PSMB9 (proteasome subunit beta type-9; LMP2), immünoproteazomun 20S çekirdek parçacığında yer alan ve antijen işlenmesiyle ilişkili protein parçalanmasına katılan katalitik bir alt birimdir. Bu çalışma, romatoid artritte (Rheumatoid Arthritis, RA) PSMB9'un hastalıkla ilişkisini ve doğal bir alkaloid olan sinomeninin (SIN) PSMB9 ile olası etkileşimini; çoklu transkriptom veri setleri, bağışıklık hücresi infiltrasyonu analizi, WGCNA, yolak analizleri, single-cell RNA-seq, moleküler docking ve RAW264.7 makrofaj hücre deneylerini birleştirerek araştırmaktadır.

Dört GEO gen ekspresyon veri setinden elde edilen farklı şekilde eksprese edilen genler ve GSE55457 üzerinde kurulan ağırlıklı gen eş-ekspresyon ağı birlikte değerlendirildiğinde PSMB9, TAP1 ve CFB ortak adaylar arasında belirlenmiştir. Bağışıklık infiltrasyonu analizleri RA sinovyumunda özellikle M1 makrofaj zenginleşmesini göstermiştir. PSMB9 daha sonra protein–protein etkileşim ağlarında merkezi bir immünoproteazom/antijen işleme bileşeni olarak incelenmiştir.

GSE109449 single-cell RNA-seq veri setindeki dört donörden toplam 396 sinovyal fibroblast hücresinin yeniden analizi, RA kaynaklı fibroblast-benzeri sinoviyositlerde PSMB9 ekspresyonunun OA grubuna göre yükseldiğini ve PSMB9 ekspresyonunun interferon-α, interferon-γ, IL6/JAK–STAT3 ve allograft rejection gibi inflamatuvar Hallmark yolaklarıyla ilişkili olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte bu single-cell bölümü yalnız dört donöre dayandığı için çalışma tarafından keşifsel kabul edilmektedir.

Sinomenin ile PSMB9 arasında yapılan moleküler docking analizinde Vina skoru −9,0 kcal/mol bulunmuştur. Hücresel termal kayma testi (Cellular Thermal Shift Assay, CETSA), sinomenin varlığında PSMB9'un termal davranışında zayıf bir stabilize edici etki göstermiş ve olası hedef etkileşimini desteklemiştir. LPS ile inflamasyon oluşturulan RAW264.7 makrofajlarında 150–600 µM sinomenin, IL-6 ve TNF-α düzeylerinde doza bağlı azalma ve PSMB9 protein ekspresyonunda düşüşle ilişkilendirilmiştir.

Bu sonuçlar sinomeninin anti-inflamatuvar etkilerinin en azından bir bölümünün PSMB9 düzenlenmesiyle ilişkili olabileceğini düşündürmektedir. Ancak çalışma bunu kesin ve tek mekanizma olarak kanıtlamamaktadır. Fonksiyonel deneyler yalnız fare kökenli RAW264.7 hücre hattında yapılmış, hayvan modeli veya RA hastalarında doğrudan tedavi deneyi gerçekleştirilmemiştir. Dolayısıyla PSMB9 bu çalışmada aday biyobelirteç ve aday terapötik hedef niteliğindedir; klinikte doğrulanmış bir tanı testi veya tedavi hedefi değildir.

Romatoid artritte araştırılan temel problem nedir?

Romatoid artrit, kronik sinovyal inflamasyon ve ilerleyici eklem hasarıyla karakterize sistemik bağışıklık ilişkili bir hastalıktır. Hastalığın patolojisinde yalnız dolaşımdaki bağışıklık hücreleri değil, sinovyal dokunun yerleşik stromal hücreleri de inflamatuvar ortamın sürdürülmesine katkıda bulunabilir.

Çalışmanın araştırma sorusu iki bağlantılı bölüme ayrılmaktadır. Birincisi, farklı insan transkriptom veri setlerinde RA ile tekrar tekrar ilişkili görünen merkezi bir immün genin belirlenip belirlenemeyeceğidir. İkincisi ise sinomeninin anti-inflamatuvar etkilerinin bu gen ve onun protein ürünü üzerinden kısmen açıklanıp açıklanamayacağıdır.

Sinomenin nedir?

Sinomenin, Sinomenium acutum bitkisinden elde edilen monomerik bir alkaloiddir. Kaynağın giriş bölümünde daha önceki çalışmalar ve klinik araştırmalar temelinde sinomeninin anti-inflamatuvar, immünomodülatör, analjezik ve kemik koruyucu etkilerle ilişkilendirildiği belirtilmektedir.

Ancak bu makalenin kendi deneyleri sinomeninin klinik RA etkinliğini yeniden test etmemektedir. Bu çalışma daha dar bir soruya, yani sinomenin ile PSMB9 arasında olası moleküler ve hücresel bir bağlantı bulunup bulunmadığına odaklanmaktadır.

PSMB9 Romatoid Artrit Açısından Neden Önemlidir?

PSMB9 veya LMP2, immünoproteazomun katalitik beta alt birimlerinden biridir; hücre içi proteinlerin peptitlere parçalanmasına ve bu peptitlerin TAP1 aracılığıyla endoplazmik retikuluma taşınıp MHC sınıf I antijen sunumuna hazırlanmasına katkıda bulunur. PSMB9 ekspresyonunun interferon-γ tarafından artırılabilmesi, proteinin bağışıklık aktivasyonu ile doğrudan bağlantılı biyolojik bağlamını güçlendirmektedir.

Proteazom, hücrede gereksiz veya hasarlı proteinlerin kontrollü parçalanmasını sağlayan büyük protein kompleksidir. İmmünoproteazom, özellikle inflamatuvar ve interferonla uyarılmış koşullarda belirli katalitik alt birimlerin standart proteazom alt birimlerinin yerini aldığı özel bir proteazom biçimidir. PSMB9 bu özel katalitik alt birimlerden biridir.

