Омили афзоиши монанди инсулин 1, ки аз микроглия сарчашма мегирад (insulin-like growth factor 1; IGF-1), дар ин таҳқиқот ҳамчун омили сигналие омӯхта шудааст, ки ба танзими тавозуни иммунӣ аз ҷониби микроглия — ҳуҷайраҳои доимии иммунии системаи марказии асаб — ҳангоми нейроилтиҳоби вирусӣ ва демиелинизатсия мусоидат мекунад. Таҳқиқотчиён мушҳои MG-Igf1KO-ро, ки метавонанд гени Igf1-ро дар микроглия ба таври назоратшавандаи замонӣ хомӯш кунанд, бо штамми JHM-и mouse hepatitis virus (JHMV), ки ҳуҷайраҳои глиалиро сироят мекунад, сироят карда, таъсири аз даст рафтани IGF-1-ро ба назорати вирусӣ, бемории неврологӣ, осеби миелин ва таркиби ҳуҷайраҳои иммунии ҳароммағз таҳқиқ карданд.

Натиҷаи марказии таҳқиқот ҷудо шудани ду раванд аз ҳамдигар аст. Аз даст рафтани IGF-1-и микроглиалӣ назорати репликатсияи JHMV-ро дар системаи марказии асаб ба таври назаррас вайрон накард; баръакс, дар мушҳои MG-Igf1KO бемории клиникӣ вазнинтар гузашт ва махсусан 21 рӯз пас аз сироят демиелинизатсияи ҳароммағз зиёд шуд. Ба ибораи дигар, осеби вазнинтари бофта танҳо бо “бештар будани вирус” шарҳ дода нашуд.

JHMV JHM strain of mouse hepatitis virus мебошад, ки ба ҳуҷайраҳои глиалӣ тропизм нишон медиҳад ва дар мушҳо пас аз энцефаломиелити шадид демиелинизатсияи бо миёнаравии иммунӣ ба вуҷуд меорад. Азбаски ин модел баъзе хусусиятҳои клиникӣ ва гистологии склерози сершуморро тақлид мекунад, дар таҳқиқоти демиелинизатсия истифода мешавад; аммо сирояти JHMV бо склерози сершумори инсон як беморӣ нест ва ин таҳқиқот табобати IGF-1-ро дар одамон намеозмояд.

Ҳазфи микроглиалии Igf1 дар мушҳо бо тамоксифен индуксия карда шуд. Ба ҳайвонот дар синни 4–6 ҳафта, дар давоми панҷ рӯз рӯзе ду маротиба ва бо фосилаи шаш соат байни тазриқҳо, барои ҳар як муш 1 mg тамоксифен дода шуд. Мушҳо дар синни 6–8 ҳафта бо роҳи интракраниалӣ бо 1200 plaque-forming unit (PFU) JHMV дар 30 µL HBSS сироят карда шуданд. Намунаҳои мағзи сар ва ҳароммағз дар рӯзҳои 7., 14. ва 21. пас аз сироят арзёбӣ шуданд.

Транскриптҳои Igf1 дар микроглия нисбат ба мушҳои назоратӣ дар рӯзи 7. пас аз сироят тақрибан %70 ва дар рӯзи 21. тақрибан %96 коҳиш ёфтанд. Бо вуҷуди ин, дар пайгирии 21-рӯза пас аз сирояти JHMV байни гурӯҳҳои MG-Igf1KO ва назорат аз ҷиҳати зиндамонӣ фарқи назаррас дида нашуд. Натиҷаҳои титри вирусӣ ва RNA-и вирусӣ низ нишон надоданд, ки ҳазфи IGF-1 назорати асосии вирусиро вайрон кардааст.

Баръакс, шиддати бемории неврологӣ дар мушҳои MG-Igf1KO зиёд шуд. Дар ҳоле ки демиелинизатсия дар ҳайвоноти назоратӣ ва knockout дар рӯзи 14. монанд буд, дар рӯзи 21. дар ҳароммағзи мушҳои MG-Igf1KO демиелинизатсияи ба таври назаррас бештар муайян шуд. Азбаски сатҳи ибтидоии миелин ва консентратсияи myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) дар мушҳои калонсоли MG-Igf1KO-и сироятнашуда аз назорат фарқ надошт, талафоти афзудаи миелин дар давраи дер танҳо бо он шарҳ дода намешавад, ки модели генетикӣ миелини ибтидоиро дар ҳароммағзи калонсол кам мекунад.

Ситометрияи ҷараён нишон дод, ки дар рӯзи 21. шумораи умумии CD8⁺ T-ҳуҷайраҳо дар ҳароммағзи MG-Igf1KO афзудааст; аммо дар шумораи умумии CD4⁺, CD4⁺ T-ҳуҷайраҳои махсуси вирус, макрофагҳо ва микроглия чунин афзоиши равшан мушоҳида нашудааст. Дар CD8⁺ T-ҳуҷайраҳои махсуси вирус тамоюли афзоиш дида шуд, вале ин муқоиса аз ҷиҳати оморӣ аҳамиятнок набуд.

Дар таҳлили CyTOF mass cytometry тағйироти интихобии иммунӣ муайян шуд. Дар ҳароммағзи MG-Igf1KO ҳиссаи CD8⁺ Ly6C⁺ T-ҳуҷайраҳои эффекторӣ зиёд шуда, кластери Tr1-монанди CD4⁺ T-ҳуҷайраҳо, ки бо хусусиятҳои танзимкунанда мувофиқ аст, коҳиш ёфт. Бо ин вуҷуд, андозаи намунаи CyTOF барои ҳар гурӯҳ танҳо \(n=4\) аст ва p-арзишҳои тестҳои differential-abundance барои 23 metacluster дар манбаъ ба таври иктишофӣ, бе ислоҳи муқоисаҳои сершумор гузориш шудаанд. Аз ин рӯ, ин натиҷаҳо нишонаҳои қавии биологӣ мебошанд, аммо ҷойи тасдиқи намунаи калонро намегиранд.

