatida, koʻp taqqoslash tuzatishi qoʻllanmasdan xabar qilingan. Shu sababli bu natijalar kuchli biologik signallardir, ammo katta namunali tasdiqlash oʻrnini bosa olmaydi.

Imaging mass cytometry (IMC) natijalari mikroglial IGF-1 yoʻqolishi faqat hujayralar sonini emas, balki immun hujayralarning toʻqima ichidagi fenotipi va joylashuv munosabatlarini ham oʻzgartirganini koʻrsatadi. Faollashuvni koʻrsatuvchi Iba1⁺CD68⁺ mikrogliyada TREM2 ekspressiyasi MG-Igf1KO guruhida kamaygan va disease-associated microglia (DAM) yetilish nisbati nazoratdagi %83,4 dan MG-Igf1KO guruhida %76,7 gacha tushgan. Har ikkala taqqoslash Benjamini–Hochberg false discovery rate tuzatishidan keyin \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}017\) bilan ahamiyatli boʻlib qolgan.

Manba shuningdek MG-Igf1KO lezyonlarida faollashgan mikrogliyaning oʻzaro koʻproq klasterlanishini va CD8⁺ T-hujayralari bilan fazoviy yaqinligi oshganini xabar qilgan. Aksincha, Iba1⁺CD163⁺ tartibga soluvchi myeloid hujayralarning CD8 T-hujayralariga yaqinligidagi guruh farqi faqat tendensiya boʻlib, FDR tuzatishidan keyin ahamiyatli emas (\(p_{\mathrm{adj}}=0{,}240\)). Bu farq muhim: manba CD163⁺ hujayralarning fazoviy oʻzgarishini biologik modelning bir qismi sifatida muhokama qilsa ham, guruh darajasidagi ushbu yagona taqqoslash statistik jihatdan qatʼiy tasdiqlanmagan.

Kuchliroq topilma CD8 T-hujayralarining 30 µm yaqinida joylashgan CD163⁺ myeloid hujayralardagi arginase-1 (Arg1) signalidir. Nazorat guruhida CD8 ga yaqin hujayralarda median Arg1 qiymati 4,17, MG-Igf1KO guruhida esa 3,89 boʻlgan; cell-level taqqoslashda \(p<0{,}001\) xabar qilingan. Ammo bu tahlil taxminan 16.000 hujayrani oʻz ichiga olgani sababli p-qiymatning juda kichik boʻlishi biologik namuna hajmi 16.000 degani emas. Mouse-level tahlilda 12 funksional markerning umumiy ekspressiyasida ahamiyatli farq topilmagani Arg1 oʻzgarishi butun myeloid populyatsiyaga yoyilgan yoʻqotishdan koʻra ayniqsa myeloid–T-hujayra interfeysida koʻrinadigan fazoviy xususiyat ekanini qoʻllab-quvvatlaydi.

Tadqiqotchilar bu natijalardan mikrogliyadan kelib chiqadigan IGF-1 virusli infeksiyani dastlabki nazorat qilishni taʼminlovchi antiviral mexanizmning mutlaq zarur komponentidan koʻra, himoyaviy yalligʻlanishning surunkali immunopatologiyaga aylanishini cheklaydigan neyroimmun muvozanat regulyatori boʻlishi mumkin degan xulosaga keladi. Taklif etilgan IGF-1–TREM2–DAM–CD163/Arg1–CD8 oʻqi muhim mexanistik modeldir; biroq TREM2 kamayishi fazoviy immun buzilishni bevosita yuzaga keltirishi ushbu tadqiqotda sababiy aralashuv bilan isbotlanmagan.

Mikrogliyadan Kelib Chiqadigan IGF-1 Ushbu Tadqiqotda Nima Vazifa Bajaradi?

Mikrogliyadan kelib chiqadigan IGF-1, tadqiqot natijalariga koʻra JHMV ning asosiy virusli tozalanishini taʼminlaydigan majburiy antiviral omildan koʻra, zararlangan markaziy nerv tizimida mikroglial yetilishni, immun hujayralar oʻrtasidagi muvozanatni va miyelin shikastlanishini cheklashni qoʻllab-quvvatlaydigan neyroimmun homeostaz regulyatori sifatida harakat qiladi.

Mikrogliya nima?

Mikrogliya markaziy nerv tizimining rezident myeloid immun hujayralaridir. Normal sharoitda toʻqima homeostazini saqlashga, rivojlanish vaqtida miyelinlanishga, shikastlanishdan keyin hujayra debris ini tozalashga va infeksiya vaqtida mahalliy immun javobni tartibga solishga hissa qoʻshadi.

Miyelin aksonlarni oʻrab turadigan va elektr signalining oʻtkazilishini qoʻllab-quvvatlaydigan lipid va oqsilga boy izolyatsion tuzilma. Markaziy nerv tizimida miyelinni oligodendrotsitlar ishlab chiqaradi. Demiyelinizatsiya esa ushbu qobiqning shikastlanishi yoki yoʻqolishidir.

