Mikroqliya mənşəli insulinəbənzər böyümə faktoru 1 (insulin-like growth factor 1; IGF-1), bu tədqiqatda mərkəzi sinir sisteminin rezident immun hüceyrələri olan mikroqliyanın viral neyroiltihab və demiyelinizasiya zamanı immun tarazlığın tənzimlənməsinə töhfə verən siqnal faktoru kimi araşdırılmışdır. Tədqiqatçılar mikroqliyada Igf1 genini zaman baxımından nəzarətli şəkildə susdura bilən MG-Igf1KO siçanlarını qlial hüceyrələri yoluxduran JHM ştammı mouse hepatitis virus (JHMV) ilə yoluxduraraq IGF-1 itkisinin viral nəzarət, nevroloji xəstəlik, mielin zədələnməsi və onurğa beynindəki immun hüceyrələrin tərkibi üzərindəki təsirlərini araşdırmışlar.

Tədqiqatın mərkəzi nəticəsi iki prosesin bir-birindən ayrılmasıdır. Mikroqlial IGF-1 itkisi JHMV-nin mərkəzi sinir sistemində replikasiyasına nəzarəti nəzərəçarpacaq dərəcədə pozmamışdır; əvəzində MG-Igf1KO siçanlarında klinik xəstəlik daha ağır keçmiş və xüsusilə infeksiyadan 21 gün sonra onurğa beyni demiyelinizasiyası artmışdır. Başqa sözlə, daha ağır toxuma zədələnməsi yalnız “daha çox virusun olması” ilə izah edilə bilməmişdir.

JHMV, qlial hüceyrələrə tropizm göstərən JHM strain of mouse hepatitis virus-dur və siçanlarda kəskin ensefalomiyelitdən sonra immun vasitəli demiyelinizasiya yaradır. Bu model multipl sklerozun bəzi klinik və histoloji xüsusiyyətlərini təqlid etdiyinə görə demiyelinizasiya tədqiqatlarında istifadə olunur; lakin JHMV infeksiyası insan multipl sklerozu ilə eyni xəstəlik deyil və bu tədqiqat insanlarda IGF-1 müalicəsini sınaqdan keçirmir.

Siçanlarda mikroqlial Igf1 silinməsi tamoksifenlə induksiya edilmişdir. Heyvanlara 4–6 həftəlik yaşda, beş gün ərzində gündə iki dəfə və inyeksiyalar arasında altı saat olmaqla hər siçana 1 mg tamoksifen verilmişdir. Siçanlar 6–8 həftəlik olduqda intrakranial yolla 30 µL HBSS içində 1200 plaque-forming unit (PFU) JHMV ilə yoluxdurulmuşdur. Beyin və onurğa beyni nümunələri infeksiyadan sonrakı 7., 14. və 21. günlərdə qiymətləndirilmişdir.

Mikroqliyadakı Igf1 transkriptləri nəzarət siçanları ilə müqayisədə infeksiyadan sonrakı 7. gündə təxminən %70, 21. gündə isə təxminən %96 azalmışdır. Buna baxmayaraq, JHMV infeksiyasından sonrakı 21 günlük müşahidədə MG-Igf1KO və nəzarət qrupları arasında sağqalma baxımından əhəmiyyətli fərq görülməmişdir. Viral titr və viral RNA nəticələri də IGF-1 silinməsinin əsas viral nəzarəti pozduğunu göstərməmişdir.

Buna qarşılıq, nevroloji xəstəliyin ağırlığı MG-Igf1KO siçanlarında artmışdır. Nəzarət və knockout heyvanlarda 14. gündə demiyelinizasiya oxşar olduğu halda, 21. gündə MG-Igf1KO siçanlarının onurğa beynində əhəmiyyətli dərəcədə daha çox demiyelinizasiya müəyyən edilmişdir. Yoluxdurulmamış yetkin MG-Igf1KO siçanlarında başlanğıc mielin səviyyəsi və myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) konsentrasiyası nəzarətlə müqayisədə fərqli olmadığından gec dövrdə artmış mielin itkisi yalnız genetik modelin yetkin onurğa beynində başlanğıc mielini azaltması ilə izah edilmir.

Axın sitometriyası 21. gündə MG-Igf1KO onurğa beynində ümumi CD8⁺ T-hüceyrə sayının artdığını; ümumi CD4⁺, virusa spesifik CD4⁺ T-hüceyrələri ilə makrofaq və mikroqliyanın ümumi saylarında eyni tipli aydın artım olmadığını göstərmişdir. Virusa spesifik CD8⁺ T-hüceyrələrində artım meyli görülmüş, lakin bu müqayisə əhəmiyyətli hesab edilməmişdir.

CyTOF mass cytometry analizində daha selektiv immun dəyişiklik müəyyən edilmişdir. MG-Igf1KO onurğa beynində CD8⁺ Ly6C⁺ effektor T-hüceyrələrinin nisbəti artarkən, tənzimləyici xüsusiyyətlərlə uyğun Tr1-bənzər CD4⁺ T-hüceyrə klasteri azalmışdır. Bununla yanaşı CyTOF nümunə ölçüsü hər qrup üçün yalnız \(n=4\)-dür və 23 metacluster üçün aparılan differential-abundance testlərinin p-dəyərləri mənbədə kəşfiyyat xarakterli olaraq, çoxsaylı müqayisə düzəlişi tətbiq edilmədən bildirilmişdir. Buna görə bu nəticələr güclü bioloji siqnallardır, lakin böyük nümunəli təsdiqi əvəz etmir.