Натиҷаҳои imaging mass cytometry (IMC) нишон медиҳанд, ки аз даст рафтани IGF-1-и микроглиалӣ на танҳо шумораи ҳуҷайраҳо, балки робитаҳои фенотипӣ ва ҷойгиршавии ҳуҷайраҳои иммунӣ дар дохили бофтаро низ тағйир медиҳад. Дар микроглияи Iba1⁺CD68⁺, ки фаъолшавиро нишон медиҳад, экспрессияи TREM2 дар гурӯҳи MG-Igf1KO коҳиш ёфт ва таносуби камолоти disease-associated microglia (DAM) аз %83,4 дар назорат то %76,7 дар гурӯҳи MG-Igf1KO поён рафт. Ҳар ду муқоиса пас аз ислоҳи Benjamini–Hochberg false discovery rate бо \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}017\) аҳамиятнок боқӣ монданд.

Манбаъ ҳамчунин хабар медиҳад, ки дар осебҳои MG-Igf1KO микроглияи фаъолшуда байни худ бештар гурӯҳбандӣ мешавад ва наздикии фазоии он ба CD8⁺ T-ҳуҷайраҳо зиёд мегардад. Баръакс, фарқи гурӯҳӣ дар наздикии Iba1⁺CD163⁺ ҳуҷайраҳои танзимкунандаи myeloid ба CD8 T-ҳуҷайраҳо танҳо тамоюл аст ва пас аз ислоҳи FDR аҳамиятнок нест (\(p_{\mathrm{adj}}=0{,}240\)). Ин фарқ муҳим аст: гарчанде манбаъ тағйироти ҷойгиршавии CD163⁺ ҳуҷайраҳоро ҳамчун қисми модели биологӣ муҳокима мекунад, ин муқоисаи ягона дар сатҳи гурӯҳ аз ҷиҳати оморӣ қатъӣ тасдиқ нашудааст.

Бозёфти қавитар сигнали arginase-1 (Arg1) дар CD163⁺ ҳуҷайраҳои myeloid аст, ки дар масофаи 30 µm аз CD8 T-ҳуҷайраҳо қарор доранд. Дар гурӯҳи назоратӣ median Arg1 дар ҳуҷайраҳои наздик ба CD8 4,17 буд, дар гурӯҳи MG-Igf1KO бошад 3,89; дар муқоисаи cell-level \(p<0{,}001\) гузориш шудааст. Аммо азбаски ин таҳлил тақрибан 16.000 ҳуҷайраро дар бар мегирад, хеле хурд будани p-арзиш маънои онро надорад, ки андозаи намунаи биологӣ 16.000 аст. Набудани фарқи назаррас дар экспрессияи умумии 12 marker-и функсионалӣ дар таҳлили mouse-level дастгирӣ мекунад, ки тағйироти Arg1 на талафоти паҳншуда дар тамоми популятсияи myeloid, балки хусусияти фазоиест, ки махсусан дар интерфейси myeloid–T-ҳуҷайра дида мешавад.

Таҳқиқотчиён аз ин натиҷаҳо ба хулоса меоянд, ки IGF-1-и аз микроглия сарчашмагиранда, ба ҷои он ки ҷузъи ивазнашавандаи механизми зиддивирусӣ барои назорати ибтидоии сирояти вирусӣ бошад, метавонад танзимкунандаи тавозуни нейроиммунӣ бошад, ки табдили илтиҳоби муҳофизатиро ба иммунопатологияи музмин маҳдуд мекунад. Меҳвари пешниҳодшудаи IGF-1–TREM2–DAM–CD163/Arg1–CD8 як модели муҳими механистӣ аст; аммо дар ин таҳқиқот бо дахолати сабабӣ исбот нашудааст, ки коҳиши TREM2 мустақиман ихтилоли фазоии иммуниро ба вуҷуд меорад.

IGF-1-и Аз Микроглия Сарчашмагиранда Дар Ин Таҳқиқот Чӣ Кор Мекунад?

Тибқи натиҷаҳои таҳқиқот, IGF-1-и аз микроглия сарчашмагиранда бештар ҳамчун танзимкунандаи гомеостази нейроиммунӣ амал мекунад, ки камолоти микроглия, тавозуни байни ҳуҷайраҳои иммунӣ ва маҳдудшавии осеби миелинро дар системаи марказии асаби сироятшуда дастгирӣ мекунад, на ҳамчун омили ҳатмии зиддивирусӣ барои тозакунии асосии JHMV.

Микроглия чист?

Микроглия ҳуҷайраҳои доимии myeloid-и иммунии системаи марказии асаб мебошанд. Дар шароити муқаррарӣ онҳо ба нигоҳдории гомеостази бофта, миелинсозӣ ҳангоми рушд, тоза кардани debris-и ҳуҷайравӣ пас аз осеб ва танзими ҷавоби маҳаллии иммунӣ ҳангоми сироят мусоидат мекунанд.

Миелин сохтори изолятсионии аз липид ва сафеда бой аст, ки аксонҳоро мепӯшонад ва интиқоли сигналҳои электрикиро дастгирӣ мекунад. Дар системаи марказии асаб миелинро олигодендроситҳо истеҳсол мекунанд. Демиелинизатсия осеб ё аз даст рафтани ҳамин қабат мебошад.

IGF-1 чист?

Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) омили афзоишест, ки дар афзоиш ва рушди узвҳо нақш дорад. Дар системаи марказии асаб микроглия ва макрофагҳо яке аз манбаъҳои IGF-1 мебошанд. Маълумоти пешини биологӣ нишон медиҳад, ки IGF-1 бо афзоиши oligodendrocyte progenitor ҳуҷайраҳо ва фарқшавии онҳо ба самти олигодендроситҳо алоқаманд аст.

