PSMB9 (proteasome subunit beta type-9; LMP2), иммунопротеасоманын 20S өзөк бөлүкчөсүндө жайгашкан жана антигенди иштетүүгө байланышкан белок ажыроосуна катышкан каталитикалык суббирдик. Бул изилдөө ревматоиддик артритте (Rheumatoid Arthritis, RA) PSMB9дун оору менен байланышын жана табигый алкалоид болгон синомениндин (SIN) PSMB9 менен мүмкүн болгон өз ара аракеттенүүсүн; бир нече транскриптом маалымат топтомдорун, иммундук клетка инфильтрациясынын анализин, WGCNAны, жол анализдерин, single-cell RNA-seqти, молекулалык dockingти жана RAW264.7 макрофаг клетка эксперименттерин бириктирип изилдейт.

Төрт GEO ген экспрессиясы маалымат топтомунан алынган дифференциалдуу экспрессияланган гендер жана GSE55457 негизинде түзүлгөн салмакталган ген ко-экспрессия тармагы чогуу бааланганда PSMB9, TAP1 жана CFB жалпы талапкерлердин арасында аныкталган. Иммундук инфильтрация анализдери RA синовиумунда айрыкча M1 макрофагдарынын байышын көрсөткөн. Андан кийин PSMB9 белок–белок өз ара аракеттенүү тармактарында борбордук иммунопротеасома/антиген иштетүү компоненти катары изилденген.

GSE109449 single-cell RNA-seq маалымат топтомундагы төрт донордон жалпы 396 синовиалдык фибробласт клеткасын кайра талдоо RAдан алынган фибробластка окшош синовиоциттерде PSMB9 экспрессиясы OA тобуна салыштырмалуу жогорулаганын жана PSMB9 экспрессиясы interferon-α, interferon-γ, IL6/JAK–STAT3 жана allograft rejection сыяктуу сезгенүүчү Hallmark жолдору менен байланышканын көрсөткөн. Бирок бул single-cell бөлүгү болгону төрт донорго негизделгендиктен, изилдөөдө чалгындоочу мүнөздө деп эсептелет.

Синоменин менен PSMB9 ортосунда жүргүзүлгөн молекулалык docking анализинде Vina упайы −9,0 kcal/mol аныкталган. Cellular Thermal Shift Assay (CETSA) синоменин бар кезде PSMB9дун термалык жүрүм-турумунда алсыз турукташтыруучу таасир көрсөткөн жана мүмкүн болгон бута өз ара аракеттенүүсүн колдогон. LPS менен сезгенүү чакырылган RAW264.7 макрофагдарында 150–600 µM синоменин IL-6 жана TNF-α деңгээлдеринин дозага көз каранды төмөндөшү жана PSMB9 белок экспрессиясынын азайышы менен байланышкан.

Бул натыйжалар синомениндин сезгенүүгө каршы таасирлеринин жок дегенде бир бөлүгү PSMB9ду жөнгө салуу менен байланыштуу болушу мүмкүн экенин көрсөтөт. Бирок изилдөө муну так жана жалгыз механизм катары далилдебейт. Функционалдык эксперименттер чычкандан алынган RAW264.7 клетка линиясында гана жүргүзүлгөн, жаныбар модели же RA бейтаптарында түздөн-түз дарылоо эксперименти жүргүзүлгөн эмес. Ошондуктан PSMB9 бул изилдөөдө талапкер биомаркер жана талапкер терапиялык бута болуп саналат; клиникада тастыкталган диагностикалык тест же дарылоо бутасы эмес.

Ревматоиддик артритте изилденген негизги көйгөй эмне?

Ревматоиддик артрит өнөкөт синовиалдык сезгенүү жана прогрессивдүү муун бузулуусу менен мүнөздөлгөн системалык иммундук байланыштагы оору. Оорунун патологиясында айланып жүргөн иммундук клеткалар гана эмес, синовиалдык ткандын резиденттик стромалык клеткалары да сезгенүү чөйрөсүнүн сакталышына салым кошушу мүмкүн.

Изилдөөнүн суроосу бири-бири менен байланышкан эки бөлүккө бөлүнөт. Биринчиси — ар түрдүү адам транскриптом маалымат топтомдорунда RA менен кайра-кайра байланыштуу көрүнгөн борбордук иммундук генди аныктоого болобу. Экинчиси — синомениндин сезгенүүгө каршы таасирин ушул ген жана анын белок продуктусу аркылуу жарым-жартылай түшүндүрүүгө болобу.

