PSMB9 (proteasome subunit beta type-9; LMP2), ni kitengo kidogo cha kichocheo kilicho katika chembe ya msingi ya 20S ya immunoproteasome na hushiriki katika uvunjaji wa protini unaohusiana na uchakataji wa antijeni. Utafiti huu unachunguza uhusiano wa PSMB9 na ugonjwa katika rheumatoid arthritis (Rheumatoid Arthritis, RA) pamoja na mwingiliano unaowezekana wa sinomenine (SIN) na PSMB9 kwa kuunganisha seti nyingi za data za transcriptome, uchanganuzi wa uingiliaji wa seli za kinga, WGCNA, uchanganuzi wa pathways, single-cell RNA-seq, molecular docking na majaribio ya seli za macrophage RAW264.7.

Wakati jeni zilizoonyeshwa kwa tofauti kutoka seti nne za data za usemi wa jeni za GEO na mtandao wa weighted gene co-expression uliojengwa kwenye GSE55457 zilipotathminiwa pamoja, PSMB9, TAP1 na CFB zilitambuliwa miongoni mwa wagombea wa pamoja. Uchanganuzi wa uingiliaji wa kinga ulionyesha hasa kuongezeka kwa macrophage za M1 katika synovium ya RA. Baadaye PSMB9 ilichunguzwa kama sehemu kuu ya immunoproteasome/uchakataji wa antijeni katika mitandao ya mwingiliano wa protini–protini.

Uchanganuzi upya wa jumla ya seli 396 za synovial fibroblast kutoka kwa wafadhili wanne katika seti ya data ya GSE109449 single-cell RNA-seq ulionyesha kuwa usemi wa PSMB9 ulikuwa juu zaidi katika fibroblast-like synoviocytes zinazotokana na RA kuliko katika kundi la OA, na kwamba usemi wa PSMB9 ulihusishwa na pathways za uchochezi za Hallmark kama interferon-α, interferon-γ, IL6/JAK–STAT3 na allograft rejection. Hata hivyo, kwa kuwa sehemu hii ya single-cell inategemea wafadhili wanne pekee, inachukuliwa kuwa ya uchunguzi katika utafiti.

Katika uchanganuzi wa molecular docking kati ya sinomenine na PSMB9, alama ya Vina −9,0 kcal/mol ilipatikana. Cellular Thermal Shift Assay (CETSA) ilionyesha athari dhaifu ya kuimarisha tabia ya joto ya PSMB9 mbele ya sinomenine na kuunga mkono uwezekano wa mwingiliano na lengo. Katika macrophage RAW264.7 zilizochochewa kwa LPS, sinomenine ya 150–600 µM ilihusishwa na kupungua kwa viwango vya IL-6 na TNF-α kwa kutegemea dozi na kupungua kwa usemi wa protini ya PSMB9.

Matokeo haya yanaashiria kwamba angalau sehemu ya athari za sinomenine dhidi ya uchochezi inaweza kuhusishwa na udhibiti wa PSMB9. Hata hivyo, utafiti hauuthibitishi huu kuwa utaratibu wa uhakika na wa pekee. Majaribio ya utendaji yalifanywa tu katika mstari wa seli RAW264.7 wa asili ya panya, na hakuna jaribio la moja kwa moja la matibabu lililofanywa katika modeli ya mnyama au kwa wagonjwa wa RA. Kwa hiyo, katika utafiti huu PSMB9 ni biomarker mgombea na lengo la tiba mgombea ; si kipimo cha uchunguzi kilichothibitishwa kliniki wala lengo la matibabu lililothibitishwa.

Tatizo kuu linalochunguzwa katika rheumatoid arthritis ni lipi?

Rheumatoid arthritis ni ugonjwa wa kimfumo unaohusiana na kinga unaojulikana kwa uchochezi sugu wa synovium na uharibifu unaoendelea wa viungo. Katika patholojia ya ugonjwa, si seli za kinga zinazozunguka pekee, bali pia seli za stromal zinazokaa katika tishu ya synovium zinaweza kuchangia kudumisha mazingira ya uchochezi.

Swali la utafiti limegawanywa katika sehemu mbili zinazohusiana. Kwanza, iwapo jeni kuu la kinga linaloonekana kuhusishwa mara kwa mara na RA katika seti tofauti za data za transcriptome za binadamu linaweza kutambuliwa. Pili, iwapo athari za sinomenine dhidi ya uchochezi zinaweza kuelezwa kwa sehemu kupitia jeni hilo na bidhaa yake ya protini.

Sinomenine ni nini?

Sinomenine, Sinomenium acutum ni alkaloid ya monomeric inayopatikana kutoka kwenye mmea huo. Katika utangulizi wa chanzo, kwa kutegemea tafiti za awali na utafiti wa kliniki, sinomenine imehusishwa na athari za kupunguza uchochezi, immunomodulatory, analgesic na kulinda mifupa.

Hata hivyo, majaribio ya makala hii yenyewe hayapimi upya ufanisi wa kliniki wa sinomenine katika RA. Utafiti huu unalenga swali finyu zaidi, yaani iwapo kuna uhusiano wa molekuli na wa seli unaowezekana kati ya sinomenine na PSMB9.

Kwa Nini PSMB9 Ni Muhimu Katika Rheumatoid Arthritis?

PSMB9 au LMP2 ni mojawapo ya catalytic beta subunits za immunoproteasome; huchangia kuvunjwa kwa protini za ndani ya seli kuwa peptidi na kusafirishwa kwa peptidi hizo kupitia TAP1 hadi endoplasmic reticulum ili ziandaliwe kwa uwasilishaji wa antijeni wa MHC class I. Uwezo wa interferon-γ kuongeza usemi wa PSMB9 unaimarisha muktadha wa kibiolojia wa uhusiano wa moja kwa moja wa protini hii na uanzishaji wa kinga.

Proteasome ni mkusanyiko mkubwa wa protini unaowezesha uvunjaji unaodhibitiwa wa protini zisizohitajika au zilizoharibika ndani ya seli. Immunoproteasome, ni aina maalumu ya proteasome ambapo, hasa katika hali za uchochezi na zilizoamshwa na interferon, baadhi ya catalytic subunits hubadilisha subunits za kawaida za proteasome. PSMB9 ni mojawapo ya catalytic subunits hizo maalumu.