Ин таҳқиқот ҳамаи нақшҳои IGF-1-ро дар тамоми организм намеомӯзад. Нуқтаи асосии таҷриба кам кардани экспрессияи Igf1 дар микроглия ба таври назоратшавандаи замонӣ ва таъсири он ҳангоми нейроилтиҳоби аз JHMV ба вуҷудомада мебошад.

Модели MG-Igf1KO чист?

Модели MG-Igf1KO модели муши бар асоси Cre-loxP мебошад, ки сохтори генетикии Cx3cr1CreERT/+ : Igf1fl/fl-ро истифода мебарад ва бо тамоксифен индуксия мешавад. Манбаъ онро барои аблятсияи махсуси микроглиалии Igf1 истифода мебарад.

Тамоксифен системаи CreERT-ро фаъол карда, рекомбинатсияи қисми гени ҳадафро, ки байни минтақаҳои flox ҷойгир аст, таъмин мекунад. Ҳадаф дар ин ҷо кам кардани IGF-1-и микроглиалӣ ба таври назоратшавандаи замонӣ дар ҳайвоноти ба синни балоғат наздик мебошад.

ΔCt дар qPCR чӣ маъно дорад?

Манбаъ сигнали RNA-и ҳадафро нисбат ба гени назорати дохилии GAPDH нормализатсия мекунад. Таърифи усулро бо фарқи зерин ифода кардан мумкин аст:

\(Ct\) шумораи cycle мебошад, ки дар он сигнали флуорессентии PCR аз ҳадди муқарраршуда мегузарад. Дар тафсири истифодашудаи манбаъ \(\Delta Ct\)-и пасттар ба сатҳи ибтидоии баландтари mRNA-и ҳадаф ва \(\Delta Ct\)-и баландтар ба сатҳи ибтидоии пасттар ишора мекунад. Сабаб он аст, ки миқдори зиёди ибтидоии RNA ба ҳадди ошкоркунӣ бо даврҳои камтари амплификатсия мерасад.

Оё Модели JHMV Бо Склерози Сершумор Як Чиз Аст?

Не. Модели муше, ки бо JHMV сохта шудааст, энцефаломиелити шадиди вирусӣ ва баъдан демиелинизатсияи бо миёнаравии иммунӣ ба вуҷуд меорад ва баъзе хусусиятҳои клиникӣ ва гистологии склерози сершуморро тақлид мекунад; аммо худи склерози сершумори инсон нест ва натиҷаҳои ин таҳқиқотро бевосита ҳамчун самаранокии табобат дар беморони MS тафсир кардан мумкин нест.

JHMV чист?

JHMV штамми нейротропии JHM-и mouse hepatitis virus ва як murine coronavirus мебошад. Дар ин таҳқиқот вирус ба таври интракраниалӣ дода шуд. Ҳангоми сироят репликатсияи вирусӣ дар ҳуҷайраҳои глиалӣ ба амал меояд; T-ҳуҷайраҳои махсуси вирус ва дигар ҳуҷайраҳои иммунӣ ба системаи марказии асаб муҳоҷират мекунанд.

Дар қисми назарраси ҳайвоноте, ки аз сирояти JHMV зинда мемонанд, баъдан демиелинизатсияи бо миёнаравии системаи иммунӣ инкишоф ёфтанаш мумкин аст. Аз ин рӯ, модел имкон медиҳад, ки робитаҳои байни сирояти вирусӣ, нейроилтиҳоби музмин ва осеби миелин омӯхта шаванд.

Хатти замонии таҷриба

Бори вирусӣ чӣ гуна чен карда шуд?

Миқдори JHMV-и сирояткунанда дар мағзи сар дар ҳуҷайраҳои DBT astrocytoma бо plaque assay арзёбӣ шуд. Plaque-forming unit воҳиди вирусеро ифода мекунад, ки қодир ба афзоиш ва ба вуҷуд овардани очаги намоёни сироят дар қабати ҳуҷайра мебошад.

Миқдори JHMV RNA дар ҳароммағз бо истифода аз экстраксияи RNA, синтези cDNA ва qPCR омӯхта шуд. Транскриптҳои viral matrix glycoprotein нисбат ба назорати дохилии GAPDH нормализатсия шуданд.

Демиелинизатсия чӣ гуна чен карда шуд?

Қисми ҳароммағз, ки ба сатҳҳои торакалии 6–10 мувофиқ аст, хориҷ карда, дар %4 параформальдегид фиксация, бо %30 сахароза cryoprotection карда ва ба блокҳои transverse-и 1 mm ҷудо карда шуд. Бофта бо ғафсии 8 µm бурида шуд.

Буришҳо ҳамроҳ бо гематоксилин-эозин (H&E) бо истифода аз Luxol fast blue (LFB) ранг карда шуданд. LFB ба арзёбии гистологии минтақаҳои аз миелин бой кумак мекунад. Барои ҳар муш 5–8 буриш таҳлил шуда, таносуби масоҳати моддаи сафеди демиелинизатсияшуда ба моддаи сафеди умумӣ бо ImageJ v1.54m ҳисоб карда шуд.

Дар ҳайвоноти сироятнашуда сатҳҳои ибтидоии myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) низ бо ELISA санҷида шуданд.

Чаро Гузариши TREM2 ва Disease-Associated Microglia Муҳим Аст?

TREM2 дар ин таҳқиқот ҳамчун яке аз marker-ҳои гузариши микроглияи фаъолшуда ба фенотипи disease-associated microglia (DAM), ки ба осеб ҷавоб медиҳад, истифода шуд; коҳиши TREM2 ва паст шудани таносуби DAM дар ҳайвоноти MG-Igf1KO бо ҳолате мувофиқ аст, ки барномаи камолоти микроглия вобаста ба ҳис кардани осеб ва тоза кардани debris пурра инкишоф наёфтааст, аммо исбот нашудааст, ки коҳиши TREM2 сабаби мустақими ҳамаи ихтилолҳои баъдӣ мебошад.

TREM2 чист?