Imaging mass cytometry (IMC) nəticələri mikroqlial IGF-1 itkisinin yalnız hüceyrə saylarını deyil, immun hüceyrələrinin toxuma daxilindəki fenotip və yerləşmə münasibətlərini də dəyişdirdiyini göstərir. Aktivləşməni göstərən Iba1⁺CD68⁺ mikroqliyada TREM2 ekspressiyası MG-Igf1KO qrupunda azalmış və disease-associated microglia (DAM) yetişmə nisbəti nəzarətdəki %83,4-dən MG-Igf1KO qrupunda %76,7-yə enmişdir. Hər iki müqayisə Benjamini–Hochberg false discovery rate düzəlişindən sonra \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}017\) ilə əhəmiyyətli qalmışdır.

Mənbə həmçinin MG-Igf1KO lezyonlarında aktivləşmiş mikroqliyanın öz aralarında daha çox qruplaşdığını və CD8⁺ T-hüceyrələri ilə məkan yaxınlığının artdığını bildirmişdir. Bunun əksinə, Iba1⁺CD163⁺ tənzimləyici myeloid hüceyrələrin CD8 T-hüceyrələrinə yaxınlığındakı qrup fərqi yalnız bir meyldir və FDR düzəlişindən sonra əhəmiyyətli deyil (\(p_{\mathrm{adj}}=0{,}240\)). Bu fərq vacibdir: mənbə CD163⁺ hüceyrələrin mövqesel dəyişməsini bioloji modelin bir hissəsi kimi müzakirə etsə də, qrup səviyyəsində bu tək müqayisə statistik cəhətdən təsdiqlənməmişdir.

Daha güclü tapıntı CD8 T-hüceyrələrinin 30 µm yaxınlığında yerləşən CD163⁺ myeloid hüceyrələrdə arginase-1 (Arg1) siqnalıdır. Nəzarət qrupunda CD8-ə yaxın hüceyrələrdə median Arg1 dəyəri 4,17, MG-Igf1KO qrupunda isə 3,89 olmuşdur; cell-level müqayisədə \(p<0{,}001\) bildirilmişdir. Lakin bu analiz təxminən 16.000 hüceyrəni əhatə etdiyindən p-dəyərinin çox kiçik olması bioloji nümunə ölçüsünün 16.000 olduğu demək deyil. Mouse-level analizdə 12 funksional marker-in ümumi ekspressiyasında əhəmiyyətli fərq tapılmaması Arg1 dəyişməsinin bütün myeloid populyasiyaya yayılmış itkidən çox, xüsusilə myeloid–T-hüceyrə interfeysində görülən məkan xüsusiyyəti olduğunu dəstəkləyir.

Tədqiqatçılar bu nəticələrdən mikroqliya mənşəli IGF-1-in viral infeksiyanın ilkin nəzarətini təmin edən antiviral mexanizmin əvəzolunmaz komponentindən daha çox, qoruyucu iltihabın xroniki immunopatologiyaya çevrilməsini məhdudlaşdıran neyroimmun tarazlıq tənzimləyicisi ola biləcəyi nəticəsinə gəlirlər. Təklif olunan IGF-1–TREM2–DAM–CD163/Arg1–CD8 oxu mühüm mexanistik modeldir; lakin TREM2 azalmasının məkan immun pozğunluğunu birbaşa yaratdığı bu tədqiqatda səbəb-nəticə müdaxiləsi ilə sübut edilməmişdir.

Mikroqliya Mənşəli IGF-1 Bu Tədqiqatda Nə İş Görür?

Mikroqliya mənşəli IGF-1, tədqiqatın nəticələrinə görə JHMV-nin əsas viral təmizlənməsini təmin edən məcburi antiviral faktordan daha çox, yoluxmuş mərkəzi sinir sistemində mikroqlial yetişməni, immun hüceyrələri arasındakı tarazlığı və mielin zədəsinin məhdudlaşdırılmasını dəstəkləyən neyroimmun homeostaz tənzimləyicisi kimi davranır.

Mikroqliya nədir?

Mikroqliya mərkəzi sinir sisteminin rezident myeloid immun hüceyrələridir. Normal şəraitdə toxuma homeostazının qorunmasına, inkişaf zamanı mielinləşməyə, zədədən sonra hüceyrə debris-inin təmizlənməsinə və infeksiya zamanı yerli immun cavabın tənzimlənməsinə töhfə verirlər.

Mielin aksonların ətrafını bürüyən və elektrik siqnalının ötürülməsini dəstəkləyən lipid və zülal baxımından zəngin izolyasiyaedici strukturdur. Mərkəzi sinir sistemində mielini oliqodendrositlər istehsal edir. Demiyelinizasiya isə bu örtüyün zədələnməsi və ya itirilməsidir.

IGF-1 nədir?

Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) böyümə və orqan inkişafında rol oynayan böyümə faktorudur. Mərkəzi sinir sistemində mikroqliya və makrofaqlar IGF-1 mənbələrindən biridir. Əvvəlki bioloji məlumatlar IGF-1-in oliqodendrosit progenitor hüceyrələrinin çoxalması və oliqodendrosit istiqamətində differensiasiyası ilə əlaqəli olduğunu göstərir.

Bu tədqiqat IGF-1-in bütün orqanizmdəki bütün rollarını araşdırmır. Təcrübənin fokus nöqtəsi mikroqliyada Igf1 ekspressiyasının zaman baxımından nəzarətli şəkildə azaldılması və bunun JHMV mənşəli neyroiltihab zamanı təsiridir.

MG-Igf1KO modeli nədir?

