Микроглиядан келип чыккан инсулин сымал өсүү фактору 1 (insulin-like growth factor 1; IGF-1) бул изилдөөдө борбордук нерв системасынын туруктуу иммундук клеткалары болгон микроглиянын вирустук нейросезгенүү жана демиелинизация учурунда иммундук тең салмакты жөнгө салуусуна салым кошкон сигналдык фактор катары изилденген. Изилдөөчүлөр микроглиядагы Igf1 генин убакыт боюнча көзөмөлдөнгөн түрдө басаңдата алган MG-Igf1KO чычкандарын глиялык клеткаларды жуктурган JHM штаммындагы mouse hepatitis virus (JHMV) менен жуктуруп, IGF-1 жоготуусунун вирусту көзөмөлдөөгө, неврологиялык ооруга, миелиндин жабыркашына жана жүлүндөгү иммундук клеткалардын курамына тийгизген таасирин изилдешкен.

Изилдөөнүн негизги жыйынтыгы эки процесстин бири-биринен ажыратылышы болуп саналат. Микроглиалдык IGF-1 жоготуусу JHMVнин борбордук нерв системасындагы репликациясын көзөмөлдөөнү олуттуу бузган эмес; тескерисинче, MG-Igf1KO чычкандарында клиникалык оору оорураак өткөн жана өзгөчө инфекциядан 21 күн өткөндөн кийин жүлүндөгү демиелинизация көбөйгөн. Башкача айтканда, ткандын оорураак жабыркашын жөн гана “вирус көбүрөөк болгон” деп түшүндүрүүгө мүмкүн болгон эмес.

JHMV глиялык клеткаларга тропизм көрсөткөн JHM strain of mouse hepatitis virus болуп, чычкандарда курч энцефаломиелиттен кийин иммундук ортомчулуктагы демиелинизацияны пайда кылат. Бул модель көп склероздун айрым клиникалык жана гистологиялык белгилерин окшоштургандыктан демиелинизацияны изилдөөдө колдонулат; бирок JHMV инфекциясы адамдагы көп склероз менен бир эле оору эмес жана бул изилдөө адамдарда IGF-1 дарылоосун сынабайт.

Чычкандарда микроглиалдык Igf1 өчүрүлүшү тамоксифен менен индукцияланган. Жаныбарларга 4–6 жумалык куракта беш күн бою күнүнө эки жолу, инъекциялардын ортосунда алты саат болчудай кылып ар бир чычканга 1 mg тамоксифен берилген. Чычкандар 6–8 жумалык болгондо интракраниалдык жол менен 30 µL HBSS ичинде 1200 plaque-forming unit (PFU) JHMV жугузулган. Мээ жана жүлүн үлгүлөрү инфекциядан кийинки 7., 14. жана 21. күндөрү бааланган.

Микроглиядагы Igf1 транскрипттери контролдук чычкандарга салыштырмалуу инфекциядан кийинки 7. күнү болжол менен %70, 21. күнү болжол менен %96 азайган. Ошого карабастан, JHMV инфекциясынан кийинки 21 күндүк байкоодо MG-Igf1KO жана контролдук топтордун ортосунда жашап калуу жагынан маанилүү айырма байкалган эмес. Вирустук титр жана вирустук RNA жыйынтыктары да IGF-1 өчүрүлүшү негизги вирустук көзөмөлдү бузганын көрсөткөн эмес.

Ал эми неврологиялык оорунун оордугу MG-Igf1KO чычкандарында жогорулаган. Контролдук жана knockout жаныбарларда 14. күнү демиелинизация окшош болсо, 21. күнү MG-Igf1KO чычкандарынын жүлүнүндө кыйла көбүрөөк демиелинизация аныкталган. Инфекцияланбаган жетилген MG-Igf1KO чычкандарында баштапкы миелин деңгээли жана myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) концентрациясы контролдордон айырмаланбагандыктан, кеч мезгилдеги күчөгөн миелин жоготуусу генетикалык модель жетилген жүлүндө баштапкы миелинди азайткандыгы менен гана түшүндүрүлбөйт.

Агымдык цитометрия 21. күнү MG-Igf1KO жүлүнүндө жалпы CD8⁺ T-клеткалардын саны көбөйгөнүн; жалпы CD4⁺, вируска мүнөздүү CD4⁺ T-клеткаларынын, макрофагдардын жана микроглиянын жалпы санында ушул сыяктуу ачык көбөйүү болбогонун көрсөткөн. Вируска мүнөздүү CD8⁺ T-клеткаларында көбөйүү тенденциясы байкалган, бирок бул салыштыруу маанилүү деп табылган эмес.

CyTOF mass cytometry анализинде андан да тандалма иммундук өзгөрүү аныкталган. MG-Igf1KO жүлүнүндө CD8⁺ Ly6C⁺ эффектор T-клеткаларынын үлүшү көбөйгөндө, жөнгө салуучу касиеттерге шайкеш Tr1-сымал CD4⁺ T-клетка кластери азайган. Ошол эле учурда CyTOF үлгү көлөмү ар бир топ үчүн болгону \(n=4\) жана 23 metacluster үчүн жүргүзүлгөн differential-abundance тесттеринин p-маанилери булакта изилдөөчү мүнөздө, көп салыштырууга түзөтүү колдонулбастан берилген. Ошондуктан бул жыйынтыктар күчтүү биологиялык белгилер болуп саналат, бирок чоң үлгүдөгү ырастоону алмаштыра албайт.