Kwa hiyo, PSMB9 si “jina la jeni” tu. Mabadiliko katika usemi wa jeni ni sehemu ya mfumo mpana wa kinga unaohusishwa na uchakataji wa antijeni na mazingira ya ishara za uchochezi. Hata hivyo, kuonekana kuwa ya kati katika uchanganuzi wa mtandao pekee hakumaanishi kuwa inaendesha ugonjwa au kwamba kuizuia kutatoa tiba; kwa hiyo utafiti uliendelea kufuatilia PSMB9 kupitia tabaka tofauti za uchanganuzi na majaribio ya seli.

Kwa nini seti nne za data za GEO hazikuunganishwa moja kwa moja?

Utafiti ulitumia seti nne za data za usemi wa jeni za GEO: GSE276772, GSE285977, GSE55457 na GSE77298. GSE55457 na GSE77298 zilijumuisha sampuli za tishu ya synovium kutoka kwa wagonjwa wa RA na vidhibiti vyenye afya, ilhali GSE276772 na GSE285977 zilitumiwa kama seti za data za gene perturbation au cytokine stimulation.

Kwa sababu majukwaa ya seti za data hayakuwa sawa, watafiti hawakuunganisha matrices za usemi kuwa matrix moja kubwa. Badala yake, kila seti ya data ilichakatwa kwa kujitegemea na matokeo ya differential expression yakalinganishwa katika kiwango cha jeni. Kwa njia hii, walijaribu kuzuia batch effect kati ya majukwaa tofauti ya microarray na RNA-seq kuhamishwa moja kwa moja kwenye matrix ya pamoja.

Data za microarray zilichakatwaje?

Faili za microarray CEL ziliingizwa katika mazingira ya R kwa kutumia affy v1.80.0 na zikachakatwa kwa Robust Multi-Array Average (RMA) . Mchakato wa RMA una hatua kuu tatu:

• marekebisho ya background,
• quantile normalization,
• probe-set summarization.

Hatimaye, thamani za usemi wa jeni katika skeli ya log2 zilipatikana, na probe sets zilioanishwa na alama za jeni na Entrez IDs kwa kutumia annotation packages mahsusi za jukwaa. Thamani zilizokosekana zilishughulikiwa kwa impute v1.76.0 .

Data za RNA-seq zilichakatwaje?

Data za RNA-seq zilichanganuliwa kwa DESeq2 v1.42.1 kwa kutumia mtiririko wa kawaida wa kazi. Kwa differential expression katika seti za data za microarray ilitumika limma v3.58.1, na katika seti ya data ya RNA-seq ilitumika DESeq2.

Ufafanuzi wa jeni lililoonyeshwa kwa tofauti (Differentially Expressed Gene, DEG) katika chanzo:

\[ p < 0.05 \quad \text{ve} \quad |\log_2 FC| > 0.5 \]

unategemea masharti hayo.

\(\log_2 FC\), ni fold change ya usemi kati ya makundi mawili katika msingi wa log2. Thamani chanya inaonyesha mwelekeo wa usemi wa juu, na thamani hasi usemi wa chini. Thamani kamili kuwa kubwa kuliko 0,5 inahitaji mabadiliko yavuke ukubwa fulani, ilhali \(p<0.05\) ni kizingiti cha uteuzi wa takwimu kilichotumiwa katika chanzo.

Kuna jambo muhimu hapa: chanzo kinaandika moja kwa moja \(p<0.05\) katika uteuzi wa DEG. Verianla haibadilishi hili kana kwamba ni adjusted p-value au kizingiti cha FDR.

Ni DEG ngapi zilipatikana katika seti nne za data?

Tofauti kubwa kati ya nambari hizi pekee haimaanishi kwamba athari ya kibiolojia ni “kubwa zaidi” katika seti moja ya data. Aina za seti za data, majukwaa, hali za majaribio na miundo ya sampuli ni tofauti. Mkakati wa utafiti ni kutambua ishara za kibiolojia zinazojirudia katika uchanganuzi tofauti, si kulinganisha tu idadi kamili ya DEG.

Uchanganuzi wa GO na KEGG unachunguza nini?

Orodha ya DEG inaweza kuwa na mamia au maelfu ya jeni. Uchanganuzi wa enrichment wa Gene Ontology (GO) na Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) unachunguza iwapo kazi au pathways fulani za kibiolojia zimewakilishwa mara nyingi kuliko ilivyotarajiwa katika orodha hiyo ya jeni.

Katika utafiti clusterProfiler v4.11.0 ilitumika. Kwa jeni za binadamu org.Hs.eg.db, na kwa jeni za panya org.Mm.eg.db zilitumiwa kama annotation resources, na jeni zikabadilishwa kuwa Entrez IDs.

Katika uchanganuzi wa GO madaraja matatu yalitathminiwa:

• BP — Biological Process: michakato ya kibiolojia ambayo jeni hushiriki,
• CC — Cellular Component: miundo ya seli ambamo bidhaa zinapatikana,
• MF — Molecular Function: kazi katika kiwango cha molekuli.

Kwa GO chanzo kinatoa adjusted p-value < 0.05, na kwa KEGG p < 0.05 kama kizingiti.

Katika matokeo ya enrichment yanayotegemea DEG, michakato inayohusiana na kinga na uchochezi ilionekana wazi; udhibiti wa uanzishaji wa macrophage, mwitikio wa uchochezi, bone resorption na IL-15-mediated signaling vilijitokeza.

Kwa nini GSEA ilitumika pamoja na uchanganuzi wa DEG?

Mbinu ya DEG hutumia tu jeni zinazopita vizingiti vya takwimu vilivyowekwa mapema. Kinyume chake, Gene Set Enrichment Analysis (GSEA), inaweza kutathmini pia mabadiliko madogo lakini yaliyoratibiwa katika orodha nzima ya jeni iliyopangwa.

Kwa hiyo utafiti ulitumia GSEA kuchunguza programu pana zaidi za transcriptome ambazo huenda zisionekane katika orodha ya “DEG zenye umuhimu” pekee.