MG-Igf1KO modeli Cx3cr1CreERT/+ : Igf1fl/fl genetik quruluşundan istifadə edən, tamoksifenlə induksiya oluna bilən Cre-loxP əsaslı siçan modelidir. Mənbə bunu mikroqliya-spesifik Igf1 ablasiyası üçün istifadə edir.

Tamoksifen CreERT sistemini aktivləşdirərək flox sahələri arasında yerləşən hədəf gen bölgəsinin rekombinasiyasını təmin edir. Buradakı məqsəd yetkinliyə yaxınlaşan heyvanlarda mikroqlial IGF-1-i zaman baxımından nəzarətli şəkildə azaltmaqdır.

qPCR-də ΔCt nə deməkdir?

Mənbə hədəf RNA siqnalını GAPDH adlı daxili nəzarət geninə görə normallaşdırır. Metoddakı tərif aşağıdakı fərqlə ifadə edilə bilər:

\(Ct\), PCR flüoresans siqnalının müəyyən olunmuş həddi keçdiyi cycle sayıdır. Mənbənin istifadə etdiyi şərhdə daha aşağı \(\Delta Ct\) hədəf mRNA-nın daha yüksək başlanğıc səviyyəsinə, daha yüksək \(\Delta Ct\) isə daha aşağı başlanğıc səviyyəsinə işarə edir. Bunun səbəbi yüksək başlanğıc RNA miqdarının aşkarlama həddinə daha az amplifikasiya dövrü ilə çatmasıdır.

JHMV Modeli Multipl Sklerozla Eyni Şeydirmi?

Xeyr. JHMV ilə yaradılan siçan modeli kəskin viral ensefalomiyelit və ardınca immun vasitəli demiyelinizasiya yaradır və multipl sklerozun bəzi klinik və histoloji xüsusiyyətlərini təqlid edir; lakin insan multipl sklerozunun özü deyil və bu tədqiqatın nəticələri birbaşa MS xəstələrində müalicə effektivliyi kimi şərh edilə bilməz.

JHMV nədir?

JHMV mouse hepatitis virus-un neyrotrop JHM ştammıdır və murine coronavirus-dur. Bu tədqiqatda virus intrakranial yolla verilmişdir. İnfeksiya zamanı qlial hüceyrələrdə viral replikasiya baş verir; virusa spesifik T-hüceyrələri və digər immun hüceyrələri mərkəzi sinir sisteminə miqrasiya edir.

JHMV infeksiyasından sağ qalan heyvanların əhəmiyyətli hissəsində daha sonra immun sistemi vasitəli demiyelinizasiya inkişaf edə bilər. Buna görə model viral infeksiya, xroniki neyroiltihab və mielin zədəsi arasındakı əlaqələri araşdırmağa imkan verir.

Təcrübənin zaman xətti

Viral yük necə ölçüldü?

Beyindəki infeksion JHMV miqdarı DBT astrocytoma hüceyrələrində plaque assay ilə qiymətləndirilmişdir. Plaque-forming unit çoxala bilən və hüceyrə qatında görünən infeksiya ocağı yarada bilən virus vahidini təmsil edir.

Onurğa beynində JHMV RNA miqdarı isə RNA ekstraksiyası, cDNA sintezi və qPCR istifadə edilərək araşdırılmışdır. Viral matrix glycoprotein transkriptləri GAPDH daxili nəzarətinə görə normallaşdırılmışdır.

Demiyelinizasiya necə ölçüldü?

Onurğa beyninin torakal 6–10 səviyyələrinə uyğun hissəsi çıxarılmış, %4 paraformaldehiddə fiksasiya edilmiş, %30 saxaroza ilə cryoprotection tətbiq olunmuş və 1 mm transverse bloklara bölünmüşdür. Toxuma 8 µm qalınlığında kəsilmişdir.

Kəsiklər hematoksilen-eozin (H&E) ilə birlikdə Luxol fast blue (LFB) istifadə olunaraq boyanmışdır. LFB mielinlə zəngin sahələrin histoloji qiymətləndirilməsinə kömək edir. Hər siçan üçün 5–8 kəsik analiz edilmiş və demiyelinləşmiş ağ maddə sahəsinin ümumi ağ maddəyə nisbəti ImageJ v1.54m ilə hesablanmışdır.

Yoluxdurulmamış heyvanlarda başlanğıc myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) səviyyələri əlavə olaraq ELISA ilə araşdırılmışdır.

TREM2 və Disease-Associated Microglia Keçidi Niyə Vacibdir?

TREM2 tədqiqatda aktivləşmiş mikroqliyanın zədəyə cavab verən disease-associated microglia (DAM) fenotipinə irəliləməsinin marker-lərindən biri kimi istifadə edilmişdir; MG-Igf1KO heyvanlarında TREM2 azalması və DAM nisbətindəki enmə mikroqliyanın zədəni hiss etmə və debris təmizlənməsi ilə əlaqəli yetişmə proqramının tam inkişaf edə bilmədiyi vəziyyətlə uyğundur, lakin TREM2 azalmasının bütün sonrakı pozğunluqların birbaşa səbəbi olduğu sübut edilməmişdir.

TREM2 nədir?

TREM2 myeloid hüceyrələrdə olan reseptordur və mikroqliyanın lipid qavrayışı, faqositar cavabı və zədələnmiş toxuma ilə qarşılıqlı təsirində rol oynayır. Bu tədqiqatda TREM2-nin əhəmiyyəti ümumi mikroqliya sayından fərqli bioloji suala cavab verməsidir: mikroqliya yalnız oradadır, yoxsa zədəyə cavab verən uyğun funksional fenotipə doğru yetişir?

