PSMB9 (proteasome subunit beta type-9; LMP2), зервоҳиди каталитикӣ мебошад, ки дар зарраи марказии 20S-и иммунопротеасома ҷойгир шуда, дар таҷзияи сафедаҳои вобаста ба коркарди антиген иштирок мекунад. Ин таҳқиқот робитаи PSMB9-ро бо беморӣ дар артрити ревматоидӣ (Rheumatoid Arthritis, RA) ва ҳамкории эҳтимолии синоменин (SIN) -ро бо PSMB9 тавассути якҷоя кардани маҷмӯаҳои сершумори додаҳои транскриптомӣ, таҳлили инфилтратсияи ҳуҷайраҳои иммунӣ, WGCNA, таҳлилҳои роҳҳо, single-cell RNA-seq, docking молекулавӣ ва таҷрибаҳои ҳуҷайравии макрофагҳои RAW264.7 меомӯзад.

Ҳангоми арзёбии якҷояи генҳои дифференсиалӣ ифодашуда аз чор маҷмӯаи додаҳои экспрессияи генҳои GEO ва шабакаи вазндори ҳамэкспрессияи генҳо, ки дар GSE55457 сохта шудааст, PSMB9, TAP1 ва CFB ҳамчун номзадҳои муштарак муайян шудаанд. Таҳлилҳои инфилтратсияи иммунӣ махсусан ғанишавии макрофагҳои M1-ро дар синовиуми RA нишон доданд. Сипас PSMB9 дар шабакаҳои ҳамкории сафеда–сафеда ҳамчун ҷузъи марказии иммунопротеасома/коркарди антиген таҳқиқ карда шуд.

Таҳлили дубораи 396 ҳуҷайраи фибробласти синовиалӣ аз чор донор дар маҷмӯаи додаҳои GSE109449 single-cell RNA-seq нишон дод, ки экспрессияи PSMB9 дар синовиоситҳои фибробластмонанди аз RA гирифташуда нисбат ба гурӯҳи OA баландтар аст ва экспрессияи PSMB9 бо роҳҳои илтиҳобии Hallmark, аз ҷумла interferon-α, interferon-γ, IL6/JAK–STAT3 ва allograft rejection, алоқаманд мебошад. Бо вуҷуди ин, азбаски ин қисми single-cell танҳо ба чор донор асос ёфтааст, дар таҳқиқот хусусияти иктишофӣ дорад.

Дар таҳлили docking молекулавӣ байни синоменин ва PSMB9 холи Vina −9,0 kcal/mol ба даст омад. Cellular Thermal Shift Assay (CETSA) дар ҳузури синоменин тағйироти сусти устуворкунанда дар рафтори гармии PSMB9-ро нишон дод ва ҳамкории эҳтимолии ҳадафро дастгирӣ намуд. Дар макрофагҳои RAW264.7, ки бо LPS илтиҳоб ангехта шуда буд, 150–600 µM синоменин бо коҳиши вобаста ба вояи сатҳҳои IL-6 ва TNF-α ва паст шудани экспрессияи сафедаи PSMB9 алоқаманд буд.

Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки ҳадди ақал як қисми таъсирҳои зиддиилтиҳобии синоменин метавонад бо танзими PSMB9 алоқаманд бошад. Аммо таҳқиқот инро ҳамчун механизми қатъӣ ва ягона исбот намекунад. Таҷрибаҳои функсионалӣ танҳо дар хатти ҳуҷайравии RAW264.7-и аз муш гирифташуда гузаронида шуданд ва дар модели ҳайвонот ё беморони RA озмоиши мустақими табобатӣ иҷро нашуд. Аз ин рӯ PSMB9 дар ин таҳқиқот биомаркери номзад ва ҳадафи терапевтии номзад мебошад; он озмоиши ташхисӣ ё ҳадафи табобатии дар клиника тасдиқшуда нест.

Мушкилоти асосие, ки дар артрити ревматоидӣ таҳқиқ мешавад, чист?

Артрити ревматоидӣ бемории системавии вобаста ба иммунитет мебошад, ки бо илтиҳоби музмини синовиалӣ ва осеби пешравандаи буғумҳо тавсиф мешавад. Дар патологияи беморӣ на танҳо ҳуҷайраҳои иммунӣ дар гардиш, балки ҳуҷайраҳои стромалии муқимии бофтаи синовиалӣ низ метавонанд ба нигоҳдории муҳити илтиҳобӣ саҳм гузоранд.

Саволи таҳқиқот ба ду қисми ба ҳам вобаста ҷудо мешавад. Якум, оё метавон як гени марказии иммуниро муайян кард, ки дар маҷмӯаҳои гуногуни транскриптомии инсон такроран бо RA алоқаманд ба назар мерасад. Дуюм, оё таъсирҳои зиддиилтиҳобии синоменинро метавон қисман тавассути ин ген ва маҳсулоти сафедаи он шарҳ дод.

Синоменин чист?

Синоменин, Sinomenium acutum алкалоиди мономерӣ мебошад, ки аз ин растанӣ гирифта мешавад. Дар қисми муқаддимавии манбаъ, бар асоси таҳқиқоти қаблӣ ва озмоишҳои клиникӣ, синоменин бо таъсирҳои зиддиилтиҳобӣ, иммуномодуляторӣ, бедардсозанда ва муҳофизати устухон алоқаманд дониста шудааст.

Аммо таҷрибаҳои худи ин мақола самаранокии клиникии синоменинро дар RA дубора намесанҷанд. Ин таҳқиқот ба саволи маҳдудтар — мавҷуд ё набудани робитаи эҳтимолии молекулавӣ ва ҳуҷайравӣ байни синоменин ва PSMB9 — равона шудааст.

Чаро PSMB9 Барои Артрити Ревматоидӣ Муҳим Аст?

PSMB9 ё LMP2 яке аз зервоҳидҳои каталитикии бетаи иммунопротеасома аст; он ба таҷзияи сафедаҳои дохилиҳуҷайравӣ ба пептидҳо ва интиқоли ин пептидҳо тавассути TAP1 ба ретикулуми эндоплазмавӣ барои омодагӣ ба муаррифии антигени MHC синфи I мусоидат мекунад. Имкони зиёд шудани экспрессияи PSMB9 тавассути interferon-γ заминаи биологии робитаи мустақими ин сафедаро бо фаъолшавии иммунӣ қавӣ мекунад.

Протеасома маҷмааи калони сафедаест, ки таҷзияи назоратшавандаи сафедаҳои нолозим ё осебдидаро дар ҳуҷайра таъмин мекунад. Иммунопротеасома, шакли махсуси протеасома мебошад, ки махсусан дар шароити илтиҳобӣ ва бо интерферон ангехташуда баъзе зервоҳидҳои каталитикӣ ҷойи зервоҳидҳои стандартии протеасомаро мегиранд. PSMB9 яке аз чунин зервоҳидҳои махсуси каталитикӣ мебошад.