TREM2 рецепторест, ки дар ҳуҷайраҳои myeloid мавҷуд аст ва дар ҳис кардани липидҳо, ҷавоби фагоситӣ ва ҳамкории микроглия бо бофтаи осебдида нақш дорад. Аҳамияти TREM2 дар ин таҳқиқот дар он аст, ки ба саволи биологии дигар аз шумораи умумии микроглия ҷавоб медиҳад: микроглия танҳо ҳузур дорад ё ба фенотипи функсионалии мувофиқ барои ҷавоб ба осеб камол меёбад?

Микроглияи фаъолшуда ва DAM чӣ гуна муайян шуданд?

Дар таҳлили IMC микроглияи фаъолшуда:

ва disease-associated microglia:

тасниф шуданд.

Таърифи DAM maturation ratio дар манбаъ:

аст. Дар ин ҷо DAM зергуруҳи TREM2-мусбати disease-associated microglia ва Act_MG категорияи микроглияи фаъолшуда мебошад, ки дар таснифи иерархӣ ба ҳадди TREM2 намерасад.

Ин муқоисаҳо дар сатҳи mouse-level дар \(n=6\) муши назоратӣ ва \(n=6\) муши MG-Igf1KO бо тести Mann–Whitney U анҷом шуда, дар доираи Benjamini–Hochberg FDR family-и ҳашт тест ислоҳ шудаанд.

Оё метавон гуфт: “TREM2 паст аст, пас демиелинизатсияро TREM2 ба вуҷуд овардааст”?

Не. Худи манбаъ дар ин масъала эҳтиёткор аст. Байни сатҳи TREM2 ва гурӯҳбандии дохилии микроглияи фаъолшуда, робитаи фазоии он бо DAM ва наздикиаш ба CD8 T-ҳуҷайраҳо коррелятсияҳои аҳамиятнок ёфт шудаанд; аммо коррелятсия исбот намекунад, ки коҳиши TREM2 сабаби мустақими бозсозии фазоӣ аст.

Муаллифон қайд мекунанд, ки барои ҳал кардани ин сабабият дар модели JHMV дахолатҳои мустақими TREM2 loss-of-function ё TREM2 agonist лозиманд.

Фарқи CyTOF ва Imaging Mass Cytometry Чист?

Дар ин таҳқиқот CyTOF барои чен кардани тақсимоти баландандозаи фенотип ва фаровонии популятсияҳои ҳуҷайраҳои иммунии ҳароммағз истифода шуд, дар ҳоле ки imaging mass cytometry имкон дод ҳамзамон ҷойгиршавии ин ҳуҷайраҳо дар бофта ва ҳамсоягии онҳо бо ҳамдигар дар миқёси тақрибан 30 µm таҳқиқ шавад.

CyTOF чӣ гуна кор кард?

CyTOF усули mass cytometry аст, ки ба ҷои fluorophore антителоҳои бо изотопҳои гуногуни металлӣ нишонгузоришударо истифода бурда, имкон медиҳад marker-ҳои зиёди ҳуҷайравӣ дар як ҳуҷайра чен карда шаванд.

Дар манбаъ ҳуҷайраҳо пас аз viability staining ва surface/intracellular antibody staining дар системаи Standard BioTools Helios таҳлил шудаанд. Файлҳои маълумот бо CyTOF Software v7.0.8493 нормализатсия шуда, batch effect-ҳо бо CytoNorm ислоҳ ва ҳуҷайраҳои мурда, debris, doublet-ҳо ва normalization bead-ҳо аз таҳлил хориҷ карда шуданд.

FlowSOM unsupervised clustering татбиқ шуд ва dimensionality reduction бо визуализатсияи opt-SNE/t-SNE пешниҳод гардид. Mouse-level cluster frequencies ҳамчун фоизи умумии CD45⁺ ҳуҷайраҳо арзёбӣ шуданд.

Дар таҳлили CyTOF differential-abundance барои ҳар гурӯҳ:

муш мавҷуд буд. Аз сабаби ин намунаи хурд ва шумораи зиёди metacluster, манбаъ натиҷаҳои CyTOF-ро дар доираи иктишофӣ арзёбӣ мекунад.

Imaging mass cytometry чӣ гуна кор кард?

Барои IMC бофтаҳои ҳароммағз бо ғафсии 10 µm бурида шуданд; antigen retrieval дар 1 mM sodium citrate, pH 6,0 дар 95–100 °C барои 20 дақиқа иҷро шуд. Буришҳо бо %3 BSA барои 30 дақиқа блок шуда, бо metal-conjugated antibody cocktail шабона дар 4 °C инкубатсия шуданд.

Тасвирбардорӣ бо Hyperion Imaging System бо истифода аз 200 Hz laser frequency, ablation energy 6 ва 1 µm pixel resolution анҷом дода шуд. Дар маҷмӯъ:

ва:

таҳлил шуданд.

Тасвирҳои хоми IMC бо IMC-Denoise pipeline тоза карда шуданд. Барои ҳар marker channel 30.000 training patch сохта шуда, аввал DIMR hot-pixel removal ва баъд DeepSNiF shot-noise filtering татбиқ шуд.

Сегментатсияи ҳуҷайра бо Cellpose-SAM

Барои ҷудо кардани сарҳадҳои ҳуҷайра аз тасвирҳо Cellpose-SAM-и бо GPU суръатёфта, cpsam model v4.0 истифода шуд. Стратегияи two-pass татбиқ шуд:

Ҳар ду pass channel-ҳои Ir191 ва Ir193 DNA intercalator-ро истифода карданд. Сегментҳои нави pass дуюм вақте якҷо карда шуданд, ки бо ҳуҷайраҳои мавҷуда камтар аз %50 ҳампӯшӣ доштанд; объектҳои аз 500 pixel² калон ҳамчун doublet ё debris-и эҳтимолӣ хориҷ шуданд.

Аз тақрибан 184.000 segmented object, 62.204 immune-associated cell барои downstream analysis нигоҳ дошта шуданд.