Aktivləşmiş mikroqliya və DAM necə müəyyən edildi?

IMC analizində aktivləşmiş mikroqliya:

kimi; disease-associated microglia isə:

kimi təsnif edilmişdir.

Mənbənin DAM maturation ratio tərifi:

şəklindədir. Burada DAM TREM2-pozitiv disease-associated microglia alt qrupunu; Act_MG isə iyerarxik təsnifatda TREM2 həddini qarşılamayan aktivləşmiş mikroqliya kateqoriyasını təmsil edir.

Bu müqayisələr mouse-level \(n=6\) nəzarət və \(n=6\) MG-Igf1KO siçanı üzərində Mann–Whitney U testi ilə aparılmış və səkkiz testlik Benjamini–Hochberg FDR family daxilində düzəldilmişdir.

“TREM2 aşağıdır, deməli demiyelinizasiyanı TREM2 yaratdı” demək olarmı?

Xeyr. Mənbənin özü bu məsələdə ehtiyatlıdır. TREM2 səviyyəsi ilə aktivləşmiş mikroqliyanın öz aralarında qruplaşması, DAM ilə məkan əlaqəsi və CD8 T-hüceyrələrinə yaxınlığı arasında əhəmiyyətli korrelyasiyalar tapılmışdır; lakin korrelyasiya TREM2 azalmasının məkan yenidən qurulmasının birbaşa səbəbi olduğunu sübut etmir.

Müəlliflər bu səbəb-nəticə əlaqəsini aydınlaşdırmaq üçün JHMV modelində birbaşa TREM2 loss-of-function və ya TREM2 agonist müdaxilələrinin zəruri olduğunu qeyd edirlər.

CyTOF ilə Imaging Mass Cytometry Arasındakı Fərq Nədir?

CyTOF bu tədqiqatda onurğa beynindəki immun hüceyrə populyasiyalarının yüksək ölçülü fenotip və bolluq paylanmasını ölçmək üçün istifadə olunarkən, imaging mass cytometry eyni zamanda bu hüceyrələrin toxuma daxilində harada yerləşdiyini və bir-biri ilə təxminən 30 µm miqyasında necə qonşuluq etdiyini araşdırmağa imkan vermişdir.

CyTOF necə işləyirdi?

CyTOF fluorophore əvəzinə müxtəlif metal izotopları ilə işarələnmiş anticisimlərdən istifadə edərək çoxsaylı hüceyrə marker-lərinin eyni hüceyrələrdə ölçülməsinə imkan verən mass cytometry metodudur.

Mənbədə hüceyrələr viability staining və səth/intracellular antibody staining-dən sonra Standard BioTools Helios sistemində analiz edilmişdir. Məlumat faylları CyTOF Software v7.0.8493 ilə normallaşdırılmış, batch effect-lər CytoNorm ilə düzəldilmiş və ölü hüceyrələr, debris, doublet-lər və normalization bead-lər analizdən çıxarılmışdır.

FlowSOM unsupervised clustering tətbiq edilmiş, dimensionality reduction opt-SNE/t-SNE vizuallaşdırması ilə təqdim edilmişdir. Mouse-level cluster frequencies ümumi CD45⁺ hüceyrələrin faizi kimi qiymətləndirilmişdir.

CyTOF differential-abundance analizində hər qrupda:

siçan vardır. Bu kiçik nümunə və çoxsaylı metacluster səbəbindən mənbə CyTOF nəticələrini kəşfiyyat çərçivəsində qiymətləndirir.

Imaging mass cytometry necə işləyirdi?

IMC üçün onurğa beyni toxumaları 10 µm kəsilmiş; antigen retrieval 1 mM sodium citrate, pH 6,0 içində 95–100 °C-də 20 dəqiqə tətbiq edilmişdir. Kəsiklər %3 BSA ilə 30 dəqiqə bloklanmış və metal-conjugated antibody cocktail ilə gecə boyu 4 °C-də inkubasiya edilmişdir.

Görüntüləmə Hyperion Imaging System ilə 200 Hz laser frequency, ablation energy 6 və 1 µm pixel resolution istifadə edilərək aparılmışdır. Ümumi:

və:

analiz edilmişdir.

Xam IMC görüntüləri IMC-Denoise pipeline ilə təmizlənmişdir. Hər marker channel üçün 30.000 training patch yaradılaraq əvvəl DIMR hot-pixel removal, sonra DeepSNiF shot-noise filtering tətbiq olunmuşdur.

Cellpose-SAM ilə hüceyrə seqmentasiyası

Hüceyrə sərhədlərini görüntülərdən çıxarmaq üçün GPU-sürətləndirilmiş Cellpose-SAM, cpsam model v4.0 istifadə edilmişdir. İki-pass strategiyası tətbiq olunmuşdur:

Hər iki pass Ir191 və Ir193 DNA intercalator channel-larından istifadə etmişdir. İkinci pass-dəki yeni seqmentlər mövcud hüceyrələrlə %50-dən az üst-üstə düşdükdə birləşdirilmiş; 500 pixel²-dən böyük obyektlər ehtimal olunan doublet və ya debris kimi çıxarılmışdır.

Təxminən 184.000 segmented object içindən 62.204 immune-associated cell downstream analysis üçün saxlanılmışdır.

Marker intensivlikləri niyə arcsinh çevrilməsindən keçirildi?