Dolayısıyla PSMB9 yalnız “bir gen adı” değildir. Gen ekspresyonundaki değişim, antijen işlenmesi ve inflamatuvar sinyal ortamıyla bağlantılı daha büyük bir immünolojik sistemin parçasıdır. Bununla birlikte bir ağ analizinde merkezi görünmesi tek başına hastalığı yönettiği veya inhibisyonunun tedavi sağlayacağı anlamına gelmez; bu nedenle çalışma daha sonra farklı analiz katmanları ve hücresel deneylerle PSMB9'u takip etmiştir.

Dört GEO veri seti neden doğrudan birleştirilmedi?

Çalışmada GSE276772, GSE285977, GSE55457 ve GSE77298 olmak üzere dört GEO gen ekspresyon veri seti kullanılmıştır. GSE55457 ve GSE77298 RA hastalarının ve sağlıklı kontrollerin sinovyal doku örneklerini içerirken GSE276772 ile GSE285977 gen perturbasyonu veya sitokin uyarımı türünde veri setleri olarak kullanılmıştır.

Veri setlerinin platformları aynı olmadığı için araştırmacılar ekspresyon matrislerini tek büyük matriste birleştirmemiştir. Bunun yerine her veri seti bağımsız işlenmiş, diferansiyel ekspresyon sonuçları gen düzeyinde karşılaştırılmıştır. Böylece farklı mikroarray ve RNA-seq platformlarının oluşturabileceği platformlar arası batch etkisinin doğrudan ortak matrise taşınması önlenmeye çalışılmıştır.

Mikroarray verileri nasıl işlendi?

Mikroarray CEL dosyaları R ortamında affy v1.80.0 paketiyle içe aktarılmış ve Robust Multi-Array Average (RMA) ile işlenmiştir. RMA süreci üç temel aşama içerir:

• arka plan düzeltmesi,
• quantile normalization,
• probe-set summarization.

Sonuçta log2 ölçekli gen ekspresyon değerleri elde edilmiş, prob setleri platforma özgü annotation paketleriyle gen sembolleri ve Entrez ID'lerine eşlenmiştir. Eksik değerler impute v1.76.0 paketiyle ele alınmıştır.

RNA-seq verileri nasıl işlendi?

RNA-seq verisi DESeq2 v1.42.1 ile standart iş akışı kullanılarak analiz edilmiştir. Mikroarray veri setlerinde diferansiyel ekspresyon için limma v3.58.1, RNA-seq veri setinde ise DESeq2 kullanılmıştır.

Kaynağın farklı şekilde eksprese edilen gen (Differentially Expressed Gene, DEG) tanımı:

\[ p < 0.05 \quad \text{ve} \quad |\log_2 FC| > 0.5 \]

koşullarına dayanır.

\(\log_2 FC\), iki grup arasındaki ekspresyon değişiminin log2 tabanındaki kat değişimidir. Pozitif değer daha yüksek, negatif değer daha düşük ekspresyon yönünü gösterir. Mutlak değerin 0,5'ten büyük olması değişimin belirli bir büyüklüğü aşmasını gerektirirken \(p<0.05\) kaynakta kullanılan istatistiksel seçim eşiğidir.

Burada önemli bir ayrıntı vardır: kaynak DEG seçiminde doğrudan \(p<0.05\) yazmaktadır. Verianla bunu düzeltilmiş p-değeri veya FDR eşiğiymiş gibi değiştirmemektedir.

Dört veri setinde kaç DEG bulundu?

Bu sayıların birbirinden çok farklı olması tek başına biyolojik etkinin bir veri setinde “daha güçlü” olduğu anlamına gelmez. Veri seti türleri, platformlar, deney koşulları ve örnek yapıları farklıdır. Çalışmanın stratejisi mutlak DEG sayısını karşılaştırmaktan çok, farklı analizlerden tekrar eden biyolojik sinyalleri belirlemektir.

GO ve KEGG analizi neyi araştırıyor?

Bir DEG listesinde yüzlerce veya binlerce gen bulunabilir. Gene Ontology (GO) ve Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analizi, bu gen listesindeki belirli biyolojik işlev veya yolakların beklenenden daha sık temsil edilip edilmediğini araştırır.

Çalışmada clusterProfiler v4.11.0 kullanılmıştır. İnsan genleri için org.Hs.eg.db, fare genleri için org.Mm.eg.db annotation kaynakları kullanılmış, genler Entrez ID'lerine dönüştürülmüştür.

GO analizinde üç sınıf değerlendirilmiştir:

• BP — Biological Process: genlerin katıldığı biyolojik süreçler,
• CC — Cellular Component: ürünlerin bulunduğu hücresel yapılar,
• MF — Molecular Function: moleküler düzeyde işlevler.

GO için kaynak adjusted p-value < 0.05, KEGG için ise p < 0.05 eşiğini vermektedir.

DEG tabanlı enrichment sonuçlarında bağışıklık ve inflamasyonla ilişkili süreçler belirginleşmiş; makrofaj aktivasyonunun düzenlenmesi, inflamatuvar yanıt, kemik rezorpsiyonu ve IL-15 aracılı sinyal gibi başlıklar öne çıkmıştır.

GSEA neden DEG analizine ek olarak kullanıldı?

DEG yaklaşımı yalnız önceden belirlenen istatistiksel eşikleri geçen genleri kullanır. Buna karşılık Gene Set Enrichment Analysis (GSEA), bütün sıralanmış gen listesindeki küçük fakat koordineli değişimleri de değerlendirebilir.

Bu nedenle çalışma, yalnız “anlamlı DEG” listesinden görünmeyebilecek daha geniş transkriptomik programları araştırmak için GSEA uygulamıştır.

Genler \(\log_2 FC\)'ye göre sıralanmış, MSigDB gen setleri msigdbr v25.1.1 ile alınmış ve gene-set büyüklüğü için:

\[ 10 \leq \text{gen setindeki gen sayısı} \leq 500 \]

aralığı kullanılmıştır.