Jeni zilipangwa kulingana na \(\log_2 FC\), na seti za jeni za MSigDB zilipatikana kwa msigdbr v25.1.1 ; kwa ukubwa wa gene-set ilitumika:

\[ 10 \leq \text{gen setindeki gen sayısı} \leq 500 \]

.

Katika matokeo ya GSEA-KEGG, pathways za JAK–STAT na Toll-like receptor zilijitokeza, na katika GSEA-GO majibu ya interferon na programu za ishara za NF-κB zilionekana wazi. Matokeo haya yaliunga mkono tafsiri kwamba programu za transcription za kinga ya kuzaliwa na uchochezi katika RA hubadilika kwa uratibu.

Uchanganuzi wa xCell wa uingiliaji wa kinga unapima nini?

xCell, ni mbinu ya kukokotoa inayokadiria relative enrichment scores za aina tofauti za seli za kinga na stromal kutoka kwenye profaili za bulk gene expression. “Infiltration” hapa si kuhesabu seli moja kwa moja chini ya darubini; ni makadirio ya relative enrichment yanayotokana na alama za usemi.

Katika utafiti xCell v1.1.0 ilitumika ndani ya R v4.3.2 kwa seti za data GSE55457 na GSE77298. Matrices za usemi zilinormalishwa na kubadilishwa kwa log2.

Alama za xCell enrichment kati ya RA na control zililinganishwa kwa Wilcoxon rank-sum test .

Katika seti zote mbili za data za synovium, muundo wa enrichment uliopanda wa seli za kinga ulionekana, hasa macrophage za M1 zikiwa miongoni mwa aina za seli zilizoonyesha ongezeko lililo wazi zaidi. Katika GSE77298, plasma cells na CD8+ T cells pia ziliongezeka.

Hili halimaanishi kwamba “kuna idadi fulani kamili ya macrophage za M1 katika tishu ya RA chini ya darubini”. Matokeo ya xCell ni viashiria vya relative cellular enrichment vinavyotokana na data za transcriptome.

WGCNA Ilichangiaje Katika Uteuzi wa PSMB9?

Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA), badala ya kuangalia tu differential expression ya jeni moja moja, hutambua vikundi vya jeni vinavyobadilika pamoja kama modules na kuchunguza uhusiano wa modules hizo na sifa ya ugonjwa. Katika utafiti huu, WGCNA ilitumika kutafuta co-expression modules zinazohusiana na RA katika synovial transcriptome ya GSE55457.

Katika uchanganuzi wa WGCNA, matrix kamili ya gene expression ilitumika isipokuwa jeni zenye usemi wa chini sana, na signed co-expression network ikajengwa.

Soft-thresholding power iliyochaguliwa katika chanzo:

\[ \beta = 7 \]

iliripotiwa.

Soft-thresholding power ni kigezo kinachoamua jinsi correlations kati ya jeni zinavyobadilishwa kuwa uzito wa miunganisho ya mtandao. Utafiti ulichagua nguvu ya chini kabisa inayofaa na kutimiza kigezo cha scale-free topology.

Baadaye topological overlap matrix (TOM) ilikokotolewa, hierarchical clustering ikafanywa juu ya distance inayotegemea TOM, na mipaka ya module ikarekebishwa kwa dynamicTreeCut .

Uhusiano wa module–RA ulichunguzwa kwa Pearson correlation na p < 0.05 ilitumika kama kigezo cha umuhimu. Modules saba, zikiwemo Lightcyan, black na lightgreen, zilionyesha uhusiano chanya wenye nguvu na RA, huku modules nne zikionyesha uhusiano hasi.

Uchanganuzi wa enrichment wa jeni katika modules hizi ulionyesha kwamba pathways zinazohusiana na mwitikio wa kinga, uchochezi na uzalishaji wa cytokine zilijikusanya katika modules za mtandao zinazohusiana na RA.

PSMB9 ilikuwaje jeni kuu mgombea?

Wakati makutano ya matokeo ya DEG katika seti nne huru za data na jeni katika module ya WGCNA inayohusiana na RA yalipochunguzwa, PSMB9, TAP1 na CFB zilipatikana miongoni mwa jeni wagombea wa pamoja.

Kisha mtandao wa protein–protein interaction (Protein–Protein Interaction, PPI) ukajengwa kwenye STRING. Chanzo kiliweka minimum interaction confidence score kuwa:

\[ 0.95 \]

. Hii inalenga kujumuisha kwenye mtandao tu miunganisho ya STRING yenye alama ya juu ya kuaminika.

PSMB9 ilipotumiwa kama seed pekee, mtandao mnene wa mwingiliano ulionekana katika vipengele vya proteasome na uchakataji wa antijeni. PSMB9, TAP1 na CFB zilipotumiwa pamoja kama seed, mtandao mpana zaidi na uliounganishwa wa kinga ulipatikana.

Kwa nini uchanganuzi wa single-cell RNA-seq ulifanywa kando?

Bulk transcriptome huonyesha wastani wa usemi unaotoka katika tishu nzima. Hata hivyo, synovium ina aina nyingi tofauti za seli, zikiwemo fibroblast na seli mbalimbali za kinga. Uchanganuzi wa single-cell RNA-seq husaidia kuchunguza kwa undani zaidi ni katika makundi gani madogo ya seli usemi wa jeni unaonekana.

GSE109449 ilitumika katika utafiti. Kulingana na chanzo, kutoka kwa wafadhili wanne:

• OA4,
• OA5,
• RA8,
• RA9

, jumla ya seli 396 za synovial fibroblast zilichanganuliwa.

OA inamaanisha osteoarthritis, na RA inamaanisha rheumatoid arthritis. Sehemu hii hasa inatathmini fibroblast-like synoviocytes (Fibroblast-Like Synoviocytes, FLS).

CPM normalization ilikokotolewaje?

