Mikroglia kaynaklı insülin benzeri büyüme faktörü 1 (insulin-like growth factor 1; IGF-1), bu çalışmada merkezi sinir sisteminin yerleşik bağışıklık hücreleri olan mikrogliaların viral nöroinflamasyon ve demiyelinizasyon sırasında bağışıklık dengesini düzenlemesine katkıda bulunan bir sinyal faktörü olarak incelenmiştir. Araştırmacılar, mikroglialardaki Igf1 genini zaman kontrollü biçimde susturabilen MG-Igf1KO farelerini glial hücreleri enfekte eden JHM suşu fare hepatit virüsü (JHMV) ile enfekte ederek IGF-1 kaybının viral kontrol, nörolojik hastalık, miyelin hasarı ve omurilikteki bağışıklık hücrelerinin yapısı üzerindeki etkilerini araştırmıştır.

Çalışmanın merkezi sonucu iki sürecin birbirinden ayrılmasıdır. Mikroglial IGF-1 kaybı JHMV'nin merkezi sinir sistemindeki replikasyonunun kontrolünü belirgin biçimde bozmamıştır; buna karşılık MG-Igf1KO farelerde klinik hastalık daha ağır seyretmiş ve özellikle enfeksiyondan 21 gün sonra omurilik demiyelinizasyonu artmıştır. Başka bir ifadeyle daha ağır doku hasarı, yalnız “daha fazla virüs bulunduğu” için açıklanamamıştır.

JHMV, glial hücrelere tropizm gösteren JHM strain of mouse hepatitis virus'tür ve farelerde akut ensefalomiyeliti izleyen immün aracılı demiyelinizasyon oluşturur. Bu model multipl sklerozun bazı klinik ve histolojik özelliklerini taklit ettiği için demiyelinizasyon araştırmalarında kullanılmaktadır; ancak JHMV enfeksiyonu insan multipl sklerozuyla aynı hastalık değildir ve bu çalışma insanlarda IGF-1 tedavisini test etmemektedir.

Farelerde mikroglial Igf1 silinmesi tamoksifenle indüklenmiştir. Hayvanlara 4–6 haftalık yaşta, beş gün boyunca günde iki kez ve enjeksiyonlar arasında altı saat olacak şekilde fare başına 1 mg tamoksifen verilmiştir. Fareler 6–8 haftalıkken intrakraniyal yolla 30 µL HBSS içinde 1200 plaque-forming unit (PFU) JHMV ile enfekte edilmiştir. Beyin ve omurilik örnekleri enfeksiyondan sonraki 7., 14. ve 21. günlerde değerlendirilmiştir.

Mikroglialardaki Igf1 transkriptleri kontrol farelerine göre enfeksiyondan sonraki 7. günde yaklaşık %70, 21. günde yaklaşık %96 azalmıştır. Buna rağmen JHMV enfeksiyonundan sonraki 21 günlük izlemde MG-Igf1KO ve kontrol grupları arasında sağkalım bakımından anlamlı fark görülmemiştir. Viral titre ve viral RNA sonuçları da IGF-1 silinmesinin temel viral kontrolü bozduğunu göstermemiştir.

Buna karşılık nörolojik hastalık şiddeti MG-Igf1KO farelerde artmıştır. Kontrol ve knockout hayvanlarda 14. günde demiyelinizasyon benzerken, 21. günde MG-Igf1KO farelerin omuriliklerinde anlamlı derecede daha fazla demiyelinizasyon saptanmıştır. Enfekte olmayan erişkin MG-Igf1KO farelerde başlangıç miyelin düzeyi ve myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) konsantrasyonu kontrollere göre farklı olmadığı için geç dönemdeki artmış miyelin kaybı, yalnız genetik modelin erişkin omurilikte başlangıç miyelinini azaltmasıyla açıklanmamaktadır.

Akım sitometrisi, 21. günde MG-Igf1KO omuriliğinde toplam CD8⁺ T-hücresi sayısının arttığını; toplam CD4⁺, virüse özgü CD4⁺ T-hücreleri ile makrofaj ve mikroglia toplam sayılarında aynı türden belirgin artış olmadığını göstermiştir. Virüse özgü CD8⁺ T-hücrelerinde artış eğilimi görülmüş fakat bu karşılaştırma anlamlı bulunmamıştır.

CyTOF mass cytometry analizinde daha seçici bir bağışıklık değişimi belirlenmiştir. MG-Igf1KO omuriliğinde CD8⁺ Ly6C⁺ efektör T-hücrelerinin oranı artarken, düzenleyici özelliklerle uyumlu Tr1-benzeri CD4⁺ T-hücresi kümesi azalmıştır. Bununla birlikte CyTOF örneklem büyüklüğü grup başına yalnız \(n=4\)'tür ve 23 metacluster için yapılan differential-abundance testlerinin p-değerleri kaynakta keşifsel olarak, çoklu karşılaştırma düzeltmesi uygulanmadan raporlanmıştır. Bu nedenle bu sonuçlar güçlü biyolojik işaretlerdir fakat büyük örneklemli doğrulama yerine geçmez.