GSEA-KEGG sonuçlarında JAK–STAT ve Toll-like receptor yolları, GSEA-GO sonuçlarında ise interferon yanıtları ve NF-κB sinyal programları belirginleşmiştir. Bu sonuçlar RA'daki doğuştan bağışıklık ve inflamatuvar transkripsiyon programlarının koordineli biçimde değiştiği yorumunu desteklemiştir.

xCell bağışıklık infiltrasyonu analizi neyi ölçüyor?

xCell, bulk gen ekspresyon profillerinden farklı bağışıklık ve stromal hücre tiplerine ait göreli enrichment skorlarını tahmin eden hesaplamalı bir yöntemdir. Buradaki “infiltrasyon”, doğrudan mikroskop altında hücre sayımı değildir; ekspresyon imzalarından çıkarılan göreli bir enrichment tahminidir.

Çalışmada xCell v1.1.0, R v4.3.2 içinde GSE55457 ve GSE77298 veri setlerine uygulanmıştır. Ekspresyon matrisleri normalize edilmiş ve log2 dönüştürülmüştür.

RA ile kontrol arasındaki xCell enrichment skorları Wilcoxon rank-sum testi ile karşılaştırılmıştır.

Her iki sinovyal veri setinde de bağışıklık hücrelerinin artmış enrichment örüntüsü görülmüş, özellikle M1 makrofajları en belirgin artışı gösteren hücre tiplerinden biri olarak ortaya çıkmıştır. GSE77298'de plasma cells ve CD8+ T cells de artış göstermiştir.

Bu sonuç “RA dokusunda mikroskopla kesin şu sayıda M1 makrofaj vardır” anlamına gelmez. xCell sonuçları transkriptom verisinden türetilen göreli hücresel enrichment göstergeleridir.

WGCNA PSMB9'un Seçilmesine Nasıl Katkı Sağladı?

Ağırlıklı gen eş-ekspresyon ağı analizi (Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA), tek tek genlerin yalnız diferansiyel ekspresyonuna bakmak yerine birlikte değişen gen kümelerini modüller halinde tanımlar ve bu modüllerin hastalık özelliğiyle ilişkisini araştırır. Bu çalışmada WGCNA, GSE55457 sinovyal transkriptomunda RA ile bağlantılı eş-ekspresyon modüllerini bulmak için kullanıldı.

WGCNA analizinde çok düşük ekspresyonlu genler dışında tam gen ekspresyon matrisi kullanılmış ve signed co-expression network kurulmuştur.

Kaynakta seçilen soft-thresholding power:

\[ \beta = 7 \]

olarak raporlanmıştır.

Soft-thresholding power, genler arasındaki korelasyonların ağ bağlantı ağırlıklarına nasıl dönüştürüleceğini belirleyen parametredir. Çalışmada scale-free topology kriterini karşılayan en düşük uygun güç seçilmiştir.

Daha sonra topological overlap matrix (TOM) hesaplanmış, TOM tabanlı uzaklık üzerinde hierarchical clustering yapılmış ve modül sınırları dynamicTreeCut algoritmasıyla düzeltilmiştir.

Modül–RA ilişkileri Pearson korelasyonu ile incelenmiş ve p < 0.05 anlamlılık ölçütü kullanılmıştır. Lightcyan, black ve lightgreen dahil yedi modül RA ile güçlü pozitif ilişki gösterirken dört modül negatif ilişki göstermiştir.

Bu modüllerdeki genlerin enrichment analizi immün yanıt, inflamasyon ve sitokin üretimiyle ilişkili yolakların RA bağlantılı ağ modülleri içinde yoğunlaştığını göstermiştir.

PSMB9 nasıl aday merkez gene dönüştü?

Dört bağımsız veri setindeki DEG sonuçları ile RA ilişkili WGCNA modülündeki genlerin kesişimi incelendiğinde PSMB9, TAP1 ve CFB ortak aday genler arasında bulunmuştur.

Ardından STRING üzerinde protein–protein etkileşim (Protein–Protein Interaction, PPI) ağı kurulmuştur. Kaynak minimum interaction confidence score değerini:

\[ 0.95 \]

olarak belirlemiştir. Bu, yalnız yüksek güven skorlu STRING bağlantılarının ağa dahil edilmesini amaçlamaktadır.

PSMB9 tek seed olarak kullanıldığında proteazom ve antijen işleme bileşenleri açısından yoğun bir etkileşim ağı ortaya çıkmıştır. PSMB9, TAP1 ve CFB birlikte seed olarak kullanıldığında daha geniş ve birbirine bağlı bağışıklık ilişkili ağ elde edilmiştir.

Single-cell RNA-seq analizi neden ayrıca yapıldı?

Bulk transkriptom bütün dokudan gelen ortalama ekspresyonu gösterir. Ancak sinovyum, fibroblastlar ve çeşitli bağışıklık hücreleri dahil birçok farklı hücre tipi içerir. Single-cell RNA-seq analizi, gen ekspresyonunun hangi hücresel alt gruplarda görüldüğünü daha ayrıntılı araştırmaya yardımcı olur.

Çalışmada GSE109449 kullanılmıştır. Kaynağa göre dört donörden:

• OA4,
• OA5,
• RA8,
• RA9

olmak üzere toplam 396 sinovyal fibroblast hücresi analiz edilmiştir.

OA, osteoartriti; RA ise romatoid artriti ifade etmektedir. Bu bölüm özellikle fibroblast-benzeri sinoviyositleri (Fibroblast-Like Synoviocytes, FLS) değerlendirmektedir.

CPM normalizasyonu nasıl hesaplandı?