IGF-1 nima?

Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) oʻsish va organlar rivojlanishida rol oʻynaydigan oʻsish omilidir. Markaziy nerv tizimida mikrogliya va makrofaglar IGF-1 manbalaridan biridir. Oldingi biologik maʼlumotlar IGF-1 oligodendrotsit progenitor hujayralarining koʻpayishi va oligodendrotsit yoʻnalishida differensiyalanishi bilan bogʻliqligini koʻrsatadi.

Ushbu tadqiqot IGF-1 ning butun tanadagi barcha vazifalarini oʻrganmaydi. Tajribaning asosiy yoʻnalishi mikrogliyada Igf1 ekspressiyasini vaqt jihatidan nazoratli ravishda kamaytirish va buning JHMV sababli neyroyalligʻlanishdagi taʼsiridir.

MG-Igf1KO modeli nima?

MG-Igf1KO modeli Cx3cr1CreERT/+ : Igf1fl/fl genetik tuzilmasidan foydalanadigan, tamoksifen bilan induksiya qilinadigan Cre-loxP asosidagi sichqon modelidir. Manba uni mikrogliyaga xos Igf1 ablatsiyasi uchun ishlatadi.

Tamoksifen CreERT tizimini faollashtirib, flox hududlari orasidagi maqsad gen segmentining rekombinatsiyasini taʼminlaydi. Bu yerda maqsad voyaga yetish davriga yaqinlashayotgan hayvonlarda mikroglial IGF-1 ni vaqt jihatidan nazoratli ravishda kamaytirishdir.

qPCR dagi ΔCt nimani anglatadi?

Manba maqsad RNA signalini GAPDH deb ataladigan ichki nazorat geniga nisbatan normallashtiradi. Usuldagi taʼrif quyidagi farq bilan ifodalanishi mumkin:

\(Ct\), PCR floresans signali belgilangan chegaradan oʻtadigan cycle sonidir. Manba qoʻllagan talqinda pastroq \(\Delta Ct\) maqsad mRNA ning yuqoriroq boshlangʻich darajasini, yuqoriroq \(\Delta Ct\) esa pastroq boshlangʻich darajani koʻrsatadi. Buning sababi boshlangʻich RNA miqdori yuqori boʻlsa, aniqlash chegarasiga kamroq amplifikatsiya sikli bilan yetib borilishidir.

JHMV Modeli Multipl Skleroz Bilan Bir Xilmi?

Yoʻq. JHMV yordamida yaratilgan sichqon modeli oʻtkir virusli ensefalomiyelitni va undan keyin immun vositali demiyelinizatsiyani yuzaga keltiradi hamda multipl sklerozning ayrim klinik va gistologik xususiyatlarini taqlid qiladi; biroq u inson multipl sklerozining oʻzi emas va ushbu tadqiqot natijalari bevosita MS bemorlarida davolash samaradorligi sifatida talqin qilinmaydi.

JHMV nima?

JHMV mouse hepatitis virus ning neyrotrop JHM shtammi va murine coronavirus dir. Ushbu tadqiqotda virus intrakranial ravishda yuborilgan. Infeksiya vaqtida glial hujayralarda virus replikatsiyasi sodir boʻladi; virusga xos T-hujayralar va boshqa immun hujayralar markaziy nerv tizimiga koʻchib oʻtadi.

JHMV infeksiyasidan omon qolgan hayvonlarning muhim qismida keyinchalik immun tizimi vositasidagi demiyelinizatsiya rivojlanishi mumkin. Shu sababli model virusli infeksiya, surunkali neyroyalligʻlanish va miyelin shikastlanishi orasidagi bogʻlanishlarni tekshirishga imkon beradi.

Tajriba vaqt chizigʻi

Virus yuki qanday oʻlchandi?

Miyadagi infeksion JHMV miqdori DBT astrocytoma hujayralarida plaque assay bilan baholangan. Plaque-forming unit koʻpaya oladigan va hujayra qatlamida koʻrinadigan infeksiya oʻchogʻini hosil qila oladigan virus birligini ifodalaydi.

Orqa miyadagi JHMV RNA miqdori esa RNA ekstraksiyasi, cDNA sintezi va qPCR yordamida tekshirilgan. Virusli matrix glycoprotein transkriptlari GAPDH ichki nazoratiga nisbatan normallashtirilgan.

Demiyelinizatsiya qanday oʻlchandi?

Orqa miyaning torakal 6–10 darajalariga mos qismi chiqarilgan, %4 paraformaldehidda fiksatsiya qilingan, %30 saxaroza bilan cryoprotection qoʻllanib, 1 mm transverse bloklarga boʻlingan. Toʻqima 8 µm qalinlikda kesilgan.