Kwa kila seli, ukubwa wa library ulikokotolewa na thamani za usemi zikanormalishwa kwa njia ya counts-per-million (CPM) :

\[ CPM_{ij} = \frac{x_{ij}} {\sum_j x_{ij}} \times 10^6 \]

Hapa:

• \(x_{ij}\), inaonyesha raw count ya jeni husika katika seli husika,
• \(\sum_j x_{ij}\), jumla ya counts katika library ya seli iliyotumika kwa normalization,
• \(10^6\), ni mgawo unaobadilisha thamani kuwa skeli ya counts per million,

mtawalia.

Chanzo kinatoa index notation ya fomula kwa namna hii; Verianla haifafanui upya indices kimya kimya.

Kwa nini log transformation ilifanywa?

Thamani za CPM zilizonormalishwa baadaye:

\[ \log_2(CPM+1) \]

zilibadilishwa kwa namna hiyo.

Neno +1 hapa huzuia logarithm kuwa isiyofafanuliwa wakati thamani ya CPM ni sifuri. Log transformation hupunguza utawala wa counts za juu kwenye skeli na kufanya usambazaji wa usemi uwe rahisi zaidi kusimamia.

GSVA inapima nini?

Gene Set Variation Analysis (GSVA), ni mbinu inayopima shughuli ya jamaa ya seti za jeni zilizofafanuliwa mapema ndani ya sampuli au profaili ya seli, badala ya kuangalia usemi wa jeni moja moja.

Seti za jeni za Hallmark zilipatikana kwa msigdbr v25.1.1 , na alama za GSVA zikakokotolewa kwa GSVA v1.50.5 .

Profaili za RA FLS zilionyesha shughuli ya juu kuliko profaili za OA katika pathways mbalimbali za Hallmark za uchochezi/kinga, zikiwemo interferon-α response, interferon-γ response, allograft rejection na IL6/JAK–STAT3 signaling.

Spearman correlation ilikokotolewa kati ya usemi wa PSMB9 na alama za GSVA za pathways hizi.

Chanzo kinafafanua sehemu ya correlation kwa kutumia wafadhili wanne na katika majadiliano kinasisitiza kwamba uchanganuzi huu wa single-cell ni wa uchunguzi kwa sababu ya idadi ndogo ya wafadhili. Kwa hiyo correlations hizi hazipaswi kufasiriwa kama msingi wa kufanya generalization thabiti kwa idadi kubwa ya watu.

Molecular docking inapima nini?

Molecular docking huchunguza nafasi zinazowezekana za molekuli ndogo kujifunga ndani ya muundo wa pande tatu wa protini lengwa na alama za computational fit. Docking si kipimo cha moja kwa moja cha maabara cha physical binding.

Muundo wa kioo wa PSMB9 ulipatikana kutoka hifadhidata ya PDB kwa PDB ID: 6avo , muundo wa pande tatu wa sinomenine ukapakuliwa kutoka PubChem katika muundo wa SDF, na structure-based docking ikafanywa kwa CB-DOCK2 .

Chanzo kinaandika kwamba faili ya muundo wa PSMB9 ilihifadhiwa katika “PDF format”. Kauli hii isiyo ya kawaida haikubadilishwa na Verianla kwa dhana ya nje ya chanzo.

Docking pose yenye alama ya chini zaidi ya Vina ilichaguliwa kuwa pose bora.

Vizingiti vya tafsiri ya docking vilivyotumiwa na chanzo:

Kwa PSMB9–SIN, thamani iliyokokotolewa:

\[ \text{Vina score}=-9.0\ \text{kcal/mol} \]

inaendana na mwelekeo wenye nguvu wa computational binding kulingana na uainishaji wa chanzo yenyewe.

Hata hivyo, alama ya docking pekee haithibitishi kwamba sinomenine inajifunga moja kwa moja kimwili kwa PSMB9 ndani ya seli. Kwa hiyo utafiti uliifuatilia matokeo ya docking kwa CETSA katika kiwango cha seli.

Je, CETSA Inathibitisha Kwa Uhakika Kwamba Sinomenine Inajifunga Moja kwa Moja kwa PSMB9?

Hapana. Katika utafiti huu, CETSA inaunga mkono uwezekano wa target interaction kutokana na mabadiliko madogo ya thermal stability ya PSMB9 mbele ya sinomenine; hata hivyo, kulingana na tafsiri ya tahadhari ya waandishi katika sehemu ya majadiliano, uhusiano wa SIN–PSMB9 unapaswa kutathminiwa kama utaratibu unaowezekana, si kama utaratibu wa uhakika na wa pekee.

Mantiki ya msingi ya CETSA

Cellular Thermal Shift Assay (CETSA) hutathmini kiwango ambacho protini hubaki mumunyifu/imara katika halijoto tofauti. Ligand inapojifunga kwa protini, katika baadhi ya hali thermal stability ya protini inaweza kubadilika.

Kwa hiyo seli zilizotibiwa kwa ligand na seli za control huwekwa katika halijoto tofauti; kisha protini lengwa inayobaki mumunyifu hupimwa kwa mbinu kama Western blot.

Katika utafiti huu seli za RAW264.7:

• zilitibiwa kwa DMSO vehicle control au 600 µM sinomenine kwa saa 19,
• ziliwekwa katika 53, 63, 73, 83, 90 na 98 °C kwa dakika 3,
• zikagandishwa mara moja katika −80 °C kwa dakika 10,
• mchakato wa freeze–thaw ukarudiwa mara tatu,
• zikalysishwa katika RIPA buffer juu ya barafu kwa dakika 30,
• zikasentrifugwa kwa 12.000 rpm, 4 °C kwa dakika 20,
• na kisha PSMB9 ikachanganuliwa kwa Western blot.

Data ya Figure 9B ya chanzo inaonyesha kwamba band ya PSMB9 hudhoofika kadiri halijoto inavyoongezeka, lakini kulikuwa na athari dhaifu ya stabilization katika kundi la sinomenine.

Kwa hiyo Verianla haipanui matokeo kuwa “CETSA imethibitisha direct binding kwa uhakika”. Docking + CETSA kwa pamoja hutoa msaada kwa uwezekano wa target engagement .

Modeli ya seli RAW264.7 ni nini?

RAW264.7 ni mstari wa seli unaofanana na macrophage wenye asili ya panya. Utafiti huu ulitathmini uhusiano kati ya sinomenine na PSMB9 katika kiwango cha mechanistic kwa kuamsha mwitikio wa uchochezi wa seli kwa LPS.