Imaging mass cytometry (IMC) sonuçları mikroglial IGF-1 kaybının yalnız hücre sayılarını değil, bağışıklık hücrelerinin doku içindeki fenotip ve konum ilişkilerini de değiştirdiğini göstermektedir. Aktivasyon gösteren Iba1⁺CD68⁺ mikroglialarda TREM2 ekspresyonu MG-Igf1KO grubunda azalmış ve disease-associated microglia (DAM) olgunlaşma oranı kontroldeki %83,4'ten MG-Igf1KO grubunda %76,7'ye düşmüştür. Her iki karşılaştırma Benjamini–Hochberg false discovery rate düzeltmesinden sonra \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}017\) ile anlamlı kalmıştır.

Kaynak ayrıca MG-Igf1KO lezyonlarında aktive mikrogliaların kendi aralarında daha fazla kümelendiğini ve CD8⁺ T-hücreleriyle mekânsal yakınlıklarının arttığını bildirmiştir. Buna karşılık Iba1⁺CD163⁺ düzenleyici myeloid hücrelerin CD8 T-hücrelerine yakınlığındaki grup farkı yalnız bir eğilimdir ve FDR düzeltmesinden sonra anlamlı değildir (\(p_{\mathrm{adj}}=0{,}240\)). Bu ayrım önemlidir: kaynak CD163⁺ hücrelerin konumsal değişimini biyolojik modelin bir parçası olarak tartışsa da grup düzeyindeki bu tek karşılaştırma istatistiksel olarak kesinleşmiş değildir.

Daha güçlü bulgu, CD8 T-hücrelerinin 30 µm yakınında bulunan CD163⁺ myeloid hücrelerdeki arginase-1 (Arg1) sinyalidir. Kontrol grubunda CD8'e yakın hücrelerde median Arg1 değeri 4,17 iken MG-Igf1KO grubunda 3,89 bulunmuştur; cell-level karşılaştırmada \(p<0{,}001\) raporlanmıştır. Ancak bu analiz yaklaşık 16.000 hücreyi içerdiği için p-değerinin çok küçük olması biyolojik örneklem büyüklüğünün 16.000 olduğu anlamına gelmez. Mouse-level analizde 12 fonksiyonel marker'ın genel ekspresyonunda anlamlı fark bulunmaması, Arg1 değişiminin bütün myeloid popülasyona yayılmış bir kayıp yerine özellikle myeloid–T-hücre arayüzünde görülen mekânsal bir özellik olduğunu desteklemektedir.

Araştırmacılar bu sonuçlardan mikroglia kaynaklı IGF-1'in, viral enfeksiyonun ilk kontrolünü sağlayan antiviral mekanizmanın vazgeçilmez bir bileşeninden ziyade, koruyucu inflamasyonun kronik immünopatolojiye dönüşmesini sınırlayan bir nöroimmün denge düzenleyicisi olabileceği sonucuna ulaşmaktadır. Önerilen IGF-1–TREM2–DAM–CD163/Arg1–CD8 ekseni önemli bir mekanistik modeldir; ancak TREM2 azalmasının mekânsal bağışıklık bozukluğunu doğrudan oluşturduğu bu çalışmada nedensel müdahaleyle kanıtlanmamıştır.

Mikroglia Kaynaklı IGF-1 Bu Çalışmada Ne İşe Yarıyor?

Mikroglia kaynaklı IGF-1, çalışmanın sonuçlarına göre JHMV'nin temel viral temizliğini sağlayan zorunlu antiviral faktörden çok, enfekte merkezi sinir sisteminde mikroglial olgunlaşmayı, bağışıklık hücreleri arasındaki dengeyi ve miyelin hasarının sınırlandırılmasını destekleyen bir nöroimmün homeostaz düzenleyicisi olarak davranmaktadır.

Mikroglia nedir?

Mikroglialar merkezi sinir sisteminin yerleşik myeloid bağışıklık hücreleridir. Normal koşullarda doku homeostazının korunmasına, gelişim sırasında miyelinizasyona, hasar sonrasında hücresel debris'in temizlenmesine ve enfeksiyon sırasında yerel bağışıklık yanıtının düzenlenmesine katkıda bulunurlar.

Miyelin, aksonların çevresini saran ve elektriksel sinyal iletimini destekleyen lipid ve protein bakımından zengin yalıtıcı yapıdır. Merkezi sinir sisteminde miyelini oligodendrositler üretir. Demiyelinizasyon ise bu kılıfın hasar görmesi veya kaybolmasıdır.

IGF-1 nedir?

Insulin-like growth factor 1 (IGF-1), büyüme ve organ gelişiminde görev yapan bir büyüme faktörüdür. Merkezi sinir sisteminde mikroglia ve makrofajlar IGF-1 kaynaklarından biridir. Önceki biyolojik bilgiler, IGF-1'in oligodendrosit progenitor hücrelerinin çoğalması ve oligodendrosit yönünde farklılaşmasıyla ilişkili olduğunu göstermektedir.

Bu çalışma IGF-1'in bütün vücuttaki bütün rollerini araştırmamaktadır. Deneyin odak noktası, mikroglialarda Igf1 ekspresyonunun zaman kontrollü biçimde azaltılması ve bunun JHMV kaynaklı nöroinflamasyon sırasındaki etkisidir.

