Insulin-like growth factor 1 inayotokana na microglia (insulin-like growth factor 1; IGF-1), katika utafiti huu imechunguzwa kama sababu ya uashiriaji inayochangia uwezo wa microglia, ambazo ni seli za kinga zinazokaa katika mfumo mkuu wa neva, kudhibiti usawaziko wa kinga wakati wa neuroinflammation ya virusi na demyelination. Watafiti waliambukiza panya wa MG-Igf1KO, ambao wanaweza kuzimisha jeni Igf1 katika microglia kwa udhibiti wa muda, kwa JHM strain of mouse hepatitis virus (JHMV) inayolenga seli za glia, ili kuchunguza athari za kupotea kwa IGF-1 katika udhibiti wa virusi, ugonjwa wa neva, uharibifu wa myelin na muundo wa seli za kinga katika uti wa mgongo.

Matokeo ya msingi ya utafiti ni kutenganishwa kwa michakato miwili. Kupotea kwa IGF-1 ya microglia hakukuvuruga kwa kiasi kikubwa udhibiti wa replication ya JHMV katika mfumo mkuu wa neva; kwa upande mwingine, ugonjwa wa kliniki ulikuwa mkali zaidi kwa panya wa MG-Igf1KO na demyelination ya uti wa mgongo iliongezeka hasa siku 21 baada ya maambukizi. Kwa maneno mengine, uharibifu mkubwa zaidi wa tishu haukuweza kuelezwa tu kwa kusema kwamba “kulikuwa na virusi zaidi”.

JHMV ni JHM strain of mouse hepatitis virus yenye tropism kwa seli za glia na husababisha demyelination inayopatanishwa na kinga baada ya acute encephalomyelitis katika panya. Kwa sababu modeli hii huiga baadhi ya sifa za kliniki na histolojia za multiple sclerosis, hutumiwa katika tafiti za demyelination; hata hivyo, maambukizi ya JHMV si ugonjwa uleule na multiple sclerosis ya binadamu, na utafiti huu haujaribu matibabu ya IGF-1 kwa binadamu.

Ufutaji wa Igf1 katika microglia za panya uliinduliwa kwa tamoxifen. Wanyama walipewa 1 mg tamoxifen kwa kila panya katika umri wa wiki 4–6, mara mbili kwa siku kwa siku tano, huku kukiwa na saa sita kati ya sindano. Panya walipo kuwa na umri wa wiki 6–8 waliambukizwa intracranially kwa 1200 plaque-forming unit (PFU) JHMV ndani ya 30 µL HBSS. Sampuli za ubongo na uti wa mgongo zilitathminiwa siku ya 7., 14. na 21. baada ya maambukizi.

Transcripts za Igf1 katika microglia zilipungua kwa takriban %70 siku ya 7. na takriban %96 siku ya 21. baada ya maambukizi ikilinganishwa na panya wa udhibiti. Pamoja na hayo, katika ufuatiliaji wa siku 21 baada ya maambukizi ya JHMV hakukuwa na tofauti kubwa ya survival kati ya kundi la MG-Igf1KO na kundi la udhibiti. Matokeo ya viral titer na viral RNA pia hayakuonyesha kwamba ufutaji wa IGF-1 uliharibu udhibiti wa msingi wa virusi.

Kinyume chake, ukali wa ugonjwa wa neva uliongezeka katika panya wa MG-Igf1KO. Ingawa demyelination ilikuwa sawa katika wanyama wa udhibiti na knockout siku ya 14., siku ya 21. kulikuwa na demyelination nyingi zaidi kwa kiwango cha maana katika uti wa mgongo wa panya wa MG-Igf1KO. Kwa kuwa kiwango cha awali cha myelin na mkusanyiko wa myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) katika panya watu wazima wa MG-Igf1KO ambao hawajaambukizwa haukutofautiana na udhibiti, upotevu mkubwa zaidi wa myelin katika kipindi cha baadaye hauelezeki tu kwa kupungua kwa myelin ya awali katika uti wa mgongo wa watu wazima kutokana na modeli ya kijeni.

Flow cytometry ilionyesha kwamba siku ya 21. idadi ya jumla ya CD8⁺ T-cells iliongezeka katika uti wa mgongo wa MG-Igf1KO; lakini hakukuwa na ongezeko la aina hiyo lililo wazi katika idadi ya jumla ya CD4⁺, CD4⁺ T-cells maalumu kwa virusi, macrophages na microglia. Kulikuwa na mwelekeo wa kuongezeka kwa CD8⁺ T-cells maalumu kwa virusi, lakini ulinganisho huu haukupatikana kuwa wa maana.

Katika uchanganuzi wa CyTOF mass cytometry, mabadiliko ya kinga yaliyokuwa mahususi zaidi yalibainishwa. Katika uti wa mgongo wa MG-Igf1KO, uwiano wa CD8⁺ Ly6C⁺ effector T-cells uliongezeka huku cluster ya Tr1-like CD4⁺ T-cell yenye sifa zinazolingana na udhibiti wa kinga ikipungua. Hata hivyo, ukubwa wa sampuli ya CyTOF ni \(n=4\) pekee kwa kila kundi na p-values za differential-abundance tests kwa 23 metacluster ziliripotiwa katika chanzo kama za uchunguzi, bila multiple-comparison correction. Kwa hiyo, matokeo haya ni ishara zenye nguvu za kibiolojia lakini hayachukui nafasi ya uthibitishaji kwa sampuli kubwa.