Seli zilifugwa katika complete DMEM yenye %10 fetal bovine serum, katika 37 °C na %5 CO₂ .

Modeli hii haiwakilishi kikamilifu mazingira changamano ya seli nyingi, sugu na autoimmune ya synovium ya RA ya binadamu.

Jaribio la CCK-8 la uhai wa seli

Kwa uhai wa seli, viwango vya sinomenine vilivyojaribiwa vilikuwa:

150, 300, 600, 1200 na 2400 µM

.

Katika sahani za 96-well, msongamano wa seli uliwekwa kuwa 1,8 × 10⁵/mL, ujazo 100 µL/well, na matumizi ya sinomenine yakaendelea kwa saa 18.

Kisha 10 µL ya suluhisho la CCK-8 iliongezwa katika kila well na ku-incubate katika 37 °C kwa dakika 45–saa 1. Absorbance ilipimwa katika 450 nm.

Chanzo kilikokotoa uhai wa seli kwa:

\[ \text{Göreli canlılık (\%)} = \frac{ OD_{treatment}-OD_{blank} }{ OD_{control}-OD_{blank} } \times100 \]

formula hii.

Hapa:

• \(OD_{treatment}\): optical density ya well iliyotibiwa kwa sinomenine,
• \(OD_{blank}\): thamani ya background ya well isiyo na seli au blank inayofaa,
• \(OD_{control}\): optical density ya kundi la control.

Kuondoa thamani ya blank hupunguza background absorbance ya mfumo wa kipimo. Kugawanya kwa kundi la control hufanya control kuwa rejea ya takriban %100 ya uhai.

Chanzo kinaeleza kwamba athari ya cytotoxic inaweza kuonekana katika viwango vya sinomenine vilivyo juu ya 600 µM, kwa hiyo katika majaribio ya utendaji yaliyofuata ilichaguliwa 150–600 µM .

Modeli ya LPS na majaribio ya ELISA

Kwa vipimo vya IL-6 na TNF-α, seli RAW264.7 ziliwekwa katika sahani za 6-well kwa msongamano wa 3 × 10⁵ seli/mL na kuachwa usiku kucha katika 37 °C.

Seli zilitibiwa kwanza kwa saa 1 na sinomenine au dexamethasone (DEX), kisha:

\[ LPS = 1\ \mu g/mL \]

zikaamshwa kwa saa 18 katika mkusanyiko huo.

LPS ni lipopolysaccharide inayotumiwa kuunda mwitikio mkubwa wa uchochezi katika macrophage. Modeli hii haiigi RA yote, bali sehemu ya majaribio ya uchochezi wa macrophage.

Supernatant ya seli ilisentrifugwa kwa 1200 rpm kwa dakika 10; IL-6 na TNF-α zilipimwa kwa ELISA, absorbance ikasomwa katika 450 nm na background correction ya 570 nm ikatumika.

Matokeo yalionyesha kwamba sinomenine ilipunguza viwango vya IL-6 na TNF-α kwa kutegemea dozi. Mwelekeo sawa wa kupunguza uchochezi ulionekana pia katika kundi la Dexamethasone.

Jaribio la Western blot

Usemi wa protini ya PSMB9 ulichunguzwa kwa Western blot. Viwango vya 150, 300 na 600 µM vilitumika kwa sinomenine, na kundi la DEX likawekwa kuwa 1 µM .

Baada ya pretreatment ya saa moja, LPS iliongezwa ili kufikia final concentration ya 1 µg/mL na seli zikafugwa kwa saa 18 zaidi.

Protini zilitenganishwa kwenye 10% SDS-PAGE na kuhamishwa kwenda kwenye membrane ya PVDF.

Dilutions za antibody:

Primary antibody incubation ilifanywa katika 4 °C usiku kucha, na secondary antibody incubation katika joto la chumba kwa saa 1.

Bands zilionyeshwa kwa chemiluminescence imaging system na gray-level quantification ikafanywa kwa ImageJ v1.53a .

Matokeo ya Figure 9F–G ya chanzo yanaonyesha kwamba sinomenine ilipunguza usemi wa protini ya PSMB9 kwa kutegemea dozi.

Vifaa na nyenzo muhimu zilizotumika katika majaribio

Uchanganuzi wa takwimu wa majaribio ya seli

Takwimu na data visualization zilifanywa kwa GraphPad Prism 8.0.2 .

Kwa kulinganisha makundi mengi ilitumika one-way ANOVA na kisha Tukey post hoc test .

Matokeo:

\[ \text{ortalama} \pm \text{standart sapma} \]

yaliwasilishwa kwa namna hiyo na:

\[ p<0.05 \]

ikakubaliwa kuwa kizingiti cha statistical significance.

Katika maelezo ya Figure 9, dhidi ya kundi la normal ilitumika ### p<0.001; na dhidi ya kundi la model *** p<0.001, ** p<0.01 na * p<0.05 .

Kwa kuwa chanzo hakiripoti urefu wa nguzo zote za grafu kama jedwali la namba, Verianla haitengenezi uwiano wa IL-6, TNF-α au PSMB9 unaoweza kukadiriwa kutoka kwenye picha kuwa namba kamili za raw data.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Tabaka za ushahidi katika muundo wa utafiti

Ugunduzi mkuu wa kwanza: pathways za kinga na uchochezi zilihusishwa sana na RA

Ingawa mifumo ya DEG katika seti nne za data ilikuwa tofauti, uchanganuzi wa enrichment ulionyesha mwelekeo wa pamoja katika michakato ya kinga na uchochezi. GSEA pia ilifunua mabadiliko mapana ya pathways ambayo yanaweza kutoonekana kwa kizingiti cha DEG na ilionyesha uhusiano na JAK–STAT, Toll-like receptor, majibu ya interferon na programu za NF-κB.

Ugunduzi mkuu wa pili: ishara ya macrophage M1 ilijitokeza

Katika uchanganuzi wa xCell wa GSE55457 na GSE77298, enrichment iliyoongezeka ilionekana kwa seli nyingi za kinga katika synovium ya RA. Macrophage M1 zilikuwa miongoni mwa alama za seli zilizoonyesha ongezeko lililo wazi zaidi katika uchanganuzi wote na zikawa mojawapo ya miktadha kuu ya uchanganuzi wa mechanistic uliofuata.