Her hücre için kütüphane büyüklüğü hesaplanmış ve ifade değerleri counts-per-million (CPM) yöntemiyle normalize edilmiştir:

\[ CPM_{ij} = \frac{x_{ij}} {\sum_j x_{ij}} \times 10^6 \]

Burada:

• \(x_{ij}\), ilgili genin ilgili hücredeki ham sayımını,
• \(\sum_j x_{ij}\), normalizasyon için kullanılan hücre kütüphanesindeki toplam sayımı,
• \(10^6\), değeri milyon başına sayım ölçeğine dönüştüren katsayıyı

temsil eder.

Kaynak formülün indeks notasyonunu bu biçimde vermektedir; Verianla indisleri sessizce yeniden tanımlamamaktadır.

Log dönüşümü neden yapıldı?

Normalize CPM değerleri daha sonra:

\[ \log_2(CPM+1) \]

biçiminde dönüştürülmüştür.

Buradaki +1 terimi CPM değeri sıfır olduğunda logaritmanın tanımsız olmasını önler. Log dönüşümü yüksek sayım değerlerinin ölçek üzerindeki baskınlığını azaltarak ekspresyon dağılımını daha yönetilebilir hale getirir.

GSVA neyi ölçüyor?

Gene Set Variation Analysis (GSVA), tek tek genlerin ekspresyonu yerine önceden tanımlanmış gen setlerinin örnek veya hücresel profil içindeki göreli aktivitesini puanlayan bir yöntemdir.

Hallmark gen setleri msigdbr v25.1.1 ile alınmış, GSVA skorları GSVA v1.50.5 ile hesaplanmıştır.

RA FLS profilleri; interferon-α response, interferon-γ response, allograft rejection ve IL6/JAK–STAT3 signaling dahil çeşitli inflamatuvar/immün Hallmark yolaklarında OA profillerinden daha yüksek aktivite göstermiştir.

PSMB9 ekspresyonu ile bu yolakların GSVA skorları arasında Spearman korelasyonu hesaplanmıştır.

Kaynak korelasyon bölümünü dört donör üzerinden tanımlamakta ve çalışmanın tartışma kısmında bu single-cell analizinin sınırlı donör sayısı nedeniyle keşifsel olduğunu özellikle belirtmektedir. Bu nedenle bu korelasyonlar güçlü nüfus genellemesi olarak yorumlanmamalıdır.

Moleküler docking neyi test ediyor?

Moleküler docking, küçük bir molekülün hedef proteinin üç boyutlu yapısı içindeki olası bağlanma pozlarını ve hesaplamalı uyum skorlarını araştırır. Docking fiziksel bağlanmanın doğrudan laboratuvar ölçümü değildir.

PSMB9 kristal yapısı PDB veritabanından PDB ID: 6avo ile alınmış, sinomeninin üç boyutlu yapısı PubChem'den SDF biçiminde indirilmiş ve yapı tabanlı docking CB-DOCK2 platformuyla yapılmıştır.

Kaynak PSMB9 yapı dosyasının “PDF formatında” kaydedildiğini yazmaktadır. Bu alışılmadık ifade Verianla tarafından kaynak dışı varsayımla değiştirilmemiştir.

En düşük Vina skoruna sahip docking pozu optimal poz olarak seçilmiştir.

Kaynağın kullandığı docking yorum eşikleri:

PSMB9–SIN için hesaplanan:

\[ \text{Vina score}=-9.0\ \text{kcal/mol} \]

değeri kaynağın kendi sınıflandırmasına göre güçlü hesaplamalı bağlanma eğilimiyle uyumludur.

Ancak docking skoru tek başına sinomeninin hücre içinde PSMB9'a kesin fiziksel olarak bağlandığını kanıtlamaz. Bu nedenle çalışma docking sonucunu CETSA ile hücresel düzeyde takip etmiştir.

CETSA, Sinomeninin PSMB9'a Doğrudan Bağlandığını Kesin Olarak Kanıtlıyor mu?

Hayır. Bu çalışmada CETSA, sinomenin varlığında PSMB9'un termal stabilitesindeki zayıf değişim nedeniyle olası hedef etkileşimini desteklemektedir; ancak yazarların tartışma bölümündeki ihtiyatlı yorumuna göre SIN–PSMB9 ilişkisi kesin ve tek mekanizma olarak değil, potansiyel bir mekanizma olarak değerlendirilmelidir.

CETSA'nın temel mantığı

Cellular Thermal Shift Assay (CETSA), bir proteinin farklı sıcaklıklarda ne kadar çözünür/stabil kaldığını değerlendirir. Bir ligand proteine bağlandığında bazı durumlarda proteinin termal kararlılığı değişebilir.

Bu nedenle ligand uygulanmış ve kontrol hücreleri farklı sıcaklıklara maruz bırakılır; ardından çözünür kalan hedef protein Western blot gibi yöntemlerle ölçülür.

Bu çalışmada RAW264.7 hücreleri:

• DMSO araç kontrolü veya 600 µM sinomenin ile 19 saat işlenmiş,
• 53, 63, 73, 83, 90 ve 98 °C sıcaklıklara 3 dakika maruz bırakılmış,
• hemen −80 °C'de 10 dakika dondurulmuş,
• freeze–thaw işlemi üç kez tekrarlanmış,
• RIPA tamponunda 30 dakika buz üzerinde parçalanmış,
• 12.000 rpm'de, 4 °C'de 20 dakika santrifüj edilmiş,
• ardından PSMB9 Western blot ile analiz edilmiştir.

Kaynağın Figure 9B verisi, sıcaklık yükseldikçe PSMB9 bandının zayıfladığını ancak sinomenin grubunda zayıf bir stabilize edici etki bulunduğunu göstermektedir.

Bu yüzden Verianla, sonucu “CETSA kesin doğrudan bağlanmayı kanıtladı” biçiminde büyütmemektedir. Docking + CETSA birlikte olası target engagement için destek sağlar.

RAW264.7 hücre modeli nedir?

RAW264.7, fare kökenli makrofaj benzeri bir hücre hattıdır. Bu çalışma hücrelerin inflamatuvar yanıtını LPS ile uyararak sinomenin ve PSMB9 arasındaki ilişkiyi mekanistik düzeyde değerlendirmiştir.