Kesimlar gematoksilin-eozin (H&E) bilan birga Luxol fast blue (LFB) yordamida boʻyalgan. LFB miyelinga boy hududlarni gistologik baholashga yordam beradi. Har bir sichqon uchun 5–8 kesim tahlil qilingan va demiyelinlangan oq modda maydonining umumiy oq moddaga nisbati ImageJ v1.54m bilan hisoblangan.

Yuqtirilmagan hayvonlarda boshlangʻich myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) darajalari qoʻshimcha ravishda ELISA bilan tekshirilgan.

TREM2 va Disease-Associated Microglia Oʻtishi Nega Muhim?

TREM2 ushbu tadqiqotda faollashgan mikrogliyaning shikastga javob beruvchi disease-associated microglia (DAM) fenotipiga oʻtish markerlaridan biri sifatida ishlatilgan; MG-Igf1KO hayvonlarida TREM2 kamayishi va DAM ulushining pasayishi mikrogliyaning shikastni sezish va debris tozalash bilan bogʻliq yetilish dasturi toʻliq rivojlanmayotgan holatga mos keladi, biroq TREM2 kamayishi keyingi barcha buzilishlarning bevosita sababi ekanligi isbotlanmagan.

TREM2 nima?

TREM2 myeloid hujayralarda uchraydigan reseptor boʻlib, mikrogliyaning lipidlarni sezishi, fagotsitar javobi va shikastlangan toʻqima bilan oʻzaro taʼsirida rol oʻynaydi. Ushbu tadqiqotda TREM2 ning ahamiyati umumiy mikrogliya sonidan boshqa biologik savolga javob berishidadir: mikrogliya shunchaki mavjudmi yoki shikastga javob beradigan mos funksional fenotip tomon yetilyaptimi?

Faollashgan mikrogliya va DAM qanday aniqlangan?

IMC tahlilida faollashgan mikrogliya:

sifatida; disease-associated microglia esa:

sifatida tasniflangan.

Manbaning DAM maturation ratio taʼrifi:

koʻrinishida. Bu yerda DAM TREM2-musbat disease-associated microglia kichik guruhini; Act_MG esa iyerarxik tasnifda TREM2 chegarasiga yetmagan faollashgan mikrogliya kategoriyasini ifodalaydi.

Bu taqqoslashlar mouse-level \(n=6\) nazorat va \(n=6\) MG-Igf1KO sichqoni ustida Mann–Whitney U testi bilan bajarilgan va sakkiz testli Benjamini–Hochberg FDR family doirasida tuzatilgan.

“TREM2 past, demak demiyelinizatsiyani TREM2 keltirib chiqardi” deyish mumkinmi?

Yoʻq. Manbaning oʻzi bu masalada ehtiyotkor. TREM2 darajasi bilan faollashgan mikrogliyaning oʻzaro klasterlanishi, DAM bilan fazoviy munosabati va CD8 T-hujayralariga yaqinligi orasida ahamiyatli korrelyatsiyalar topilgan; biroq korrelyatsiya TREM2 kamayishi fazoviy qayta tashkil etishning bevosita sababi ekanini isbotlamaydi.

Mualliflar bu sababiylikni hal qilish uchun JHMV modelida bevosita TREM2 loss-of-function yoki TREM2 agonist aralashuvlari zarur ekanini taʼkidlaydi.

CyTOF va Imaging Mass Cytometry Oʻrtasidagi Farq Nima?

CyTOF ushbu tadqiqotda orqa miyadagi immun hujayra populyatsiyalarining yuqori oʻlchamli fenotipi va koʻplik taqsimotini oʻlchash uchun ishlatilgan, imaging mass cytometry esa ushbu hujayralarning toʻqima ichida qayerda joylashganini va bir-biriga taxminan 30 µm masshtabda qanday qoʻshni boʻlishini ham tekshirishga imkon bergan.

CyTOF qanday ishlagan?

CyTOF fluorophore oʻrniga turli metall izotoplari bilan belgilangan antitanalardan foydalanib, koʻplab hujayra markerlarini bir xil hujayralarda oʻlchash imkonini beruvchi mass cytometry usulidir.

Manbada hujayralar viability staining va sirt/intracellular antibody staining dan soʻng Standard BioTools Helios tizimida tahlil qilingan. Maʼlumot fayllari CyTOF Software v7.0.8493 bilan normallashtirilgan, batch effect lar CytoNorm bilan tuzatilgan va oʻlik hujayralar, debris, doublet lar hamda normalization bead lar tahlildan chiqarilgan.

FlowSOM unsupervised clustering qoʻllangan, dimensionality reduction opt-SNE/t-SNE vizualizatsiyasi bilan taqdim etilgan. Mouse-level cluster frequencies umumiy CD45⁺ hujayralarning foizi sifatida baholangan.