Imaging mass cytometry (IMC) жыйынтыктары микроглиалдык IGF-1 жоготуусу клеткалардын санын гана эмес, иммундук клеткалардын ткандын ичиндеги фенотиптик жана мейкиндиктик мамилелерин да өзгөрткөнүн көрсөтөт. Активдешүүнү көрсөткөн Iba1⁺CD68⁺ микроглияда TREM2 экспрессиясы MG-Igf1KO тобунда азайып, disease-associated microglia (DAM) жетилүү катышы контролдогу %83,4төн MG-Igf1KO тобунда %76,7ге төмөндөгөн. Эки салыштыруу тең Benjamini–Hochberg false discovery rate түзөтүүсүнөн кийин \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}017\) менен маанилүү бойдон калган.

Булак ошондой эле MG-Igf1KO жабыркоолорунда активдешкен микроглия өз ара көбүрөөк топтолорун жана CD8⁺ T-клеткалары менен мейкиндиктик жакындыгы күчөгөнүн билдирген. Ал эми Iba1⁺CD163⁺ жөнгө салуучу myeloid клеткалардын CD8 T-клеткаларына жакындыгындагы топтор аралык айырма болгону тенденция болуп, FDR түзөтүүсүнөн кийин маанилүү эмес (\(p_{\mathrm{adj}}=0{,}240\)). Бул айырма маанилүү: булак CD163⁺ клеткалардын мейкиндиктик өзгөрүшүн биологиялык моделдин бөлүгү катары талкуулаганы менен, топ деңгээлиндеги бул жалгыз салыштыруу статистикалык жактан бекемделген эмес.

Күчтүүрөөк табылга — CD8 T-клеткаларынын 30 µm жакындыгында жайгашкан CD163⁺ myeloid клеткалардагы arginase-1 (Arg1) сигналы. Контролдук топто CD8ге жакын клеткалардын median Arg1 мааниси 4,17 болсо, MG-Igf1KO тобунда 3,89 болгон; cell-level салыштырууда \(p<0{,}001\) билдирилген. Бирок бул анализ болжол менен 16.000 клетканы камтыгандыктан, p-маанинин өтө кичине болушу биологиялык үлгү көлөмү 16.000 дегенди билдирбейт. Mouse-level анализде 12 функционалдык markerдин жалпы экспрессиясында маанилүү айырма табылбаганы Arg1 өзгөрүшү бүтүндөй myeloid популяциясына жайылган жоготуудан көрө, өзгөчө myeloid–T-клетка интерфейсинде байкалган мейкиндиктик касиет экенин колдойт.

Изилдөөчүлөр бул жыйынтыктардан микроглиядан келип чыккан IGF-1 вирустук инфекциянын алгачкы көзөмөлүн камсыз кылган антивирустук механизмдин алмаштырылгыс компоненти болуудан көрө, коргоочу сезгенүүнүн өнөкөт иммунопатологияга өтүшүн чектеген нейроиммундук тең салмактын жөнгө салуучусу болушу мүмкүн деген жыйынтыкка келишет. Сунушталган IGF-1–TREM2–DAM–CD163/Arg1–CD8 огу маанилүү механизмдик модель; бирок TREM2 азайышы мейкиндиктик иммундук бузулууну түздөн-түз пайда кылары бул изилдөөдө себептик кийлигишүү менен далилденген эмес.

Микроглиядан Келип Чыккан IGF-1 Бул Изилдөөдө Эмне Кызмат Аткарат?

Изилдөөнүн жыйынтыктарына ылайык, микроглиядан келип чыккан IGF-1 JHMVнин негизги вирустук тазаланышын камсыз кылган милдеттүү антивирустук фактордон көрө, инфекцияланган борбордук нерв системасында микроглиалдык жетилүүнү, иммундук клеткалардын ортосундагы тең салмакты жана миелиндин жабыркашын чектөөнү колдогон нейроиммундук гомеостаз жөнгө салуучусу катары иштейт.

Микроглия деген эмне?

Микроглия борбордук нерв системасынын туруктуу myeloid иммундук клеткалары. Кадимки шартта алар ткандын гомеостазын сактоого, өнүгүү учурунда миелинденүүгө, жабыркоодон кийин клеткалык debrisти тазалоого жана инфекция учурунда жергиликтүү иммундук жоопту жөнгө салууга катышат.

Миелин — аксондорду курчап, электрдик сигналдын өткөрүлүшүн колдогон липиддерге жана белокторго бай изоляциялоочу түзүлүш. Борбордук нерв системасында миелинди олигодендроциттер өндүрөт. Демиелинизация болсо ушул кабыктын жабыркашы же жоголушу.

IGF-1 деген эмне?

Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) өсүүдө жана органдардын өнүгүшүндө кызмат аткарган өсүү фактору. Борбордук нерв системасында микроглия жана макрофагдар IGF-1 булактарынын бири болуп саналат. Мурунку биологиялык маалыматтар IGF-1 олигодендроцит progenitor клеткаларынын көбөйүшү жана олигодендроцит багытында дифференциацияланышы менен байланыштуу экенин көрсөтөт.

Бул изилдөө IGF-1дин бүт организмдеги бардык ролдорун изилдебейт. Эксперименттин негизги багыты — микроглияда Igf1 экспрессиясын убакыт боюнча көзөмөлдөнгөн түрдө азайтуу жана анын JHMVден келип чыккан нейросезгенүү учурундагы таасири.