Синоменин деген эмне?

Синоменин, Sinomenium acutum өсүмдүгүнөн алынган мономердик алкалоид. Булактын кириш бөлүмүндө мурунку изилдөөлөр жана клиникалык изилдөөлөрдүн негизинде синоменин сезгенүүгө каршы, иммуномодуляциялоочу, анальгетикалык жана сөөктү коргоочу таасирлер менен байланыштырылганы айтылат.

Бирок бул макаланын өз эксперименттери синомениндин клиникалык RA натыйжалуулугун кайра текшербейт. Бул изилдөө тар суроого — синоменин менен PSMB9 ортосунда мүмкүн болгон молекулалык жана клеткалык байланыш бар-жогуна — багытталган.

PSMB9 Ревматоиддик Артрит Үчүн Эмне Үчүн Маанилүү?

PSMB9 же LMP2 иммунопротеасоманын каталитикалык бета суббирдиктеринин бири; клетка ичиндеги белоктордун пептиддерге ажырашына жана бул пептиддердин TAP1 аркылуу эндоплазмалык ретикулумга ташылып, MHC I классындагы антигенди көрсөтүүгө даярдалышына салым кошот. PSMB9 экспрессиясынын interferon-γ тарабынан жогорулатылышы мүмкүн болушу белоктун иммундук активдешүү менен түз байланышкан биологиялык контекстин бекемдейт.

Протеасома — клеткадагы керексиз же бузулган белоктордун көзөмөлдөнгөн ажырашын камсыз кылган чоң белок комплекси. Иммунопротеасома, өзгөчө сезгенүүчү жана интерферон менен стимулданган шарттарда айрым каталитикалык суббирдиктер стандарттык протеасома суббирдиктеринин ордун баскан атайын протеасома формасы. PSMB9 ушул атайын каталитикалык суббирдиктердин бири.

Демек, PSMB9 жөн гана “гендин аталышы” эмес. Ген экспрессиясындагы өзгөрүү антигенди иштетүү жана сезгенүү сигналдык чөйрөсү менен байланышкан чоңураак иммунологиялык системанын бөлүгү. Бирок тармак анализинде борбордук көрүнүшү өзүнөн-өзү ооруну башкарат же аны ингибирлөө дарылоону камсыз кылат дегенди билдирбейт; ошондуктан изилдөө кийинки этаптарда ар түрдүү анализ катмарлары жана клеткалык эксперименттер аркылуу PSMB9ду көзөмөлдөгөн.

Төрт GEO маалымат топтому эмне үчүн түздөн-түз бириктирилген эмес?

Изилдөөдө GSE276772, GSE285977, GSE55457 жана GSE77298 болгон төрт GEO ген экспрессиясы маалымат топтому колдонулган. GSE55457 жана GSE77298 RA бейтаптарынын жана дени сак контролдордун синовиалдык ткань үлгүлөрүн камтыса, GSE276772 жана GSE285977 ген perturbation же цитокин стимулдаштыруу түрүндөгү маалымат топтомдору катары колдонулган.

Маалымат топтомдорунун платформалары бирдей болбогондуктан, изилдөөчүлөр экспрессия матрицаларын бир чоң матрицага бириктирген эмес. Анын ордуна ар бир маалымат топтому өзүнчө иштелип, дифференциалдык экспрессия натыйжалары ген деңгээлинде салыштырылган. Муну менен ар башка микроarray жана RNA-seq платформалары жаратышы мүмкүн болгон платформалар аралык batch эффектинин жалпы матрицага түз өтүшүнө жол бербөөгө аракет кылынган.

Микроarray маалыматтары кантип иштелген?

Микроarray CEL файлдары R чөйрөсүндө affy v1.80.0 пакети менен импорттолуп, Robust Multi-Array Average (RMA) аркылуу иштелген. RMA процесси үч негизги этапты камтыйт:

• фонду оңдоо,
• quantile normalization,
• probe-set summarization.

Натыйжада log2 масштабындагы ген экспрессия маанилери алынган, проб топтомдору платформага мүнөздүү annotation пакеттери аркылуу ген символдоруна жана Entrez IDлерине дал келтирилген. Жетишпеген маанилер impute v1.76.0 пакети менен иштелген.

RNA-seq маалыматтары кантип иштелген?