MG-Igf1KO modeli nedir?

MG-Igf1KO modeli, Cx3cr1CreERT/+ : Igf1fl/fl genetik yapısını kullanan, tamoksifenle indüklenebilen Cre-loxP tabanlı bir fare modelidir. Kaynak bunu mikroglia-özgül Igf1 ablasyonu için kullanmaktadır.

Tamoksifen, CreERT sistemini aktive ederek flox bölgeleri arasında bulunan hedef gen bölgesinin rekombinasyonunu sağlar. Buradaki amaç erişkinliğe yaklaşan hayvanlarda mikroglial IGF-1'i zaman kontrollü biçimde azaltmaktır.

qPCR'deki ΔCt ne anlama geliyor?

Kaynak, hedef RNA sinyalini GAPDH adlı iç kontrol gene göre normalize etmektedir. Yöntemdeki tanım aşağıdaki farkla ifade edilebilir:

\(Ct\), PCR floresans sinyalinin belirlenmiş eşiği geçtiği cycle sayısıdır. Kaynağın kullandığı yorumda daha düşük \(\Delta Ct\), hedef mRNA'nın daha yüksek başlangıç düzeyine; daha yüksek \(\Delta Ct\) ise daha düşük başlangıç düzeyine işaret eder. Bunun nedeni yüksek başlangıç RNA miktarının tespit eşiğine daha az amplifikasyon döngüsüyle ulaşmasıdır.

JHMV Modeli Multipl Sklerozla Aynı Şey midir?

Hayır. JHMV ile oluşturulan fare modeli akut viral ensefalomiyelit ve ardından immün aracılı demiyelinizasyon üretir ve multipl sklerozun bazı klinik ve histolojik özelliklerini taklit eder; ancak insan multipl sklerozunun kendisi değildir ve bu çalışmanın sonuçları doğrudan MS hastalarında tedavi etkinliği olarak yorumlanamaz.

JHMV nedir?

JHMV, mouse hepatitis virus'un nörotropik JHM suşudur ve bir murine coronavirus'tür. Bu çalışmada virüs intrakraniyal olarak verilmiştir. Enfeksiyon sırasında glial hücrelerde viral replikasyon meydana gelir; virüs-spesifik T-hücreleri ve başka bağışıklık hücreleri merkezi sinir sistemine göç eder.

JHMV enfeksiyonundan sağ çıkan hayvanların önemli bölümünde daha sonra bağışıklık sistemi aracılı demiyelinizasyon gelişebilir. Bu nedenle model, viral enfeksiyon, kronik nöroinflamasyon ve miyelin hasarı arasındaki bağlantıları incelemeye izin verir.

Deney zaman çizelgesi

Viral yük nasıl ölçüldü?

Beyindeki enfeksiyöz JHMV miktarı DBT astrocytoma hücrelerinde plaque assay ile değerlendirilmiştir. Plaque-forming unit, çoğalabilen ve hücre tabakasında görünür enfeksiyon odağı oluşturabilen virüs birimini temsil eder.

Omurilikte JHMV RNA miktarı ise RNA ekstraksiyonu, cDNA sentezi ve qPCR kullanılarak incelenmiştir. Viral matrix glycoprotein transkriptleri GAPDH iç kontrolüne göre normalize edilmiştir.

Demiyelinizasyon nasıl ölçüldü?

Omuriliğin torakal 6–10 seviyelerine karşılık gelen bölümü çıkarılmış, %4 paraformaldehitte fikse edilmiş, %30 sukrozla cryoprotection uygulanmış ve 1 mm transverse bloklara ayrılmıştır. Doku 8 µm kalınlığında kesilmiştir.

Kesitler hematoksilen-eozin (H&E) ile birlikte Luxol fast blue (LFB) kullanılarak boyanmıştır. LFB miyelin bakımından zengin alanların histolojik olarak değerlendirilmesine yardımcı olur. Fare başına 5–8 kesit analiz edilmiş ve demiyelinize beyaz cevher alanının toplam beyaz cevhere oranı ImageJ v1.54m ile hesaplanmıştır.

Enfekte olmayan hayvanlarda başlangıç myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) düzeyleri ayrıca ELISA ile incelenmiştir.

TREM2 ve Disease-Associated Microglia Geçişi Neden Önemlidir?

TREM2, çalışmada aktive mikrogliaların hasara yanıt veren disease-associated microglia (DAM) fenotipine ilerlemesinin belirteçlerinden biri olarak kullanılmıştır; MG-Igf1KO hayvanlarda TREM2 azalması ve DAM oranındaki düşüş, mikrogliaların hasar algılama ve debris temizliğiyle ilişkili olgunlaşma programının tam olarak gelişemediği bir durumla uyumludur ancak TREM2 azalmasının bütün sonraki bozuklukların doğrudan nedeni olduğu kanıtlanmamıştır.

TREM2 nedir?

TREM2, myeloid hücrelerde bulunan bir reseptördür ve mikrogliaların lipid algısı, fagositik yanıtı ve hasarlı dokuyla etkileşiminde rol oynar. Bu çalışmada TREM2'nin önemi, toplam mikroglia sayısından farklı bir biyolojik soruyu yanıtlamasıdır: mikroglia yalnız orada mı, yoksa hasara yanıt veren uygun fonksiyonel fenotipe doğru olgunlaşıyor mu?