Matokeo ya imaging mass cytometry (IMC) yanaonyesha kwamba kupotea kwa IGF-1 ya microglia hubadilisha si tu idadi ya seli bali pia uhusiano wa phenotype na nafasi wa seli za kinga ndani ya tishu. Katika Iba1⁺CD68⁺ microglia zinazoonyesha activation, expression ya TREM2 ilipungua katika kundi la MG-Igf1KO na disease-associated microglia (DAM) maturation ratio ilishuka kutoka %83,4 katika udhibiti hadi %76,7 katika kundi la MG-Igf1KO. Ulinganisho wote wawili uliendelea kuwa wa maana kwa \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}017\) baada ya Benjamini–Hochberg false discovery rate correction.

Chanzo pia kimeripoti kwamba katika lesions za MG-Igf1KO, activated microglia zilikuwa na clustering zaidi kati yao na spatial proximity yao kwa CD8⁺ T-cells iliongezeka. Kwa upande mwingine, tofauti ya kundi katika ukaribu wa Iba1⁺CD163⁺ regulatory myeloid cells kwa CD8 T-cells ilikuwa mwelekeo tu na haikuwa ya maana baada ya FDR correction (\(p_{\mathrm{adj}}=0{,}240\)). Tofauti hii ni muhimu: ingawa chanzo kinajadili mabadiliko ya nafasi ya CD163⁺ cells kama sehemu ya modeli ya kibiolojia, ulinganisho huu mmoja wa kiwango cha kundi haujathibitishwa kwa uhakika wa kitakwimu.

Ugunduzi wenye nguvu zaidi ni signal ya arginase-1 (Arg1) katika CD163⁺ myeloid cells zilizoko ndani ya 30 µm ya CD8 T-cells. Katika kundi la udhibiti, median Arg1 katika seli zilizo karibu na CD8 ilikuwa 4,17, ilhali katika kundi la MG-Igf1KO ilikuwa 3,89; katika cell-level comparison \(p<0{,}001\) iliripotiwa. Hata hivyo, kwa sababu uchanganuzi huu unajumuisha takriban 16.000 cells, p-value ndogo sana haimaanishi kuwa ukubwa wa sampuli ya kibaolojia ni 16.000. Kutokuwepo kwa tofauti ya maana katika expression ya jumla ya 12 functional marker katika mouse-level analysis kunaunga mkono kwamba mabadiliko ya Arg1 si upotevu ulioenea katika myeloid population yote bali ni spatial feature inayoonekana hasa katika myeloid–T-cell interface.

Kwa msingi wa matokeo haya, watafiti wanahitimisha kwamba IGF-1 inayotokana na microglia inaweza kuwa mdhibiti wa usawaziko wa neuroimmune unaopunguza mabadiliko ya protective inflammation kuwa chronic immunopathology, badala ya kuwa sehemu isiyoweza kubadilishwa ya antiviral mechanism inayohakikisha udhibiti wa awali wa maambukizi ya virusi. Mhimili uliopendekezwa wa IGF-1–TREM2–DAM–CD163/Arg1–CD8 ni modeli muhimu ya kimakanika; hata hivyo, utafiti huu haujathibitisha kwa causal intervention kwamba kupungua kwa TREM2 ndiko kunakosababisha moja kwa moja spatial immune dysfunction.

IGF-1 Inayotokana na Microglia Inafanya Kazi Gani Katika Utafiti Huu?

Kulingana na matokeo ya utafiti, IGF-1 inayotokana na microglia hufanya kazi zaidi kama mdhibiti wa neuroimmune homeostasis anayesaidia microglial maturation, usawaziko kati ya seli za kinga na kuzuia uharibifu wa myelin katika mfumo mkuu wa neva ulioambukizwa, kuliko kuwa antiviral factor ya lazima inayohakikisha basic viral clearance ya JHMV.

Microglia ni nini?

Microglia ni resident myeloid immune cells za mfumo mkuu wa neva. Katika hali ya kawaida, huchangia kudumisha tissue homeostasis, myelination wakati wa maendeleo, kusafisha cellular debris baada ya uharibifu na kudhibiti local immune response wakati wa maambukizi.

Myelin ni muundo wa insulation wenye lipid na protein nyingi unaozunguka axons na kusaidia usafirishaji wa ishara za umeme. Katika mfumo mkuu wa neva, myelin huzalishwa na oligodendrocytes. Demyelination ni kuharibika au kupotea kwa sheath hii.

IGF-1 ni nini?

Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) ni growth factor inayohusika katika ukuaji na maendeleo ya viungo. Katika mfumo mkuu wa neva, microglia na macrophages ni miongoni mwa vyanzo vya IGF-1. Maarifa ya awali ya kibiolojia yanaonyesha kwamba IGF-1 inahusishwa na proliferation ya oligodendrocyte progenitor cells na differentiation kuelekea oligodendrocytes.

Utafiti huu hauchunguzi majukumu yote ya IGF-1 katika mwili mzima. Lengo la majaribio ni kupunguza expression ya Igf1 katika microglia kwa udhibiti wa muda na kuchunguza athari zake wakati wa neuroinflammation inayosababishwa na JHMV.

Modeli ya MG-Igf1KO ni nini?

Modeli ya MG-Igf1KO ni modeli ya panya inayotumia muundo wa kijeni Cx3cr1CreERT/+ : Igf1fl/fl, inayoweza kuinduliwa na tamoxifen na inayotegemea mfumo wa Cre-loxP. Chanzo kinaitumia kwa microglia-specific Igf1 ablation.

Tamoxifen huanzisha mfumo wa CreERT na kuruhusu recombination ya sehemu ya jeni lengwa iliyo kati ya maeneo ya flox. Lengo hapa ni kupunguza microglial IGF-1 kwa udhibiti wa muda katika wanyama wanaokaribia utu uzima.

ΔCt katika qPCR inamaanisha nini?

Chanzo hunormalize signal ya RNA lengwa kulingana na jeni la udhibiti wa ndani linaloitwa GAPDH. Ufafanuzi katika mbinu unaweza kuonyeshwa kwa tofauti ifuatayo:

\(Ct\) ni idadi ya cycle ambayo signal ya fluorescence ya PCR huvuka kizingiti kilichowekwa. Katika tafsiri inayotumiwa na chanzo, \(\Delta Ct\) ya chini inaashiria kiwango cha juu cha awali cha target mRNA, na \(\Delta Ct\) ya juu inaashiria kiwango cha chini cha awali. Sababu ni kwamba kiwango kikubwa cha RNA ya awali hufikia detection threshold kwa amplification cycles chache zaidi.

Je, Modeli ya JHMV ni Sawa na Multiple Sclerosis?

Hapana. Modeli ya panya inayotengenezwa kwa JHMV husababisha acute viral encephalomyelitis na kisha immune-mediated demyelination, na huiga baadhi ya sifa za kliniki na histolojia za multiple sclerosis; hata hivyo, si multiple sclerosis yenyewe ya binadamu, na matokeo ya utafiti huu hayawezi kutafsiriwa moja kwa moja kama ufanisi wa matibabu kwa wagonjwa wa MS.

JHMV ni nini?

JHMV ni neurotropic JHM strain ya mouse hepatitis virus na ni murine coronavirus. Katika utafiti huu virusi vilitolewa intracranially. Wakati wa maambukizi, viral replication hutokea katika seli za glia; T-cells maalumu kwa virusi na seli nyingine za kinga huhamia kwenye mfumo mkuu wa neva.

Katika sehemu kubwa ya wanyama wanaonusurika maambukizi ya JHMV, immune-mediated demyelination inaweza kuendelea baadaye. Kwa hiyo modeli hii huruhusu uchunguzi wa uhusiano kati ya maambukizi ya virusi, chronic neuroinflammation na uharibifu wa myelin.

Ratiba ya muda ya majaribio

Viral load ilipimwaje?

Kiasi cha JHMV yenye uwezo wa kuambukiza katika ubongo kilitathminiwa kwa plaque assay katika DBT astrocytoma cells. Plaque-forming unit inawakilisha kitengo cha virusi kinachoweza kuzaliana na kuunda focus inayoonekana ya maambukizi katika safu ya seli.

Kiasi cha JHMV RNA katika uti wa mgongo kilichunguzwa kwa RNA extraction, cDNA synthesis na qPCR. Viral matrix glycoprotein transcripts zilinormalishwa dhidi ya GAPDH internal control.

Demyelination ilipimwaje?

Sehemu ya uti wa mgongo inayolingana na thoracic levels 6–10 ilitolewa, ikafungwa katika %4 paraformaldehyde, ikafanyiwa cryoprotection kwa %30 sucrose na kugawanywa katika 1 mm transverse blocks. Tishu ilikatwa kwa unene wa 8 µm.

Sections zilipakwa hematoxylin-eosin (H&E) pamoja na Luxol fast blue (LFB). LFB husaidia kutathmini kihistolojia maeneo yenye myelin nyingi. Sections 5–8 kwa kila panya zilichanganuliwa na uwiano wa demyelinated white matter area kwa total white matter ukahesabiwa kwa ImageJ v1.54m.

Katika wanyama ambao hawajaambukizwa, viwango vya awali vya myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) vilichunguzwa pia kwa ELISA.

Kwa Nini Mpito wa TREM2 na Disease-Associated Microglia ni Muhimu?