Hücreler %10 fetal bovine serum içeren tam DMEM ortamında, 37 °C ve %5 CO₂ koşullarında kültüre edilmiştir.

Bu model insan RA sinovyumunun çok hücreli, kronik ve otoimmün mikroçevresinin tamamını temsil etmez.

CCK-8 hücre canlılığı testi

Hücre canlılığında sinomenin için:

150, 300, 600, 1200 ve 2400 µM

konsantrasyonları test edilmiştir.

96-well plaklarda hücre yoğunluğu 1,8 × 10⁵/mL, hacim 100 µL/well olarak ayarlanmış ve sinomenin uygulaması 18 saat sürmüştür.

Ardından her kuyucuğa 10 µL CCK-8 çözeltisi eklenmiş ve 37 °C'de 45 dakika–1 saat inkübe edilmiştir. Absorbans 450 nm'de ölçülmüştür.

Kaynak hücre canlılığını:

\[ \text{Göreli canlılık (\%)} = \frac{ OD_{treatment}-OD_{blank} }{ OD_{control}-OD_{blank} } \times100 \]

formülüyle hesaplamıştır.

Burada:

• \(OD_{treatment}\): sinomenin uygulanan kuyucuğun optik yoğunluğu,
• \(OD_{blank}\): hücresiz veya uygun blank kuyucuğunun arka plan değeri,
• \(OD_{control}\): kontrol grubunun optik yoğunluğudur.

Blank değerinin çıkarılması ölçüm sisteminin arka plan absorbansını azaltır. Kontrol grubuna bölme ise kontrolü yaklaşık %100 canlılık referansı haline getirir.

Kaynakta 600 µM'yi aşan sinomenin konsantrasyonlarında sitotoksik etkinin ortaya çıkabileceği belirtilmiş, bu nedenle sonraki fonksiyonel deneylerde 150–600 µM aralığı seçilmiştir.

LPS modeli ve ELISA deneyleri

IL-6 ve TNF-α ölçümü için RAW264.7 hücreleri 3 × 10⁵ hücre/mL yoğunlukta 6-well plaklara ekilmiş ve gece boyunca 37 °C'de tutulmuştur.

Hücreler önce 1 saat sinomenin veya dexamethasone (DEX) ile ön işleme tabi tutulmuş, ardından:

\[ LPS = 1\ \mu g/mL \]

konsantrasyonuyla 18 saat uyarılmıştır.

LPS, makrofajlarda güçlü inflamatuvar yanıt oluşturmak için kullanılan lipopolisakkarittir. Bu model RA'nın tamamını değil, makrofaj inflamasyonunun deneysel bir bölümünü taklit eder.

Hücre süpernatantı 1200 rpm'de 10 dakika santrifüj edilmiş; IL-6 ve TNF-α ELISA ile ölçülmüş, absorbans 450 nm'de okunmuş ve 570 nm arka plan düzeltmesi kullanılmıştır.

Sonuçlar, sinomeninin IL-6 ve TNF-α konsantrasyonlarını doza bağlı biçimde azalttığını göstermiştir. Dexamethasone grubunda da benzer anti-inflamatuvar yön gözlenmiştir.

Western blot deneyi

PSMB9 protein ekspresyonu Western blot ile incelenmiştir. Sinomenin için 150, 300 ve 600 µM düzeyleri kullanılmış, DEX grubu 1 µM olarak ayarlanmıştır.

Bir saatlik ön işlemden sonra LPS son konsantrasyonu 1 µg/mL olacak biçimde eklenmiş ve hücreler 18 saat daha kültüre edilmiştir.

Proteinler 10% SDS-PAGE üzerinde ayrılmış ve PVDF membrana aktarılmıştır.

Antikor dilüsyonları:

Primer antikor inkübasyonu 4 °C'de gece boyunca, sekonder antikor inkübasyonu oda sıcaklığında 1 saat gerçekleştirilmiştir.

Bantlar chemiluminescence görüntüleme sistemiyle görüntülenmiş ve gri-seviye kantifikasyonu ImageJ v1.53a ile yapılmıştır.

Kaynağın Figure 9F–G sonuçları sinomeninin PSMB9 protein ekspresyonunu doza bağlı biçimde düşürdüğünü göstermektedir.

Deneylerde kullanılan önemli cihaz ve materyaller

Hücresel deneylerin istatistiksel analizi

İstatistik ve veri görselleştirmesi GraphPad Prism 8.0.2 ile yapılmıştır.

Birden çok grup karşılaştırması için one-way ANOVA ve ardından Tukey post hoc testi uygulanmıştır.

Sonuçlar:

\[ \text{ortalama} \pm \text{standart sapma} \]

biçiminde sunulmuş ve:

\[ p<0.05 \]

istatistiksel anlamlılık eşiği olarak kabul edilmiştir.

Figure 9 açıklamasında normal gruba karşı ### p<0.001; model grubuna karşı ise *** p<0.001, ** p<0.01 ve * p<0.05 işaretleri kullanılmıştır.

Kaynak grafiklerin bütün sütun yüksekliklerini sayısal tablo halinde raporlamadığı için Verianla, görselden yaklaşık okunabilecek IL-6, TNF-α veya PSMB9 oranlarını kesin ham sayı olarak üretmemektedir.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Araştırma tasarımının kanıt katmanları

Birinci ana bulgu: bağışıklık ve inflamasyon yolakları RA ile güçlü biçimde ilişkiliydi

Dört veri setindeki DEG örüntüleri farklı olmasına rağmen enrichment analizleri immün ve inflamatuvar süreçlerde ortaklaşma göstermiştir. GSEA, DEG eşiğiyle görünmeyebilecek daha geniş yolak değişimlerini de ortaya koymuş ve JAK–STAT, Toll-like receptor, interferon yanıtları ve NF-κB programlarıyla ilişki göstermiştir.