Marker intensity dəyərləri:

və cofactor \(=1\) istifadə edilərək çevrilmişdir. Bu çevrilmə çox yüksək signal dəyərlərinin dynamic range-ini sıxışdırarkən dəyərlərin rank order-ını qoruyur və fərqli expression scale-lərə malik marker-lər üçün percentile-based threshold istifadəsini asanlaşdırır.

Hüceyrə tipi təsnifatı

Mənbə marker positivity üçün əsasən arcsinh-transformed intensity distribution-ın 75. percentile dəyərindən istifadə etmişdir. Təsnif edilən əsas hüceyrə tipləri arasında astrocyte, neuron, oligodendrocyte, microglia, activated microglia, DAM, CD4 T cell və CD8 T cell vardır. Heç bir threshold-u qarşılamayan hüceyrələr “Other” kimi təsnif edilmişdir.

Iba1⁺CD163⁺ regulatory myeloid cells isə digər siniflərin üzərindən keçə bildiyinə görə non-exclusive overlay population kimi ayrıca analiz edilmişdir.

Məkan qonşuluq analizi

Hər toxuma görüntüsündə 30 pixel, yəni mənbə görüntü rezolyusiyasına görə 30 µm interaction radius istifadə edilərək spatial neighbor graph yaradılmışdır. Hər hüceyrə tipi cütü üçün müşahidə edilən qonşuluq sayları hüceyrə etiketlərinin:

dəfə təsadüfi permutasiyası ilə yaradılan null distributions ilə müqayisə edilmiş və image-level enrichment z-score-ları əldə edilmişdir.

50-dən az hüceyrə ehtiva edən görüntülər çıxarılmışdır. Mouse-level score eyni heyvana aid görüntülərin z-score ortalaması ilə əldə edilmişdir.

Rank-biserial effect size

Mənbə kiçik nümunəli iki-qrup Mann–Whitney U müqayisələrində effect size üçün:

rank-biserial correlation formulundan istifadə etmişdir.

Burada \(U\), Mann–Whitney U statistikası; \(n_1\) və \(n_2\), iki qrupun müstəqil bioloji nümunə saylarıdır. Mənbə \(|r|\ge0{,}5\) dəyərini böyük, \(0{,}3\le|r|<0{,}5\) dəyərini orta və \(|r|<0{,}3\) dəyərini kiçik təsir kimi təsnif edir.

Tədqiqatın Metodu və Nəticələri

IGF-1 Silinməsi Viral Yükü Artırmadan Demiyelinizasiyaya Necə Təsir Etdi?

Mikroqlial Igf1 silinməsi JHMV-nin əsas nəzarətini pozmamış, lakin infeksiyanın xroniki dövründə klinik xəstəliyin və onurğa beyni demiyelinizasiyasının artması ilə əlaqəli olmuşdur; mənbə bunu artmış viral replikasiyadan daha çox immun homeostazın və toxuma-qoruyucu myeloid proqramların pozulması ilə izah edən model təklif edir.

Viral nəzarət

Kaplan–Meier analizində JHMV ilə yoluxdurulmuş:

• Cre-CTRL: \(n=66\)
• MG-Igf1KO: \(n=88\)

siçanlar arasında 21 günlük izləmədə əhəmiyyətli sağqalma fərqi tapılmamışdır.

MG-Igf1KO siçanlarında klinik skorlar xüsusilə 6. və 7. günlərdə və xroniki dövrdə 17–21. günlər arasında daha yüksək olmuşdur. Bununla yanaşı viral plaque assay və qPCR nəticələri bu daha ağır klinik tablonun viral replikasiyaya nəzarətin uğursuzluğundan qaynaqlandığını dəstəkləmir.

Demiyelinizasiya

Yoluxdurulmamış yetkin MG-Igf1KO və nəzarət siçanlarının LFB boyanmasında başlanğıc mielin fərqi görülməmiş; MOG ELISA nəticələrində də əhəmiyyətli başlanğıc fərqi müəyyən edilməmişdir.

JHMV infeksiyasından sonrakı 14. gündə qrupların demiyelinizasiya səviyyəsi oxşardır. 21. gündə isə MG-Igf1KO qrupunda demiyelinizasiya nəzarət qrupundan daha yüksək olmuşdur; əsas nəticə mətni bu fərq üçün \(p<0{,}04\), fiqur açıqlaması isə \(p\le0{,}05\) verir.

Axın sitometriyası

Bu flow-cytometry müqayisələrində Cre-CTRL qrupunda \(n=10\), MG-Igf1KO qrupunda \(n=4\) istifadə edilmiş və mənbə bu müqayisələrin multiple unpaired t-test ilə aparıldığını, multiple-comparison correction tətbiq edilmədiyini bildirmişdir. Bu statistik detal nəticələrin gücü qiymətləndirilərkən qorunmalıdır.

CyTOF: effektor və tənzimləyici tarazlıq

CyTOF nəticələri ümumi immun hüceyrə artımından daha çox tərkib dəyişikliyinə işarə etmişdir.

Tr1-bənzər klasterin CD39 kimi tənzimləyici xüsusiyyətlərlə əlaqəli marker-lər göstərməsi bu şərhi dəstəkləyir. Lakin mənbə CD49b və LAG-3 marker-lərinin paneldə olmadığını açıq şəkildə bildirərək bu population-ı qəti Tr1 hüceyrəsi deyil, Tr1-like kimi təyin edir.

IMC: immun hüceyrələri toxuma daxilində necə yenidən təşkil olundu?