RNA-seq маалыматы DESeq2 v1.42.1 менен стандарттык иш агымын колдонуп талданган. Микроarray маалымат топтомдорунда дифференциалдык экспрессия үчүн limma v3.58.1, ал эми RNA-seq маалымат топтомунда DESeq2 колдонулган.

Булактагы дифференциалдуу экспрессияланган гендин (Differentially Expressed Gene, DEG) аныктамасы:

\[ p < 0.05 \quad \text{ve} \quad |\log_2 FC| > 0.5 \]

шарттарына негизделет.

\(\log_2 FC\), эки топтун ортосундагы экспрессия өзгөрүүсүнүн log2 негизиндеги fold change көрсөткүчү. Оң мааниси жогору, терс мааниси төмөн экспрессия багытын көрсөтөт. Абсолюттук маанинин 0,5тен чоң болушу өзгөрүүнүн белгилүү өлчөмдөн ашышын талап кылат, ал эми \(p<0.05\) булакта колдонулган статистикалык тандоо чеги.

Бул жерде маанилүү деталь бар: булак DEG тандоодо түздөн-түз \(p<0.05\) деп жазат. Verianla муну оңдолгон p-мааниси же FDR чеги катары өзгөртпөйт.

Төрт маалымат топтомунда канча DEG табылган?

Бул сандардын бири-биринен абдан айырмаланышы өзүнөн-өзү биологиялык таасир бир маалымат топтомунда “күчтүүрөөк” дегенди билдирбейт. Маалымат топтомдорунун түрлөрү, платформалары, эксперимент шарттары жана үлгү түзүлүштөрү ар башка. Изилдөөнүн стратегиясы абсолюттук DEG сандарын салыштыруудан көрө ар түрдүү анализдерде кайталанган биологиялык сигналдарды аныктоого багытталган.

GO жана KEGG анализи эмнени изилдейт?

Бир DEG тизмесинде жүздөгөн же миңдеген гендер болушу мүмкүн. Gene Ontology (GO) жана Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment анализи бул ген тизмесиндеги белгилүү биологиялык функциялар же жолдор күтүлгөндөн көбүрөөк көрсөтүлгөнбү, ошону изилдейт.

Изилдөөдө clusterProfiler v4.11.0 колдонулган. Адам гендери үчүн org.Hs.eg.db, чычкан гендери үчүн org.Mm.eg.db annotation булактары колдонулуп, гендер Entrez IDлерине айландырылган.

GO анализинде үч класс бааланган:

• BP — Biological Process: гендер катышкан биологиялык процесстер,
• CC — Cellular Component: продуктылар жайгашкан клеткалык түзүлүштөр,
• MF — Molecular Function: молекулалык деңгээлдеги функциялар.

GO үчүн булак adjusted p-value < 0.05, KEGG үчүн болсо p < 0.05 чегин берет.

DEG негизиндеги enrichment жыйынтыктарында иммунитет жана сезгенүүгө байланыштуу процесстер айырмаланып; макрофаг активдешүүсүн жөнгө салуу, сезгенүү жооп, сөөк резорбциясы жана IL-15 аркылуу сигнал берүү сыяктуу темалар алдыга чыккан.

GSEA эмне үчүн DEG анализине кошумча колдонулган?

DEG ыкмасы алдын ала белгиленген статистикалык чектен өткөн гендерди гана колдонот. Ал эми Gene Set Enrichment Analysis (GSEA), толук иреттелген ген тизмесиндеги кичине, бирок координацияланган өзгөрүүлөрдү да баалай алат.

Ошондуктан изилдөө “маанилүү DEG” тизмесинен көрүнбөй калышы мүмкүн болгон кеңири транскриптомдук программаларды изилдөө үчүн GSEA колдонгон.

Гендер \(\log_2 FC\) боюнча иреттелип, MSigDB ген топтомдору msigdbr v25.1.1 менен алынган жана ген топтому өлчөмү үчүн:

\[ 10 \leq \text{gen setindeki gen sayısı} \leq 500 \]

аралыгы колдонулган.