Aktive mikroglia ve DAM nasıl tanımlandı?

IMC analizinde aktive mikroglialar:

olarak; disease-associated microglia ise:

olarak sınıflandırılmıştır.

Kaynağın DAM maturation ratio tanımı:

şeklindedir. Burada DAM, TREM2 pozitif disease-associated microglia alt grubunu; Act_MG ise hiyerarşik sınıflandırmada TREM2 eşik değerini karşılamayan aktive mikroglia kategorisini temsil eder.

Bu karşılaştırmalar mouse-level \(n=6\) kontrol ve \(n=6\) MG-Igf1KO fare üzerinde Mann–Whitney U testiyle yapılmış ve sekiz testlik Benjamini–Hochberg FDR family içinde düzeltilmiştir.

“TREM2 düşük, dolayısıyla demiyelinizasyonu TREM2 oluşturdu” denebilir mi?

Hayır. Kaynağın kendisi bu konuda temkinlidir. TREM2 düzeyi ile aktive mikrogliaların kendi aralarında kümelenmesi, DAM ile mekânsal ilişkisi ve CD8 T-hücrelerine yakınlığı arasında anlamlı korelasyonlar bulunmuştur; ancak korelasyon TREM2 azalmasının mekânsal yeniden yapılanmanın doğrudan nedeni olduğunu kanıtlamaz.

Yazarlar bu nedenselliği çözmek için JHMV modelinde doğrudan TREM2 loss-of-function veya TREM2 agonist müdahalelerin gerekli olduğunu belirtmektedir.

CyTOF ile Imaging Mass Cytometry Arasındaki Fark Nedir?

CyTOF bu çalışmada omurilikteki immün hücre popülasyonlarının yüksek boyutlu fenotip ve bolluk dağılımını ölçmek için kullanılırken, imaging mass cytometry aynı zamanda bu hücrelerin doku içinde nerede bulunduğunu ve birbirlerine yaklaşık 30 µm ölçeğinde nasıl komşuluk ettiğini incelemeye olanak vermiştir.

CyTOF nasıl çalıştı?

CyTOF, fluorophore yerine farklı metal izotoplarıyla işaretlenmiş antikorlar kullanarak çok sayıda hücresel marker'ın aynı hücrelerde ölçülebilmesine olanak veren mass cytometry yöntemidir.

Kaynakta hücreler viability staining ve yüzey/intracellular antibody staining sonrasında Standard BioTools Helios sisteminde analiz edilmiştir. Veri dosyaları CyTOF Software v7.0.8493 ile normalize edilmiş, batch effect'ler CytoNorm ile düzeltilmiş ve ölü hücreler, debris, doublet'ler ile normalization bead'leri analiz dışı bırakılmıştır.

FlowSOM unsupervised clustering uygulanmış, dimensionality reduction opt-SNE/t-SNE görselleştirmesiyle sunulmuştur. Mouse-level cluster frequencies toplam CD45⁺ hücrelerin yüzdesi olarak değerlendirilmiştir.

CyTOF differential-abundance analizinde grup başına:

fare bulunmaktadır. Bu küçük örneklem ve çok sayıdaki metacluster nedeniyle kaynak CyTOF sonuçlarını keşifsel çerçevede değerlendirmektedir.

Imaging mass cytometry nasıl çalıştı?

IMC için omurilik dokuları 10 µm kesilmiş; antigen retrieval 1 mM sodium citrate, pH 6,0 içinde 95–100 °C'de 20 dakika uygulanmıştır. Kesitler %3 BSA ile 30 dakika bloke edilmiş ve metal-conjugated antibody cocktail ile gece boyunca 4 °C'de inkübe edilmiştir.

Görüntüleme Hyperion Imaging System ile 200 Hz laser frequency, ablation energy 6 ve 1 µm pixel resolution kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Toplam:

ve:

analiz edilmiştir.

Ham IMC görüntüleri IMC-Denoise pipeline ile temizlenmiştir. Her marker channel için 30.000 training patch oluşturularak önce DIMR hot-pixel removal, ardından DeepSNiF shot-noise filtering uygulanmıştır.

Cellpose-SAM ile hücre segmentasyonu

Hücre sınırlarını görüntülerden çıkarmak için GPU hızlandırmalı Cellpose-SAM, cpsam model v4.0 kullanılmıştır. İki-pass strateji uygulanmıştır:

Her iki pass Ir191 ve Ir193 DNA intercalator channel'larını kullanmıştır. İkinci pass'teki yeni segmentler mevcut hücrelerle %50'den az örtüştüğünde birleştirilmiş; 500 pixel²'den büyük nesneler muhtemel doublet veya debris olarak çıkarılmıştır.

Yaklaşık 184.000 segmented object içinden 62.204 immune-associated cell downstream analysis için tutulmuştur.

Marker yoğunlukları neden arcsinh dönüşümünden geçirildi?