TREM2 ilə məkan quruluşu arasındakı korrelyasiyalar

Bu korrelyasiyaların üçü FDR düzəlişindən sonra əhəmiyyətlidir. Bununla yanaşı korrelyasiyalar “TREM2 azalması bu məkan dəyişikliklərinə səbəb oldu” nəticəsini təkbaşına sübut etmir.

CD163 və Arg1 nəticəsi niyə fərqli şərh edilməlidir?

Iba1⁺CD163⁺ regulatory myeloid hüceyrələrin CD8 T-hüceyrələri ilə mouse-level spatial enrichment-i nəzarətdə median z=18,0, MG-Igf1KO-da median z=13,7 olmuşdur. Lakin:

olduğuna görə qrup səviyyəsindəki bu “dispersal” nəticəsi əhəmiyyətli deyil və meyl kimi saxlanmalıdır.

Buna qarşılıq CD8 T-hüceyrələrinin 30 µm yaxınlığındakı CD163⁺ hüceyrələrin Arg1 intensity-si:

şəklindədir. Yaxın hüceyrələrin Cre-CTRL–MG-Igf1KO cell-level müqayisəsində \(p<0{,}001\) bildirilmişdir.

Bu analiz 15.979 CD163⁺ hüceyrə üzərində aparılmışdır. Çox yüksək hüceyrə sayı güclü cell-level statistical power yaradır; bununla yanaşı hüceyrə sayı müstəqil heyvan sayı ilə eyni deyil. Mənbə də cell-level p-dəyərlərinin mouse-level FDR family xaricində saxlanmalı və mouse-level nəticələrlə birlikdə şərh edilməli olduğunu açıq şəkildə bildirir.

Figure 9-dakı klinik korrelyasiyalar niyə kəşfiyyat xarakterlidir?

Figure 9 yalnız MG-Igf1KO siçanları daxilində:

ilə aparılmışdır. Beş məkan metriki həm peak clinical score, həm də cumulative clinical score ilə müqayisə edildiyi üçün ümumilikdə 10 test vardır.

Nominal olaraq diqqətçəkən nəticələr arasında:

tapılmışdır. Lakin mənbə açıq şəkildə bildirir ki, 10-test family üçün bu korrelyasiyaların heç biri FDR düzəlişindən sonra əhəmiyyətli qalmamışdır:

Buna görə bunlar gələcəkdə daha böyük kohortlarda sınaqdan keçirilməli olan kəşfiyyat əlaqələri kimi qiymətləndirilməlidir.

Mikroqliya mənşəli IGF-1 üçün təklif olunan inteqrativ model

Tədqiqatın dəstəklədiyi nəticələr

Mikroqliya mənşəli IGF-1-in azaldılması JHMV-nin əsas CNS viral nəzarətini nəzərəçarpacaq dərəcədə pozmadan daha ağır xroniki klinik xəstəlik və daha çox onurğa beyni demiyelinizasiyası ilə əlaqəlidir.

Mikroqlial IGF-1 itkisi ümumi CD8 T-hüceyrəsi artımı və CyTOF-da CD8⁺Ly6C⁺ effektor population genişlənməsi ilə birlikdədir.

MG-Igf1KO siçanlarında aktivləşmiş mikroqliyanın TREM2 ekspressiyası və DAM maturation ratio-su azalmışdır.

MG-Igf1KO toxuması aktivləşmiş mikroqliyanın artmış self-clustering-i və CD8 T-hüceyrələri ilə artmış məkan yaxınlığı ilə xarakterizə olunur.

CD8 T-hüceyrəsi yaxınlığındakı CD163⁺ myeloid hüceyrələrdə Arg1 intensity-si MG-Igf1KO qrupunda daha aşağıdır.

Bu tapıntılar mikroqliya mənşəli IGF-1-in viral demiyelinizasiya zamanı immun aktivasiya ilə tənzimləmə/həllolunma arasındakı tarazlığın qorunmasına töhfə verdiyi şərhini dəstəkləyir.

Tədqiqatın dəstəkləmədiyi nəticələr

Tədqiqat IGF-1-in insanlarda multipl skleroz müalicəsi olduğunu göstərmir.

Tədqiqat JHMV infeksiyasının insan multipl sklerozu ilə eyni xəstəlik olduğunu göstərmir.

Tədqiqat daha ağır demiyelinizasiyanın daha yüksək viral yükdən qaynaqlandığını göstərmir.

Tədqiqat TREM2 azalmasının bütün məkan immun dəyişikliklərinin birbaşa səbəbi olduğunu sübut etmir.

Tədqiqat CD163⁺ myeloid hüceyrələrin CD8 T-hüceyrələrindən qrup səviyyəsində statistik olaraq qəti şəkildə uzaqlaşdığını göstərmir; müvafiq müqayisə \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}240\)-dır.

Figure 9-dakı nominal klinik korrelyasiyalar multiple-testing correction-dan sonra əhəmiyyətli qalmadığından təsdiqlənmiş prognostic biomarker əlaqələri deyil.

Siçan modelində genetik Igf1 silinməsindən əldə edilən nəticələr sistemik və ya lokal IGF-1 dərmanının insanlarda eyni istiqamətdə və təhlükəsiz təsir göstərəcəyini göstərmir.

Əsas metodoloji məhdudiyyətlər

Heyvan modeli: Nəticələr murine JHMV infeksiyasına aiddir; insan xəstəliyinə birbaşa ümumiləşdirilə bilməz.

Nümunə ölçüsü: CyTOF analizində \(n=4\)/qrup, IMC analizində \(n=6\)/qrup istifadə edilmişdir. Xüsusilə within-genotype klinik korrelyasiyalar yalnız altı MG-Igf1KO siçanına əsaslanır.