Аз ин рӯ, PSMB9 танҳо “номи як ген” нест. Тағйироти экспрессияи ген қисми системаи васеътари иммунологӣ мебошад, ки бо коркарди антиген ва муҳити сигналии илтиҳобӣ алоқаманд аст. Бо вуҷуди ин, марказӣ будани он дар таҳлили шабака худ аз худ маънои онро надорад, ки он бемориро идора мекунад ё ингибитсияи он табобат фароҳам меорад; аз ин рӯ таҳқиқот баъдан PSMB9-ро бо қабатҳои гуногуни таҳлил ва таҷрибаҳои ҳуҷайравӣ пайгирӣ кард.

Чаро чор маҷмӯаи додаҳои GEO мустақиман якҷо карда нашуданд?

Дар таҳқиқот чор маҷмӯаи додаҳои экспрессияи генҳои GEO — GSE276772, GSE285977, GSE55457 ва GSE77298 — истифода шуданд. GSE55457 ва GSE77298 намунаҳои бофтаи синовиалии беморони RA ва назоратҳои солимро дар бар мегирифтанд, дар ҳоле ки GSE276772 ва GSE285977 ҳамчун маҷмӯаҳои додаҳои perturbation-и ген ё ангезиши ситокин истифода шуданд.

Азбаски платформаҳои маҷмӯаҳои додаҳо яксон набуданд, муҳаққиқон матритсаҳои экспрессияро ба як матритсаи калон муттаҳид накарданд. Ба ҷойи ин, ҳар маҷмӯаи додаҳо мустақилона коркард шуда, натиҷаҳои экспрессияи дифференсиалӣ дар сатҳи ген муқоиса гардиданд. Бо ин роҳ кӯшиш шуд, ки таъсири batch-и байниплатформавӣ, ки аз платформаҳои гуногуни микроarray ва RNA-seq ба вуҷуд меояд, мустақиман ба матритсаи умумӣ интиқол наёбад.

Додаҳои микроarray чӣ гуна коркард шуданд?

Файлҳои CEL-и микроarray дар муҳити R бо affy v1.80.0 ворид карда шуда, бо Robust Multi-Array Average (RMA) коркард шуданд. Раванди RMA се марҳилаи асосиро дар бар мегирад:

• ислоҳи замина,
• quantile normalization,
• probe-set summarization.

Дар натиҷа қиматҳои экспрессияи ген дар миқёси log2 ба даст омаданд ва маҷмӯаҳои probe бо бастаҳои annotation-и хоси платформа ба рамзҳои ген ва Entrez ID мувофиқ карда шуданд. Қиматҳои гумшуда бо impute v1.76.0 коркард шуданд.

Додаҳои RNA-seq чӣ гуна коркард шуданд?

Додаҳои RNA-seq бо DESeq2 v1.42.1 бо истифода аз ҷараёни стандартии кор таҳлил шуданд. Барои экспрессияи дифференсиалӣ дар маҷмӯаҳои микроarray limma v3.58.1 ва дар маҷмӯаи RNA-seq бошад DESeq2 истифода шуд.

Таърифи гени дифференсиалӣ ифодашуда (Differentially Expressed Gene, DEG) дар манбаъ:

\[ p < 0.05 \quad \text{ve} \quad |\log_2 FC| > 0.5 \]

ба ин шартҳо асос меёбад.

\(\log_2 FC\), тағйироти fold change-и экспрессия байни ду гурӯҳ дар асоси log2 мебошад. Қимати мусбат самти экспрессияи баландтар ва қимати манфӣ самти пасттарро нишон медиҳад. Аз 0,5 калон будани қимати мутлақ талаб мекунад, ки тағйирот аз андозаи муайян гузарад, дар ҳоле ки \(p<0.05\) ҳадди интихоби омории дар манбаъ истифодашуда мебошад.

Дар ин ҷо як нуктаи муҳим ҳаст: манбаъ барои интихоби DEG мустақиман \(p<0.05\) менависад. Verianla онро ҳамчун p-қимати ислоҳшуда ё ҳадди FDR тағйир намедиҳад.

Дар чор маҷмӯаи додаҳо чанд DEG ёфт шуд?

Фарқи зиёди ин рақамҳо худ аз худ маънои онро надорад, ки таъсири биологӣ дар як маҷмӯаи додаҳо “қавитар” аст. Навъҳои маҷмӯаҳо, платформаҳо, шароити таҷриба ва сохтори намунаҳо фарқ мекунанд. Стратегияи таҳқиқот бештар ба муайян кардани сигналҳои биологии такроршаванда дар таҳлилҳои гуногун равона шудааст, на ба муқоисаи шумораи мутлақи DEG.

Таҳлили GO ва KEGG чиро меомӯзад?

Дар як рӯйхати DEG садҳо ё ҳазорҳо ген буда метавонанд. Таҳлили enrichment-и Gene Ontology (GO) ва Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) месанҷад, ки оё вазифаҳо ё роҳҳои муайяни биологӣ дар ин рӯйхати генҳо аз интизор бештар намояндагӣ шудаанд.

Дар таҳқиқот clusterProfiler v4.11.0 истифода шуд. Барои генҳои инсон org.Hs.eg.db ва барои генҳои муш org.Mm.eg.db ҳамчун манбаъҳои annotation истифода шуда, генҳо ба Entrez ID табдил дода шуданд.

Дар таҳлили GO се синф арзёбӣ шуд:

• BP — Biological Process: равандҳои биологие, ки генҳо дар онҳо иштирок мекунанд,
• CC — Cellular Component: сохторҳои ҳуҷайравие, ки маҳсулот дар онҳо ҷойгир аст,
• MF — Molecular Function: вазифаҳо дар сатҳи молекулавӣ.

Манбаъ барои GO adjusted p-value < 0.05 ва барои KEGG p < 0.05 -ро ҳамчун ҳад истифода мебарад.

Дар натиҷаҳои enrichment-и асосёфта ба DEG равандҳои вобаста ба иммунитет ва илтиҳоб барҷаста шуданд; танзими фаъолшавии макрофаг, ҷавоби илтиҳобӣ, резорбсияи устухон ва сигнализатсияи миёнаравии IL-15 аз ҷумлаи мавзӯъҳои асосӣ буданд.

Чаро GSEA илова ба таҳлили DEG истифода шуд?

Равиши DEG танҳо генҳоеро истифода мекунад, ки аз ҳадҳои омории пешакӣ муайяншуда мегузаранд. Баръакс, Gene Set Enrichment Analysis (GSEA), метавонад тағйироти хурд, вале ҳамоҳангро дар рӯйхати пурраи генҳои тартибдодашуда низ арзёбӣ кунад.

Аз ин сабаб, таҳқиқот GSEA-ро барои омӯзиши барномаҳои васеътари транскриптомӣ истифода кард, ки мумкин аст танҳо аз рӯйхати “DEG-и аҳамиятнок” дида нашаванд.