Чаро шиддатҳои marker аз табдили arcsinh гузаронида шуданд?

Қиматҳои marker intensity:

бо cofactor \(=1\) табдил дода шуданд. Ин табдил dynamic range-и қиматҳои хеле баланди signal-ро фишурда, ҳамзамон rank order-и қиматҳоро нигоҳ медорад ва истифодаи percentile-based threshold-ро барои marker-ҳои дорои expression scale-и гуногун осон мекунад.

Таснифи навъи ҳуҷайра

Манбаъ барои marker positivity асосан қимати 75. percentile-и arcsinh-transformed intensity distribution-ро истифода кардааст. Ба навъҳои асосии таснифшуда astrocyte, neuron, oligodendrocyte, microglia, activated microglia, DAM, CD4 T cell ва CD8 T cell дохил мешаванд. Ҳуҷайраҳое, ки ба ҳеҷ threshold намерасиданд, ҳамчун “Other” тасниф шуданд.

Iba1⁺CD163⁺ regulatory myeloid cells азбаски метавонанд бо синфҳои дигар ҳампӯшӣ дошта бошанд, ҳамчун non-exclusive overlay population алоҳида таҳлил шуданд.

Таҳлили ҳамсоягии фазоӣ

Дар ҳар тасвири бофта бо истифода аз 30 pixel, яъне мувофиқи ҳалли тасвири манбаъ 30 µm interaction radius, spatial neighbor graph сохта шуд. Барои ҳар ҷуфти навъи ҳуҷайра шумораи ҳамсоягиҳои мушоҳидашуда бо null distributions, ки аз:

маротиба permutation-и тасодуфии нишонаҳои ҳуҷайра сохта шудаанд, муқоиса карда шуда, image-level enrichment z-score-ҳо ба даст омаданд.

Тасвирҳое, ки камтар аз 50 ҳуҷайра доштанд, хориҷ шуданд. Mouse-level score аз миёнаи z-score-и тасвирҳои ҳамон ҳайвон гирифта шуд.

Rank-biserial effect size

Манбаъ дар муқоисаҳои ду гурӯҳи Mann–Whitney U бо намунаи хурд барои effect size формулаи:

rank-biserial correlation-ро истифода кардааст.

Дар ин ҷо \(U\) омораи Mann–Whitney U ва \(n_1\), \(n_2\) шумораи намунаҳои мустақили биологии ду гурӯҳ мебошанд. Манбаъ \(|r|\ge0{,}5\)-ро таъсири калон, \(0{,}3\le|r|<0{,}5\)-ро миёна ва \(|r|<0{,}3\)-ро хурд тасниф мекунад.

Усул ва Натиҷаҳои Таҳқиқот

Ҳазфи IGF-1 Бе Афзоиши Бори Вирусӣ Ба Демиелинизатсия Чӣ Гуна Таъсир Кард?

Ҳазфи микроглиалии Igf1 назорати асосии JHMV-ро вайрон накард, аммо бо зиёд шудани бемории клиникӣ ва демиелинизатсияи ҳароммағз дар давраи музмини сироят алоқаманд буд; манбаъ моделиеро пешниҳод мекунад, ки инро бештар бо вайрон шудани гомеостази иммунӣ ва барномаҳои myeloid-и муҳофизаткунандаи бофта шарҳ медиҳад, на бо афзоиши репликатсияи вирусӣ.

Назорати вирусӣ

Дар таҳлили Kaplan–Meier байни мушҳои бо JHMV сироятшуда:

• Cre-CTRL: \(n=66\)
• MG-Igf1KO: \(n=88\)

дар пайгирии 21-рӯза фарқи назарраси зиндамонӣ ёфт нашуд.

Дар мушҳои MG-Igf1KO баллҳои клиникӣ махсусан дар рӯзҳои 6. ва 7. ва дар давраи музмин байни рӯзҳои 17–21. баландтар буданд. Бо вуҷуди ин, натиҷаҳои viral plaque assay ва qPCR дастгирӣ намекунанд, ки ин манзараи вазнинтари клиникӣ аз нокомии назорати репликатсияи вирусӣ сарчашма мегирад.

Демиелинизатсия

Дар рангкунии LFB-и мушҳои калонсоли MG-Igf1KO ва назоратии сироятнашуда фарқи ибтидоии миелин дида нашуд; натиҷаҳои MOG ELISA низ фарқи назарраси ибтидоиро нишон надоданд.

Дар рӯзи 14. пас аз сирояти JHMV сатҳи демиелинизатсияи гурӯҳҳо монанд буд. Дар рӯзи 21. бошад, демиелинизатсия дар гурӯҳи MG-Igf1KO аз гурӯҳи назоратӣ баландтар буд; матни натиҷаи асосӣ барои ин фарқ \(p<0{,}04\), шарҳи фигура бошад \(p\le0{,}05\) медиҳад.

Ситометрияи ҷараён

Дар ин муқоисаҳои flow-cytometry дар гурӯҳи Cre-CTRL \(n=10\) ва дар гурӯҳи MG-Igf1KO \(n=4\) истифода шуд ва манбаъ қайд кардааст, ки муқоисаҳо бо multiple unpaired t-test анҷом шуда, multiple-comparison correction татбиқ нашудааст. Ин ҷузъиёти оморӣ ҳангоми арзёбии қувваи натиҷаҳо бояд нигоҳ дошта шавад.

CyTOF: тавозуни эффекторӣ ва танзимкунанда

Натиҷаҳои CyTOF бештар ба тағйироти таркиб ишора карданд, на ба афзоиши умумии ҳуҷайраҳои иммунӣ.

Он ки кластери Tr1-монанд marker-ҳои марбут ба хусусиятҳои танзимкунанда, аз қабили CD39, нишон медиҳад, ин тафсирро дастгирӣ мекунад. Аммо манбаъ ошкоро қайд мекунад, ки marker-ҳои CD49b ва LAG-3 дар панел набуданд ва ин population-ро на ҳамчун ҳуҷайраи қатъии Tr1, балки ҳамчун Tr1-like муайян мекунад.