TREM2 imetumiwa katika utafiti huu kama mojawapo ya markers za kuendelea kwa activated microglia kuelekea disease-associated microglia (DAM) phenotype inayojibu uharibifu; kupungua kwa TREM2 na kushuka kwa uwiano wa DAM katika wanyama wa MG-Igf1KO kunalingana na hali ambapo maturation program ya microglia inayohusiana na sensing ya uharibifu na debris clearance haijakua kikamilifu, lakini haijathibitishwa kwamba kupungua kwa TREM2 ndiko sababu ya moja kwa moja ya matatizo yote yanayofuata.

TREM2 ni nini?

TREM2 ni receptor inayopatikana katika myeloid cells na hushiriki katika lipid sensing ya microglia, phagocytic response na mwingiliano na tishu zilizoharibiwa. Umuhimu wa TREM2 katika utafiti huu ni kwamba unajibu swali tofauti la kibiolojia na idadi ya jumla ya microglia: je, microglia zipo tu, au zinakomaa kuelekea functional phenotype inayofaa kujibu uharibifu?

Activated microglia na DAM zilitambuliwaje?

Katika uchanganuzi wa IMC, activated microglia ziliainishwa kama:

na disease-associated microglia kama:

.

Ufafanuzi wa DAM maturation ratio katika chanzo ni:

. Hapa DAM inawakilisha TREM2-positive disease-associated microglia subgroup; Act_MG inawakilisha activated microglia category ambayo haifikii TREM2 threshold katika hierarchical classification.

Ulinganisho huu ulifanywa kwa mouse-level \(n=6\) control na \(n=6\) MG-Igf1KO mice kwa Mann–Whitney U test na ukarekebishwa ndani ya Benjamini–Hochberg FDR family ya tests nane.

Je, tunaweza kusema “TREM2 iko chini, kwa hiyo TREM2 ilisababisha demyelination”?

Hapana. Chanzo chenyewe ni cha tahadhari kuhusu hili. Correlations zenye maana zilipatikana kati ya kiwango cha TREM2 na clustering ya activated microglia kati yao, spatial relationship na DAM na proximity kwa CD8 T-cells; lakini correlation haithibitishi kwamba kupungua kwa TREM2 ndiko sababu ya moja kwa moja ya spatial reorganization.

Waandishi wanaeleza kwamba direct TREM2 loss-of-function au TREM2 agonist interventions katika modeli ya JHMV zinahitajika ili kutatua causal direction hii.

Tofauti Kati ya CyTOF na Imaging Mass Cytometry ni Nini?

Katika utafiti huu CyTOF ilitumika kupima high-dimensional phenotype na abundance distribution ya immune cell populations katika uti wa mgongo, wakati imaging mass cytometry pia iliruhusu kuchunguza mahali seli hizo zilipo ndani ya tishu na jinsi zinavyokuwa majirani kwa takriban kipimo cha 30 µm.

CyTOF ilifanyaje kazi?

CyTOF ni mass cytometry method inayotumia antibodies zilizowekwa alama kwa isotopes mbalimbali za metali badala ya fluorophore, na hivyo kuruhusu markers nyingi za seli kupimwa katika seli zilezile.

Katika chanzo, seli zilichanganuliwa katika Standard BioTools Helios system baada ya viability staining na surface/intracellular antibody staining. Data files zilinormalishwa kwa CyTOF Software v7.0.8493, batch effects zikasahihishwa kwa CytoNorm, na dead cells, debris, doublets na normalization beads zikaondolewa katika uchanganuzi.

FlowSOM unsupervised clustering ilitumika na dimensionality reduction iliwasilishwa kwa opt-SNE/t-SNE visualization. Mouse-level cluster frequencies zilitathminiwa kama asilimia ya total CD45⁺ cells.

Katika CyTOF differential-abundance analysis, kila kundi lilikuwa na:

panya. Kwa sababu ya sample ndogo na idadi kubwa ya metacluster, chanzo kinatafsiri matokeo ya CyTOF katika muktadha wa uchunguzi.

Imaging mass cytometry ilifanyaje kazi?

Kwa IMC, tishu za uti wa mgongo zilikatwa katika 10 µm; antigen retrieval ilifanywa katika 1 mM sodium citrate, pH 6,0 kwa 95–100 °C kwa dakika 20. Sections zilizuiliwa kwa %3 BSA kwa dakika 30 na kisha kuincubate na metal-conjugated antibody cocktail usiku kucha kwa 4 °C.

Imaging ilifanywa kwa Hyperion Imaging System kwa 200 Hz laser frequency, ablation energy 6 na 1 µm pixel resolution. Jumla ya:

na:

zilichanganuliwa.

Raw IMC images zilisafishwa kwa IMC-Denoise pipeline. Kwa kila marker channel, 30.000 training patch zilitengenezwa, kwanza DIMR hot-pixel removal na kisha DeepSNiF shot-noise filtering zikatumiwa.

Cell segmentation kwa Cellpose-SAM

GPU-accelerated Cellpose-SAM, cpsam model v4.0, ilitumika kutoa mipaka ya seli kutoka kwenye images. Two-pass strategy ilitumika:

Pass zote mbili zilitumia Ir191 na Ir193 DNA intercalator channels. New segments za pass ya pili ziliunganishwa pale zilipo overlap kwa chini ya %50 na existing cells; objects kubwa kuliko 500 pixel² zikaondolewa kama possible doublets au debris.