Генҳо аз рӯи \(\log_2 FC\) тартиб дода шуда, маҷмӯаҳои генҳои MSigDB бо msigdbr v25.1.1 гирифта шуданд ва барои андозаи gene-set:

\[ 10 \leq \text{gen setindeki gen sayısı} \leq 500 \]

истифода шуд.

Дар натиҷаҳои GSEA-KEGG роҳҳои JAK–STAT ва Toll-like receptor ва дар натиҷаҳои GSEA-GO ҷавобҳои интерферон ва барномаҳои сигналии NF-κB барҷаста шуданд. Ин натиҷаҳо тафсири тағйироти ҳамоҳангшудаи барномаҳои транскрипсионии иммунитети модарзодӣ ва илтиҳобиро дар RA дастгирӣ карданд.

Таҳлили инфилтратсияи иммунӣ бо xCell чиро чен мекунад?

xCell, усули ҳисоббарорӣ мебошад, ки аз профилҳои bulk-и экспрессияи ген холҳои нисбии enrichment-ро барои навъҳои гуногуни ҳуҷайраҳои иммунӣ ва стромалӣ тахмин мекунад. “Инфилтратсия” дар ин ҷо шумориши мустақими ҳуҷайраҳо зери микроскоп нест; он тахмини нисбии enrichment аз имзоҳои экспрессия мебошад.

Дар таҳқиқот xCell v1.1.0 дар R v4.3.2 ба маҷмӯаҳои GSE55457 ва GSE77298 татбиқ шуд. Матритсаҳои экспрессия нормализатсия шуда, ба log2 табдил дода шуданд.

Холҳои xCell enrichment байни RA ва назорат бо Wilcoxon rank-sum тести муқоиса шуданд.

Дар ҳар ду маҷмӯаи синовиалӣ намунаи баландтари enrichment-и ҳуҷайраҳои иммунӣ дида шуд, махсусан макрофагҳои M1 ҳамчун яке аз навъҳои ҳуҷайравие баромаданд, ки афзоиши бештар нишон доданд. Дар GSE77298 plasma cells ва CD8+ T cells низ зиёд шуданд.

Ин натиҷа маънои онро надорад, ки “дар бофтаи RA зери микроскоп маҳз ҳамин миқдор макрофаги M1 вуҷуд дорад”. Натиҷаҳои xCell нишондиҳандаҳои нисбии ҳуҷайравии enrichment мебошанд, ки аз додаҳои транскриптомӣ ба даст омадаанд.

WGCNA Чӣ Гуна Ба Интихоби PSMB9 Мусоидат Кард?

Таҳлили шабакаи вазндори ҳамэкспрессияи генҳо (Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA) ба ҷойи танҳо экспрессияи дифференсиалии генҳои алоҳида, гурӯҳҳои генҳои якҷоя тағйирёбандаро ҳамчун модулҳо муайян мекунад ва робитаи ин модулҳоро бо хусусияти беморӣ меомӯзад. Дар ин таҳқиқот WGCNA барои ёфтани модулҳои ҳамэкспрессияи вобаста ба RA дар транскриптоми синовиалии GSE55457 истифода шуд.

Дар таҳлили WGCNA, ба истиснои генҳои дорои экспрессияи хеле паст, матритсаи пурраи экспрессияи ген истифода шуда, signed co-expression network сохта шуд.

soft-thresholding power-и интихобшуда дар манбаъ:

\[ \beta = 7 \]

гузориш шудааст.

Soft-thresholding power параметрест, ки муайян мекунад коррелятсияҳои байни генҳо чӣ гуна ба вазнҳои пайвастагии шабака табдил меёбанд. Дар таҳқиқот пасттарин қувваи мувофиқе интихоб шуд, ки меъёри scale-free topology-ро иҷро мекард.

Сипас topological overlap matrix (TOM) ҳисоб карда шуда, hierarchical clustering дар масофаи асосёфта ба TOM анҷом дода шуд ва ҳудудҳои модул бо dynamicTreeCut ислоҳ гардиданд.

Робитаҳои модул–RA бо коррелятсияи Pearson таҳқиқ шуда, p < 0.05 ҳамчун меъёри аҳамият истифода шуд. Ҳафт модул, аз ҷумла Lightcyan, black ва lightgreen, бо RA робитаи мусбати қавӣ нишон доданд, дар ҳоле ки чор модул робитаи манфӣ доштанд.

Таҳлили enrichment-и генҳои ин модулҳо нишон дод, ки роҳҳои вобаста ба ҷавоби иммунӣ, илтиҳоб ва истеҳсоли ситокин дар модулҳои шабакаи вобаста ба RA ҷамъ шудаанд.

PSMB9 чӣ гуна ба гени марказии номзад табдил ёфт?

Ҳангоми баррасии буриши натиҷаҳои DEG аз чор маҷмӯаи мустақил ва генҳои модули WGCNA-и вобаста ба RA, PSMB9, TAP1 ва CFB ҳамчун генҳои номзади муштарак муайян шуданд.

Сипас дар STRING шабакаи ҳамкории сафеда–сафеда (Protein–Protein Interaction, PPI) сохта шуд. Манбаъ minimum interaction confidence score-ро чунин муайян мекунад:

\[ 0.95 \]

Ин ҳадаф дорад, ки танҳо пайвастагиҳои STRING бо холи баланди эътимод ба шабака дохил шаванд.

Ҳангоми истифодаи PSMB9 ҳамчун seed-и ягона шабакаи зичи ҳамкорӣ аз ҷиҳати протеасома ва ҷузъҳои коркарди антиген ба вуҷуд омад. Ҳангоми истифодаи якҷояи PSMB9, TAP1 ва CFB ҳамчун seed шабакаи васеътар ва ба ҳам пайвастаи иммунӣ ба даст омад.

Чаро таҳлили single-cell RNA-seq алоҳида анҷом дода шуд?

Bulk транскриптом экспрессияи миёнаи аз тамоми бофта омадаро нишон медиҳад. Аммо синовиум навъҳои зиёди ҳуҷайраҳо, аз ҷумла фибробластҳо ва ҳуҷайраҳои гуногуни иммунӣ дорад. Таҳлили single-cell RNA-seq кӯмак мекунад, ки экспрессияи ген дар кадом зергурӯҳҳои ҳуҷайравӣ дида мешавад, муфассалтар омӯхта шавад.

Дар таҳқиқот GSE109449 истифода шуд. Тибқи манбаъ, аз чор донор:

• OA4,
• OA5,
• RA8,
• RA9

дар маҷмӯъ 396 ҳуҷайраи фибробласти синовиалӣ таҳлил шуданд.

OA маънои остеоартрит ва RA маънои артрити ревматоидиро дорад. Ин қисм махсусан синовиоситҳои фибробластмонандро (Fibroblast-Like Synoviocytes, FLS) арзёбӣ мекунад.