MG-Igf1KO модели деген эмне?

MG-Igf1KO модели Cx3cr1CreERT/+ : Igf1fl/fl генетикалык түзүлүшүн колдонгон, тамоксифен менен индукциялануучу Cre-loxP негизиндеги чычкан модели. Булак муну микроглияга мүнөздүү Igf1 абляциясы үчүн колдонот.

Тамоксифен CreERT системасын активдештирип, flox аймактарынын ортосунда жайгашкан максаттуу ген бөлүгүнүн рекомбинациясын камсыз кылат. Бул жердеги максат — жетилүүгө жакындаган жаныбарларда микроглиалдык IGF-1ди убакыт боюнча көзөмөлдөнгөн түрдө азайтуу.

qPCRдеги ΔCt эмнени билдирет?

Булак максаттуу RNA сигналын GAPDH деп аталган ички контролдук генге карата нормалдаштырат. Ыкмадагы аныктама төмөнкү айырма менен көрсөтүлүшү мүмкүн:

\(Ct\) — PCR флуоресценция сигналы белгиленген чектен өткөн cycle саны. Булак колдонгон түшүндүрмөдө төмөнүрөөк \(\Delta Ct\) максаттуу mRNAнын жогорку баштапкы деңгээлин, жогорураак \(\Delta Ct\) болсо төмөнкү баштапкы деңгээлди көрсөтөт. Мунун себеби баштапкы RNA көлөмү көп болсо, аныктоо чегине азыраак амплификация цикли менен жетишилет.

JHMV Модели Көп Склероз Менен Бир Эле Нерсеби?

Жок. JHMV менен түзүлгөн чычкан модели курч вирустук энцефаломиелитти жана андан кийинки иммундук ортомчулуктагы демиелинизацияны пайда кылат жана көп склероздун айрым клиникалык жана гистологиялык өзгөчөлүктөрүн окшоштурат; бирок адамдагы көп склероздун өзү эмес жана бул изилдөөнүн жыйынтыктарын MS бейтаптарында дарылоонун эффективдүүлүгү катары түз чечмелөөгө болбойт.

JHMV деген эмне?

JHMV — mouse hepatitis virusтун нейротроптук JHM штаммы жана murine coronavirus. Бул изилдөөдө вирус интракраниалдык жол менен берилген. Инфекция учурунда глиялык клеткаларда вирустук репликация болот; вируска мүнөздүү T-клеткалар жана башка иммундук клеткалар борбордук нерв системасына көчөт.

JHMV инфекциясынан аман калган жаныбарлардын олуттуу бөлүгүндө кийин иммундук система ортомчулук кылган демиелинизация өнүгүшү мүмкүн. Ошондуктан модель вирустук инфекция, өнөкөт нейросезгенүү жана миелиндин жабыркашынын ортосундагы байланыштарды изилдөөгө мүмкүнчүлүк берет.

Эксперименттин убакыт сызыгы

Вирустук жүк кантип өлчөнгөн?

Мээдеги инфекциялык JHMV көлөмү DBT astrocytoma клеткаларында plaque assay менен бааланган. Plaque-forming unit көбөйө алган жана клеткалык катмарда көрүнгөн инфекция очогун түзө алган вирус бирдигин билдирет.

Жүлүндөгү JHMV RNA көлөмү RNA экстракциясы, cDNA синтези жана qPCR колдонулуп изилденген. Вирустук matrix glycoprotein транскрипттери GAPDH ички контролуна карата нормалдаштырылган.

Демиелинизация кантип өлчөнгөн?

Жүлүндүн көкүрөк 6–10 деңгээлдерине туура келген бөлүгү алынып, %4 параформальдегидде фиксацияланган, %30 сахароза менен cryoprotection жасалып, 1 mm transverse блокторго бөлүнгөн. Ткань 8 µm калыңдыкта кесилген.

Кесиндилер гематоксилин-эозин (H&E) менен бирге Luxol fast blue (LFB) колдонулуп боёлгон. LFB миелинге бай аймактарды гистологиялык баалоого жардам берет. Ар бир чычканга 5–8 кесинди анализделип, демиелинизацияланган ак зат аянтынын жалпы ак затка катышы ImageJ v1.54m менен эсептелген.

Инфекцияланбаган жаныбарларда баштапкы myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) деңгээлдери кошумча ELISA менен изилденген.

TREM2 жана Disease-Associated Microglia Өтүүсү Эмне Үчүн Маанилүү?

TREM2 бул изилдөөдө активдешкен микроглиянын жабыркоого жооп берген disease-associated microglia (DAM) фенотипине өтүүсүнүн markerлеринин бири катары колдонулган; MG-Igf1KO жаныбарларында TREM2 азайышы жана DAM үлүшүнүн төмөндөшү микроглиянын жабыркоону сезүү жана debrisти тазалоо менен байланышкан жетилүү программасы толук өнүкпөгөн абалга шайкеш, бирок TREM2 азайышы бардык кийинки бузулуулардын түздөн-түз себеби экени далилденген эмес.

TREM2 деген эмне?