Ugunduzi mkuu wa tatu: PSMB9 ilipita katika tabaka nyingi za uteuzi

PSMB9 haikuchaguliwa kutoka kwenye volcano plot moja tu. Makutano ya DEG, module ya WGCNA na uchanganuzi wa PPI vilitathminiwa pamoja; PSMB9, TAP1 na CFB zikatambuliwa kama jeni wagombea zinazojirudia.

Uhusiano mnene wa PSMB9 hasa na immunoproteasome na vipengele vya uchakataji wa antijeni ulisababisha protini hii kufuatiliwa kama mmoja wa wagombea wakuu wa utafiti.

Ugunduzi mkuu wa nne: PSMB9 haikuwa ishara iliyozuiliwa kwa seli za kinga pekee

Katika reanalysis ya single-cell, usemi wa PSMB9 katika fibroblast-like synoviocytes zinazotokana na RA ulikuwa juu kuliko katika FLS zinazotokana na OA.

Katika profaili hizo hizo, shughuli za pathways za Hallmark za kinga/uchochezi kama interferon-α, interferon-γ, allograft rejection na IL6/JAK–STAT3 pia zilikuwa juu katika kundi la RA.

Ugunduzi huu unaunga mkono modeli kwamba mazingira ya uchochezi katika synovium ya RA hayajumuishi tu seli za kinga zinazoingia; resident stromal fibroblasts pia zinaweza kuonyesha programu za uchochezi.

Hata hivyo, kwa kuwa sehemu hii inategemea wafadhili wanne pekee, haipaswi kutumiwa kufanya hitimisho pana kwa idadi kubwa ya watu.

Ugunduzi mkuu wa tano: alama ya docking ya sinomenine–PSMB9 ilikuwa −9,0 kcal/mol

Uchanganuzi wa CB-DOCK2 ulitoa docking pose kati ya PSMB9 na sinomenine yenye alama ya Vina ya −9,0 kcal/mol. Thamani hii inaendana na mwelekeo wenye nguvu wa binding kulingana na vizingiti vya tathmini ya docking vya chanzo yenyewe.

Hata hivyo, docking ni simulation/utabiri. Ushahidi wa ziada wa majaribio unahitajika ili kujua iwapo molekuli hiyo kweli inajifunga kwa protini husika ndani ya seli hai.

Ugunduzi mkuu wa sita: CETSA iliunga mkono uwezekano wa target engagement

Katika CETSA, sinomenine haikuonyesha stabilization kubwa inayobadilisha kabisa solubility ya PSMB9 kwa joto; chanzo kilitafsiri hili kama athari dhaifu/modest ya stabilization .

Kwa hiyo, ugunduzi wa CETSA unaunga mkono mwingiliano unaowezekana katika mwelekeo sawa na docking, lakini hauchukui nafasi ya characterization ya uhakika ya biophysical binding ya SIN–PSMB9.

Ugunduzi mkuu wa saba: 150–600 µM sinomenine ilipunguza mwitikio wa uchochezi

Kwa kuwa jaribio la CCK-8 lilionyesha kwamba uwezekano wa cytotoxicity huongezeka katika viwango vilivyo juu ya 600 µM, majaribio ya utendaji yalitumia kiwango cha 150–600 µM.

Katika macrophage RAW264.7 zilizochochewa kwa LPS, matumizi ya sinomenine yalipunguza viwango vya IL-6 na TNF-α kwa kutegemea dozi.

Matokeo ya Western blot pia yalionyesha kwamba usemi wa protini ya PSMB9 ulipungua kadiri mkusanyiko wa sinomenine ulivyoongezeka.

Dexamethasone control pia ilionyesha athari katika mwelekeo wa inhibition ya usemi wa PSMB9 na cytokines za uchochezi.

Kwa nini sinomenine inaweza kujifunga kwa PSMB9 na kisha kupunguza usemi wake?

Utafiti huu hautambui hatua zote za kati za molekuli za swali hili. Wakati docking na CETSA zinatoa ushahidi unaoelekea kwenye uwezekano wa physical target engagement, Western blot inaonyesha kwamba kiwango cha protini ya PSMB9 hupungua baada ya matibabu. Hata hivyo, chanzo hakijatatua moja kwa moja ni kwa utaratibu upi wa transcription, translation au protein degradation ambao ligand binding hupunguza usemi wa protini ya PSMB9.

Kwa hiyo Verianla haiongezi utaratibu usio katika chanzo kama “kwa sababu sinomenine inajifunga kwa PSMB9, protini huvunjwa moja kwa moja”.

Matokeo yanayoungwa mkono na utafiti

• PSMB9 ilitambuliwa katika uchanganuzi mwingi wa transcriptome na mtandao wa utafiti huu kama moja ya jeni kuu wagombea zinazohusiana na RA.
• Katika profaili za usemi wa tishu ya synovium ya RA, pathways za kinga na uchochezi zilijitokeza kwa nguvu.
• Uchanganuzi wa xCell ulionyesha hasa kwamba alama ya macrophage M1 ilikuwa imeongezeka katika sampuli za RA.
• Usemi wa PSMB9 katika RA FLS ulikuwa juu kuliko katika OA FLS.
• Usemi wa PSMB9 ulionyesha uhusiano chanya na shughuli za pathways zinazohusiana na interferon na cytokine.
• Alama ya docking ya PSMB9–sinomenine ilikokotolewa kuwa −9,0 kcal/mol.
• CETSA ilitoa matokeo yanayoendana na athari dhaifu ya thermal stabilization ya sinomenine kwenye PSMB9.
• Sinomenine ya 150–600 µM inahusishwa na kupungua kwa viwango vya IL-6 na TNF-α kwa kutegemea dozi katika seli RAW264.7 zilizochochewa kwa LPS.
• Sinomenine ilipunguza usemi wa protini ya PSMB9 kwa kutegemea dozi.