GSEA-KEGG жыйынтыктарында JAK–STAT жана Toll-like receptor жолдору, GSEA-GO жыйынтыктарында болсо интерферон жооптору жана NF-κB сигнал программалары айырмаланган. Бул натыйжалар RAдагы тубаса иммунитет жана сезгенүүчү транскрипция программалары координацияланган түрдө өзгөрөт деген түшүндүрмөнү колдогон.

xCell иммундук инфильтрация анализи эмнени өлчөйт?

xCell, bulk ген экспрессия профилдеринен ар кандай иммундук жана стромалык клетка түрлөрүнө тиешелүү салыштырмалуу enrichment упайларын баалоочу эсептөө ыкмасы. Бул жердеги “инфильтрация” микроскоп астында түз клетка саноо эмес; экспрессия кол тамгаларынан алынган салыштырмалуу enrichment баалоосу.

Изилдөөдө xCell v1.1.0, R v4.3.2 ичинде GSE55457 жана GSE77298 маалымат топтомдоруна колдонулган. Экспрессия матрицалары нормалдаштырылып, log2 өзгөртүүсү жасалган.

RA менен контролдун ортосундагы xCell enrichment упайлары Wilcoxon rank-sum тести менен салыштырылган.

Эки синовиалдык маалымат топтомунда тең иммундук клеткалардын жогорулаган enrichment үлгүсү байкалган, айрыкча M1 макрофагдары эң айкын өсүш көрсөткөн клетка түрлөрүнүн бири болгон. GSE77298де plasma cells жана CD8+ T cells да өскөн.

Бул натыйжа “RA тканында микроскоп менен так ушунча M1 макрофаг бар” дегенди билдирбейт. xCell жыйынтыктары транскриптом маалыматынан алынган салыштырмалуу клеткалык enrichment көрсөткүчтөрү.

WGCNA PSMB9ду Тандоого Кантип Салым Кошту?

Салмакталган ген ко-экспрессия тармагынын анализи (Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA) өзүнчө гендердин дифференциалдык экспрессиясын гана кароонун ордуна бирге өзгөргөн ген топторун модулдар катары аныктайт жана бул модулдардын оору өзгөчөлүгү менен байланышын изилдейт. Бул изилдөөдө WGCNA GSE55457 синовиалдык транскриптомунда RA менен байланышкан ко-экспрессия модулдарын табуу үчүн колдонулган.

WGCNA анализинде өтө төмөн экспрессияланган гендерден башка толук ген экспрессия матрицасы колдонулуп, signed co-expression network түзүлгөн.

Булакта тандалган soft-thresholding power:

\[ \beta = 7 \]

деп билдирилген.

Soft-thresholding power гендер арасындагы корреляциялар тармак байланыш салмактарына кандай айланарын аныктаган параметр. Изилдөөдө scale-free topology критерийине жооп берген эң төмөнкү ылайыктуу күч тандалган.

Андан кийин topological overlap matrix (TOM) эсептелип, TOM негизиндеги аралык боюнча hierarchical clustering жүргүзүлүп, модул чектери dynamicTreeCut алгоритми менен оңдолгон.

Модул–RA байланыштары Pearson корреляциясы менен изилденип, p < 0.05 маанилүүлүк критерийи колдонулган. Lightcyan, black жана lightgreen кошулган жети модул RA менен күчтүү оң, төрт модул терс байланыш көрсөткөн.

Бул модулдардагы гендердин enrichment анализи иммундук жооп, сезгенүү жана цитокин өндүрүшү менен байланышкан жолдор RAга байланышкан тармак модулдарында топтолгонун көрсөткөн.

PSMB9 кантип талапкер борбордук генге айланды?

Төрт көз карандысыз маалымат топтомундагы DEG жыйынтыктары менен RAга байланышкан WGCNA модулундагы гендердин кесилиши текшерилгенде PSMB9, TAP1 жана CFB жалпы талапкер гендердин арасынан табылган.

Андан кийин STRINGде белок–белок өз ара аракеттенүү (Protein–Protein Interaction, PPI) тармагы түзүлгөн. Булак minimum interaction confidence score маанисин:

\[ 0.95 \]

деп белгилеген. Бул жогорку ишеним упайы бар STRING байланыштарын гана тармакка кошууну көздөйт.

PSMB9 жалгыз seed катары колдонулганда протеасома жана антиген иштетүү компоненттери жагынан тыгыз өз ара аракеттенүү тармагы пайда болгон. PSMB9, TAP1 жана CFB бирге seed катары колдонулганда кеңири жана бири-бири менен байланышкан иммундук тармак алынган.

Single-cell RNA-seq анализи эмне үчүн өзүнчө жүргүзүлгөн?