Нормализатсияи CPM чӣ гуна ҳисоб шуд?

Барои ҳар ҳуҷайра андозаи китобхона ҳисоб карда шуда, қиматҳои экспрессия бо усули counts-per-million (CPM) нормализатсия шуданд:

\[ CPM_{ij} = \frac{x_{ij}} {\sum_j x_{ij}} \times 10^6 \]

Дар ин ҷо:

• \(x_{ij}\), шумораи хоми гени дахлдор дар ҳуҷайраи дахлдорро,
• \(\sum_j x_{ij}\), шумораи умумӣ дар китобхонаи ҳуҷайравии барои нормализатсия истифодашударо,
• \(10^6\), коэффитсиенте, ки қиматро ба миқёси шумора ба як миллион табдил медиҳад,

ифода мекунад.

Манбаъ ишораи индексии формуларо бо ҳамин шакл медиҳад; Verianla индексҳоро пинҳонӣ аз нав таъриф намекунад.

Чаро табдилдиҳии log анҷом дода шуд?

Қиматҳои нормализатсияшудаи CPM сипас:

\[ \log_2(CPM+1) \]

табдил дода шуданд.

Иловаи +1 дар ин ҷо аз номуайян шудани логарифм ҳангоми сифр будани CPM пешгирӣ мекунад. Табдилдиҳии log бартарии қиматҳои баланди шуморишро дар миқёс кам карда, тақсимоти экспрессияро идорашавандатар мекунад.

GSVA чиро чен мекунад?

Gene Set Variation Analysis (GSVA), усулест, ки ба ҷойи экспрессияи генҳои алоҳида фаъолии нисбии маҷмӯаҳои пешакӣ муайяншудаи генҳоро дар намуна ё профили ҳуҷайравӣ баҳогузорӣ мекунад.

Маҷмӯаҳои генҳои Hallmark бо msigdbr v25.1.1 гирифта шуда, холҳои GSVA бо GSVA v1.50.5 ҳисоб карда шуданд.

Профилҳои RA FLS дар роҳҳои гуногуни илтиҳобӣ/иммунии Hallmark, аз ҷумла interferon-α response, interferon-γ response, allograft rejection ва IL6/JAK–STAT3 signaling, нисбат ба профилҳои OA фаъолии баландтар нишон доданд.

Байни экспрессияи PSMB9 ва холҳои GSVA-и ин роҳҳо коррелятсияи Spearman ҳисоб карда шуд.

Манбаъ қисми коррелятсияро бар асоси чор донор тавсиф мекунад ва дар бахши муҳокима махсус таъкид менамояд, ки ин таҳлили single-cell бо сабаби шумораи маҳдуди донорҳо хусусияти иктишофӣ дорад. Аз ин рӯ ин коррелятсияҳо набояд ҳамчун умумисозии қавӣ ба аҳолӣ тафсир шаванд.

Docking молекулавӣ чиро месанҷад?

Docking молекулавӣ мавқеъҳои эҳтимолии пайвастшавии молекулаи хурдро дар сохтори сеандозаи сафедаи ҳадаф ва холҳои мутобиқати ҳисоббарориро меомӯзад. Docking ченаки мустақими лаборатории пайвастшавии физикӣ нест.

Сохтори кристаллии PSMB9 аз пойгоҳи PDB бо PDB ID: 6avo гирифта шуда, сохтори сеандозаи синоменин аз PubChem дар формати SDF боргирӣ ва docking-и асосёфта ба сохтор бо CB-DOCK2 анҷом дода шуд.

Манбаъ менависад, ки файли сохтори PSMB9 дар “PDF format” нигоҳ дошта шудааст. Ин ибораи ғайриодӣ аз ҷониби Verianla бо фарзияи берун аз манбаъ иваз нашудааст.

Пози docking бо пасттарин холи Vina ҳамчун пози оптималӣ интихоб шуд.

Ҳадҳои тафсири docking, ки манбаъ истифода кардааст:

Барои PSMB9–SIN ҳисобшуда:

\[ \text{Vina score}=-9.0\ \text{kcal/mol} \]

мувофиқи таснифи худи манбаъ бо тамоюли қавии ҳисоббарории пайвастшавӣ мувофиқ аст.

Аммо холи docking худ аз худ исбот намекунад, ки синоменин дар дохили ҳуҷайра ба PSMB9 ҳатман ҷисман пайваст мешавад. Аз ин рӯ таҳқиқот натиҷаи docking-ро бо CETSA дар сатҳи ҳуҷайравӣ пайгирӣ кард.

Оё CETSA Пайвастшавии Бевоситаи Синоменин Ба PSMB9-ро Қатъӣ Исбот Мекунад?

Не. Дар ин таҳқиқот CETSA бинобар тағйироти сусти устувории гармии PSMB9 дар ҳузури синоменин ҳамкории эҳтимолии ҳадафро дастгирӣ мекунад; аммо мувофиқи тафсири эҳтиёткоронаи муаллифон дар муҳокима, робитаи SIN–PSMB9 бояд на ҳамчун механизми қатъӣ ва ягона, балки ҳамчун механизми эҳтимолӣ арзёбӣ шавад.

Мантиқи асосии CETSA

Cellular Thermal Shift Assay (CETSA) арзёбӣ мекунад, ки сафеда дар ҳароратҳои гуногун то чӣ андоза ҳалшаванда/устувор мемонад. Ҳангоми пайваст шудани ligand ба сафеда, дар баъзе ҳолатҳо устувории гармии сафеда метавонад тағйир ёбад.

Аз ин рӯ ҳуҷайраҳои бо ligand коркардшуда ва назоратӣ ба ҳароратҳои гуногун дучор карда мешаванд; сипас сафедаи ҳадафе, ки ҳалшаванда мемонад, бо усулҳое мисли Western blot чен карда мешавад.

Дар ин таҳқиқот ҳуҷайраҳои RAW264.7:

• бо назорати vehicle-и DMSO ё 600 µM синоменин 19 соат коркард шуданд,
• ба ҳароратҳои 53, 63, 73, 83, 90 ва 98 °C барои 3 дақиқа дучор шуданд,
• фавран дар −80 °C барои 10 дақиқа ях карда шуданд,
• раванди freeze–thaw се маротиба такрор шуд,
• дар буфери RIPA рӯи ях 30 дақиқа лизис шуданд,
• дар 12.000 rpm, 4 °C барои 20 дақиқа сентрифуга шуданд,
• сипас PSMB9 бо Western blot таҳлил шуд.

Додаи Figure 9B-и манбаъ нишон медиҳад, ки бо боло рафтани ҳарорат банди PSMB9 суст мешавад, аммо дар гурӯҳи синоменин таъсири сусти устуворкунанда мавҷуд аст.

Аз ин рӯ Verianla натиҷаро ба шакли “CETSA пайвастшавии бевоситаи қатъиро исбот кард” бузург намекунад. Docking + CETSA якҷоя барои target engagement-и эҳтимолӣ дастгирӣ медиҳанд.