TREM2 myeloid клеткалардагы рецептор болуп, микроглиянын липиддерди сезүүсүндө, фагоцитоздук жоопто жана жабыркаган ткань менен өз ара аракеттенүүсүндө роль ойнойт. Бул изилдөөдө TREM2нин мааниси жалпы микроглия санынан башка биологиялык суроого жооп берүүсүндө: микроглия жөн гана барбы, же жабыркоого жооп берген туура функционалдык фенотипке карай жетилип жатабы?

Активдешкен микроглия жана DAM кантип аныкталган?

IMC анализинде активдешкен микроглия:

катары; disease-associated microglia болсо:

катары классификацияланган.

Булактын DAM maturation ratio аныктамасы:

түрүндө. Бул жерде DAM TREM2-позитивдүү disease-associated microglia кичи тобун; Act_MG болсо иерархиялык классификацияда TREM2 босогосуна жетпеген активдешкен микроглия категориясын билдирет.

Бул салыштыруулар mouse-level \(n=6\) контроль жана \(n=6\) MG-Igf1KO чычканы боюнча Mann–Whitney U тести менен жүргүзүлүп, сегиз тесттик Benjamini–Hochberg FDR family ичинде түзөтүлгөн.

“TREM2 төмөн, демек демиелинизацияны TREM2 жаратты” деп айтууга болобу?

Жок. Булактын өзү бул жагынан этият. TREM2 деңгээли менен активдешкен микроглиянын өз ара кластерлениши, DAM менен мейкиндиктик мамилеси жана CD8 T-клеткаларына жакындыгынын ортосунда маанилүү корреляциялар табылган; бирок корреляция TREM2 азайышы мейкиндиктик кайра түзүлүштүн түздөн-түз себеби экенин далилдебейт.

Авторлор бул себептүүлүктү чечүү үчүн JHMV моделинде түздөн-түз TREM2 loss-of-function же TREM2 agonist кийлигишүүлөрү керек экенин белгилешет.

CyTOF менен Imaging Mass Cytometryнин Айырмасы Эмне?

CyTOF бул изилдөөдө жүлүндөгү иммундук клетка популяцияларынын жогорку өлчөмдүү фенотипин жана санынын бөлүштүрүлүшүн өлчөө үчүн колдонулса, imaging mass cytometry ошол эле учурда бул клеткалар ткандын ичинде кайда жайгашканын жана бири-бири менен болжол менен 30 µm масштабында кандай кошуналашарын изилдөөгө мүмкүндүк берген.

CyTOF кантип иштеген?

CyTOF fluorophore ордуна ар башка металл изотоптору менен белгиленген антителолорду колдонуп, бир эле клеткада көптөгөн клеткалык markerлерди өлчөөгө мүмкүндүк берген mass cytometry ыкмасы.

Булакта клеткалар viability staining жана беттик/intracellular antibody stainingден кийин Standard BioTools Helios системасында анализделген. Маалымат файлдары CyTOF Software v7.0.8493 менен нормалдаштырылып, batch effectтер CytoNorm менен түзөтүлүп, өлгөн клеткалар, debris, doubletтер жана normalization beadдер анализден чыгарылган.

FlowSOM unsupervised clustering колдонулуп, dimensionality reduction opt-SNE/t-SNE визуалдаштыруу менен берилген. Mouse-level cluster frequencies жалпы CD45⁺ клеткалардын пайызы катары бааланган.

CyTOF differential-abundance анализинде ар бир топто:

чычкан бар. Бул кичине үлгү жана metaclusterлердин көп саны себептүү булак CyTOF жыйынтыктарын изилдөөчү алкакта баалайт.

Imaging mass cytometry кантип иштеген?

IMC үчүн жүлүн ткандары 10 µm кесилип; antigen retrieval 1 mM sodium citrate, pH 6,0 ичинде 95–100 °Cде 20 мүнөт жүргүзүлгөн. Кесиндилер %3 BSA менен 30 мүнөт блоктолуп, metal-conjugated antibody cocktail менен түнү бою 4 °Cде инкубацияланган.

Сүрөттөө Hyperion Imaging System аркылуу 200 Hz laser frequency, ablation energy 6 жана 1 µm pixel resolution колдонулуп жүргүзүлгөн. Жалпы:

жана:

анализделген.

Чийки IMC сүрөттөрү IMC-Denoise pipeline менен тазаланган. Ар бир marker channel үчүн 30.000 training patch түзүлүп, адегенде DIMR hot-pixel removal, андан кийин DeepSNiF shot-noise filtering колдонулган.

Cellpose-SAM менен клетка сегментациясы

Клетка чек араларын сүрөттөрдөн бөлүп алуу үчүн GPU-тездетилген Cellpose-SAM, cpsam model v4.0 колдонулган. Эки-pass стратегия колдонулган:

Эки pass тең Ir191 жана Ir193 DNA intercalator channelдарын колдонгон. Экинчи passтагы жаңы сегменттер бар клеткалар менен %50ден аз кабышканда бириктирилип, 500 pixel²ден чоң объекттер мүмкүн болгон doublet же debris катары чыгарылган.

Болжол менен 184.000 segmented object ичинен 62.204 immune-associated cell downstream analysis үчүн калтырылган.

Marker интенсивдүүлүктөрү эмне үчүн arcsinh трансформациясынан өткөрүлгөн?

Marker intensity маанилери:

жана cofactor \(=1\) колдонулуп трансформацияланган. Бул трансформация өтө жогорку signal маанилеринин dynamic rangeин кыскартып, ошол эле учурда маанилердин rank orderун сактайт жана ар башка expression scaleге ээ markerлер үчүн percentile-based threshold колдонууга ыңгайлаштырат.