Marker intensity değerleri:

ve cofactor \(=1\) kullanılarak dönüştürülmüştür. Bu dönüşüm çok yüksek signal değerlerinin dynamic range'ini sıkıştırırken değerlerin rank order'ını korur ve farklı expression scale'lerine sahip marker'lar için percentile-based threshold kullanımını kolaylaştırır.

Hücre tipi sınıflandırması

Kaynak marker positivity için ağırlıklı olarak arcsinh-transformed intensity distribution'ın 75. percentile değerini kullanmıştır. Sınıflandırılan temel hücre tipleri arasında astrocyte, neuron, oligodendrocyte, microglia, activated microglia, DAM, CD4 T cell ve CD8 T cell bulunmaktadır. Hiçbir threshold'u karşılamayan hücreler “Other” olarak sınıflandırılmıştır.

Iba1⁺CD163⁺ regulatory myeloid cells ise diğer sınıfların üzerinden geçebildiği için non-exclusive overlay population olarak ayrıca analiz edilmiştir.

Mekânsal komşuluk analizi

Her doku görüntüsünde 30 pixel, yani kaynak görüntü çözünürlüğüne göre 30 µm interaction radius kullanılarak spatial neighbor graph oluşturulmuştur. Her hücre tipi çifti için gözlenen komşuluk sayıları hücre etiketlerinin:

kez rastgele permütasyonu ile oluşturulan null distributions ile karşılaştırılmış ve image-level enrichment z-score'ları elde edilmiştir.

50'den az hücre içeren görüntüler çıkarılmıştır. Mouse-level score, aynı hayvana ait görüntülerin z-score ortalamasıyla elde edilmiştir.

Rank-biserial effect size

Kaynak küçük örneklemli iki-grup Mann–Whitney U karşılaştırmalarında effect size için:

rank-biserial correlation formülünü kullanmıştır.

Burada \(U\), Mann–Whitney U istatistiği; \(n_1\) ve \(n_2\), iki grubun bağımsız biyolojik örnek sayılarıdır. Kaynak \(|r|\ge0{,}5\) değerini büyük, \(0{,}3\le|r|<0{,}5\) değerini orta ve \(|r|<0{,}3\) değerini küçük etki olarak sınıflandırmaktadır.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

IGF-1 Silinmesi Viral Yükü Artırmadan Demiyelinizasyonu Nasıl Etkiledi?

Mikroglial Igf1 silinmesi JHMV'nin temel kontrolünü bozmamış, fakat enfeksiyonun kronik döneminde klinik hastalığın ve omurilik demiyelinizasyonunun artmasıyla ilişkili olmuştur; kaynak bunu artmış viral replikasyondan çok bağışıklık homeostazının ve doku-koruyucu myeloid programların bozulmasıyla açıklayan bir model önermektedir.

Viral kontrol

Kaplan–Meier analizinde JHMV ile enfekte:

• Cre-CTRL: \(n=66\)
• MG-Igf1KO: \(n=88\)

fare arasında 21 günlük takipte anlamlı sağkalım farkı bulunmamıştır.

MG-Igf1KO farelerde klinik skorlar özellikle 6. ve 7. günlerde ve kronik dönemde 17–21. günler arasında daha yüksek bulunmuştur. Bununla birlikte viral plaque assay ve qPCR sonuçları bu daha ağır klinik tablonun viral replikasyon kontrolünün başarısızlığından kaynaklandığını desteklememektedir.

Demiyelinizasyon

Enfekte olmayan erişkin MG-Igf1KO ve kontrol farelerin LFB boyamasında başlangıç miyelin farkı görülmemiş; MOG ELISA sonuçlarında da anlamlı başlangıç farkı belirlenmemiştir.

JHMV enfeksiyonundan sonraki 14. günde grupların demiyelinizasyon düzeyi benzerdir. 21. günde ise MG-Igf1KO grubunda demiyelinizasyon kontrol grubundan daha yüksek bulunmuştur; ana sonuç metni bu fark için \(p<0{,}04\), figür açıklaması ise \(p\le0{,}05\) vermektedir.

Akım sitometrisi

Bu flow-cytometry karşılaştırmalarında Cre-CTRL grubunda \(n=10\), MG-Igf1KO grubunda \(n=4\) kullanılmış ve kaynak bu karşılaştırmaların multiple unpaired t-test ile yapıldığını, multiple-comparison correction uygulanmadığını belirtmiştir. Bu istatistiksel ayrıntı sonuçların gücü değerlendirilirken korunmalıdır.

CyTOF: efektör ve düzenleyici denge

CyTOF sonuçları toplam immün hücre artışından çok bileşim değişikliğine işaret etmiştir.

Tr1-benzeri kümenin CD39 gibi düzenleyici özelliklerle ilişkili marker'lar göstermesi bu yorumu desteklemektedir. Fakat kaynak CD49b ve LAG-3 marker'larının panelde bulunmadığını açıkça belirterek bu population'ı kesin Tr1 hücresi değil Tr1-like olarak tanımlar.

IMC: bağışıklık hücreleri doku içinde nasıl yeniden düzenlendi?

TREM2 ile mekânsal yapı arasındaki korelasyonlar

Bu korelasyonların üçü FDR düzeltmesinden sonra anlamlıdır. Bununla birlikte korelasyonlar “TREM2 azalması bu mekânsal değişikliklere neden oldu” sonucunu tek başına kanıtlamaz.