Kati ya takriban 184.000 segmented object, 62.204 immune-associated cell zilibaki kwa downstream analysis.

Kwa nini marker intensities zilifanyiwa arcsinh transformation?

Marker intensity values zilibadilishwa kwa:

na cofactor \(=1\). Transformation hii hufinya dynamic range ya signal values zilizo juu sana huku ikihifadhi rank order ya values na kurahisisha matumizi ya percentile-based threshold kwa markers zenye expression scale tofauti.

Uainishaji wa aina za seli

Chanzo kilitumia hasa 75. percentile ya arcsinh-transformed intensity distribution kwa marker positivity. Aina kuu za seli zilizotambuliwa ni pamoja na astrocyte, neuron, oligodendrocyte, microglia, activated microglia, DAM, CD4 T cell na CD8 T cell. Seli ambazo hazikufikia threshold yoyote ziliainishwa kama “Other”.

Iba1⁺CD163⁺ regulatory myeloid cells zilichanganuliwa kando kama non-exclusive overlay population kwa sababu zinaweza kuingiliana na classes nyingine.

Uchanganuzi wa spatial neighborhood

Katika kila tissue image, spatial neighbor graph iliundwa kwa 30 pixel, yaani 30 µm interaction radius kulingana na image resolution ya chanzo. Kwa kila jozi ya cell type, observed neighbor counts zililinganishwa na null distributions zilizoundwa kwa:

random cell-label permutations na image-level enrichment z-scores zikapatikana.

Images zenye chini ya 50 cells ziliondolewa. Mouse-level score ilipatikana kwa wastani wa z-score za images za mnyama yuleyule.

Rank-biserial effect size

Chanzo kilitumia formula ya:

rank-biserial correlation kwa effect size katika two-group Mann–Whitney U comparisons zenye samples ndogo.

Hapa \(U\) ni Mann–Whitney U statistic; \(n_1\) na \(n_2\) ni idadi ya independent biological samples katika makundi mawili. Chanzo kinaainisha \(|r|\ge0{,}5\) kama effect kubwa, \(0{,}3\le|r|<0{,}5\) kama ya kati na \(|r|<0{,}3\) kama ndogo.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Ufutaji wa IGF-1 Uliathirije Demyelination Bila Kuongeza Viral Load?

Ufutaji wa Igf1 katika microglia haukuvuruga udhibiti wa msingi wa JHMV, lakini ulihusishwa na kuongezeka kwa ugonjwa wa kliniki na demyelination ya uti wa mgongo katika kipindi cha chronic cha maambukizi; chanzo kinapendekeza modeli inayoeleza hili zaidi kwa kuvurugika kwa immune homeostasis na tissue-protective myeloid programs kuliko kwa kuongezeka kwa viral replication.

Udhibiti wa virusi

Katika Kaplan–Meier analysis, kati ya panya walioambukizwa JHMV:

• Cre-CTRL: \(n=66\)
• MG-Igf1KO: \(n=88\)

hakukuwa na tofauti ya maana ya survival katika ufuatiliaji wa siku 21.

Kwa panya wa MG-Igf1KO, clinical scores zilikuwa juu zaidi hasa siku ya 6. na 7. na katika kipindi chronic kati ya siku 17–21. Hata hivyo, matokeo ya viral plaque assay na qPCR hayaungi mkono kwamba hali hii kali zaidi ya kliniki ilitokana na kushindwa kudhibiti viral replication.

Demyelination

Katika LFB staining ya panya watu wazima wa MG-Igf1KO na control ambao hawajaambukizwa, hakukuwa na tofauti ya awali ya myelin; MOG ELISA results pia hazikuonyesha tofauti kubwa ya awali.

Siku ya 14. baada ya maambukizi ya JHMV, viwango vya demyelination vya makundi vilikuwa sawa. Siku ya 21. demyelination katika kundi la MG-Igf1KO ilikuwa juu kuliko control; main results text inatoa \(p<0{,}04\) kwa tofauti hii, huku figure legend ikitoa \(p\le0{,}05\).

Flow cytometry

Katika flow-cytometry comparisons hizi, \(n=10\) ilitumika katika kundi la Cre-CTRL na \(n=4\) katika kundi la MG-Igf1KO, na chanzo kimesema kwamba comparisons zilifanywa kwa multiple unpaired t-test bila multiple-comparison correction. Maelezo haya ya takwimu yanapaswa kuhifadhiwa wakati wa kutathmini nguvu ya matokeo.

CyTOF: usawaziko wa effector na regulatory

Matokeo ya CyTOF yaliashiria zaidi mabadiliko ya composition kuliko ongezeko la jumla la immune cells.

Kuonekana kwa markers zinazohusishwa na regulatory features kama CD39 katika Tr1-like cluster kunaunga mkono tafsiri hii. Hata hivyo, chanzo kinasema wazi kwamba CD49b na LAG-3 markers hazikuwepo kwenye panel na hivyo population hii inaitwa Tr1-like, si definitive Tr1 cells.