Клетка түрүн классификациялоо

Булак marker positivity үчүн негизинен arcsinh-transformed intensity distributionдун 75. percentile маанисин колдонгон. Классификацияланган негизги клетка түрлөрүнүн арасында astrocyte, neuron, oligodendrocyte, microglia, activated microglia, DAM, CD4 T cell жана CD8 T cell бар. Эч бир thresholdго жетпеген клеткалар “Other” катары классификацияланган.

Iba1⁺CD163⁺ regulatory myeloid cells башка класстар менен кайчылаша алгандыктан non-exclusive overlay population катары өзүнчө анализделген.

Мейкиндиктик кошуналык анализи

Ар бир ткань сүрөтүндө 30 pixel, башкача айтканда булак сүрөтүнүн чечилишине ылайык 30 µm interaction radius колдонулуп spatial neighbor graph түзүлгөн. Ар бир клетка түрү жуп үчүн байкалган кошуналык сандары клетка энбелгилеринин:

жолу кокустук пермутациясы менен түзүлгөн null distributions менен салыштырылып, image-level enrichment z-scoreлор алынган.

50дөн аз клетка камтыган сүрөттөр чыгарылган. Mouse-level score ошол эле жаныбарга тиешелүү сүрөттөрдүн z-score орточосу менен алынган.

Rank-biserial effect size

Булак кичине үлгүлүү эки топтук Mann–Whitney U салыштырууларында effect size үчүн:

rank-biserial correlation формуласын колдонгон.

Бул жерде \(U\) — Mann–Whitney U статистикасы; \(n_1\) жана \(n_2\) — эки топтогу көз карандысыз биологиялык үлгүлөрдүн саны. Булак \(|r|\ge0{,}5\) маанисин чоң, \(0{,}3\le|r|<0{,}5\) маанисин орто жана \(|r|<0{,}3\) маанисин кичине таасир деп классификациялайт.

Изилдөөнүн Ыкмасы жана Жыйынтыктары

IGF-1 Өчүрүү Вирустук Жүктү Көбөйтпөстөн Демиелинизацияга Кантип Таасир Этти?

Микроглиалдык Igf1 өчүрүлүшү JHMVнин негизги көзөмөлүн бузган эмес, бирок инфекциянын өнөкөт мезгилинде клиникалык оорунун жана жүлүндөгү демиелинизациянын көбөйүшү менен байланышкан; булак муну вирустук репликациянын көбөйүшүнөн көрө иммундук гомеостаздын жана тканды коргоочу myeloid программалардын бузулушу менен түшүндүргөн моделди сунуштайт.

Вирустук көзөмөл

Kaplan–Meier анализинде JHMV менен инфекцияланган:

• Cre-CTRL: \(n=66\)
• MG-Igf1KO: \(n=88\)

чычкандардын ортосунда 21 күндүк байкоодо жашап калуу боюнча маанилүү айырма табылган эмес.

MG-Igf1KO чычкандарында клиникалык баллдар өзгөчө 6. жана 7. күндөрү жана өнөкөт мезгилде 17–21. күндөр арасында жогорураак болгон. Бирок вирустук plaque assay жана qPCR жыйынтыктары бул оорураак клиникалык көрүнүш вирустук репликацияны көзөмөлдөөнүн бузулушунан келип чыкканын колдобойт.

Демиелинизация

Инфекцияланбаган жетилген MG-Igf1KO жана контролдук чычкандардын LFB боёосунда баштапкы миелин айырмасы байкалган эмес; MOG ELISA жыйынтыктарында да маанилүү баштапкы айырма аныкталган эмес.

JHMV инфекциясынан кийинки 14. күнү топтордун демиелинизация деңгээли окшош болгон. 21. күнү болсо MG-Igf1KO тобунда демиелинизация контролдук топко караганда жогору болгон; негизги жыйынтык тексти бул айырма үчүн \(p<0{,}04\), фигуранын түшүндүрмөсү болсо \(p\le0{,}05\) берет.

Агымдык цитометрия

Бул flow-cytometry салыштырууларында Cre-CTRL тобунда \(n=10\), MG-Igf1KO тобунда \(n=4\) колдонулуп, булак бул салыштыруулар multiple unpaired t-test менен жүргүзүлгөнүн жана multiple-comparison correction колдонулбаганын билдирген. Бул статистикалык детал жыйынтыктардын күчүн баалоодо сакталышы керек.

CyTOF: эффектордук жана жөнгө салуучу тең салмак

CyTOF жыйынтыктары жалпы иммундук клеткалардын көбөйүшүнөн көрө курамдын өзгөргөнүнө ишарат кылган.

Tr1-сымал кластердин CD39 сыяктуу жөнгө салуучу касиеттерге байланышкан markerлерди көрсөтүшү бул түшүндүрмөнү колдойт. Бирок булак CD49b жана LAG-3 markerлери панелде жок экенин ачык айтып, бул populationду так Tr1 клеткасы эмес Tr1-like деп аныктайт.

IMC: иммундук клеткалар ткань ичинде кантип кайра уюшулган?