Matokeo ambayo utafiti hauungi mkono

Utafiti huu haujathibitisha kwamba PSMB9 ni biomarker ya uchunguzi wa RA iliyothibitishwa kliniki kwa sasa. Utafiti unaonyesha PSMB9 kama biomarker mgombea na waandishi wanaeleza hitaji la uthibitishaji katika cohorts huru na kubwa zaidi.

Haikujaribiwa moja kwa moja katika utafiti huu kwamba sinomenine husababisha uboreshaji wa kliniki kwa wagonjwa wa RA wa binadamu kwa kupunguza PSMB9.

Alama ya docking pekee haithibitishi kwamba sinomenine inajifunga kwa uhakika kwa PSMB9.

Ugunduzi wa CETSA si characterization thabiti na kamili ya biophysical binding; chanzo kinaujadili kama stabilization dhaifu na uwezekano wa target engagement.

PSMB9 haijaonyeshwa kuwa lengo pekee la sinomenine dhidi ya uchochezi. Waandishi wanasisitiza kwamba sinomenine inaweza kutenda kupitia taratibu nyingi, zikiwemo pathways nyingine kama Nrf2.

Modeli ya macrophage RAW264.7 iliyochochewa kwa LPS haiwakilishi kikamilifu mazingira changamano, sugu na autoimmune ya synovium ya RA ya binadamu.

Hakukuwa na uthibitishaji wa in vivo kwa mnyama katika utafiti.

Nguvu za utafiti

Moja ya nguvu za utafiti ni kwamba PSMB9 haikuchaguliwa kwa kutumia seti moja tu ya data au algorithm moja. Seti tofauti za data za gene expression, WGCNA, PPI, immune infiltration na single-cell analyses zilitumika kama tabaka zinazokamilishana.

Nguvu ya pili ni kwamba matokeo ya computational docking hayakukubaliwa moja kwa moja kama utaratibu wa mwisho, bali yalifuatiliwa kwa cellular CETSA, Western blot na vipimo vya cytokine.

Nguvu ya tatu ni kwamba matrices hazikuunganishwa moja kwa moja kwa sababu seti za data zilitoka kwenye majukwaa tofauti, na matokeo ya kiwango cha jeni yalitumiwa katika consensus analysis ili kupunguza batch effect kati ya majukwaa.

Vikwazo vikuu

• Majaribio ya utendaji yalifanywa tu katika mstari wa seli za macrophage RAW264.7 wa panya.
• Hakukuwa na uthibitishaji wa utendaji kwa kutumia mistari mingi ya seli au primary human RA cells.
• Hakukutumiwa modeli ya mnyama.
• Hakuna jaribio jipya la kliniki kwa binadamu linalojaribu moja kwa moja utaratibu wa sinomenine–PSMB9.
• Data ya single-cell inajumuisha wafadhili wanne pekee: OA4, OA5, RA8 na RA9.
• Kwa hiyo matokeo ya single-cell yanapaswa kuchukuliwa kuwa ya uchunguzi.
• Utendaji wa PSMB9 katika uchunguzi haujathibitishwa prospectively katika cohorts huru na kubwa.
• Molecular docking si kipimo cha moja kwa moja cha physical binding.
• CETSA ilionyesha thermal stabilization dhaifu pekee.
• Hatua zote za kati za molekuli ambazo sinomenine hupunguza usemi wa PSMB9 hazijafafanuliwa.
• Kwa kuzingatia kwamba sinomenine inaweza kutenda kupitia taratibu nyingi za kupunguza uchochezi, PSMB9 si maelezo pekee.

Maana sahihi ya kibiolojia ya matokeo

Tabaka zote za uchanganuzi wa utafiti huu zinapotathminiwa pamoja, PSMB9 inaonekana kama nodi mgombea ya immunoproteasome inayoweza kuunganisha uanzishaji wa kinga katika synovium ya RA na programu za uchochezi za stromal fibroblasts.

Kwa upande wa sinomenine, mlolongo wa ushahidi una viwango vitatu tofauti: docking ilionyesha computationally pose inayowezekana ya binding, CETSA iliunga mkono uwezekano wa target interaction ndani ya seli, na Western blot pamoja na ELISA zilionyesha athari ya matumizi ya sinomenine kwenye kiwango cha protini ya PSMB9 na outputs za uchochezi za IL-6/TNF-α.

Uwepo wa tabaka hizi pamoja unaimarisha mechanistic hypothesis; hata hivyo, hakuna hata moja peke yake inayothibitisha utaratibu wa uhakika wa matibabu wa sinomenine kupitia PSMB9 katika rheumatoid arthritis ya binadamu.

Kwa hiyo sentensi inayofaa zaidi ya hitimisho ni hii: PSMB9 ni lengo/biomarker mgombea inayohusiana na kinga katika rheumatoid arthritis inayostahili uthibitishaji zaidi, na sinomenine inaweza kupunguza uchochezi kwa kiasi kupitia udhibiti wa PSMB9.

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Kichwa asili: Sinomenine Regulates PSMB9 to Mediate Therapeutic Effects in Rheumatoid Arthritis

Waandishi: Cui Zhang; Chonkit Lio; Nana Li; Yang Yu; Jinfang Luo.

Mpangilio wa waandishi: Mpangilio wa chanzo umehifadhiwa bila kubadilishwa.

Mchango sawa: Cui Zhang na Chonkit Lio ni waandishi wenye mchango sawa.

Waandishi wanaowajibika: Chonkit Lio na Jinfang Luo.

Taasisi 1: Department of Basic Medicine, Department of Pharmacy, Key Laboratory on the Property & Effect of Chinese Medicine (Ethnic Medicine), Guizhou Genuine Herbs Center of Consistency of Utility, Guizhou Key Laboratory of Miao Medicine, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China.

Taasisi 2: Faculty of Chinese Medicine, Macau University of Science and Technology, Avenida Wailong, Taipa, Macao, China.

Taasisi 3: State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine, Macau University of Science and Technology, Avenida Wailong, Taipa, Macao, China.

Anwani ya sasa ya Chonkit Lio iliyotolewa katika chanzo: Department of Medical Biochemistry, Tohoku University Graduate School of Medicine, Sendai, Japan.