Bulk транскриптом бүт ткандан келген орточо экспрессияны көрсөтөт. Бирок синовиум фибробласттар жана ар кандай иммундук клеткаларды кошкондо көп түрдүү клетка түрлөрүн камтыйт. Single-cell RNA-seq анализи ген экспрессиясы кайсы клеткалык кичи топтордо көрүнөрүн кененирээк изилдөөгө жардам берет.

Изилдөөдө GSE109449 колдонулган. Булакка ылайык төрт донордон:

• OA4,
• OA5,
• RA8,
• RA9

болуп жалпы 396 синовиалдык фибробласт клеткасы талданган.

OA остеоартритти, RA болсо ревматоиддик артритти билдирет. Бул бөлүм айрыкча фибробластка окшош синовиоциттерди (Fibroblast-Like Synoviocytes, FLS) баалайт.

CPM нормалдаштыруу кантип эсептелген?

Ар бир клетка үчүн китепкана көлөмү эсептелип, экспрессия маанилери counts-per-million (CPM) ыкмасы менен нормалдаштырылган:

\[ CPM_{ij} = \frac{x_{ij}} {\sum_j x_{ij}} \times 10^6 \]

Бул жерде:

• \(x_{ij}\), тиешелүү гендин тиешелүү клеткадагы чийки санын,
• \(\sum_j x_{ij}\), нормалдаштыруу үчүн колдонулган клетка китепканасындагы жалпы санды,
• \(10^6\), маанини миллионго карата саноо масштабына айлантуучу коэффициентти

билдирет.

Булак формуланын индекс белгилөөсүн ушул түрдө берет; Verianla индекстерди үнсүз кайра аныктабайт.

Log өзгөртүүсү эмне үчүн жасалган?

Нормалдаштырылган CPM маанилери андан кийин:

\[ \log_2(CPM+1) \]

түрүнө өзгөртүлгөн.

Бул жердеги +1 мүчөсү CPM мааниси нөл болгондо логарифмдин аныкталбай калышына жол бербейт. Log өзгөртүүсү жогорку саноо маанилеринин масштабдагы үстөмдүгүн азайтып, экспрессия бөлүштүрүлүшүн башкарууга жеңилирээк кылат.

GSVA эмнени өлчөйт?

Gene Set Variation Analysis (GSVA), өзүнчө гендердин экспрессиясынын ордуна алдын ала аныкталган ген топтомдорунун үлгү же клеткалык профилдеги салыштырмалуу активдүүлүгүн баалаган ыкма.

Hallmark ген топтомдору msigdbr v25.1.1 менен алынып, GSVA упайлары GSVA v1.50.5 менен эсептелген.

RA FLS профилдери interferon-α response, interferon-γ response, allograft rejection жана IL6/JAK–STAT3 signaling кошулган ар кандай сезгенүүчү/иммундук Hallmark жолдорунда OA профилдерине караганда жогору активдүүлүк көрсөткөн.

PSMB9 экспрессиясы менен бул жолдордун GSVA упайларынын ортосунда Spearman корреляциясы эсептелген.

Булак корреляция бөлүмүн төрт донор боюнча сүрөттөйт жана изилдөөнүн талкуу бөлүгүндө бул single-cell анализи донорлордун саны чектелүү болгондуктан чалгындоочу экенин өзгөчө белгилейт. Ошондуктан бул корреляциялар калкка күчтүү жалпылоо катары чечмеленбеши керек.

Молекулалык docking эмнени текшерет?

Молекулалык docking кичинекей молекуланын бута белоктун үч өлчөмдүү түзүлүшүндөгү мүмкүн болгон байланыш позаларын жана эсептөөчү шайкештик упайларын изилдейт. Docking физикалык байланыштын лабораториядагы түз өлчөөсү эмес.

PSMB9 кристалл түзүлүшү PDB маалымат базасынан PDB ID: 6avo менен алынып, синомениндин үч өлчөмдүү түзүлүшү PubChemден SDF форматында жүктөлүп жана түзүлүшкө негизделген docking CB-DOCK2 платформасы менен жүргүзүлгөн.

Булак PSMB9 түзүлүш файлы “PDF форматында” сакталганын жазат. Бул адаттан тыш билдирүү Verianla тарабынан булактан тыш божомол менен өзгөртүлгөн эмес.

Эң төмөн Vina упайына ээ docking позасы оптималдуу поза катары тандалган.