TREM2 менен мейкиндиктик түзүлүштүн ортосундагы корреляциялар

Бул корреляциялардын үчөө FDR түзөтүүсүнөн кийин маанилүү. Бирок корреляциялар “TREM2 азайышы бул мейкиндиктик өзгөрүүлөргө себеп болду” деген жыйынтыкты өз алдынча далилдебейт.

CD163 жана Arg1 жыйынтыгы эмне үчүн башкача түшүндүрүлүшү керек?

Iba1⁺CD163⁺ regulatory myeloid клеткалардын CD8 T-клеткалары менен mouse-level spatial enrichmentи контролдо median z=18,0, MG-Igf1KOда median z=13,7 болгон. Бирок:

болгондуктан топ деңгээлиндеги бул “dispersal” жыйынтыгы маанилүү эмес жана тенденция катары сакталууга тийиш.

Ал эми CD8 T-клеткаларынын 30 µm жакындыгындагы CD163⁺ клеткалардын Arg1 intensityси:

түрүндө. Жакын клеткалардын Cre-CTRL–MG-Igf1KO cell-level салыштыруусунда \(p<0{,}001\) билдирилген.

Бул анализ 15.979 CD163⁺ клетка боюнча жүргүзүлгөн. Өтө жогорку клетка саны күчтүү cell-level statistical power түзөт; бирок клетка саны көз карандысыз жаныбарлардын саны менен бирдей эмес. Булак да cell-level p-маанилер mouse-level FDR familyден тышкары кармалып, mouse-level жыйынтыктар менен бирге түшүндүрүлүшү керек экенин ачык белгилейт.

Figure 9дагы клиникалык корреляциялар эмне үчүн изилдөөчү?

Figure 9 MG-Igf1KO чычкандарынын ичинде гана:

менен жүргүзүлгөн. Беш мейкиндиктик метрика peak clinical score жана cumulative clinical score менен салыштырылгандыктан жалпы 10 тест бар.

Номиналдуу түрдө көңүл буруучу жыйынтыктардын арасында:

табылган. Бирок булак 10-test family үчүн бул корреляциялардын эч бири FDR түзөтүүсүнөн кийин маанилүү бойдон калбаганын ачык билдирет:

Ошондуктан алар келечекте чоңураак когорттордо текшериле турган изилдөөчү байланыштар катары бааланышы керек.

Микроглиядан келип чыккан IGF-1 үчүн сунушталган интеграцияланган модель

Изилдөө колдогон жыйынтыктар

Микроглиядан келип чыккан IGF-1дин азайтылышы JHMVнин негизги CNS вирустук көзөмөлүн олуттуу бузбастан, оорураак өнөкөт клиникалык оору жана көбүрөөк жүлүн демиелинизациясы менен байланыштуу.

Микроглиалдык IGF-1 жоготуусу жалпы CD8 T-клеткаларынын көбөйүшү жана CyTOFто CD8⁺Ly6C⁺ эффектор population кеңейиши менен коштолот.

MG-Igf1KO чычкандарында активдешкен микроглиянын TREM2 экспрессиясы жана DAM maturation ratioсу азайган.

MG-Igf1KO тканы активдешкен микроглиянын көбөйгөн self-clusteringи жана CD8 T-клеткалары менен көбөйгөн мейкиндиктик жакындыгы менен мүнөздөлөт.

CD8 T-клеткасынын жакындыгындагы CD163⁺ myeloid клеткаларда Arg1 intensityси MG-Igf1KO тобунда төмөн.

Бул табылгалар микроглиядан келип чыккан IGF-1 вирустук демиелинизация учурунда иммундук активдешүү менен жөнгө салуу/чечилүү ортосундагы тең салмакты сактоого салым кошот деген түшүндүрмөнү колдойт.

Изилдөө колдобогон жыйынтыктар

Изилдөө IGF-1 адамдарда көп склероздун дарылоосу экенин көрсөтпөйт.

Изилдөө JHMV инфекциясы адамдагы көп склероз менен бир эле оору экенин көрсөтпөйт.

Изилдөө оорураак демиелинизация жогорураак вирустук жүктөн келип чыгарын көрсөтпөйт.

Изилдөө TREM2 азайышы бардык мейкиндиктик иммундук өзгөрүүлөрдүн түздөн-түз себеби экенин далилдебейт.

Изилдөө CD163⁺ myeloid клеткалар CD8 T-клеткаларынан топ деңгээлинде статистикалык жактан так алыстаганын көрсөтпөйт; тиешелүү салыштыруу \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}240\).

Figure 9дагы номиналдык клиникалык корреляциялар multiple-testing correctionдан кийин маанилүү бойдон калбагандыктан, ырасталган prognostic biomarker байланыштары эмес.

Чычкан моделиндеги генетикалык Igf1 өчүрүүдөн алынган жыйынтыктар системалык же жергиликтүү IGF-1 дарысын адамдарга берүү ошол эле багытта жана коопсуз таасир берерин көрсөтпөйт.

Негизги ыкмалык чектөөлөр

Жаныбар модели: Жыйынтыктар murine JHMV инфекциясына тиешелүү; адам оорусуна түз жалпыланбайт.

Үлгү көлөмү: CyTOF анализинде \(n=4\)/топ, IMC анализинде \(n=6\)/топ колдонулган. Өзгөчө within-genotype клиникалык корреляциялар болгону алты MG-Igf1KO чычканына негизделген.

CyTOF көп салыштыруулары: Булак CyTOF differential-abundance p-маанилерин 23 metacluster боюнча изилдөөчү түрдө түзөтүүсүз берген.