CyTOF differential-abundance tahlilida har bir guruhda:

sichqon mavjud. Ushbu kichik namuna va koʻplab metaclusterlar sababli manba CyTOF natijalarini izlanish doirasida baholaydi.

Imaging mass cytometry qanday ishlagan?

IMC uchun orqa miya toʻqimalari 10 µm qilib kesilgan; antigen retrieval 1 mM sodium citrate, pH 6,0 ichida 95–100 °C da 20 daqiqa qoʻllangan. Kesimlar %3 BSA bilan 30 daqiqa bloklangan va metal-conjugated antibody cocktail bilan tun davomida 4 °C da inkubatsiya qilingan.

Tasvirlash Hyperion Imaging System bilan 200 Hz laser frequency, ablation energy 6 va 1 µm pixel resolution yordamida amalga oshirilgan. Jami:

va:

tahlil qilingan.

Xom IMC tasvirlari IMC-Denoise pipeline yordamida tozalangan. Har bir marker channel uchun 30.000 training patch yaratilib, avval DIMR hot-pixel removal, keyin DeepSNiF shot-noise filtering qoʻllangan.

Cellpose-SAM bilan hujayra segmentatsiyasi

Hujayra chegaralarini tasvirlardan ajratish uchun GPU tezlashtirilgan Cellpose-SAM, cpsam model v4.0 qoʻllangan. Ikki-pass strategiyasi ishlatilgan:

Har ikkala pass Ir191 va Ir193 DNA intercalator channel laridan foydalangan. Ikkinchi pass dagi yangi segmentlar mavjud hujayralar bilan %50 dan kam ustma-ust tushganda birlashtirilgan; 500 pixel² dan katta obyektlar ehtimoliy doublet yoki debris sifatida chiqarib tashlangan.

Taxminan 184.000 segmented object ichidan 62.204 immune-associated cell downstream analysis uchun saqlangan.

Marker intensivliklari nega arcsinh transformatsiyasidan oʻtkazilgan?

Marker intensity qiymatlari:

va cofactor \(=1\) yordamida oʻzgartirilgan. Bu transformatsiya juda yuqori signal qiymatlarining dynamic range ini siqish bilan birga qiymatlarning rank order ini saqlaydi va turli expression scale larga ega markerlar uchun percentile-based threshold dan foydalanishni osonlashtiradi.

Hujayra turi tasnifi

Manba marker positivity uchun asosan arcsinh-transformed intensity distribution ning 75. percentile qiymatidan foydalangan. Tasniflangan asosiy hujayra turlari orasida astrocyte, neuron, oligodendrocyte, microglia, activated microglia, DAM, CD4 T cell va CD8 T cell bor. Hech bir threshold ga yetmagan hujayralar “Other” sifatida tasniflangan.

Iba1⁺CD163⁺ regulatory myeloid cells esa boshqa sinflar ustidan oʻtishi mumkinligi sababli non-exclusive overlay population sifatida alohida tahlil qilingan.

Fazoviy qoʻshnichilik tahlili

Har bir toʻqima tasvirida 30 pixel, yaʼni manba tasvir rezolyutsiyasiga koʻra 30 µm interaction radius yordamida spatial neighbor graph tuzilgan. Har bir hujayra turi juftligi uchun kuzatilgan qoʻshnichilik sonlari hujayra yorliqlarining:

marta tasodifiy permutatsiyasi bilan yaratilgan null distributions bilan taqqoslangan va image-level enrichment z-score lari olingan.

50 dan kam hujayra boʻlgan tasvirlar chiqarib tashlangan. Mouse-level score bir xil hayvonga tegishli tasvirlarning z-score oʻrtachasi orqali olingan.

Rank-biserial effect size

Manba kichik namunali ikki-guruh Mann–Whitney U taqqoslashlarida effect size uchun:

rank-biserial correlation formulasidan foydalangan.

Bu yerda \(U\) Mann–Whitney U statistikasi; \(n_1\) va \(n_2\) ikki guruhning mustaqil biologik namuna sonlaridir. Manba \(|r|\ge0{,}5\) ni katta, \(0{,}3\le|r|<0{,}5\) ni oʻrta va \(|r|<0{,}3\) ni kichik taʼsir deb tasniflaydi.

Tadqiqot Usuli va Natijalari

IGF-1 Oʻchirilishi Virus Yukini Oshirmasdan Demiyelinizatsiyaga Qanday Taʼsir Qildi?

Mikroglial Igf1 oʻchirilishi JHMV ning asosiy nazoratini buzmagan, ammo infeksiyaning surunkali davrida klinik kasallik va orqa miya demiyelinizatsiyasi ortishi bilan bogʻliq boʻlgan; manba buni virus replikatsiyasi ortishidan koʻra immun homeostaz va toʻqimani himoya qiluvchi myeloid dasturlar buzilishi bilan izohlovchi modelni taklif qiladi.