IMC: ҳуҷайраҳои иммунӣ дар дохили бофта чӣ гуна аз нав ташкил шуданд?

Коррелятсияҳо байни TREM2 ва сохтори фазоӣ

Се аз ин коррелятсияҳо пас аз ислоҳи FDR аҳамиятноканд. Бо вуҷуди ин, коррелятсияҳо худ аз худ хулосаи “коҳиши TREM2 ин тағйироти фазоиро ба вуҷуд овард”-ро исбот намекунанд.

Чаро натиҷаи CD163 ва Arg1 бояд дигар хел тафсир шавад?

Mouse-level spatial enrichment-и Iba1⁺CD163⁺ regulatory myeloid ҳуҷайраҳо бо CD8 T-ҳуҷайраҳо дар назорат median z=18,0 ва дар MG-Igf1KO median z=13,7 буд. Аммо:

аз ин рӯ натиҷаи “dispersal” дар сатҳи гурӯҳ аҳамиятнок нест ва бояд ҳамчун тамоюл нигоҳ дошта шавад.

Баръакс, Arg1 intensity-и CD163⁺ ҳуҷайраҳое, ки дар масофаи 30 µm аз CD8 T-ҳуҷайраҳо қарор доранд:

мебошад. Дар муқоисаи cell-level-и ҳуҷайраҳои наздик Cre-CTRL–MG-Igf1KO \(p<0{,}001\) гузориш шудааст.

Ин таҳлил дар 15.979 CD163⁺ ҳуҷайра анҷом дода шудааст. Шумораи хеле зиёди ҳуҷайраҳо cell-level statistical power-и қавӣ медиҳад; аммо шумораи ҳуҷайраҳо ба шумораи ҳайвоноти мустақил баробар нест. Манбаъ низ ошкоро мегӯяд, ки p-арзишҳои cell-level бояд берун аз mouse-level FDR family нигоҳ дошта ва якҷо бо натиҷаҳои mouse-level тафсир шаванд.

Чаро коррелятсияҳои клиникии Figure 9 иктишофӣ мебошанд?

Figure 9 танҳо дар дохили мушҳои MG-Igf1KO:

анҷом дода шудааст. Азбаски панҷ метрикаи фазоӣ ҳам бо peak clinical score ва ҳам бо cumulative clinical score муқоиса шудаанд, ҳамагӣ 10 тест мавҷуд аст.

Дар байни натиҷаҳои номиналӣ ҷолиб:

ёфт шуданд. Аммо манбаъ ошкоро хабар медиҳад, ки барои 10-test family ҳеҷ яке аз ин коррелятсияҳо пас аз ислоҳи FDR аҳамиятнок боқӣ намонданд:

Аз ин рӯ, онҳо бояд ҳамчун робитаҳои иктишофӣ арзёбӣ шаванд, ки дар оянда дар когортҳои калонтар санҷида шаванд.

Модели интегратсионии пешниҳодшуда барои IGF-1-и аз микроглия сарчашмагиранда

Натиҷаҳое, ки таҳқиқот дастгирӣ мекунад

Кам кардани IGF-1-и аз микроглия сарчашмагиранда бе вайрон кардани назарраси назорати асосии вирусии CNS-и JHMV бо бемории музмини клиникии вазнинтар ва демиелинизатсияи бештари ҳароммағз алоқаманд аст.

Аз даст рафтани IGF-1-и микроглиалӣ бо афзоиши умумии CD8 T-ҳуҷайраҳо ва васеъшавии CD8⁺Ly6C⁺ эффектор population дар CyTOF ҳамроҳ аст.

Дар мушҳои MG-Igf1KO экспрессияи TREM2 дар микроглияи фаъолшуда ва DAM maturation ratio коҳиш ёфтааст.

Бофтаи MG-Igf1KO бо self-clustering-и афзудаи микроглияи фаъолшуда ва наздикии афзудаи фазоӣ ба CD8 T-ҳуҷайраҳо тавсиф мешавад.

Arg1 intensity дар CD163⁺ myeloid ҳуҷайраҳои наздик ба CD8 T-ҳуҷайра дар гурӯҳи MG-Igf1KO пасттар аст.

Ин бозёфтҳо тафсиреро дастгирӣ мекунанд, ки IGF-1-и аз микроглия сарчашмагиранда ҳангоми демиелинизатсияи вирусӣ ба нигоҳ доштани тавозуни байни фаъолшавии иммунӣ ва танзим/ҳалли ҷавоб мусоидат мекунад.

Натиҷаҳое, ки таҳқиқот дастгирӣ намекунад

Таҳқиқот нишон намедиҳад, ки IGF-1 табобати склерози сершумор дар одамон аст.

Таҳқиқот нишон намедиҳад, ки сирояти JHMV бо склерози сершумори инсон як беморӣ аст.

Таҳқиқот нишон намедиҳад, ки демиелинизатсияи вазнинтар аз бори бештари вирусӣ ба вуҷуд омадааст.

Таҳқиқот исбот намекунад, ки коҳиши TREM2 сабаби мустақими ҳамаи тағйироти фазоии иммунӣ аст.

Таҳқиқот нишон намедиҳад, ки CD163⁺ myeloid ҳуҷайраҳо аз CD8 T-ҳуҷайраҳо дар сатҳи гурӯҳ ба таври статистикӣ қатъӣ дур шудаанд; муқоисаи дахлдор \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}240\) мебошад.

Азбаски коррелятсияҳои номиналии клиникии Figure 9 пас аз multiple-testing correction аҳамиятнок боқӣ намонданд, онҳо робитаҳои тасдиқшудаи prognostic biomarker нестанд.

Натиҷаҳои аз ҳазфи генетикии Igf1 дар модели муш бадастомада нишон намедиҳанд, ки додани доруи системавӣ ё маҳаллии IGF-1 дар одамон ба ҳамон самт ва бехатар таъсир мекунад.