Cell-level pseudo-replication коркунучу: Arg1 анализи 15.979 клетканы камтыганы менен, көз карандысыз биологиялык бирдик клетка эмес, чычкан. Булак муну mouse-level жыйынтыктар менен бирге түшүндүрөт.

Себептүүлүк: TREM2–мейкиндиктик уюшуу корреляциялары себеп багытын аныктай албайт.

Tr1 аныктамасы: CD49b жана LAG-3 панелде болбогондуктан тиешелүү CD4 population Tr1-сымал гана деп аталган.

Булактагы жыныс маалыматы: Каралган негизги ыкма текстинде эксперименттик жаныбарлардын жынысы ачык билдирилген эмес; ошондуктан жыныска мүнөздүү жыйынтык чыгарууга болбойт.

Булак ичиндеги ыкма дал келбестиктери: CyTOF cluster саны, айрым статистикалык тесттердин жазылышы жана IMC marker панелинин көлөмү ар башка бөлүмдөрдө толук бирдей берилген эмес. Verianla бул айырмачылыктарды үнсүз теңештирген эмес.

Булак жана Ыкма Жөнүндө Эскертүү

Түпнуска аталыш: Microglial-Derived IGF-1 Serves as a Regulator for Neuroimmune Homeostasis During Viral-Induced Demyelination

Авторлор: Vanessa M. Scarfone, Collin Pachow, Pauline U. Nguyen, Anita Lakatos, Jamie-Jean De La Torre, Alisa Xie, Kellie Fernandez, Charlene Collado, Kaitlin Murray, Roberto Tinoco, Craig M. Walsh, Trevor Owens, Agnieszka Wlodarczyk, Thomas E. Lane.

Тең салым: Vanessa M. Scarfone жана Collin Pachow.

Corresponding author: Thomas E. Lane.

Э-почта: tlane@uci.edu

Мекеме 1: Sue & Bill Gross Stem Cell Research Center, University of California, Irvine, CA 92697, USA.

Мекеме 2: Department of Molecular Biology and Biochemistry, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, CA 92697, USA.

Мекеме 3: Department of Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine, 2213 McGaugh Hall, Irvine, CA 92697, USA.

Мекеме 4: Center for Virus Research, University of California, Irvine, CA 92697, USA.

Мекеме 5: Neurobiology Research, Department of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, 5000 Odense, Denmark.

Журнал: Viruses.

Басма: MDPI, Basel, Switzerland.

Жыл: 2026.

Том: 18.

Сан: 5.

Макала номери: 550.

DOI: 10.3390/v18050550.

Received: 6 Апрель 2026.

Revised: 1 Май 2026.

Accepted: 6 Май 2026.

Published: 9 Май 2026.

Булак түрү: Рецензияланган оригиналдуу изилдөө макаласы.

Лицензия: Creative Commons Attribution (CC BY).

Расмий жарыя шилтемеси: https://www.mdpi.com/1999-4915/18/5/550

Академиялык редактор: Maria Cecilia Garibaldi Marcondes.

Илимий тармак: Нейроиммунология, нейровирусология, демиелинизация, микроглия биологиясы жана борбордук нерв системасынын вирустук инфекциясы.

Изилдөө түрү: Генетикалык чычкан модели + вирустук инфекция + гистопатология + flow cytometry + CyTOF mass cytometry + imaging mass cytometry + мейкиндиктик клетка анализи.

Чычкан модели: MG-Igf1KO, Cx3cr1CreERT/+ : Igf1fl/fl; контроль, Cx3cr1CreERT/+ : Igf1+/+.

Ген индукциясы: 4–6 жумалык куракта ар бир чычканга 1 mg тамоксифен, 100 µL intraperitoneal инъекция, күнүнө эки жолу, инъекциялардын ортосунда алты саат, беш күн катары менен.

Viral challenge: 6–8 жумалык куракта 30 µL HBSS ичинде 1200 PFU JHMV, интракраниалдык.

Үлгү алуу: 7., 14. жана 21. күн post-infection.

Вирустук жүк: Мээ plaque assay; жүлүн JHMV mRNA qPCR.

Гистология: H&E + Luxol fast blue; 8 µm spinal-cord cryosections; ар бир чычканга 5–8 кесинди; ImageJ v1.54m.

MOG өлчөөсү: Abcam ab282304 ELISA; Varioskan LUX.

Flow cytometry: Novocyte; анализ FlowJo v10.0.8 жана 11.0.2; FACS sorting BD FACSAria Fusion.

CyTOF: Standard BioTools Helios; normalization CyTOF Software v7.0.8493; OMIQ; CytoNorm; FlowSOM; opt-SNE/t-SNE.

CyTOF биологиялык үлгүсү: \(n=4\)/генотип.

IMC: Hyperion Imaging System; 39 tissue image; 12 чычкан, 6 Cre-CTRL + 6 MG-Igf1KO; 200 Hz; ablation energy 6; 1 µm pixel resolution.

IMC denoising: IMC-Denoise; DIMR + DeepSNiF; ар бир marker channel үчүн 30.000 training patch.

Сегментация: Cellpose-SAM cpsam v4.0, GPU acceleration, two-pass segmentation.

Spatial neighborhood radius: 30 pixel = 30 µm.

Пермутация саны: 500 random cell-label permutation.