İkinci ana bulgu: M1 makrofaj sinyali öne çıktı

GSE55457 ve GSE77298 xCell analizlerinde RA sinovyumunda birçok bağışıklık hücresi için artmış enrichment gözlenmiştir. M1 makrofajlar her iki analizde de en belirgin artış gösteren hücresel imzalardan biri olmuş ve sonraki mekanistik analizlerin ana bağlamlarından birini oluşturmuştur.

Üçüncü ana bulgu: PSMB9 çoklu seçim katmanlarından geçti

PSMB9 yalnız tek bir volcano plot'tan seçilmemiştir. DEG kesişimi, WGCNA modülü ve PPI analizi birlikte değerlendirilmiş; PSMB9, TAP1 ve CFB tekrar eden aday genler olarak belirlenmiştir.

PSMB9'un özellikle immünoproteazom ve antijen işleme bileşenleriyle yoğun bağlantısı, proteinin araştırmanın merkezi adaylarından biri olarak izlenmesine yol açmıştır.

Dördüncü ana bulgu: PSMB9 yalnız bağışıklık hücreleriyle sınırlı bir sinyal değildi

Single-cell yeniden analizinde RA kökenli fibroblast-benzeri sinoviyositlerde PSMB9 ekspresyonu OA kökenli FLS'lere göre daha yüksektir.

Aynı profillerde interferon-α, interferon-γ, allograft rejection ve IL6/JAK–STAT3 gibi immün/inflamatuvar Hallmark yolaklarının aktivitesi de RA grubunda yükselmiştir.

Bu bulgu, RA sinovyumundaki inflamatuvar ortamın yalnız infiltrasyon yapan bağışıklık hücrelerinden ibaret olmadığı; yerleşik stromal fibroblastların da inflamatuvar programlar gösterebildiği modelini desteklemektedir.

Ancak bu bölümün yalnız dört donöre dayanması nedeniyle büyük popülasyon çıkarımı yapılmamalıdır.

Beşinci ana bulgu: sinomenin–PSMB9 docking skoru −9,0 kcal/mol'dü

CB-DOCK2 analizi PSMB9 ile sinomenin arasında −9,0 kcal/mol Vina skoru veren bir docking pozu üretmiştir. Bu değer kaynağın kendi docking değerlendirme sınırlarına göre güçlü bağlanma eğilimiyle uyumludur.

Ancak docking bir simülasyon/tahmindir. Molekülün yaşayan hücrede gerçekten ilgili proteine bağlanıp bağlanmadığı için ek deneysel kanıt gerekir.

Altıncı ana bulgu: CETSA olası target engagement'ı destekledi

CETSA'da sinomenin PSMB9'un sıcaklıkla çözünürlüğünü tamamen değiştiren dramatik bir stabilizasyon göstermemiş; kaynak bunu zayıf/modest stabilize edici etki olarak yorumlamıştır.

Dolayısıyla CETSA bulgusu docking ile aynı yönde olası etkileşimi destekler, ancak SIN–PSMB9 bağlanmasının kesin biyofiziksel karakterizasyonunun yerine geçmez.

Yedinci ana bulgu: 150–600 µM sinomenin inflamatuvar yanıtı azalttı

CCK-8 testi 600 µM üzerindeki konsantrasyonlarda sitotoksisite olasılığının arttığını gösterdiği için fonksiyonel deneylerde 150–600 µM aralığı kullanılmıştır.

LPS ile uyarılmış RAW264.7 makrofajlarında sinomenin uygulaması IL-6 ve TNF-α düzeylerini doza bağlı olarak düşürmüştür.

Western blot sonuçları da PSMB9 protein ekspresyonunun sinomenin konsantrasyonu arttıkça azaldığını göstermiştir.

Dexamethasone kontrolü de PSMB9 ekspresyonu ve inflamatuvar sitokinlerde inhibisyon yönünde etki göstermiştir.

Sinomenin PSMB9'u bağlayıp sonra neden ekspresyonunu azaltabilir?

Bu çalışma bu sorunun bütün moleküler ara basamaklarını belirlememektedir. Docking ve CETSA olası fiziksel target engagement yönünde kanıt sağlarken Western blot PSMB9 protein düzeyinin tedavi sonrasında azaldığını göstermektedir. Fakat ligand bağlanmasının PSMB9 protein ekspresyonunu hangi transkripsiyonel, translasyonel veya protein yıkım mekanizmasıyla azalttığı kaynakta doğrudan çözülmemiştir.

Bu nedenle Verianla, “sinomenin PSMB9'a bağlandığı için protein otomatik olarak parçalanır” gibi kaynak dışı bir mekanizma eklememektedir.

Çalışmanın desteklediği sonuçlar

• PSMB9, bu çalışmada kullanılan çoklu transkriptom ve ağ analizlerinde RA ile ilişkili aday merkez genlerden biri olarak belirlenmiştir.
• RA sinovyal doku ekspresyon profillerinde bağışıklık ve inflamasyon yolakları güçlü biçimde öne çıkmıştır.
• xCell analizi özellikle M1 makrofaj imzasının RA örneklerinde zenginleştiğini göstermiştir.
• RA FLS'lerinde PSMB9 ekspresyonu OA FLS'lerine göre daha yüksek bulunmuştur.
• PSMB9 ekspresyonu interferon ve sitokin ilişkili yolak aktivitesiyle pozitif ilişki göstermiştir.
• PSMB9–sinomenin docking skoru −9,0 kcal/mol olarak hesaplanmıştır.
• CETSA, sinomeninin PSMB9 üzerinde zayıf bir termal stabilize edici etkisiyle uyumlu sonuç vermiştir.
• 150–600 µM sinomenin, LPS ile uyarılmış RAW264.7 hücrelerinde IL-6 ve TNF-α düzeylerinde doza bağlı azalmayla ilişkilidir.
• Sinomenin PSMB9 protein ekspresyonunu doza bağlı biçimde düşürmüştür.