Маҳдудиятҳои асосии методологӣ

Модели ҳайвонот: Натиҷаҳо ба сирояти murine JHMV дахл доранд; онҳоро бевосита ба бемории инсон умумӣ кардан мумкин нест.

Андозаи намуна: Дар таҳлили CyTOF \(n=4\)/гурӯҳ ва дар таҳлили IMC \(n=6\)/гурӯҳ истифода шудааст. Хусусан коррелятсияҳои клиникии within-genotype танҳо ба шаш муши MG-Igf1KO асос ёфтаанд.

Муқоисаҳои сершумори CyTOF: Манбаъ p-арзишҳои CyTOF differential-abundance-ро дар 23 metacluster ба таври иктишофӣ бе ислоҳ гузориш кардааст.

Хатари cell-level pseudo-replication: Гарчанде таҳлили Arg1 15.979 ҳуҷайраро дар бар мегирад, воҳиди мустақили биологӣ ҳуҷайра нест, балки муш аст. Манбаъ инро якҷо бо натиҷаҳои mouse-level тафсир мекунад.

Сабабият: Коррелятсияҳои TREM2–ташкили фазоӣ самти сабабро муайян карда наметавонанд.

Таърифи Tr1: Азбаски CD49b ва LAG-3 дар панел набуданд, CD4 population-и дахлдор танҳо Tr1-монанд номида шудааст.

Маълумоти ҷинс дар манбаъ: Дар матни асосии усул ҷинси ҳайвоноти таҷрибавӣ ошкоро гузориш нашудааст; аз ин рӯ, хулосаи махсуси ҷинсӣ баровардан мумкин нест.

Номувофиқати усулҳо дар дохили манбаъ: Шумораи CyTOF cluster, навишти баъзе тестҳои оморӣ ва андозаи IMC marker panel дар бахшҳои гуногун комилан яксон гузориш нашудаанд. Verianla ин фарқҳоро хомӯшона яксон накардааст.

Ёддошт оид ба Манбаъ ва Усул

Унвони аслӣ: Microglial-Derived IGF-1 Serves as a Regulator for Neuroimmune Homeostasis During Viral-Induced Demyelination

Муаллифон: Vanessa M. Scarfone, Collin Pachow, Pauline U. Nguyen, Anita Lakatos, Jamie-Jean De La Torre, Alisa Xie, Kellie Fernandez, Charlene Collado, Kaitlin Murray, Roberto Tinoco, Craig M. Walsh, Trevor Owens, Agnieszka Wlodarczyk, Thomas E. Lane.

Саҳми баробар: Vanessa M. Scarfone ва Collin Pachow.

Corresponding author: Thomas E. Lane.

Почтаи электронӣ: tlane@uci.edu

Муассиса 1: Sue & Bill Gross Stem Cell Research Center, University of California, Irvine, CA 92697, USA.

Муассиса 2: Department of Molecular Biology and Biochemistry, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, CA 92697, USA.

Муассиса 3: Department of Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine, 2213 McGaugh Hall, Irvine, CA 92697, USA.

Муассиса 4: Center for Virus Research, University of California, Irvine, CA 92697, USA.

Муассиса 5: Neurobiology Research, Department of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, 5000 Odense, Denmark.

Маҷалла: Viruses.

Ношир: MDPI, Basel, Switzerland.

Сол: 2026.

Ҷилд: 18.

Шумора: 5.

Рақами мақола: 550.

DOI: 10.3390/v18050550.

Received: 6 Апрел 2026.

Revised: 1 Май 2026.

Accepted: 6 Май 2026.

Published: 9 Май 2026.

Навъи манбаъ: Мақолаи аслии таҳқиқотии рецензияшуда.

Литсензия: Creative Commons Attribution (CC BY).

Пайванди расмии нашр: https://www.mdpi.com/1999-4915/18/5/550

Муҳаррири академӣ: Maria Cecilia Garibaldi Marcondes.

Соҳаи илмӣ: Нейроиммунология, нейровирусология, демиелинизатсия, биологияи микроглия ва сирояти вирусии системаи марказии асаб.

Навъи таҳқиқот: Модели генетикии муш + сирояти вирусӣ + гистопатология + flow cytometry + CyTOF mass cytometry + imaging mass cytometry + таҳлили фазоии ҳуҷайра.

Модели муш: MG-Igf1KO, Cx3cr1CreERT/+ : Igf1fl/fl; назорат, Cx3cr1CreERT/+ : Igf1+/+.

Индуксияи ген: Дар синни 4–6 ҳафта барои ҳар муш 1 mg тамоксифен, 100 µL intraperitoneal injection, рӯзе ду маротиба, бо шаш соат фосила байни тазриқҳо, панҷ рӯзи пайдарпай.

Viral challenge: Дар синни 6–8 ҳафта 1200 PFU JHMV дар 30 µL HBSS, интракраниалӣ.

Намунагирӣ: Рӯзҳои 7., 14. ва 21. post-infection.

Бори вирусӣ: Plaque assay-и мағзи сар; JHMV mRNA qPCR-и ҳароммағз.

Гистология: H&E + Luxol fast blue; 8 µm spinal-cord cryosections; барои ҳар муш 5–8 буриш; ImageJ v1.54m.

Андозагирии MOG: Abcam ab282304 ELISA; Varioskan LUX.

Flow cytometry: Novocyte; таҳлил FlowJo v10.0.8 ва 11.0.2; FACS sorting BD FACSAria Fusion.

CyTOF: Standard BioTools Helios; normalization CyTOF Software v7.0.8493; OMIQ; CytoNorm; FlowSOM; opt-SNE/t-SNE.

Намунаи биологии CyTOF: \(n=4\)/генотип.

IMC: Hyperion Imaging System; 39 tissue image; 12 муш, 6 Cre-CTRL + 6 MG-Igf1KO; 200 Hz; ablation energy 6; 1 µm pixel resolution.