IMC analysis cell count: Болжол менен 184.000 segmented object ичинен 62.204 immune-associated cell.

CD163/Arg1 analysis: 15.979 Iba1⁺CD163⁺ cell; %84,2 CX3CR1⁺.

IMC mouse-level statistics: Эки тараптуу Mann–Whitney U; Benjamini–Hochberg FDR, \(Q=0{,}05\), негизги family size = 8.

TREM2 spatial-correlation family: Өзүнчө төрт тесттик FDR family.

Клиникалык–мейкиндиктик корреляциялар: MG-Igf1KO \(n=6\); беш spatial metric × эки clinical metric = 10 тест; булак p-маанилерди номиналдуу берген жана алардын эч бири FDRден кийин \(p_{\mathrm{adj}}<0{,}05\) болгон эмес.

Figure 1 survival үлгүсү: Cre-CTRL \(n=66\); MG-Igf1KO \(n=88\).

Figure 3 flow-cytometry үлгүсү: Cre-CTRL \(n=10\); MG-Igf1KO \(n=4\).

Негизги TREM2 жыйынтыгы: MG-Igf1KO activated microgliaда TREM2 азайышы, \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}017\).

DAM maturation ratio: Cre-CTRL %83,4; MG-Igf1KO %76,7; \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}017\).

Activated microglia self-clustering: MG-Igf1KOдо көбөйгөн; \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}047\).

Activated microglia–CD8 T-cell proximity: MG-Igf1KOдо көбөйгөн; \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}047\).

CD163+–CD8 spatial enrichment: Контроль median z=18,0; MG-Igf1KO median z=13,7; \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}240\), маанилүү эмес.

CD163+ Arg1 interface: CD8ге жакын cell median intensity Cre-CTRL 4,17, MG-Igf1KO 3,89; cell-level \(p<0{,}001\). CD8ден алыс эки генотипте тең median 3,13.

Булак ичиндеги CyTOF population-count эскертүүсү: ыкма бөлүмү FlowSOM үчүн 25 metacluster жана 23 immune lineage билдирсе, башка текст/фигура түшүндүрмөлөрүндө башка жалпы cluster/population сандары кездешет. Бул сандар Verianla тарабынан үнсүз теңештирилген эмес.

Булак ичиндеги IMC marker-count эскертүүсү: булак бир жерде 27-marker IMC panel, tissue-staining ыкмасында болсо 36-marker metal-conjugated panel/36 marker channel билдирет. Булак бул айырма analysis subsetпи же тексттик дал келбестикпи экенин ачык чечпейт.

Булак ичиндеги статистика эскертүүсү: айрым фигура түшүндүрмөлөрүндөгү тест аныктамалары негизги статистика ыкмасы бөлүмү менен толук бирдей эмес. Verianla сандык p-маанилерди булактагы контексти менен сактап, ыкма атындагы дал келбестиктерди тактаган эмес.

Supplementary Material: opt-SNE cluster overlays, бардык immune clusters, CyTOF cluster marker-expression profile, spatial neighborhood enrichment; ошондой эле CyTOF жана IMC antibody панелдери жана key immune population таблицалары.

Авторлордун салымы: Conceptualization: T.E.L., V.M.S., C.P.; methodology: V.M.S., C.P., P.U.N., A.L., J.-J.D.L.T., A.X., K.F., K.M., C.C.; software and validation: V.M.S.; formal analysis: V.M.S., C.P., T.E.L., R.T.; resources: T.O., A.W., C.M.W.; original draft: V.M.S., C.P.; review and editing: V.M.S., T.E.L., A.W., T.O., R.T., C.M.W.; supervision: T.E.L.; funding acquisition: T.E.L., A.W., T.O., R.T., C.M.W.

Каржылоо: NIH R35NS116835; Lundbeck Foundation R209-2015-2724; Warwara Larsen Foundation 2016; Scleroseforeningen A41538; Danish Research Council DFF 6110-0064 A; NIH R01 AI137239 жана AI187458; NIAMS/NIH Interdisciplinary Skin Biology Training Program T32AR080622; NIH 1S10OD028645-01A1.

Этикалык бекитүү: University of California, Irvine Institutional Animal Care and Use Committee; protocol AUP-25-093; 28 Август 2025–28 Август 2028.

Data Availability: Изилдөөдө көрсөтүлгөн маалыматтар жана анализ коду акылга сыярлык суроо-талап боюнча corresponding authorдон алынышы мүмкүн.

Acknowledgment: Авторлор MG-Igf1KO чычкан моделин түзүүдөгү эмгеги үчүн Dina Arengothко ыраазычылык билдиришет.

Conflicts of Interest: Авторлор кызыкчылыктардын кагылышы жок экенин билдиришкен.

Лицензия: CC BY. Булак фигураларын лицензия боюнча кайра колдонууга болсо да, Verianla макаласында пикселдик көчүрмөнүн ордуна көз карандысыз SVG схемалары тандалган.

Негизги түшүндүрмө чеги: Бул изилдөө микроглиалдык IGF-1дин JHMV менен түзүлгөн чычкан нейросезгенүүсүндө жана демиелинизациясында иммундук гомеостаз менен байланышкан ролун көрсөтөт. Адамдагы көп склероздо IGF-1 дарылоосу, TREM2ге багытталган клиникалык кийлигишүү же башка вирустук неврологиялык ооруларга түз жалпылоо бул экспериментте текшерилген эмес.