Virus nazorati

Kaplan–Meier tahlilida JHMV bilan yuqtirilgan:

• Cre-CTRL: \(n=66\)
• MG-Igf1KO: \(n=88\)

sichqonlar orasida 21 kunlik kuzatuvda ahamiyatli yashab qolish farqi topilmagan.

MG-Igf1KO sichqonlarida klinik ballar ayniqsa 6. va 7. kunlarda hamda surunkali davrda 17–21. kunlar orasida yuqoriroq boʻlgan. Biroq virusli plaque assay va qPCR natijalari ogʻirroq klinik manzara virus replikatsiyasi nazoratining muvaffaqiyatsizligidan kelib chiqqanini qoʻllab-quvvatlamaydi.

Demiyelinizatsiya

Yuqtirilmagan voyaga yetgan MG-Igf1KO va nazorat sichqonlarining LFB boʻyashida boshlangʻich miyelin farqi koʻrilmagan; MOG ELISA natijalarida ham ahamiyatli boshlangʻich farq aniqlanmagan.

JHMV infeksiyasidan keyingi 14. kunda guruhlarning demiyelinizatsiya darajasi oʻxshash. 21. kunda esa MG-Igf1KO guruhidagi demiyelinizatsiya nazorat guruhidan yuqori boʻlgan; asosiy natijalar matni bu farq uchun \(p<0{,}04\), figura izohi esa \(p\le0{,}05\) beradi.

Oqim sitometriyasi

Ushbu flow-cytometry taqqoslashlarida Cre-CTRL guruhida \(n=10\), MG-Igf1KO guruhida \(n=4\) ishlatilgan va manba bu taqqoslashlar multiple unpaired t-test bilan bajarilganini, multiple-comparison correction qoʻllanmaganini bildirgan. Bu statistik tafsilot natijalar kuchini baholashda saqlanishi kerak.

CyTOF: effektor va tartibga soluvchi muvozanat

CyTOF natijalari umumiy immun hujayralar ortishidan koʻra tarkib oʻzgarishiga ishora qilgan.

Tr1-simon klasterning CD39 kabi tartibga soluvchi xususiyatlar bilan bogʻliq markerlarni koʻrsatishi ushbu talqinni qoʻllab-quvvatlaydi. Biroq manba CD49b va LAG-3 markerlari panelda yoʻqligini ochiq qayd etib, bu population ni aniq Tr1 hujayrasi emas, Tr1-like deb ataydi.

IMC: immun hujayralar toʻqima ichida qanday qayta tashkil etildi?

TREM2 va fazoviy tuzilma oʻrtasidagi korrelyatsiyalar

Ushbu korrelyatsiyalarning uchtasi FDR tuzatishidan keyin ahamiyatli. Biroq korrelyatsiyalar “TREM2 kamayishi ushbu fazoviy oʻzgarishlarga sabab boʻldi” degan xulosani oʻzi alohida isbotlamaydi.

CD163 va Arg1 natijasi nega boshqacha talqin qilinishi kerak?

Iba1⁺CD163⁺ regulatory myeloid hujayralarning CD8 T-hujayralari bilan mouse-level spatial enrichment i nazoratda median z=18,0, MG-Igf1KO da median z=13,7 boʻlgan. Ammo:

boʻlgani uchun guruh darajasidagi ushbu “dispersal” natijasi ahamiyatli emas va tendensiya sifatida saqlanishi kerak.

Buning aksiga, CD8 T-hujayralarining 30 µm yaqinidagi CD163⁺ hujayralarning Arg1 intensity si:

koʻrinishida. Yaqin hujayralarning Cre-CTRL–MG-Igf1KO cell-level taqqoslashida \(p<0{,}001\) xabar qilingan.

Ushbu tahlil 15.979 CD163⁺ hujayra ustida bajarilgan. Juda yuqori hujayra soni kuchli cell-level statistical power beradi; ammo hujayra soni mustaqil hayvonlar soni bilan bir xil emas. Manba ham cell-level p-qiymatlarini mouse-level FDR family tashqarisida saqlash va mouse-level natijalar bilan birga talqin qilish kerakligini aniq koʻrsatadi.

Figure 9 dagi klinik korrelyatsiyalar nega izlanish xususiyatida?

Figure 9 faqat MG-Igf1KO sichqonlari ichida:

bilan bajarilgan. Beshta fazoviy metrik ham peak clinical score, ham cumulative clinical score bilan taqqoslangani uchun jami 10 test mavjud.

Nominal jihatdan eʼtiborga molik natijalar orasida:

topilgan. Ammo manba 10-test family uchun ushbu korrelyatsiyalarning hech biri FDR tuzatishidan keyin ahamiyatli boʻlib qolmaganini aniq bildiradi:

Shu sababli ular kelajakda kattaroq kohortalarda tekshirilishi kerak boʻlgan izlanish xususiyatidagi bogʻlanishlar sifatida baholanishi kerak.