IMC: immune cells zilipangwa upya vipi ndani ya tishu?

Correlations kati ya TREM2 na spatial structure

Correlations tatu kati ya hizi ni za maana baada ya FDR correction. Hata hivyo, correlations peke yake hazithibitishi hitimisho kwamba “kupungua kwa TREM2 kulisababisha spatial changes hizi”.

Kwa nini matokeo ya CD163 na Arg1 yanapaswa kutafsiriwa tofauti?

Mouse-level spatial enrichment ya Iba1⁺CD163⁺ regulatory myeloid cells pamoja na CD8 T-cells ilikuwa median z=18,0 katika control na median z=13,7 katika MG-Igf1KO. Hata hivyo:

kwa hiyo matokeo haya ya “dispersal” katika group level si ya maana na yanapaswa kuhifadhiwa kama mwelekeo.

Kinyume chake, Arg1 intensity ya CD163⁺ cells zilizo ndani ya 30 µm ya CD8 T-cells ilikuwa:

. Katika cell-level comparison ya cells zilizo karibu, Cre-CTRL–MG-Igf1KO \(p<0{,}001\) iliripotiwa.

Uchanganuzi huu ulifanywa kwa 15.979 CD163⁺ cells. Idadi kubwa sana ya cells huleta cell-level statistical power yenye nguvu; lakini idadi ya cells si sawa na idadi ya independent animals. Chanzo pia kinasema wazi kwamba cell-level p-values zinapaswa kuwekwa nje ya mouse-level FDR family na kutafsiriwa pamoja na mouse-level results.

Kwa nini clinical correlations katika Figure 9 ni exploratory?

Figure 9 ilifanywa ndani ya MG-Igf1KO mice pekee kwa:

. Kwa kuwa spatial metrics tano zililinganishwa na peak clinical score na cumulative clinical score, jumla kuna tests 10.

Matokeo yanayovutia nominally ni pamoja na:

. Lakini chanzo kinasema wazi kwamba kwa 10-test family hakuna correlation hata moja iliyobaki ya maana baada ya FDR correction:

Kwa hiyo hizi zinapaswa kutazamwa kama exploratory relationships zinazohitaji kupimwa katika cohorts kubwa zaidi baadaye.

Modeli jumuishi inayopendekezwa kwa IGF-1 inayotokana na microglia

Matokeo yanayoungwa mkono na utafiti

Kupunguza IGF-1 inayotokana na microglia kunahusishwa na ugonjwa sugu wa kliniki ulio mkali zaidi na demyelination zaidi ya uti wa mgongo bila kuharibu kwa kiasi kikubwa basic CNS viral control ya JHMV.

Kupotea kwa microglial IGF-1 kunaambatana na ongezeko la total CD8 T-cells na upanuzi wa CD8⁺Ly6C⁺ effector population katika CyTOF.

Katika panya wa MG-Igf1KO, TREM2 expression katika activated microglia na DAM maturation ratio zimepungua.

Tishu ya MG-Igf1KO ina sifa ya increased self-clustering ya activated microglia na increased spatial proximity kwa CD8 T-cells.

Arg1 intensity katika CD163⁺ myeloid cells zilizo karibu na CD8 T-cell ni chini katika kundi la MG-Igf1KO.

Matokeo haya yanaunga mkono tafsiri kwamba IGF-1 inayotokana na microglia huchangia kudumisha usawaziko kati ya immune activation na regulation/resolution wakati wa viral demyelination.

Matokeo ambayo utafiti hauungi mkono

Utafiti hauonyeshi kwamba IGF-1 ni matibabu ya multiple sclerosis kwa binadamu.

Utafiti hauonyeshi kwamba maambukizi ya JHMV ni ugonjwa uleule na multiple sclerosis ya binadamu.

Utafiti hauonyeshi kwamba demyelination kali zaidi inatokana na viral load ya juu zaidi.

Utafiti haujathibitisha kwamba kupungua kwa TREM2 ndiyo sababu ya moja kwa moja ya spatial immune changes zote.

Utafiti hauonyeshi kwamba CD163⁺ myeloid cells zimetengana kwa uhakika wa kitakwimu na CD8 T-cells katika group level; ulinganisho husika ni \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}240\).

Kwa sababu nominal clinical correlations katika Figure 9 hazikubaki za maana baada ya multiple-testing correction, si confirmed prognostic biomarker relationships.

Matokeo yanayotokana na genetic Igf1 deletion katika mouse model hayaonyeshi kwamba systemic au local IGF-1 drug administration kwa binadamu itakuwa na athari sawa na salama.

Mapungufu makuu ya mbinu

Modeli ya wanyama: Matokeo yanahusu maambukizi ya murine JHMV; hayawezi kuhamishwa moja kwa moja kwa ugonjwa wa binadamu.

Ukubwa wa sampuli: CyTOF analysis ilitumia \(n=4\)/group na IMC analysis \(n=6\)/group. Hasa within-genotype clinical correlations zinategemea panya sita tu wa MG-Igf1KO.