CD163 ve Arg1 sonucu neden farklı yorumlanmalıdır?

Iba1⁺CD163⁺ regulatory myeloid hücrelerin CD8 T-hücreleriyle mouse-level mekânsal enrichment'ı kontrolde median z=18,0, MG-Igf1KO'da median z=13,7 bulunmuştur. Ancak:

olduğu için grup düzeyindeki bu “dispersal” sonucu anlamlı değildir ve eğilim olarak tutulmalıdır.

Buna karşılık CD8 T-hücrelerinin 30 µm yakınındaki CD163⁺ hücrelerin Arg1 intensity'si:

şeklindedir. Yakın hücrelerin Cre-CTRL–MG-Igf1KO cell-level karşılaştırmasında \(p<0{,}001\) bildirilmiştir.

Bu analiz 15.979 CD163⁺ hücre üzerinden yapılmıştır. Çok yüksek hücre sayısı güçlü cell-level statistical power üretir; bununla birlikte hücre sayısı bağımsız hayvan sayısıyla aynı değildir. Kaynak da cell-level p-değerlerinin mouse-level FDR family dışında tutulması ve mouse-level sonuçlarla birlikte yorumlanması gerektiğini açıkça belirtmektedir.

Şekil 9'daki klinik korelasyonlar neden keşifsel?

Şekil 9 yalnız MG-Igf1KO fareleri içinde:

ile yapılmıştır. Beş mekânsal metrik hem peak clinical score hem cumulative clinical score ile karşılaştırıldığı için toplam 10 test bulunmaktadır.

Nominal olarak dikkat çekici sonuçlar arasında:

bulunmaktadır. Fakat kaynak açıkça 10-test family için bu korelasyonların hiçbirinin FDR düzeltmesinden sonra anlamlı kalmadığını:

şeklinde bildirir. Dolayısıyla bunlar gelecekte daha büyük kohortlarda test edilmesi gereken keşifsel ilişkiler olarak değerlendirilmelidir.

Mikroglia kaynaklı IGF-1 için önerilen bütünleşik model

Çalışmanın desteklediği sonuçlar

Mikroglia kaynaklı IGF-1'in azaltılması JHMV'nin temel CNS viral kontrolünü belirgin biçimde bozmadan daha ağır kronik klinik hastalık ve daha fazla omurilik demiyelinizasyonuyla ilişkilidir.

Mikroglial IGF-1 kaybı, toplam CD8 T-hücresi artışı ve CyTOF'ta CD8⁺Ly6C⁺ efektör population genişlemesiyle birliktedir.

MG-Igf1KO farelerde aktive mikrogliaların TREM2 ekspresyonu ve DAM maturation ratio'su azalmıştır.

MG-Igf1KO doku, aktive mikrogliaların artmış self-clustering'i ve CD8 T-hücreleriyle artmış mekânsal yakınlığıyla karakterizedir.

CD8 T-hücresi yakınındaki CD163⁺ myeloid hücrelerde Arg1 intensity'si MG-Igf1KO grubunda daha düşüktür.

Bu bulgular mikroglia kaynaklı IGF-1'in viral demiyelinizasyon sırasında immün aktivasyon ile düzenleme/çözülme arasındaki dengenin korunmasına katkı verdiği yorumunu desteklemektedir.

Çalışmanın desteklemediği sonuçlar

Çalışma IGF-1'in insanlarda multipl skleroz tedavisi olduğunu göstermemektedir.

Çalışma JHMV enfeksiyonunun insan multipl sklerozuyla aynı hastalık olduğunu göstermemektedir.

Çalışma daha ağır demiyelinizasyonun daha yüksek viral yükten kaynaklandığını göstermemektedir.

Çalışma TREM2 azalmasının bütün mekânsal immün değişikliklerin doğrudan nedeni olduğunu kanıtlamamaktadır.

Çalışma CD163⁺ myeloid hücrelerin CD8 T-hücrelerinden grup düzeyinde istatistiksel olarak kesin biçimde uzaklaştığını göstermemektedir; ilgili karşılaştırma \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}240\)'tır.

Şekil 9'daki nominal klinik korelasyonlar multiple-testing correction sonrasında anlamlı kalmadığı için doğrulanmış prognostic biomarker ilişkileri değildir.

Fare modelindeki genetik Igf1 silinmesinden elde edilen sonuçlar, sistemik veya lokal IGF-1 ilacı verilmesinin insanlarda aynı yönde ve güvenli biçimde etki edeceğini göstermemektedir.

Başlıca yöntemsel sınırlılıklar

Hayvan modeli: Sonuçlar murine JHMV enfeksiyonuna aittir; insan hastalığına doğrudan genellenemez.

Örneklem büyüklüğü: CyTOF analizinde \(n=4\)/grup, IMC analizinde \(n=6\)/grup kullanılmıştır. Özellikle within-genotype klinik korelasyonlar yalnız altı MG-Igf1KO fareye dayanmaktadır.

CyTOF çoklu karşılaştırmaları: Kaynak CyTOF differential-abundance p-değerlerini 23 metacluster boyunca keşifsel olarak düzeltmesiz raporlamıştır.