Mikrogliyadan kelib chiqadigan IGF-1 uchun taklif etilgan integrativ model

Tadqiqot qoʻllab-quvvatlaydigan natijalar

Mikrogliyadan kelib chiqadigan IGF-1 ning kamaytirilishi JHMV ning asosiy CNS virus nazoratini sezilarli ravishda buzmasdan ogʻirroq surunkali klinik kasallik va koʻproq orqa miya demiyelinizatsiyasi bilan bogʻliq.

Mikroglial IGF-1 yoʻqolishi umumiy CD8 T-hujayra ortishi va CyTOF da CD8⁺Ly6C⁺ effektor population kengayishi bilan birga kuzatiladi.

MG-Igf1KO sichqonlarida faollashgan mikrogliyaning TREM2 ekspressiyasi va DAM maturation ratio si kamaygan.

MG-Igf1KO toʻqimasi faollashgan mikrogliyaning ortgan self-clustering i va CD8 T-hujayralari bilan ortgan fazoviy yaqinligi bilan tavsiflanadi.

CD8 T-hujayra yaqinidagi CD163⁺ myeloid hujayralarda Arg1 intensity si MG-Igf1KO guruhida pastroq.

Bu topilmalar mikrogliyadan kelib chiqadigan IGF-1 virusli demiyelinizatsiya vaqtida immun faollashuv bilan tartibga solish/rezolyutsiya orasidagi muvozanatni saqlashga hissa qoʻshadi degan talqinni qoʻllab-quvvatlaydi.

Tadqiqot qoʻllab-quvvatlamaydigan natijalar

Tadqiqot IGF-1 odamlarda multipl skleroz davosi ekanini koʻrsatmaydi.

Tadqiqot JHMV infeksiyasi inson multipl sklerozi bilan bir xil kasallik ekanini koʻrsatmaydi.

Tadqiqot ogʻirroq demiyelinizatsiya yuqoriroq virus yukidan kelib chiqishini koʻrsatmaydi.

Tadqiqot TREM2 kamayishi barcha fazoviy immun oʻzgarishlarning bevosita sababi ekanini isbotlamaydi.

Tadqiqot CD163⁺ myeloid hujayralar CD8 T-hujayralaridan guruh darajasida statistik jihatdan qatʼiy uzoqlashganini koʻrsatmaydi; tegishli taqqoslash \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}240\).

Figure 9 dagi nominal klinik korrelyatsiyalar multiple-testing correction dan keyin ahamiyatli boʻlib qolmagani uchun tasdiqlangan prognostic biomarker aloqalari emas.

Sichqon modelidagi genetik Igf1 oʻchirilishidan olingan natijalar sistemik yoki lokal IGF-1 dori berilishi odamlarda xuddi shu yoʻnalishda va xavfsiz tarzda taʼsir qilishini koʻrsatmaydi.

Asosiy uslubiy cheklovlar

Hayvon modeli: Natijalar murine JHMV infeksiyasiga tegishli; inson kasalligiga bevosita umumlashtirib boʻlmaydi.

Namuna hajmi: CyTOF tahlilida \(n=4\)/guruh, IMC tahlilida \(n=6\)/guruh ishlatilgan. Ayniqsa within-genotype klinik korrelyatsiyalar faqat oltita MG-Igf1KO sichqoniga asoslangan.

CyTOF koʻp taqqoslashlari: Manba CyTOF differential-abundance p-qiymatlarini 23 metacluster boʻylab izlanish xususiyatida tuzatishsiz xabar qilgan.

Cell-level pseudo-replication xavfi: Arg1 tahlili 15.979 hujayrani oʻz ichiga olsa ham, mustaqil biologik birlik hujayra emas, sichqondir. Manba buni mouse-level natijalar bilan birga talqin qiladi.

Sababiylik: TREM2–fazoviy tashkilot korrelyatsiyalari sabab yoʻnalishini aniqlay olmaydi.

Tr1 taʼrifi: CD49b va LAG-3 panelda mavjud emasligi sababli tegishli CD4 population faqat Tr1-simon deb atalgan.

Manbadagi jins maʼlumoti: Tekshirilgan asosiy usul matnida tajriba hayvonlarining jinsi ochiq xabar qilinmagan; shu sababli jinsga xos xulosa chiqarib boʻlmaydi.

Manba ichidagi metod nomuvofiqliklari: CyTOF cluster soni, ayrim statistik testlar yozilishi va IMC marker panel hajmi turli boʻlimlarda aynan bir xil xabar qilinmagan. Verianla bu farqlarni jim tarzda birlashtirmagan.