Çalışmanın desteklemediği sonuçlar

PSMB9'un bugün klinikte doğrulanmış RA tanı biyobelirteci olduğu bu çalışmayla kanıtlanmamıştır. Çalışma PSMB9'u aday biyobelirteç olarak göstermektedir ve yazarlar daha büyük bağımsız kohortlarda doğrulamaya ihtiyaç olduğunu belirtmektedir.

Sinomeninin insan RA hastalarında PSMB9'u düşürerek klinik düzelme sağladığı bu araştırmada doğrudan test edilmemiştir.

Docking skoru sinomeninin PSMB9'a kesin bağlandığını tek başına kanıtlamaz.

CETSA bulgusu güçlü ve eksiksiz biyofiziksel bağlanma karakterizasyonu değildir; kaynak bunu zayıf stabilizasyon ve olası target engagement olarak tartışmaktadır.

PSMB9 sinomeninin tek anti-inflamatuvar hedefi olarak gösterilmemiştir. Yazarlar sinomeninin Nrf2 gibi başka yollar dahil birden çok mekanizmayla etkili olabileceğini özellikle belirtmektedir.

LPS ile uyarılmış RAW264.7 makrofaj modeli insan RA sinovyumunun kompleks kronik otoimmün mikroçevresinin tamamını temsil etmez.

Çalışmada in vivo hayvan doğrulaması yapılmamıştır.

Çalışmanın güçlü yönleri

Araştırmanın güçlü yönlerinden biri PSMB9'u yalnız tek bir veri seti veya tek bir algoritmayla seçmemesidir. Farklı gen ekspresyon veri setleri, WGCNA, PPI, bağışıklık infiltrasyonu ve single-cell analizleri birbirini tamamlayan katmanlar olarak kullanılmıştır.

İkinci güçlü yön, hesaplamalı docking sonucunun doğrudan nihai mekanizma kabul edilmemesi ve hücresel CETSA, Western blot ve sitokin ölçümleriyle takip edilmesidir.

Üçüncü güçlü yön, veri setlerinin farklı platformlardan gelmesi nedeniyle matrislerin doğrudan birleştirilmemesi ve platformlar arası batch etkisinin azaltılması için gen-düzeyi sonuçların konsensüs analizinde kullanılmasıdır.

Başlıca sınırlılıklar

• Fonksiyonel deneyler yalnız RAW264.7 fare makrofaj hücre hattında gerçekleştirilmiştir.
• Birden fazla hücre hattı veya primer insan RA hücresiyle fonksiyonel doğrulama yapılmamıştır.
• Hayvan modeli kullanılmamıştır.
• İnsanlarda sinomenin–PSMB9 mekanizmasını doğrudan test eden yeni klinik deney yoktur.
• Single-cell veri yalnız OA4, OA5, RA8 ve RA9 olmak üzere dört donörden oluşmaktadır.
• Single-cell sonuçları bu nedenle keşifsel kabul edilmelidir.
• PSMB9'un tanısal performansı büyük bağımsız kohortlarda prospektif olarak doğrulanmamıştır.
• Moleküler docking fiziksel bağlanmanın doğrudan ölçümü değildir.
• CETSA yalnız zayıf termal stabilizasyon göstermiştir.
• Sinomeninin PSMB9 ekspresyonunu düşürmesinin tüm moleküler ara basamakları çözülmemiştir.
• Sinomeninin birden fazla anti-inflamatuvar mekanizma üzerinden etkili olabileceği göz önüne alındığında PSMB9 tek açıklama değildir.

Sonuçların doğru biyolojik anlamı

Bu çalışmanın bütün analiz katmanları birlikte değerlendirildiğinde PSMB9, RA sinovyumundaki bağışıklık aktivasyonu ile stromal fibroblast inflamatuvar programları arasında bağlantı kurabilecek aday bir immünoproteazom düğümü olarak ortaya çıkmaktadır.

Sinomenin tarafında kanıt zinciri üç ayrı seviyededir: docking hesaplamalı olarak olası bağlanma pozu göstermiş, CETSA hücre içinde olası hedef etkileşimini desteklemiş, Western blot ve ELISA ise sinomenin uygulamasının PSMB9 protein düzeyi ile IL-6/TNF-α inflamatuvar çıktıları üzerindeki etkisini göstermiştir.

Bu katmanların birlikte bulunması mekanistik hipotezi güçlendirir; ancak hiçbiri tek başına sinomeninin insan romatoid artritinde PSMB9 üzerinden kesin tedavi mekanizmasını kanıtlamaz.

Bu nedenle en uygun sonuç cümlesi şudur: PSMB9 romatoid artritte daha ileri doğrulamayı hak eden bir immün ilişkili aday hedef/biyobelirteçtir ve sinomenin, PSMB9 düzenlenmesi üzerinden inflamasyonu kısmen azaltıyor olabilir.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün başlık: Sinomenine Regulates PSMB9 to Mediate Therapeutic Effects in Rheumatoid Arthritis

Yazarlar: Cui Zhang; Chonkit Lio; Nana Li; Yang Yu; Jinfang Luo.

Yazar sırası: Kaynaktaki sıra aynen korunmuştur.

Eş katkı: Cui Zhang ve Chonkit Lio eş katkılı yazarlardır.

Sorumlu yazarlar: Chonkit Lio ve Jinfang Luo.

Kurum 1: Department of Basic Medicine, Department of Pharmacy, Key Laboratory on the Property & Effect of Chinese Medicine (Ethnic Medicine), Guizhou Genuine Herbs Center of Consistency of Utility, Guizhou Key Laboratory of Miao Medicine, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China.

Kurum 2: Faculty of Chinese Medicine, Macau University of Science and Technology, Avenida Wailong, Taipa, Macao, China.

Kurum 3: State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine, Macau University of Science and Technology, Avenida Wailong, Taipa, Macao, China.

Chonkit Lio için kaynakta verilen güncel adres: Department of Medical Biochemistry, Tohoku University Graduate School of Medicine, Sendai, Japan.