Cell-level pseudo-replication riski: Arg1 analizi 15.979 hücre içerse de bağımsız biyolojik birim hücre değil faredir. Kaynak bunu mouse-level sonuçlarla birlikte yorumlamaktadır.

Nedensellik: TREM2–mekânsal organizasyon korelasyonları nedensel yönü belirleyemez.

Tr1 tanımı: CD49b ve LAG-3 panelde bulunmadığından ilgili CD4 population yalnız Tr1-benzeri olarak adlandırılmıştır.

Kaynakta cinsiyet bilgisi: İncelenen ana yöntem metninde deney hayvanlarının cinsiyeti açık biçimde raporlanmamaktadır; bu nedenle cinsiyete özgü sonuç çıkarılamaz.

Kaynak-içi metot tutarsızlıkları: CyTOF cluster sayısı, bazı istatistik testlerinin yazımı ve IMC marker panel büyüklüğü farklı bölümlerde tam olarak aynı raporlanmamıştır. Verianla bu farklılıkları sessizce birleştirmemiştir.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün başlık: Microglial-Derived IGF-1 Serves as a Regulator for Neuroimmune Homeostasis During Viral-Induced Demyelination

Yazarlar: Vanessa M. Scarfone, Collin Pachow, Pauline U. Nguyen, Anita Lakatos, Jamie-Jean De La Torre, Alisa Xie, Kellie Fernandez, Charlene Collado, Kaitlin Murray, Roberto Tinoco, Craig M. Walsh, Trevor Owens, Agnieszka Wlodarczyk, Thomas E. Lane.

Eş katkı: Vanessa M. Scarfone ve Collin Pachow.

Corresponding author: Thomas E. Lane.

E-posta: tlane@uci.edu

Kurum 1: Sue & Bill Gross Stem Cell Research Center, University of California, Irvine, CA 92697, USA.

Kurum 2: Department of Molecular Biology and Biochemistry, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, CA 92697, USA.

Kurum 3: Department of Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine, 2213 McGaugh Hall, Irvine, CA 92697, USA.

Kurum 4: Center for Virus Research, University of California, Irvine, CA 92697, USA.

Kurum 5: Neurobiology Research, Department of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, 5000 Odense, Denmark.

Dergi: Viruses.

Yayınevi: MDPI, Basel, Switzerland.

Yıl: 2026.

Cilt: 18.

Sayı: 5.

Makale numarası: 550.

DOI: 10.3390/v18050550.

Received: 6 Nisan 2026.

Revised: 1 Mayıs 2026.

Accepted: 6 Mayıs 2026.

Published: 9 Mayıs 2026.

Kaynak türü: Hakemli özgün araştırma makalesi.

Lisans: Creative Commons Attribution (CC BY).

Resmî yayın bağlantısı: https://www.mdpi.com/1999-4915/18/5/550

Akademik editör: Maria Cecilia Garibaldi Marcondes.

Bilimsel alan: Nöroimmünoloji, nöroviroloji, demiyelinizasyon, mikroglia biyolojisi ve viral merkezi sinir sistemi enfeksiyonu.

Çalışma türü: Genetik fare modeli + viral enfeksiyon + histopatoloji + flow cytometry + CyTOF mass cytometry + imaging mass cytometry + mekânsal hücre analizi.

Fare modeli: MG-Igf1KO, Cx3cr1CreERT/+ : Igf1fl/fl; kontrol, Cx3cr1CreERT/+ : Igf1+/+.

Gen indüksiyonu: 4–6 haftalık yaşta fare başına 1 mg tamoksifen, 100 µL intraperitoneal enjeksiyon, günde iki kez, enjeksiyonlar arasında altı saat, beş ardışık gün.

Viral challenge: 6–8 haftalık yaşta 30 µL HBSS içinde 1200 PFU JHMV, intrakraniyal.

Örnekleme: 7., 14. ve 21. gün post-infection.

Viral yük: Beyin plaque assay; omurilik JHMV mRNA qPCR.

Histoloji: H&E + Luxol fast blue; 8 µm spinal-cord cryosections; fare başına 5–8 kesit; ImageJ v1.54m.

MOG ölçümü: Abcam ab282304 ELISA; Varioskan LUX.

Flow cytometry: Novocyte; analiz FlowJo v10.0.8 ve 11.0.2; FACS sorting BD FACSAria Fusion.

CyTOF: Standard BioTools Helios; normalization CyTOF Software v7.0.8493; OMIQ; CytoNorm; FlowSOM; opt-SNE/t-SNE.

CyTOF biyolojik örneklem: \(n=4\)/genotip.

IMC: Hyperion Imaging System; 39 tissue image; 12 fare, 6 Cre-CTRL + 6 MG-Igf1KO; 200 Hz; ablation energy 6; 1 µm pixel resolution.

IMC denoising: IMC-Denoise; DIMR + DeepSNiF; marker channel başına 30.000 training patch.

Segmentasyon: Cellpose-SAM cpsam v4.0, GPU acceleration, two-pass segmentation.

Spatial neighborhood radius: 30 pixel = 30 µm.