Модели ҳуҷайравии RAW264.7 чист?

RAW264.7 хатти ҳуҷайравии макрофагмонанди аз муш гирифташуда мебошад. Ин таҳқиқот ҷавоби илтиҳобии ҳуҷайраҳоро бо LPS ангехта, робитаи байни синоменин ва PSMB9-ро дар сатҳи механистӣ арзёбӣ кардааст.

Ҳуҷайраҳо дар муҳити пурраи DMEM бо %10 fetal bovine serum, дар 37 °C ва %5 CO₂ парвариш шуданд.

Ин модел тамоми микромуҳити бисёрҳуҷайравӣ, музмин ва аутоиммунии синовиуми RA-и инсонро намояндагӣ намекунад.

Озмоиши ҳаётпазирии ҳуҷайра CCK-8

Барои ҳаётпазирии ҳуҷайра синоменин дар консентратсияҳои:

150, 300, 600, 1200 ва 2400 µM

санҷида шуд.

Дар плитаҳои 96-well зичии ҳуҷайра 1,8 × 10⁵/mL ва ҳаҷм 100 µL/well муқаррар шуда, коркарди синоменин 18 соат идома кард.

Сипас ба ҳар well 10 µL маҳлули CCK-8 илова шуда, дар 37 °C барои 45 дақиқа–1 соат инкубатсия шуд. Абсорбанс дар 450 nm чен карда шуд.

Манбаъ ҳаётпазирии ҳуҷайраро бо формулаи:

\[ \text{Göreli canlılık (\%)} = \frac{ OD_{treatment}-OD_{blank} }{ OD_{control}-OD_{blank} } \times100 \]

ҳисоб кардааст.

Дар ин ҷо:

• \(OD_{treatment}\): зичии оптикии well-и бо синоменин коркардшуда,
• \(OD_{blank}\): қимати заминавии well-и бе ҳуҷайра ё blank-и мувофиқ,
• \(OD_{control}\): зичии оптикии гурӯҳи назоратӣ мебошад.

Тарҳ кардани қимати blank абсорбанси заминавии системаи ченкуниро кам мекунад. Тақсим ба гурӯҳи назоратӣ назоратро тақрибан ба истиноди %100 ҳаётпазирӣ табдил медиҳад.

Манбаъ қайд мекунад, ки дар консентратсияҳои аз 600 µM баландтари синоменин таъсири ситотоксикӣ метавонад пайдо шавад; аз ин рӯ дар таҷрибаҳои функсионалии баъдӣ 150–600 µM интихоб шуд.

Модели LPS ва таҷрибаҳои ELISA

Барои чен кардани IL-6 ва TNF-α ҳуҷайраҳои RAW264.7 бо зичии 3 × 10⁵ ҳуҷайра/mL ба плитаҳои 6-well гузошта шуда, шабона дар 37 °C нигоҳ дошта шуданд.

Ҳуҷайраҳо аввал 1 соат бо синоменин ё dexamethasone (DEX) пешакӣ коркард шуда, сипас:

\[ LPS = 1\ \mu g/mL \]

бо ин консентратсия 18 соат ангехта шуданд.

LPS липополисахаридест, ки барои ба вуҷуд овардани ҷавоби қавии илтиҳобӣ дар макрофагҳо истифода мешавад. Ин модел на тамоми RA, балки як қисми таҷрибавии илтиҳоби макрофагро тақлид мекунад.

Супернатанти ҳуҷайра дар 1200 rpm барои 10 дақиқа сентрифуга шуд; IL-6 ва TNF-α бо ELISA чен, абсорбанс дар 450 nm хонда ва ислоҳи замина дар 570 nm истифода шуд.

Натиҷаҳо нишон доданд, ки синоменин консентратсияҳои IL-6 ва TNF-α-ро вобаста ба воя кам мекунад. Дар гурӯҳи Dexamethasone низ самти монанди зиддиилтиҳобӣ мушоҳида шуд.

Таҷрибаи Western blot

Экспрессияи сафедаи PSMB9 бо Western blot таҳқиқ шуд. Барои синоменин сатҳҳои 150, 300 ва 600 µM истифода шуда, гурӯҳи DEX 1 µM муқаррар гардид.

Пас аз пешкоркарди яксоата LPS ба тавре илова шуд, ки консентратсияи ниҳоӣ 1 µg/mL бошад ва ҳуҷайраҳо боз 18 соат парвариш шуданд.

Сафедаҳо дар 10% SDS-PAGE ҷудо ва ба мембранаи PVDF интиқол дода шуданд.

Разбавкаҳои антитело:

Инкубатсияи антителои ибтидоӣ дар 4 °C шабона ва антителои дуюмдараҷа дар ҳарорати хона барои 1 соат анҷом дода шуд.

Бандҳо бо системаи тасвиргирии chemiluminescence тасвир шуда, квантификатсияи сатҳи хокистарӣ бо ImageJ v1.53a анҷом дода шуд.

Натиҷаҳои Figure 9F–G-и манбаъ нишон медиҳанд, ки синоменин экспрессияи сафедаи PSMB9-ро вобаста ба воя кам мекунад.

Дастгоҳҳо ва маводи муҳими истифодашуда дар таҷрибаҳо

Таҳлили омории таҷрибаҳои ҳуҷайравӣ

Омор ва визуализатсияи додаҳо бо GraphPad Prism 8.0.2 анҷом дода шуд.

Барои муқоисаи чанд гурӯҳ one-way ANOVA ва сипас Tukey post hoc тести истифода шуданд.

Натиҷаҳо:

\[ \text{ortalama} \pm \text{standart sapma} \]

пешниҳод шуда,

\[ p<0.05 \]

ҳамчун ҳадди аҳамияти оморӣ қабул шуд.

Дар шарҳи Figure 9 нисбат ба гурӯҳи normal ### p<0.001; нисбат ба гурӯҳи model бошад *** p<0.001, ** p<0.01 ва * p<0.05 истифода шуданд.

Азбаски манбаъ баландии ҳамаи сутунҳои графикҳоро ҳамчун ҷадвали рақамӣ гузориш намекунад, Verianla таносубҳои IL-6, TNF-α ё PSMB9-ро, ки аз тасвир тахминан хонда мешаванд, ҳамчун рақамҳои дақиқи хом намесозад.

Усул ва Натиҷаҳои Таҳқиқот

Қабатҳои далели тарҳи таҳқиқот

Натиҷаи асосии якум: роҳҳои иммунитет ва илтиҳоб бо RA сахт алоқаманд буданд

Гарчанде намунаҳои DEG дар чор маҷмӯаи додаҳо фарқ мекарданд, таҳлилҳои enrichment дар равандҳои иммунӣ ва илтиҳобӣ муштаракӣ нишон доданд. GSEA тағйироти васеътари роҳҳоро, ки бо ҳадди DEG мумкин буд дида нашаванд, ошкор карда, робита бо JAK–STAT, Toll-like receptor, ҷавобҳои интерферон ва барномаҳои NF-κB нишон дод.