Dergi: Cells.

Yayınevi: MDPI, Basel, Switzerland.

Cilt / sayı / makale numarası: 15 / 11 / 1005.

DOI: 10.3390/cells15111005.

Resmî DOI bağlantısı: https://doi.org/10.3390/cells15111005

Alınma tarihi: 1 Nisan 2026.

Revizyon tarihi: 4 Mayıs 2026.

Kabul tarihi: 26 Mayıs 2026.

Yayın tarihi: 29 Mayıs 2026.

Kaynak türü: Article — bütünleşik transkriptomik/biyoinformatik analiz, moleküler docking ve in vitro hücresel deneyleri birleştiren özgün araştırma makalesi.

Hakemlik durumu: Yayımlanmış, hakemli dergi makalesidir.

Lisans: Creative Commons Attribution — CC BY.

Ana veri kaynakları: GEO GSE276772, GSE285977, GSE55457 ve GSE77298; single-cell yeniden analizi için GSE109449.

Diferansiyel ekspresyon eşiği: p < 0.05 ve |log2FC| > 0.5.

Mikroarray işleme: affy v1.80.0 + RMA; limma v3.58.1.

RNA-seq analizi: DESeq2 v1.42.1.

Eksik değer işlemi: impute v1.76.0.

GO/KEGG: clusterProfiler v4.11.0; org.Hs.eg.db ve org.Mm.eg.db.

GSEA: clusterProfiler; MSigDB gen setleri msigdbr v25.1.1; minimum gen seti 10, maksimum 500.

Bağışıklık infiltrasyonu: xCell v1.1.0; Wilcoxon rank-sum testi.

WGCNA: WGCNA v1.73; signed network; soft-thresholding power β = 7; TOM ve dynamicTreeCut; modül–trait değerlendirmesi Pearson korelasyonu, p < 0.05.

PPI: STRING; minimum interaction confidence score = 0.95.

Single-cell veri: GSE109449; OA4, OA5, RA8 ve RA9 olmak üzere dört donörden 396 synovial fibroblast hücresi.

Single-cell normalizasyonu: CPM ve log2(CPM + 1).

Yolak aktivitesi: GSVA v1.50.5; Hallmark gen setleri.

Korelasyon: PSMB9 ekspresyonu ile immün yolak aktivitesi için Spearman korelasyonu.

Moleküler docking: CB-DOCK2; PSMB9 PDB ID 6avo; SIN yapısı PubChem; en düşük Vina skoruna sahip poz seçilmiştir.

Kaynak içi teknik not: PSMB9 kristal yapısının PDB'den alındığı belirtilmesine rağmen yöntem metninde yapının “PDF formatında” kaydedildiği yazılmıştır. Verianla bu ifadeyi kaynak dışı varsayımla düzeltmemiştir.

Docking sonucu: PSMB9–SIN Vina skoru −9,0 kcal/mol.

Hücre hattı: RAW264.7 fare makrofaj hücreleri.

Hücre kültürü: DMEM + %10 fetal bovine serum; 37 °C; %5 CO₂.

Sinomenin saflığı: >%99.

CCK-8 dozları: 150, 300, 600, 1200 ve 2400 µM SIN; 18 saat.

Fonksiyonel deney SIN dozları: 150–600 µM.

LPS: 1 µg/mL.

DEX: Western blot deneyinde 1 µM.

ELISA: IL-6 ve TNF-α; 450 nm ölçüm, 570 nm background correction.

Western blot: PSMB9 1:1000; β-actin 1:3000; HRP sekonder 1:3000; ImageJ v1.53a kantifikasyonu.

CETSA: SIN 600 µM / 19 saat; 53, 63, 73, 83, 90 ve 98 °C; sıcaklık başına 3 dakika; −80 °C'de 10 dakika; üç freeze–thaw çevrimi.

Hücresel istatistik: GraphPad Prism 8.0.2; one-way ANOVA + Tukey post hoc; mean ± SD; p < 0.05.

Finansman: National Science Foundation of China (82160779, 82505133); Research Project of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine No. GuiZhong, Yi Ke Yu (2025)54; Guizhou University of Traditional Chinese Medicine Talent Innovation Team [Gui Traditional Chinese Medicine TD He Zi [2023] 002]; Guizhou University of Traditional Chinese Medicine National and Provincial Science and Technology Innovation Talent Team Cultivation Project TD NO.[2022]004; Guizhou Provincial Basic Research Program No. ZK[2024]358.

Etik kurul: Uygulanabilir değil.

Bilgilendirilmiş onam: Uygulanabilir değil.

Veri erişilebilirliği: GSE276772, GSE285977, GSE55457 ve GSE77298 GEO'da açık olarak erişilebilir; ek deneysel verilerin kurumsal veri yönetimi ve depolama düzenlemeleri nedeniyle makul talep üzerine sorumlu yazardan alınabileceği belirtilmiştir.

Çıkar çatışması: Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmiştir.

Yazar katkıları: Cui Zhang, Chonkit Lio ve Jinfang Luo: yöntem, biçimsel analiz, doğrulama ve ilk taslak. Nana Li ve Yang Yu: veri düzenleme ve biçimsel analiz. Chonkit Lio ve Jinfang Luo: gözden geçirme, düzenleme ve kaynaklar. Bütün yazarlar yayımlanmış sürümü okuyup kabul etmiştir.

Temel yöntemsel sınır: Fonksiyonel SIN–PSMB9 doğrulaması yalnız LPS ile uyarılmış RAW264.7 fare makrofajlarında yapılmıştır. Çalışmada in vivo deney veya yeni insan klinik doğrulaması yoktur. Single-cell analiz dört donörle sınırlıdır ve keşifsel kabul edilmiştir. PSMB9'un tanısal ve terapötik değeri daha büyük bağımsız kohortlar, primer hasta hücreleri ve in vivo modellerle doğrulanmalıdır.