CyTOF multiple comparisons: Chanzo kiliripoti CyTOF differential-abundance p-values katika 23 metacluster kwa namna exploratory bila correction.

Hatari ya cell-level pseudo-replication: Ingawa Arg1 analysis inajumuisha 15.979 cells, independent biological unit si cell bali panya. Chanzo kinaitafsiri pamoja na mouse-level results.

Causality: TREM2–spatial organization correlations haziwezi kuamua causal direction.

Ufafanuzi wa Tr1: Kwa sababu CD49b na LAG-3 hazikuwa kwenye panel, CD4 population husika imeitwa Tr1-like pekee.

Taarifa ya jinsia katika chanzo: Jinsia ya experimental animals haijaripotiwa wazi katika main methods text iliyochunguzwa; kwa hiyo hakuna sex-specific conclusion inayoweza kutolewa.

Method inconsistencies ndani ya chanzo: Idadi ya CyTOF cluster, uandishi wa baadhi ya statistical tests na ukubwa wa IMC marker panel haujaripotiwa kwa namna ileile katika sections tofauti. Verianla haijaunganisha kimya kimya tofauti hizi.

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Kichwa asilia: Microglial-Derived IGF-1 Serves as a Regulator for Neuroimmune Homeostasis During Viral-Induced Demyelination

Waandishi: Vanessa M. Scarfone, Collin Pachow, Pauline U. Nguyen, Anita Lakatos, Jamie-Jean De La Torre, Alisa Xie, Kellie Fernandez, Charlene Collado, Kaitlin Murray, Roberto Tinoco, Craig M. Walsh, Trevor Owens, Agnieszka Wlodarczyk, Thomas E. Lane.

Mchango sawa: Vanessa M. Scarfone na Collin Pachow.

Corresponding author: Thomas E. Lane.

Barua pepe: tlane@uci.edu

Taasisi 1: Sue & Bill Gross Stem Cell Research Center, University of California, Irvine, CA 92697, USA.

Taasisi 2: Department of Molecular Biology and Biochemistry, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, CA 92697, USA.

Taasisi 3: Department of Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine, 2213 McGaugh Hall, Irvine, CA 92697, USA.

Taasisi 4: Center for Virus Research, University of California, Irvine, CA 92697, USA.

Taasisi 5: Neurobiology Research, Department of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, 5000 Odense, Denmark.

Jarida: Viruses.

Mchapishaji: MDPI, Basel, Switzerland.

Mwaka: 2026.

Juzuu: 18.

Toleo: 5.

Nambari ya makala: 550.

DOI: 10.3390/v18050550.

Received: 6 Aprili 2026.

Revised: 1 Mei 2026.

Accepted: 6 Mei 2026.

Published: 9 Mei 2026.

Aina ya chanzo: Peer-reviewed original research article.

Leseni: Creative Commons Attribution (CC BY).

Kiungo rasmi cha uchapishaji: https://www.mdpi.com/1999-4915/18/5/550

Mhariri wa kitaaluma: Maria Cecilia Garibaldi Marcondes.

Eneo la kisayansi: Neuroimmunology, neurovirology, demyelination, microglia biology na viral central nervous system infection.

Aina ya utafiti: Genetic mouse model + viral infection + histopathology + flow cytometry + CyTOF mass cytometry + imaging mass cytometry + spatial cell analysis.

Modeli ya panya: MG-Igf1KO, Cx3cr1CreERT/+ : Igf1fl/fl; control, Cx3cr1CreERT/+ : Igf1+/+.

Gene induction: Katika umri wa wiki 4–6, 1 mg tamoxifen kwa panya, 100 µL intraperitoneal injection, mara mbili kwa siku, saa sita kati ya injections, siku tano mfululizo.

Viral challenge: Katika umri wa wiki 6–8, 1200 PFU JHMV ndani ya 30 µL HBSS, intracranial.

Sampling: Siku ya 7., 14. na 21. post-infection.

Viral load: Brain plaque assay; spinal cord JHMV mRNA qPCR.

Histology: H&E + Luxol fast blue; 8 µm spinal-cord cryosections; sections 5–8 kwa panya; ImageJ v1.54m.

MOG measurement: Abcam ab282304 ELISA; Varioskan LUX.

Flow cytometry: Novocyte; analysis FlowJo v10.0.8 na 11.0.2; FACS sorting BD FACSAria Fusion.

CyTOF: Standard BioTools Helios; normalization CyTOF Software v7.0.8493; OMIQ; CytoNorm; FlowSOM; opt-SNE/t-SNE.

CyTOF biological sample: \(n=4\)/genotype.

IMC: Hyperion Imaging System; 39 tissue image; 12 panya, 6 Cre-CTRL + 6 MG-Igf1KO; 200 Hz; ablation energy 6; 1 µm pixel resolution.

IMC denoising: IMC-Denoise; DIMR + DeepSNiF; 30.000 training patch kwa marker channel.

Segmentation: Cellpose-SAM cpsam v4.0, GPU acceleration, two-pass segmentation.