Булак колдонгон docking түшүндүрмө чектери:

PSMB9–SIN үчүн эсептелген:

\[ \text{Vina score}=-9.0\ \text{kcal/mol} \]

мааниси булактын өз классификациясына ылайык күчтүү эсептөөчү байланыш тенденциясына шайкеш.

Бирок docking упайы өзүнөн-өзү синоменин клетканын ичинде PSMB9га так физикалык түрдө байланышканын далилдебейт. Ошондуктан изилдөө docking жыйынтыгын CETSA менен клеткалык деңгээлде уланткан.

CETSA Синомениндин PSMB9га Түз Байланганын Так Далилдейби?

Жок. Бул изилдөөдө CETSA синоменин бар кезде PSMB9дун термалык туруктуулугундагы алсыз өзгөрүүгө байланыштуу мүмкүн болгон бута өз ара аракеттенүүсүн колдойт; бирок авторлордун талкуу бөлүгүндөгү этият түшүндүрмөсүнө ылайык SIN–PSMB9 байланышы так жана жалгыз механизм катары эмес, потенциалдуу механизм катары бааланышы керек.

CETSAнын негизги логикасы

Cellular Thermal Shift Assay (CETSA) белок ар кандай температураларда канчалык эригич/туруктуу бойдон каларын баалайт. Лиганд белокко байланышканда айрым учурларда белоктун термалык туруктуулугу өзгөрүшү мүмкүн.

Ошондуктан лиганд колдонулган жана контролдук клеткалар ар кандай температураларга дуушар кылынат; андан кийин эригич бойдон калган бута белок Western blot сыяктуу ыкмалар менен өлчөнөт.

Бул изилдөөдө RAW264.7 клеткалары:

• DMSO vehicle контролу же 600 µM синоменин менен 19 саат иштетилген,
• 53, 63, 73, 83, 90 жана 98 °C температураларда 3 мүнөт кармалган,
• дароо −80 °Cде 10 мүнөт тоңдурулган,
• freeze–thaw процесси үч жолу кайталанган,
• RIPA буферинде муз үстүндө 30 мүнөт лизис кылынган,
• 12.000 rpmде, 4 °Cде 20 мүнөт центрифугаланган,
• андан кийин PSMB9 Western blot менен талданган.

Булактагы Figure 9B маалыматы температура жогорулаган сайын PSMB9 тилкеси алсырай турганын, бирок синоменин тобунда алсыз турукташтыруучу таасир бар экенин көрсөтөт.

Ошондуктан Verianla жыйынтыкты “CETSA так түз байланыш далилденди” деп көбүртпөйт. Docking + CETSA бирге мүмкүн болгон target engagement үчүн колдоо берет.

RAW264.7 клетка модели деген эмне?

RAW264.7 — чычкандан алынган макрофагга окшош клетка линиясы. Бул изилдөө клеткалардын сезгенүү жоопторун LPS менен стимулдап, синоменин менен PSMB9 ортосундагы байланышты механисттик деңгээлде баалаган.

Клеткалар %10 fetal bovine serum камтыган толук DMEM чөйрөсүндө, 37 °C жана %5 CO₂ шарттарында өстүрүлгөн.

Бул модель адамдын RA синовиумунун көп клеткалуу, өнөкөт жана аутоиммундук микрочөйрөсүнүн баарын чагылдырбайт.

CCK-8 клетканын тирүүлүк тести

Клетканын тирүүлүгүндө синоменин үчүн:

150, 300, 600, 1200 жана 2400 µM

концентрациялары сыналган.

96-well пластинкаларда клетка тыгыздыгы 1,8 × 10⁵/mL, көлөм 100 µL/well болуп коюлуп, синоменин колдонуу 18 саатка созулган.

Андан соң ар бир уячага 10 µL CCK-8 эритмеси кошулуп, 37 °Cде 45 мүнөт–1 саат инкубацияланган. Абсорбанс 450 nmде өлчөнгөн.

Булак клетканын тирүүлүгүн:

\[ \text{Göreli canlılık (\%)} = \frac{ OD_{treatment}-OD_{blank} }{ OD_{control}-OD_{blank} } \times100 \]

формуласы менен эсептеген.

Бул жерде:

• \(OD_{treatment}\): синоменин колдонулган уячанын оптикалык тыгыздыгы,
• \(OD_{blank}\): клеткасыз же ылайыктуу blank уячанын фон мааниси,
• \(OD_{control}\): контролдук топтун оптикалык тыгыздыгы.