Натиҷаи асосии дуюм: сигнали макрофаги M1 барҷаста шуд

Дар таҳлилҳои xCell-и GSE55457 ва GSE77298 барои бисёр ҳуҷайраҳои иммунӣ дар синовиуми RA enrichment-и зиёд мушоҳида шуд. Макрофагҳои M1 дар ҳар ду таҳлил яке аз имзоҳои ҳуҷайравии бо афзоиши барҷаста буданд ва яке аз заминаҳои асосии таҳлилҳои механистии баъдӣ гардиданд.

Натиҷаи асосии сеюм: PSMB9 аз чанд қабати интихоб гузашт

PSMB9 танҳо аз як volcano plot интихоб нашуд. Буриши DEG, модули WGCNA ва таҳлили PPI якҷоя арзёбӣ шуда, PSMB9, TAP1 ва CFB ҳамчун генҳои номзади такроршаванда муайян шуданд.

Робитаи зичи PSMB9 махсусан бо ҷузъҳои иммунопротеасома ва коркарди антиген боис шуд, ки сафеда ҳамчун яке аз номзадҳои марказии таҳқиқот пайгирӣ шавад.

Натиҷаи асосии чорум: PSMB9 танҳо сигнали маҳдуд ба ҳуҷайраҳои иммунӣ набуд

Дар таҳлили дубораи single-cell экспрессияи PSMB9 дар синовиоситҳои фибробластмонанди аз RA гирифташуда нисбат ба FLS-и аз OA гирифташуда баландтар буд.

Дар ҳамон профилҳо фаъолии роҳҳои иммунӣ/илтиҳобии Hallmark, аз ҷумла interferon-α, interferon-γ, allograft rejection ва IL6/JAK–STAT3, дар гурӯҳи RA низ баланд буд.

Ин натиҷа модели онро дастгирӣ мекунад, ки муҳити илтиҳобии синовиуми RA танҳо аз ҳуҷайраҳои иммунӣ, ки инфилтратсия мекунанд, иборат нест; фибробластҳои стромалии муқимӣ низ метавонанд барномаҳои илтиҳобӣ нишон диҳанд.

Аммо азбаски ин қисм танҳо ба чор донор асос ёфтааст, набояд барои аҳолии калон хулосаи умумӣ бароварда шавад.

Натиҷаи асосии панҷум: холи docking-и синоменин–PSMB9 −9,0 kcal/mol буд

Таҳлили CB-DOCK2 байни PSMB9 ва синоменин пози docking бо холи Vina-и −9,0 kcal/mol ба вуҷуд овард. Ин қимат мувофиқи ҳадҳои арзёбии docking-и худи манбаъ бо тамоюли қавии пайвастшавӣ мувофиқ аст.

Аммо docking симулятсия/тахмин аст. Барои муайян кардани он ки молекула воқеан дар ҳуҷайраи зинда ба сафедаи дахлдор мепайвандад ё не, далели иловагии таҷрибавӣ лозим аст.

Натиҷаи асосии шашум: CETSA target engagement-и эҳтимолиро дастгирӣ кард

Дар CETSA синоменин устуворшавии драматикиеро нишон надод, ки ҳалшавандагии PSMB9-ро бо ҳарорат комилан тағйир диҳад; манбаъ онро ҳамчун таъсири суст/modest-и устуворкунанда тафсир кардааст.

Аз ин рӯ, натиҷаи CETSA ҳамкории эҳтимолиро дар як самт бо docking дастгирӣ мекунад, вале ҷойи тавсифи қатъии биофизикии пайвастшавии SIN–PSMB9-ро намегирад.

Натиҷаи асосии ҳафтум: 150–600 µM синоменин ҷавоби илтиҳобиро кам кард

Азбаски озмоиши CCK-8 нишон дод, ки дар консентратсияҳои аз 600 µM баландтар эҳтимоли ситотоксикӣ меафзояд, дар таҷрибаҳои функсионалӣ диапазони 150–600 µM истифода шуд.

Дар макрофагҳои RAW264.7, ки бо LPS ангехта шуданд, истифодаи синоменин сатҳҳои IL-6 ва TNF-α-ро вобаста ба воя паст кард.

Натиҷаҳои Western blot низ нишон доданд, ки бо зиёд шудани консентратсияи синоменин экспрессияи сафедаи PSMB9 кам мешавад.

Назорати Dexamethasone низ ба самти ингибитсия дар экспрессияи PSMB9 ва ситокинҳои илтиҳобӣ таъсир нишон дод.

Чаро синоменин пас аз пайваст шудан ба PSMB9 метавонад экспрессияи онро кам кунад?

Ин таҳқиқот ҳамаи марҳилаҳои мобайнии молекулавии ин саволро муайян намекунад. Дар ҳоле ки docking ва CETSA далели имконпазири physical target engagement медиҳанд, Western blot нишон медиҳад, ки пас аз табобат сатҳи сафедаи PSMB9 кам шудааст. Аммо дар манбаъ мустақиман ҳал нашудааст, ки пайвастшавии ligand экспрессияи сафедаи PSMB9-ро тавассути кадом механизми транскрипсионӣ, транслятсионӣ ё таҷзияи сафеда кам мекунад.

Аз ин рӯ Verianla механизми берун аз манбаъ, мисли “азбаски синоменин ба PSMB9 мепайвандад, сафеда худкор таҷзия мешавад”, илова намекунад.

Натиҷаҳое, ки таҳқиқот дастгирӣ мекунад

• PSMB9 дар таҳлилҳои сершумори транскриптомӣ ва шабакавии ин таҳқиқот ҳамчун яке аз генҳои марказии номзади вобаста ба RA муайян шудааст.
• Дар профилҳои экспрессияи бофтаи синовиалии RA роҳҳои иммунитет ва илтиҳоб ба таври равшан барҷаста шуданд.
• Таҳлили xCell махсусан ғанишавии имзои макрофаги M1-ро дар намунаҳои RA нишон дод.
• Дар FLS-и RA экспрессияи PSMB9 нисбат ба FLS-и OA баландтар ёфт шуд.
• Экспрессияи PSMB9 бо фаъолияти роҳҳои вобаста ба интерферон ва ситокин робитаи мусбат нишон дод.
• Холи docking-и PSMB9–синоменин −9,0 kcal/mol ҳисоб карда шуд.
• CETSA натиҷаи мувофиқ бо таъсири сусти устуворкунандаи гармии синоменин ба PSMB9 дод.
• 150–600 µM синоменин дар ҳуҷайраҳои RAW264.7-и бо LPS ангехташуда бо коҳиши вобаста ба вояи сатҳҳои IL-6 ва TNF-α алоқаманд аст.
• Синоменин экспрессияи сафедаи PSMB9-ро вобаста ба воя кам кард.