Spatial neighborhood radius: 30 pixel = 30 µm.

Idadi ya permutation: 500 random cell-label permutation.

IMC analysis cell count: Kati ya takriban 184.000 segmented object, 62.204 immune-associated cell.

CD163/Arg1 analysis: 15.979 Iba1⁺CD163⁺ cell; %84,2 CX3CR1⁺.

IMC mouse-level statistics: Two-sided Mann–Whitney U; Benjamini–Hochberg FDR, \(Q=0{,}05\), main family size = 8.

TREM2 spatial-correlation family: Separate four-test FDR family.

Clinical–spatial correlations: MG-Igf1KO \(n=6\); spatial metric tano × clinical metric mbili = 10 test; chanzo kiliripoti p-values nominally na hakuna iliyokuwa \(p_{\mathrm{adj}}<0{,}05\) baada ya FDR.

Figure 1 survival sample: Cre-CTRL \(n=66\); MG-Igf1KO \(n=88\).

Figure 3 flow-cytometry sample: Cre-CTRL \(n=10\); MG-Igf1KO \(n=4\).

Matokeo makuu ya TREM2: TREM2 imepungua katika activated microglia ya MG-Igf1KO, \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}017\).

DAM maturation ratio: Cre-CTRL %83,4; MG-Igf1KO %76,7; \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}017\).

Activated microglia self-clustering: Imeongezeka katika MG-Igf1KO; \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}047\).

Activated microglia–CD8 T-cell proximity: Imeongezeka katika MG-Igf1KO; \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}047\).

CD163+–CD8 spatial enrichment: Control median z=18,0; MG-Igf1KO median z=13,7; \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}240\), si ya maana.

CD163+ Arg1 interface: CD8-near cell median intensity Cre-CTRL 4,17, MG-Igf1KO 3,89; cell-level \(p<0{,}001\). CD8-far median ni 3,13 katika genotypes zote mbili.

CyTOF population-count note ndani ya chanzo: Methods section inaripoti 25 metacluster na 23 immune lineage kwa FlowSOM, huku text/figure legends nyingine zikionyesha total cluster/population counts tofauti. Nambari hizi hazijasawazishwa kimya kimya na Verianla.

IMC marker-count note ndani ya chanzo: Chanzo kinaripoti 27-marker IMC panel sehemu moja, lakini 36-marker metal-conjugated panel/36 marker channel katika tissue-staining method. Chanzo hakitatui wazi kama tofauti hii ni analysis subset au textual inconsistency.

Statistical note ndani ya chanzo: Maelezo ya baadhi ya tests katika figure legends hayalingani kikamilifu na main statistical methods section. Verianla imehifadhi quantitative p-values katika context ya chanzo bila kulazimisha jina la method lenye inconsistency.

Supplementary Material: opt-SNE cluster overlays, immune clusters zote, CyTOF cluster marker-expression profile, spatial neighborhood enrichment; pamoja na CyTOF na IMC antibody panels na key immune population tables.

Michango ya waandishi: Conceptualization: T.E.L., V.M.S., C.P.; methodology: V.M.S., C.P., P.U.N., A.L., J.-J.D.L.T., A.X., K.F., K.M., C.C.; software and validation: V.M.S.; formal analysis: V.M.S., C.P., T.E.L., R.T.; resources: T.O., A.W., C.M.W.; original draft: V.M.S., C.P.; review and editing: V.M.S., T.E.L., A.W., T.O., R.T., C.M.W.; supervision: T.E.L.; funding acquisition: T.E.L., A.W., T.O., R.T., C.M.W.

Ufadhili: NIH R35NS116835; Lundbeck Foundation R209-2015-2724; Warwara Larsen Foundation 2016; Scleroseforeningen A41538; Danish Research Council DFF 6110-0064 A; NIH R01 AI137239 na AI187458; NIAMS/NIH Interdisciplinary Skin Biology Training Program T32AR080622; NIH 1S10OD028645-01A1.

Ethics approval: University of California, Irvine Institutional Animal Care and Use Committee; protocol AUP-25-093; 28 Agosti 2025–28 Agosti 2028.

Data Availability: Data na analysis code zilizowasilishwa katika utafiti zinaweza kupatikana kutoka kwa corresponding author kwa reasonable request.

Acknowledgment: Waandishi wanamshukuru Dina Arengoth kwa kazi yake katika kutengeneza modeli ya panya ya MG-Igf1KO.

Conflicts of Interest: Waandishi wametangaza kwamba hakuna conflict of interest.

Leseni: CC BY. Ingawa figures za chanzo zinaweza kutumika tena chini ya leseni, Verianla article imetanguliza independent SVG diagrams badala ya pixel copies.

Kikomo kikuu cha tafsiri: Utafiti huu unaonyesha role ya microglial IGF-1 inayohusiana na immune homeostasis katika neuroinflammation na demyelination ya panya inayosababishwa na JHMV. IGF-1 treatment katika human multiple sclerosis, TREM2-targeted clinical intervention au direct generalization kwa viral neurological diseases nyingine haijajaribiwa na experiment hii.