CyTOF çoxsaylı müqayisələri: Mənbə CyTOF differential-abundance p-dəyərlərini 23 metacluster boyunca kəşfiyyat xarakterli olaraq düzəlişsiz bildirmişdir.

Cell-level pseudo-replication riski: Arg1 analizi 15.979 hüceyrə ehtiva etsə də müstəqil bioloji vahid hüceyrə deyil, siçandır. Mənbə bunu mouse-level nəticələrlə birlikdə şərh edir.

Səbəbiyyət: TREM2–məkan təşkili korrelyasiyaları səbəb istiqamətini müəyyən edə bilməz.

Tr1 tərifi: CD49b və LAG-3 paneldə olmadığından müvafiq CD4 population yalnız Tr1-bənzər adlandırılmışdır.

Mənbədə cinsiyyət məlumatı: Araşdırılan əsas metod mətnində təcrübə heyvanlarının cinsiyyəti açıq şəkildə bildirilməmişdir; buna görə cinsiyyətə spesifik nəticə çıxarıla bilməz.

Mənbədaxili metod uyğunsuzluqları: CyTOF cluster sayı, bəzi statistik testlərin yazılışı və IMC marker panel ölçüsü müxtəlif bölmələrdə tam eyni bildirilmir. Verianla bu fərqləri səssiz şəkildə birləşdirməmişdir.

Mənbə və Metod Qeydi

Orijinal başlıq: Microglial-Derived IGF-1 Serves as a Regulator for Neuroimmune Homeostasis During Viral-Induced Demyelination

Müəlliflər: Vanessa M. Scarfone, Collin Pachow, Pauline U. Nguyen, Anita Lakatos, Jamie-Jean De La Torre, Alisa Xie, Kellie Fernandez, Charlene Collado, Kaitlin Murray, Roberto Tinoco, Craig M. Walsh, Trevor Owens, Agnieszka Wlodarczyk, Thomas E. Lane.

Bərabər töhfə: Vanessa M. Scarfone və Collin Pachow.

Corresponding author: Thomas E. Lane.

E-poçt: tlane@uci.edu

Qurum 1: Sue & Bill Gross Stem Cell Research Center, University of California, Irvine, CA 92697, USA.

Qurum 2: Department of Molecular Biology and Biochemistry, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, CA 92697, USA.

Qurum 3: Department of Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine, 2213 McGaugh Hall, Irvine, CA 92697, USA.

Qurum 4: Center for Virus Research, University of California, Irvine, CA 92697, USA.

Qurum 5: Neurobiology Research, Department of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, 5000 Odense, Denmark.

Jurnal: Viruses.

Nəşriyyat: MDPI, Basel, Switzerland.

İl: 2026.

Cild: 18.

Say: 5.

Məqalə nömrəsi: 550.

DOI: 10.3390/v18050550.

Received: 6 Aprel 2026.

Revised: 1 May 2026.

Accepted: 6 May 2026.

Published: 9 May 2026.

Mənbə növü: Resenziyalı orijinal tədqiqat məqaləsi.

Lisenziya: Creative Commons Attribution (CC BY).

Rəsmi nəşr bağlantısı: https://www.mdpi.com/1999-4915/18/5/550

Akademik redaktor: Maria Cecilia Garibaldi Marcondes.

Elmi sahə: Neyroimmunologiya, neyrovirolojiya, demiyelinizasiya, mikroqliya biologiyası və viral mərkəzi sinir sistemi infeksiyası.

Tədqiqat növü: Genetik siçan modeli + viral infeksiya + histopatologiya + flow cytometry + CyTOF mass cytometry + imaging mass cytometry + məkan hüceyrə analizi.

Siçan modeli: MG-Igf1KO, Cx3cr1CreERT/+ : Igf1fl/fl; nəzarət, Cx3cr1CreERT/+ : Igf1+/+.

Gen induksiyası: 4–6 həftəlik yaşda hər siçana 1 mg tamoksifen, 100 µL intraperitoneal inyeksiya, gündə iki dəfə, inyeksiyalar arasında altı saat, ardıcıl beş gün.

Viral challenge: 6–8 həftəlik yaşda 30 µL HBSS içində 1200 PFU JHMV, intrakranial.

Nümunə götürülməsi: 7., 14. və 21. gün post-infection.

Viral yük: Beyin plaque assay; onurğa beyni JHMV mRNA qPCR.

Histologiya: H&E + Luxol fast blue; 8 µm spinal-cord cryosections; hər siçan üçün 5–8 kəsik; ImageJ v1.54m.

MOG ölçümü: Abcam ab282304 ELISA; Varioskan LUX.

Flow cytometry: Novocyte; analiz FlowJo v10.0.8 və 11.0.2; FACS sorting BD FACSAria Fusion.

CyTOF: Standard BioTools Helios; normalization CyTOF Software v7.0.8493; OMIQ; CytoNorm; FlowSOM; opt-SNE/t-SNE.

CyTOF bioloji nümunəsi: \(n=4\)/genotip.

IMC: Hyperion Imaging System; 39 tissue image; 12 siçan, 6 Cre-CTRL + 6 MG-Igf1KO; 200 Hz; ablation energy 6; 1 µm pixel resolution.

IMC denoising: IMC-Denoise; DIMR + DeepSNiF; hər marker channel üçün 30.000 training patch.

Seqmentasiya: Cellpose-SAM cpsam v4.0, GPU acceleration, two-pass segmentation.

Spatial neighborhood radius: 30 pixel = 30 µm.