Jarida: Cells.

Mchapishaji: MDPI, Basel, Switzerland.

Juzuu / toleo / nambari ya makala: 15 / 11 / 1005.

DOI: 10.3390/cells15111005.

Kiungo rasmi cha DOI: https://doi.org/10.3390/cells15111005

Tarehe ya kupokelewa: 1 Aprili 2026.

Tarehe ya marekebisho: 4 Mei 2026.

Tarehe ya kukubaliwa: 26 Mei 2026.

Tarehe ya kuchapishwa: 29 Mei 2026.

Aina ya chanzo: Article — makala asili ya utafiti inayounganisha uchanganuzi jumuishi wa transcriptomics/bioinformatics, molecular docking na majaribio ya seli ya in vitro.

Hali ya peer review: Ni makala ya jarida iliyochapishwa na kupitiwa na wenzao.

Leseni: Creative Commons Attribution — CC BY.

Vyanzo vikuu vya data: GEO GSE276772, GSE285977, GSE55457 na GSE77298; GSE109449 kwa reanalysis ya single-cell.

Kizingiti cha differential expression: p < 0.05 na |log2FC| > 0.5.

Uchakataji wa microarray: affy v1.80.0 + RMA; limma v3.58.1.

Uchanganuzi wa RNA-seq: DESeq2 v1.42.1.

Uchakataji wa missing values: impute v1.76.0.

GO/KEGG: clusterProfiler v4.11.0; org.Hs.eg.db na org.Mm.eg.db.

GSEA: clusterProfiler; seti za jeni za MSigDB kwa msigdbr v25.1.1; ukubwa wa chini wa seti 10, wa juu 500.

Immune infiltration: xCell v1.1.0; Wilcoxon rank-sum test.

WGCNA: WGCNA v1.73; signed network; soft-thresholding power β = 7; TOM na dynamicTreeCut; tathmini ya module–trait kwa Pearson correlation, p < 0.05.

PPI: STRING; minimum interaction confidence score = 0.95.

Data ya single-cell: GSE109449; seli 396 za synovial fibroblast kutoka kwa wafadhili wanne OA4, OA5, RA8 na RA9.

Single-cell normalization: CPM na log2(CPM + 1).

Shughuli za pathways: GSVA v1.50.5; Hallmark gene sets.

Correlation: Spearman correlation kati ya usemi wa PSMB9 na shughuli za pathways za kinga.

Molecular docking: CB-DOCK2; PSMB9 PDB ID 6avo; muundo wa SIN kutoka PubChem; pose yenye alama ya chini zaidi ya Vina ilichaguliwa.

Dokezo la kiufundi ndani ya chanzo: Ingawa imeelezwa kwamba muundo wa kioo wa PSMB9 ulipatikana kutoka PDB, maandishi ya mbinu yanaandika kwamba muundo ulihifadhiwa katika “PDF format”. Verianla haijarekebisha kauli hii kwa dhana ya nje ya chanzo.

Matokeo ya docking: Alama ya Vina ya PSMB9–SIN ni −9,0 kcal/mol.

Mstari wa seli: Seli za macrophage RAW264.7 za panya.

Cell culture: DMEM + %10 fetal bovine serum; 37 °C; %5 CO₂.

Usafi wa sinomenine: >%99.

Dozi za CCK-8: 150, 300, 600, 1200 na 2400 µM SIN; saa 18.

Dozi za SIN katika majaribio ya utendaji: 150–600 µM.

LPS: 1 µg/mL.

DEX: 1 µM katika jaribio la Western blot.

ELISA: IL-6 na TNF-α; kipimo katika 450 nm, background correction katika 570 nm.

Western blot: PSMB9 1:1000; β-actin 1:3000; HRP secondary 1:3000; quantification kwa ImageJ v1.53a.

CETSA: SIN 600 µM / saa 19; 53, 63, 73, 83, 90 na 98 °C; dakika 3 kwa kila halijoto; dakika 10 katika −80 °C; mizunguko mitatu ya freeze–thaw.

Takwimu za seli: GraphPad Prism 8.0.2; one-way ANOVA + Tukey post hoc; mean ± SD; p < 0.05.

Ufadhili: National Science Foundation of China (82160779, 82505133); Research Project of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine No. GuiZhong, Yi Ke Yu (2025)54; Guizhou University of Traditional Chinese Medicine Talent Innovation Team [Gui Traditional Chinese Medicine TD He Zi [2023] 002]; Guizhou University of Traditional Chinese Medicine National and Provincial Science and Technology Innovation Talent Team Cultivation Project TD NO.[2022]004; Guizhou Provincial Basic Research Program No. ZK[2024]358.

Kamati ya maadili: Haitumiki.

Idhini iliyoarifiwa: Haitumiki.

Upatikanaji wa data: GSE276772, GSE285977, GSE55457 na GSE77298 zinapatikana wazi katika GEO; imeelezwa kwamba data za ziada za majaribio zinaweza kupatikana kutoka kwa mwandishi anayewajibika kwa ombi linalofaa kutokana na taratibu za taasisi za usimamizi na uhifadhi wa data.

Mgongano wa maslahi: Waandishi wametangaza kwamba hakuna mgongano wa maslahi.

Michango ya waandishi: Cui Zhang, Chonkit Lio na Jinfang Luo: mbinu, formal analysis, validation na draft ya kwanza. Nana Li na Yang Yu: data curation na formal analysis. Chonkit Lio na Jinfang Luo: review, editing na resources. Waandishi wote walisoma na kukubali toleo lililochapishwa.

Kikomo kikuu cha kimbinu: Uthibitishaji wa utendaji wa SIN–PSMB9 ulifanywa tu katika macrophage RAW264.7 za panya zilizochochewa kwa LPS. Utafiti haukuwa na jaribio la in vivo wala uthibitishaji mpya wa kliniki kwa binadamu. Uchanganuzi wa single-cell ulikuwa na wafadhili wanne tu na ulizingatiwa kuwa wa uchunguzi. Thamani ya PSMB9 kwa uchunguzi na tiba inahitaji kuthibitishwa katika cohorts huru na kubwa zaidi, primary patient cells na modeli za in vivo.