Натиҷаҳое, ки таҳқиқот дастгирӣ намекунад

Бо ин таҳқиқот исбот нашудааст, ки PSMB9 имрӯз биомаркери ташхисии дар клиника тасдиқшудаи RA мебошад. Таҳқиқот PSMB9-ро ҳамчун биомаркери номзад нишон медиҳад ва муаллифон зарурати тасдиқ дар когорти мустақили калонтарро қайд мекунанд.

Дар ин таҳқиқот мустақиман санҷида нашудааст, ки синоменин дар беморони инсонии RA бо паст кардани PSMB9 беҳбудии клиникӣ меорад.

Холи docking худ аз худ пайвастшавии қатъии синоменин ба PSMB9-ро исбот намекунад.

Натиҷаи CETSA тавсифи қавӣ ва пурраи биофизикии пайвастшавӣ нест; манбаъ онро ҳамчун устуворшавии суст ва target engagement-и эҳтимолӣ баррасӣ мекунад.

PSMB9 ҳамчун ҳадафи ягонаи зиддиилтиҳобии синоменин нишон дода нашудааст. Муаллифон махсус қайд мекунанд, ки синоменин метавонад тавассути чанд механизми гуногун, аз ҷумла роҳҳои дигар мисли Nrf2, таъсир кунад.

Модели макрофаги RAW264.7-и бо LPS ангехташуда тамоми микромуҳити мураккаби музмин ва аутоиммунии синовиуми RA-и инсонро намояндагӣ намекунад.

Дар таҳқиқот тасдиқи in vivo дар ҳайвон анҷом дода нашуд.

Ҷиҳатҳои қавии таҳқиқот

Яке аз ҷиҳатҳои қавии таҳқиқот ин аст, ки PSMB9 танҳо бо як маҷмӯаи додаҳо ё як алгоритм интихоб нашудааст. Маҷмӯаҳои гуногуни экспрессияи ген, WGCNA, PPI, инфилтратсияи иммунӣ ва таҳлилҳои single-cell ҳамчун қабатҳои якдигарро пуркунанда истифода шудаанд.

Ҷиҳати қавии дуюм он аст, ки натиҷаи docking-и ҳисоббарорӣ мустақиман ҳамчун механизми ниҳоӣ қабул нашуда, бо CETSA-и ҳуҷайравӣ, Western blot ва ченкунии ситокинҳо пайгирӣ шудааст.

Ҷиҳати қавии сеюм он аст, ки бо сабаби омадани маҷмӯаҳои додаҳо аз платформаҳои гуногун матритсаҳо мустақиман якҷо нашуда, барои кам кардани таъсири batch-и байниплатформавӣ натиҷаҳои сатҳи ген дар таҳлили консенсус истифода шудаанд.

Маҳдудиятҳои асосӣ

• Таҷрибаҳои функсионалӣ танҳо дар хатти ҳуҷайравии макрофаги муши RAW264.7 гузаронида шуданд.
• Тасдиқи функсионалӣ бо чанд хатти ҳуҷайравӣ ё ҳуҷайраҳои ибтидоии инсонии RA анҷом дода нашуд.
• Модели ҳайвонот истифода нашуд.
• Дар инсон озмоиши нави клиникӣ, ки механизми синоменин–PSMB9-ро мустақиман месанҷад, вуҷуд надорад.
• Додаҳои single-cell танҳо аз чор донор — OA4, OA5, RA8 ва RA9 — иборатанд.
• Аз ин рӯ натиҷаҳои single-cell бояд иктишофӣ ҳисобида шаванд.
• Самаранокии ташхисии PSMB9 дар когорти мустақили калон ба таври проспективӣ тасдиқ нашудааст.
• Docking молекулавӣ ченаки мустақими пайвастшавии физикӣ нест.
• CETSA танҳо устуворшавии сусти гармиро нишон дод.
• Ҳамаи марҳилаҳои мобайнии молекулавии коҳиш додани экспрессияи PSMB9 тавассути синоменин ҳал нашудаанд.
• Бо назардошти он ки синоменин метавонад тавассути чанд механизми зиддиилтиҳобӣ таъсир кунад, PSMB9 ягона шарҳ нест.

Маънои дурусти биологии натиҷаҳо

Ҳангоми арзёбии якҷояи ҳамаи қабатҳои таҳлилии ин таҳқиқот, PSMB9 ҳамчун гиреҳи номзади иммунопротеасома намоён мешавад, ки метавонад байни фаъолшавии иммунӣ дар синовиуми RA ва барномаҳои илтиҳобии фибробластҳои стромалӣ робита эҷод кунад.

Дар ҷониби синоменин занҷири далелҳо дар се сатҳи ҷудогона аст: docking ба таври ҳисоббарорӣ пози эҳтимолии пайвастшавиро нишон дод, CETSA ҳамкории эҳтимолии ҳадафро дар дохили ҳуҷайра дастгирӣ кард, Western blot ва ELISA таъсири синоменинро ба сатҳи сафедаи PSMB9 ва баромадҳои илтиҳобии IL-6/TNF-α нишон доданд.

Ҳузури якҷояи ин қабатҳо гипотезаи механистиро қавӣ мекунад; аммо ҳеҷ кадомаш танҳо механизми қатъии табобатии синоменинро тавассути PSMB9 дар артрити ревматоидии инсон исбот намекунад.

Аз ин рӯ ҷумлаи мувофиқтарини хулоса чунин аст: PSMB9 дар артрити ревматоидӣ ҳадаф/биомаркери номзади вобаста ба иммунитет мебошад, ки сазовори тасдиқи минбаъда аст, ва синоменин метавонад тавассути танзими PSMB9 илтиҳобро қисман коҳиш диҳад.

Ёддошт оид ба Манбаъ ва Усул

Унвони аслӣ: Sinomenine Regulates PSMB9 to Mediate Therapeutic Effects in Rheumatoid Arthritis

Муаллифон: Cui Zhang; Chonkit Lio; Nana Li; Yang Yu; Jinfang Luo.

Тартиби муаллифон: Тартиби манбаъ айнан нигоҳ дошта шудааст.

Саҳми баробар: Cui Zhang ва Chonkit Lio муаллифони дорои саҳми баробар мебошанд.

Муаллифони масъул: Chonkit Lio ва Jinfang Luo.

Муассиса 1: Department of Basic Medicine, Department of Pharmacy, Key Laboratory on the Property & Effect of Chinese Medicine (Ethnic Medicine), Guizhou Genuine Herbs Center of Consistency of Utility, Guizhou Key Laboratory of Miao Medicine, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China.

Муассиса 2: Faculty of Chinese Medicine, Macau University of Science and Technology, Avenida Wailong, Taipa, Macao, China.

Муассиса 3: State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine, Macau University of Science and Technology, Avenida Wailong, Taipa, Macao, China.