Manba va Usul Haqida Izoh

Asl sarlavha: Microglial-Derived IGF-1 Serves as a Regulator for Neuroimmune Homeostasis During Viral-Induced Demyelination

Mualliflar: Vanessa M. Scarfone, Collin Pachow, Pauline U. Nguyen, Anita Lakatos, Jamie-Jean De La Torre, Alisa Xie, Kellie Fernandez, Charlene Collado, Kaitlin Murray, Roberto Tinoco, Craig M. Walsh, Trevor Owens, Agnieszka Wlodarczyk, Thomas E. Lane.

Teng hissa: Vanessa M. Scarfone va Collin Pachow.

Corresponding author: Thomas E. Lane.

E-pochta: tlane@uci.edu

Muassasa 1: Sue & Bill Gross Stem Cell Research Center, University of California, Irvine, CA 92697, USA.

Muassasa 2: Department of Molecular Biology and Biochemistry, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, CA 92697, USA.

Muassasa 3: Department of Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine, 2213 McGaugh Hall, Irvine, CA 92697, USA.

Muassasa 4: Center for Virus Research, University of California, Irvine, CA 92697, USA.

Muassasa 5: Neurobiology Research, Department of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, 5000 Odense, Denmark.

Jurnal: Viruses.

Nashriyot: MDPI, Basel, Switzerland.

Yil: 2026.

Jild: 18.

Son: 5.

Maqola raqami: 550.

DOI: 10.3390/v18050550.

Received: 6 Aprel 2026.

Revised: 1 May 2026.

Accepted: 6 May 2026.

Published: 9 May 2026.

Manba turi: Taqrizdan oʻtgan original tadqiqot maqolasi.

Litsenziya: Creative Commons Attribution (CC BY).

Rasmiy nashr havolasi: https://www.mdpi.com/1999-4915/18/5/550

Akademik muharrir: Maria Cecilia Garibaldi Marcondes.

Ilmiy soha: Neyroimmunologiya, neyrovirologiya, demiyelinizatsiya, mikrogliya biologiyasi va markaziy nerv tizimining virusli infeksiyasi.

Tadqiqot turi: Genetik sichqon modeli + virusli infeksiya + gistopatologiya + flow cytometry + CyTOF mass cytometry + imaging mass cytometry + fazoviy hujayra tahlili.

Sichqon modeli: MG-Igf1KO, Cx3cr1CreERT/+ : Igf1fl/fl; nazorat, Cx3cr1CreERT/+ : Igf1+/+.

Gen induksiyasi: 4–6 haftalik yoshda har bir sichqonga 1 mg tamoksifen, 100 µL intraperitoneal inyeksiya, kuniga ikki marta, inyeksiyalar orasida olti soat, ketma-ket besh kun.

Viral challenge: 6–8 haftalik yoshda 30 µL HBSS ichida 1200 PFU JHMV, intrakranial.

Namuna olish: 7., 14. va 21. kun post-infection.

Virus yuki: Miya plaque assay; orqa miya JHMV mRNA qPCR.

Gistologiya: H&E + Luxol fast blue; 8 µm spinal-cord cryosections; har bir sichqonga 5–8 kesim; ImageJ v1.54m.

MOG oʻlchovi: Abcam ab282304 ELISA; Varioskan LUX.

Flow cytometry: Novocyte; tahlil FlowJo v10.0.8 va 11.0.2; FACS sorting BD FACSAria Fusion.

CyTOF: Standard BioTools Helios; normalization CyTOF Software v7.0.8493; OMIQ; CytoNorm; FlowSOM; opt-SNE/t-SNE.

CyTOF biologik namunasi: \(n=4\)/genotip.

IMC: Hyperion Imaging System; 39 tissue image; 12 sichqon, 6 Cre-CTRL + 6 MG-Igf1KO; 200 Hz; ablation energy 6; 1 µm pixel resolution.

IMC denoising: IMC-Denoise; DIMR + DeepSNiF; har bir marker channel uchun 30.000 training patch.

Segmentatsiya: Cellpose-SAM cpsam v4.0, GPU acceleration, two-pass segmentation.

Spatial neighborhood radius: 30 pixel = 30 µm.

Permutatsiya soni: 500 random cell-label permutation.

IMC analysis cell count: Taxminan 184.000 segmented object ichidan 62.204 immune-associated cell.

CD163/Arg1 analysis: 15.979 Iba1⁺CD163⁺ cell; %84,2 CX3CR1⁺.

IMC mouse-level statistics: Ikki tomonlama Mann–Whitney U; Benjamini–Hochberg FDR, \(Q=0{,}05\), asosiy family size = 8.

TREM2 spatial-correlation family: Alohida toʻrt testli FDR family.

Klinik–fazoviy korrelyatsiyalar: MG-Igf1KO \(n=6\); beshta spatial metric × ikkita clinical metric = 10 test; manba p-qiymatlarini nominal xabar qilgan va hech biri FDR dan keyin \(p_{\mathrm{adj}}<0{,}05\) boʻlmagan.