Permutation sayısı: 500 random cell-label permutation.

IMC analysis cell count: Yaklaşık 184.000 segmented object içinden 62.204 immune-associated cell.

CD163/Arg1 analysis: 15.979 Iba1⁺CD163⁺ cell; %84,2 CX3CR1⁺.

IMC mouse-level statistics: İki yönlü Mann–Whitney U; Benjamini–Hochberg FDR, \(Q=0{,}05\), ana family size = 8.

TREM2 spatial-correlation family: Ayrı dört testlik FDR family.

Klinik–mekânsal korelasyonlar: MG-Igf1KO \(n=6\); beş spatial metric × iki clinical metric = 10 test; kaynak p-değerlerini nominal raporlamıştır ve hiçbiri FDR sonrası \(p_{\mathrm{adj}}<0{,}05\) olmamıştır.

Figure 1 survival örneklemi: Cre-CTRL \(n=66\); MG-Igf1KO \(n=88\).

Figure 3 flow-cytometry örneklemi: Cre-CTRL \(n=10\); MG-Igf1KO \(n=4\).

Ana TREM2 sonucu: MG-Igf1KO activated microglia'da TREM2 azalması, \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}017\).

DAM maturation ratio: Cre-CTRL %83,4; MG-Igf1KO %76,7; \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}017\).

Activated microglia self-clustering: MG-Igf1KO'da artmış; \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}047\).

Activated microglia–CD8 T-cell proximity: MG-Igf1KO'da artmış; \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}047\).

CD163+–CD8 spatial enrichment: Kontrol median z=18,0; MG-Igf1KO median z=13,7; \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}240\), anlamlı değil.

CD163+ Arg1 interface: CD8'e yakın cell median intensity Cre-CTRL 4,17, MG-Igf1KO 3,89; cell-level \(p<0{,}001\). CD8'den uzak her iki genotip median 3,13.

Kaynak-içi CyTOF population-count notu: yöntem kısmı FlowSOM için 25 metacluster ve 23 immune lineage bildirirken, başka metin/figür açıklamalarında farklı toplam cluster/population sayıları görülmektedir. Bu sayılar Verianla tarafından sessizce eşitlenmemiştir.

Kaynak-içi IMC marker-count notu: kaynak bir yerde 27-marker IMC panel, tissue-staining yönteminde ise 36-marker metal-conjugated panel/36 marker channel bildirmektedir. Kaynak bu farkın analysis subset mi yoksa metinsel tutarsızlık mı olduğunu açık biçimde çözmemektedir.

Kaynak-içi istatistik notu: bazı figür açıklamalarındaki test tanımları ana istatistik yöntem bölümüyle tamamen aynı değildir. Verianla nicel p-değerlerini kaynaktaki bağlamıyla korumuş ve yöntem adındaki uyuşmazlıkları kesinleştirmemiştir.

Supplementary Material: opt-SNE cluster overlays, bütün immune clusters, CyTOF cluster marker-expression profile, spatial neighborhood enrichment; ayrıca CyTOF ve IMC antibody panelleri ile key immune population tabloları.

Yazar katkıları: Conceptualization: T.E.L., V.M.S., C.P.; methodology: V.M.S., C.P., P.U.N., A.L., J.-J.D.L.T., A.X., K.F., K.M., C.C.; software and validation: V.M.S.; formal analysis: V.M.S., C.P., T.E.L., R.T.; resources: T.O., A.W., C.M.W.; original draft: V.M.S., C.P.; review and editing: V.M.S., T.E.L., A.W., T.O., R.T., C.M.W.; supervision: T.E.L.; funding acquisition: T.E.L., A.W., T.O., R.T., C.M.W.

Finansman: NIH R35NS116835; Lundbeck Foundation R209-2015-2724; Warwara Larsen Foundation 2016; Scleroseforeningen A41538; Danish Research Council DFF 6110-0064 A; NIH R01 AI137239 ve AI187458; NIAMS/NIH Interdisciplinary Skin Biology Training Program T32AR080622; NIH 1S10OD028645-01A1.

Etik onay: University of California, Irvine Institutional Animal Care and Use Committee; protocol AUP-25-093; 28 Ağustos 2025–28 Ağustos 2028.

Data Availability: Çalışmada sunulan veriler ve analiz kodu, makul talep üzerine corresponding author'dan alınabilir.

Acknowledgment: Yazarlar MG-Igf1KO fare modelinin oluşturulmasındaki çalışmaları için Dina Arengoth'a teşekkür etmektedir.

Conflicts of Interest: Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmiştir.

Lisans: CC BY. Kaynak figürleri lisans bakımından yeniden kullanılabilir olsa da Verianla makalesinde piksel kopyası yerine bağımsız SVG şemaları tercih edilmiştir.

Temel yorum sınırı: Bu çalışma mikroglial IGF-1'in JHMV ile oluşturulan fare nöroinflamasyonu ve demiyelinizasyonunda immün homeostazla ilişkili rolünü gösterir. İnsan multipl sklerozunda IGF-1 tedavisi, TREM2 hedefli klinik müdahale veya başka viral nörolojik hastalıklara doğrudan genelleme bu deney tarafından test edilmemiştir.