Суроғаи ҷории Chonkit Lio, ки дар манбаъ дода шудааст: Department of Medical Biochemistry, Tohoku University Graduate School of Medicine, Sendai, Japan.

Маҷалла: Cells.

Ношир: MDPI, Basel, Switzerland.

Ҷилд / шумора / рақами мақола: 15 / 11 / 1005.

DOI: 10.3390/cells15111005.

Пайванди расмии DOI: https://doi.org/10.3390/cells15111005

Санаи қабул барои баррасӣ: 1 апрели 2026.

Санаи бознигарӣ: 4 майи 2026.

Санаи қабул: 26 майи 2026.

Санаи нашр: 29 майи 2026.

Навъи манбаъ: Article — мақолаи аслии таҳқиқотӣ, ки таҳлили ҳамгирои транскриптомӣ/биоинформатикӣ, docking молекулавӣ ва таҷрибаҳои ҳуҷайравии in vitro-ро муттаҳид мекунад.

Ҳолати рецензия: Мақолаи нашршудаи рецензияшудаи маҷалла мебошад.

Литсензия: Creative Commons Attribution — CC BY.

Манбаъҳои асосии додаҳо: GEO GSE276772, GSE285977, GSE55457 ва GSE77298; барои таҳлили дубораи single-cell GSE109449.

Ҳадди экспрессияи дифференсиалӣ: p < 0.05 ва |log2FC| > 0.5.

Коркарди микроarray: affy v1.80.0 + RMA; limma v3.58.1.

Таҳлили RNA-seq: DESeq2 v1.42.1.

Коркарди қиматҳои гумшуда: impute v1.76.0.

GO/KEGG: clusterProfiler v4.11.0; org.Hs.eg.db ва org.Mm.eg.db.

GSEA: clusterProfiler; маҷмӯаҳои генҳои MSigDB бо msigdbr v25.1.1; ҳадди ақали маҷмӯа 10, ҳадди аксар 500.

Инфилтратсияи иммунӣ: xCell v1.1.0; Wilcoxon rank-sum тести.

WGCNA: WGCNA v1.73; signed network; soft-thresholding power β = 7; TOM ва dynamicTreeCut; арзёбии модул–trait бо коррелятсияи Pearson, p < 0.05.

PPI: STRING; minimum interaction confidence score = 0.95.

Додаҳои single-cell: GSE109449; 396 ҳуҷайраи synovial fibroblast аз чор донор — OA4, OA5, RA8 ва RA9.

Нормализатсияи single-cell: CPM ва log2(CPM + 1).

Фаъолияти роҳҳо: GSVA v1.50.5; маҷмӯаҳои генҳои Hallmark.

Коррелятсия: Коррелятсияи Spearman байни экспрессияи PSMB9 ва фаъолияти роҳҳои иммунӣ.

Docking молекулавӣ: CB-DOCK2; PSMB9 PDB ID 6avo; сохтори SIN аз PubChem; пози дорои пасттарин холи Vina интихоб шуд.

Ёддошти техникии дохили манбаъ: Гарчанде гуфта мешавад, ки сохтори кристаллии PSMB9 аз PDB гирифта шудааст, дар матни усул навишта шудааст, ки сохтор дар “PDF format” нигоҳ дошта шудааст. Verianla ин ибораро бо фарзияи берун аз манбаъ ислоҳ накардааст.

Натиҷаи docking: Холи Vina-и PSMB9–SIN −9,0 kcal/mol.

Хатти ҳуҷайравӣ: Ҳуҷайраҳои макрофаги муши RAW264.7.

Культураи ҳуҷайра: DMEM + %10 fetal bovine serum; 37 °C; %5 CO₂.

Покии синоменин: >%99.

Вояҳои CCK-8: 150, 300, 600, 1200 ва 2400 µM SIN; 18 соат.

Вояҳои SIN дар таҷрибаҳои функсионалӣ: 150–600 µM.

LPS: 1 µg/mL.

DEX: Дар таҷрибаи Western blot 1 µM.

ELISA: IL-6 ва TNF-α; ченкунӣ дар 450 nm, background correction дар 570 nm.

Western blot: PSMB9 1:1000; β-actin 1:3000; HRP дуюмдараҷа 1:3000; квантификатсия бо ImageJ v1.53a.

CETSA: SIN 600 µM / 19 соат; 53, 63, 73, 83, 90 ва 98 °C; барои ҳар ҳарорат 3 дақиқа; дар −80 °C 10 дақиқа; се давраи freeze–thaw.

Омори ҳуҷайравӣ: GraphPad Prism 8.0.2; one-way ANOVA + Tukey post hoc; mean ± SD; p < 0.05.

Маблағгузорӣ: National Science Foundation of China (82160779, 82505133); Research Project of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine No. GuiZhong, Yi Ke Yu (2025)54; Guizhou University of Traditional Chinese Medicine Talent Innovation Team [Gui Traditional Chinese Medicine TD He Zi [2023] 002]; Guizhou University of Traditional Chinese Medicine National and Provincial Science and Technology Innovation Talent Team Cultivation Project TD NO.[2022]004; Guizhou Provincial Basic Research Program No. ZK[2024]358.

Кумитаи ахлоқ: Татбиқ намешавад.

Ризоияти огоҳона: Татбиқ намешавад.

Дастрасии додаҳо: GSE276772, GSE285977, GSE55457 ва GSE77298 дар GEO дастрасии кушода доранд; гуфта шудааст, ки додаҳои иловагии таҷрибавиро бо сабаби қоидаҳои институтсионалии идоракунӣ ва нигоҳдории додаҳо бо дархости оқилона аз муаллифи масъул гирифтан мумкин аст.

Бархӯрди манфиатҳо: Муаллифон эълом кардаанд, ки бархӯрди манфиатҳо вуҷуд надорад.

Саҳмҳои муаллифон: Cui Zhang, Chonkit Lio ва Jinfang Luo: усул, таҳлили формалӣ, тасдиқ ва лоиҳаи аввал. Nana Li ва Yang Yu: танзими додаҳо ва таҳлили формалӣ. Chonkit Lio ва Jinfang Luo: бозбинӣ, таҳрир ва захираҳо. Ҳамаи муаллифон версияи нашршударо хонда ва қабул карданд.

Маҳдудияти асосии методологӣ: Тасдиқи функсионалии SIN–PSMB9 танҳо дар макрофагҳои муши RAW264.7, ки бо LPS ангехта шудаанд, гузаронида шудааст. Дар таҳқиқот таҷрибаи in vivo ё тасдиқи нави клиникии инсон вуҷуд надорад. Таҳлили single-cell бо чор донор маҳдуд буда, иктишофӣ ҳисобида шудааст. Арзиши ташхисӣ ва терапевтии PSMB9 бояд бо когорти мустақили калонтар, ҳуҷайраҳои ибтидоии беморон ва моделҳои in vivo тасдиқ шавад.