Figure 1 survival namunasi: Cre-CTRL \(n=66\); MG-Igf1KO \(n=88\).

Figure 3 flow-cytometry namunasi: Cre-CTRL \(n=10\); MG-Igf1KO \(n=4\).

Asosiy TREM2 natijasi: MG-Igf1KO activated microglia da TREM2 kamayishi, \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}017\).

DAM maturation ratio: Cre-CTRL %83,4; MG-Igf1KO %76,7; \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}017\).

Activated microglia self-clustering: MG-Igf1KO da ortgan; \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}047\).

Activated microglia–CD8 T-cell proximity: MG-Igf1KO da ortgan; \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}047\).

CD163+–CD8 spatial enrichment: Nazorat median z=18,0; MG-Igf1KO median z=13,7; \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}240\), ahamiyatli emas.

CD163+ Arg1 interface: CD8 ga yaqin cell median intensity Cre-CTRL 4,17, MG-Igf1KO 3,89; cell-level \(p<0{,}001\). CD8 dan uzoq har ikki genotip median 3,13.

Manba ichidagi CyTOF population-count qaydi: usul boʻlimi FlowSOM uchun 25 metacluster va 23 immune lineage bildirgan boʻlsa, boshqa matn/figura izohlarida turli umumiy cluster/population sonlari koʻrinadi. Bu sonlar Verianla tomonidan jim tarzda tenglashtirilmagan.

Manba ichidagi IMC marker-count qaydi: manba bir joyda 27-marker IMC panel, tissue-staining usulida esa 36-marker metal-conjugated panel/36 marker channel bildiradi. Manba bu farq analysis subsetmi yoki matndagi nomuvofiqlikmi ekanini aniq hal qilmaydi.

Manba ichidagi statistika qaydi: ayrim figura izohlaridagi test taʼriflari asosiy statistika usuli boʻlimi bilan toʻliq bir xil emas. Verianla miqdoriy p-qiymatlarini manbadagi konteksti bilan saqlagan va usul nomidagi nomuvofiqliklarni qatʼiylashtirmagan.

Supplementary Material: opt-SNE cluster overlays, barcha immune clusters, CyTOF cluster marker-expression profile, spatial neighborhood enrichment; shuningdek CyTOF va IMC antibody panellari hamda key immune population jadvallari.

Mualliflar hissasi: Conceptualization: T.E.L., V.M.S., C.P.; methodology: V.M.S., C.P., P.U.N., A.L., J.-J.D.L.T., A.X., K.F., K.M., C.C.; software and validation: V.M.S.; formal analysis: V.M.S., C.P., T.E.L., R.T.; resources: T.O., A.W., C.M.W.; original draft: V.M.S., C.P.; review and editing: V.M.S., T.E.L., A.W., T.O., R.T., C.M.W.; supervision: T.E.L.; funding acquisition: T.E.L., A.W., T.O., R.T., C.M.W.

Moliyalashtirish: NIH R35NS116835; Lundbeck Foundation R209-2015-2724; Warwara Larsen Foundation 2016; Scleroseforeningen A41538; Danish Research Council DFF 6110-0064 A; NIH R01 AI137239 va AI187458; NIAMS/NIH Interdisciplinary Skin Biology Training Program T32AR080622; NIH 1S10OD028645-01A1.

Etik tasdiq: University of California, Irvine Institutional Animal Care and Use Committee; protocol AUP-25-093; 28 Avgust 2025–28 Avgust 2028.

Data Availability: Tadqiqotda taqdim etilgan maʼlumotlar va tahlil kodi oqilona soʻrov asosida corresponding author dan olinishi mumkin.

Acknowledgment: Mualliflar MG-Igf1KO sichqon modelini yaratishdagi ishlari uchun Dina Arengoth ga minnatdorlik bildiradi.

Conflicts of Interest: Mualliflar manfaatlar toʻqnashuvi yoʻqligini eʼlon qilgan.

Litsenziya: CC BY. Manba figuralari litsenziya nuqtai nazaridan qayta ishlatilishi mumkin boʻlsa-da, Verianla maqolasida piksel nusxa oʻrniga mustaqil SVG sxemalar afzal koʻrilgan.

Asosiy talqin chegarasi: Ushbu tadqiqot mikroglial IGF-1 ning JHMV bilan yaratilgan sichqon neyroyalligʻlanishi va demiyelinizatsiyasida immun homeostaz bilan bogʻliq rolini koʻrsatadi. Inson multipl sklerozida IGF-1 davolashi, TREM2 ga yoʻnaltirilgan klinik aralashuv yoki boshqa virusli nevrologik kasalliklarga bevosita umumlashtirish ushbu tajribada sinovdan oʻtkazilmagan.