Permutasiya sayı: 500 random cell-label permutation.

IMC analysis cell count: Təxminən 184.000 segmented object içindən 62.204 immune-associated cell.

CD163/Arg1 analysis: 15.979 Iba1⁺CD163⁺ cell; %84,2 CX3CR1⁺.

IMC mouse-level statistics: İki yönlü Mann–Whitney U; Benjamini–Hochberg FDR, \(Q=0{,}05\), əsas family size = 8.

TREM2 spatial-correlation family: Ayrı dörd testlik FDR family.

Klinik–məkan korrelyasiyaları: MG-Igf1KO \(n=6\); beş spatial metric × iki clinical metric = 10 test; mənbə p-dəyərlərini nominal bildirmişdir və heç biri FDR-dən sonra \(p_{\mathrm{adj}}<0{,}05\) olmamışdır.

Figure 1 survival nümunəsi: Cre-CTRL \(n=66\); MG-Igf1KO \(n=88\).

Figure 3 flow-cytometry nümunəsi: Cre-CTRL \(n=10\); MG-Igf1KO \(n=4\).

Əsas TREM2 nəticəsi: MG-Igf1KO activated microglia-da TREM2 azalması, \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}017\).

DAM maturation ratio: Cre-CTRL %83,4; MG-Igf1KO %76,7; \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}017\).

Activated microglia self-clustering: MG-Igf1KO-da artmış; \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}047\).

Activated microglia–CD8 T-cell proximity: MG-Igf1KO-da artmış; \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}047\).

CD163+–CD8 spatial enrichment: Nəzarət median z=18,0; MG-Igf1KO median z=13,7; \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}240\), əhəmiyyətli deyil.

CD163+ Arg1 interface: CD8-ə yaxın cell median intensity Cre-CTRL 4,17, MG-Igf1KO 3,89; cell-level \(p<0{,}001\). CD8-dən uzaq hər iki genotip median 3,13.

Mənbədaxili CyTOF population-count qeydi: metod bölməsi FlowSOM üçün 25 metacluster və 23 immune lineage bildirsə də, başqa mətn/fiqur açıqlamalarında fərqli ümumi cluster/population sayları görünür. Bu saylar Verianla tərəfindən səssizcə bərabərləşdirilməmişdir.

Mənbədaxili IMC marker-count qeydi: mənbə bir yerdə 27-marker IMC panel, tissue-staining metodunda isə 36-marker metal-conjugated panel/36 marker channel bildirir. Mənbə bu fərqin analysis subset, yoxsa mətn uyğunsuzluğu olduğunu açıq şəkildə həll etmir.

Mənbədaxili statistika qeydi: bəzi fiqur açıqlamalarındakı test tərifləri əsas statistika metod bölməsi ilə tam eyni deyil. Verianla kəmiyyət p-dəyərlərini mənbədəki konteksti ilə qorumuş və metod adındakı uyğunsuzluqları dəqiqləşdirməmişdir.

Supplementary Material: opt-SNE cluster overlays, bütün immune clusters, CyTOF cluster marker-expression profile, spatial neighborhood enrichment; əlavə olaraq CyTOF və IMC antibody panelləri ilə key immune population cədvəlləri.

Müəllif töhfələri: Conceptualization: T.E.L., V.M.S., C.P.; methodology: V.M.S., C.P., P.U.N., A.L., J.-J.D.L.T., A.X., K.F., K.M., C.C.; software and validation: V.M.S.; formal analysis: V.M.S., C.P., T.E.L., R.T.; resources: T.O., A.W., C.M.W.; original draft: V.M.S., C.P.; review and editing: V.M.S., T.E.L., A.W., T.O., R.T., C.M.W.; supervision: T.E.L.; funding acquisition: T.E.L., A.W., T.O., R.T., C.M.W.

Maliyyələşdirmə: NIH R35NS116835; Lundbeck Foundation R209-2015-2724; Warwara Larsen Foundation 2016; Scleroseforeningen A41538; Danish Research Council DFF 6110-0064 A; NIH R01 AI137239 və AI187458; NIAMS/NIH Interdisciplinary Skin Biology Training Program T32AR080622; NIH 1S10OD028645-01A1.

Etik təsdiq: University of California, Irvine Institutional Animal Care and Use Committee; protocol AUP-25-093; 28 Avqust 2025–28 Avqust 2028.

Data Availability: Tədqiqatda təqdim edilən məlumatlar və analiz kodu məqbul sorğu əsasında corresponding author-dan əldə edilə bilər.

Acknowledgment: Müəlliflər MG-Igf1KO siçan modelinin yaradılmasındakı işlərinə görə Dina Arengoth-a təşəkkür edirlər.

Conflicts of Interest: Müəlliflər maraqlar toqquşmasının olmadığını bəyan etmişlər.

Lisenziya: CC BY. Mənbə fiqurları lisenziya baxımından yenidən istifadə oluna bilsə də Verianla məqaləsində piksel surəti əvəzinə müstəqil SVG sxemlərinə üstünlük verilmişdir.

Əsas şərh sərhədi: Bu tədqiqat mikroqlial IGF-1-in JHMV ilə yaradılmış siçan neyroiltihabı və demiyelinizasiyasında immun homeostazla əlaqəli rolunu göstərir. İnsan multipl sklerozunda IGF-1 müalicəsi, TREM2 hədəfli klinik müdaxilə və ya digər viral nevroloji xəstəliklərə birbaşa ümumiləşdirmə bu təcrübə tərəfindən sınaqdan keçirilməmişdir.