IMC denoising: IMC-Denoise; DIMR + DeepSNiF; барои ҳар marker channel 30.000 training patch.

Сегментатсия: Cellpose-SAM cpsam v4.0, GPU acceleration, two-pass segmentation.

Spatial neighborhood radius: 30 pixel = 30 µm.

Шумораи permutation: 500 random cell-label permutation.

IMC analysis cell count: Аз тақрибан 184.000 segmented object, 62.204 immune-associated cell.

CD163/Arg1 analysis: 15.979 Iba1⁺CD163⁺ cell; %84,2 CX3CR1⁺.

IMC mouse-level statistics: Mann–Whitney U-и дутарафа; Benjamini–Hochberg FDR, \(Q=0{,}05\), main family size = 8.

TREM2 spatial-correlation family: FDR family-и ҷудогонаи чор тест.

Коррелятсияҳои клиникӣ–фазоӣ: MG-Igf1KO \(n=6\); панҷ spatial metric × ду clinical metric = 10 test; манбаъ p-арзишҳоро номиналӣ гузориш кардааст ва ҳеҷ кадом пас аз FDR \(p_{\mathrm{adj}}<0{,}05\) нашудааст.

Figure 1 survival sample: Cre-CTRL \(n=66\); MG-Igf1KO \(n=88\).

Figure 3 flow-cytometry sample: Cre-CTRL \(n=10\); MG-Igf1KO \(n=4\).

Натиҷаи асосии TREM2: Коҳиши TREM2 дар activated microglia-и MG-Igf1KO, \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}017\).

DAM maturation ratio: Cre-CTRL %83,4; MG-Igf1KO %76,7; \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}017\).

Activated microglia self-clustering: Дар MG-Igf1KO афзуда; \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}047\).

Activated microglia–CD8 T-cell proximity: Дар MG-Igf1KO афзуда; \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}047\).

CD163+–CD8 spatial enrichment: Назорат median z=18,0; MG-Igf1KO median z=13,7; \(p_{\mathrm{adj}}=0{,}240\), аҳамиятнок нест.

CD163+ Arg1 interface: Cell median intensity дар наздикии CD8: Cre-CTRL 4,17, MG-Igf1KO 3,89; cell-level \(p<0{,}001\). Дур аз CD8 дар ҳар ду генотип median 3,13.

Ёддошти population-count-и CyTOF дар дохили манбаъ: қисми усул барои FlowSOM 25 metacluster ва 23 immune lineage гузориш мекунад, аммо дар дигар матн/шарҳҳои фигура шумораҳои дигари умумии cluster/population дида мешаванд. Verianla ин шумораҳоро хомӯшона баробар накардааст.

Ёддошти IMC marker-count дар дохили манбаъ: манбаъ дар як ҷой 27-marker IMC panel ва дар усули tissue-staining 36-marker metal-conjugated panel/36 marker channel хабар медиҳад. Манбаъ ошкоро ҳал намекунад, ки ин фарқ analysis subset аст ё номувофиқати матнӣ.

Ёддошти оморӣ дар дохили манбаъ: таърифҳои баъзе тестҳо дар шарҳҳои фигура бо қисми асосии усулҳои оморӣ комилан яксон нестанд. Verianla p-арзишҳои миқдориро бо контексти манбаъ нигоҳ дошта ва номувофиқати номи усулро қатъӣ ҳал накардааст.

Supplementary Material: opt-SNE cluster overlays, ҳамаи immune clusters, CyTOF cluster marker-expression profile, spatial neighborhood enrichment; инчунин панелҳои CyTOF ва IMC antibody ва ҷадвалҳои key immune population.

Саҳми муаллифон: Conceptualization: T.E.L., V.M.S., C.P.; methodology: V.M.S., C.P., P.U.N., A.L., J.-J.D.L.T., A.X., K.F., K.M., C.C.; software and validation: V.M.S.; formal analysis: V.M.S., C.P., T.E.L., R.T.; resources: T.O., A.W., C.M.W.; original draft: V.M.S., C.P.; review and editing: V.M.S., T.E.L., A.W., T.O., R.T., C.M.W.; supervision: T.E.L.; funding acquisition: T.E.L., A.W., T.O., R.T., C.M.W.

Маблағгузорӣ: NIH R35NS116835; Lundbeck Foundation R209-2015-2724; Warwara Larsen Foundation 2016; Scleroseforeningen A41538; Danish Research Council DFF 6110-0064 A; NIH R01 AI137239 ва AI187458; NIAMS/NIH Interdisciplinary Skin Biology Training Program T32AR080622; NIH 1S10OD028645-01A1.

Тасдиқи ахлоқӣ: University of California, Irvine Institutional Animal Care and Use Committee; protocol AUP-25-093; 28 Август 2025–28 Август 2028.

Data Availability: Маълумот ва коди таҳлилии пешниҳодшуда дар таҳқиқот бо дархости асоснок аз corresponding author дастрас аст.

Acknowledgment: Муаллифон ба Dina Arengoth барои кор дар сохтани модели муши MG-Igf1KO ташаккур мегӯянд.

Conflicts of Interest: Муаллифон изҳор кардаанд, ки бархӯрди манфиатҳо надоранд.

Литсензия: CC BY. Гарчанде фигураҳои манбаъ аз рӯи литсензия метавонанд дубора истифода шаванд, дар мақолаи Verianla ба ҷои нусхаи пикселӣ схемаҳои мустақили SVG афзал дониста шудаанд.

Ҳудуди асосии тафсир: Ин таҳқиқот нақши марбут ба гомеостази иммунии IGF-1-и микроглиалиро дар нейроилтиҳоб ва демиелинизатсияи муш, ки бо JHMV ба вуҷуд оварда шудааст, нишон медиҳад. Табобати IGF-1 дар склерози сершумори инсон, дахолати клиникии ҳадафманди TREM2 ё умумисозии мустақим ба дигар бемориҳои неврологии вирусӣ дар ин таҷриба санҷида нашудаанд.