Blank маанисин алып салуу өлчөө системасынын фон абсорбансын азайтат. Контролдук топко бөлүү контролду болжол менен %100 тирүүлүк маалымдама маанисине айлантат.

Булакта 600 µMден жогору синоменин концентрацияларында цитотоксикалык таасир пайда болушу мүмкүн экени айтылып, ошондуктан кийинки функционалдык эксперименттерде 150–600 µM аралыгы тандалган.

LPS модели жана ELISA эксперименттери

IL-6 жана TNF-α өлчөө үчүн RAW264.7 клеткалары 3 × 10⁵ клетка/mL тыгыздыкта 6-well пластинкаларга себилип, түнү бою 37 °Cде кармалган.

Клеткалар адегенде 1 саат синоменин же dexamethasone (DEX) менен алдын ала иштетилип, андан кийин:

\[ LPS = 1\ \mu g/mL \]

концентрациясы менен 18 саат стимулданган.

LPS макрофагдарда күчтүү сезгенүү жооп жаратуу үчүн колдонулган липополисахарид. Бул модель RAнын баарын эмес, макрофаг сезгенүүсүнүн эксперименталдык бөлүгүн туурайт.

Клетка супернатанты 1200 rpmде 10 мүнөт центрифугаланып; IL-6 жана TNF-α ELISA менен өлчөнүп, абсорбанс 450 nmде окулган жана 570 nm фон оңдоосу колдонулган.

Натыйжалар синоменин IL-6 жана TNF-α концентрацияларын дозага көз каранды түрдө азайтканын көрсөткөн. Dexamethasone тобунда да окшош сезгенүүгө каршы багыт байкалган.

Western blot эксперименти

PSMB9 белок экспрессиясы Western blot менен изилденген. Синоменин үчүн 150, 300 жана 600 µM деңгээлдери колдонулуп, DEX тобу 1 µM болуп коюлган.

Бир сааттык алдын ала иштетүүдөн кийин LPS акыркы концентрациясы 1 µg/mL боло тургандай кошулуп, клеткалар дагы 18 саат өстүрүлгөн.

Белоктор 10% SDS-PAGEде бөлүнүп, PVDF мембранага өткөрүлгөн.

Антитело суюлтуулары:

Биринчилик антитело инкубациясы 4 °Cде түнү бою, экинчилик антитело инкубациясы бөлмө температурасында 1 саат жүргүзүлгөн.

Тилкелер chemiluminescence сүрөттөө системасы менен сүрөттөлүп, боз деңгээлдин квантификациясы ImageJ v1.53a менен жүргүзүлгөн.

Булактагы Figure 9F–G жыйынтыктары синоменин PSMB9 белок экспрессиясын дозага көз каранды түрдө азайтканын көрсөтөт.

Эксперименттерде колдонулган маанилүү жабдуулар жана материалдар

Клеткалык эксперименттердин статистикалык анализи

Статистика жана маалыматтарды визуалдаштыруу GraphPad Prism 8.0.2 менен жүргүзүлгөн.

Бир нече топту салыштыруу үчүн one-way ANOVA жана андан кийин Tukey post hoc тести колдонулган.

Натыйжалар:

\[ \text{ortalama} \pm \text{standart sapma} \]

түрүндө көрсөтүлүп жана:

\[ p<0.05 \]

статистикалык маанилүүлүк чеги катары кабыл алынган.

Figure 9 түшүндүрмөсүндө нормалдуу топко каршы ### p<0.001; моделдик топко каршы болсо *** p<0.001, ** p<0.01 жана * p<0.05 белгилери колдонулган.

Булак графиктердин бардык мамыча бийиктиктерин сандык таблица катары бербегендиктен Verianla сүрөттөн болжолдуу окууга мүмкүн болгон IL-6, TNF-α же PSMB9 катыштарын так чийки сан катары чыгарбайт.

Изилдөөнүн Ыкмасы жана Жыйынтыктары

Изилдөө дизайнынын далил катмарлары

Биринчи негизги табылга: иммунитет жана сезгенүү жолдору RA менен күчтүү байланышкан

Төрт маалымат топтомундагы DEG үлгүлөрү ар башка болгонуна карабастан enrichment анализдери иммундук жана сезгенүү процесстеринде жалпылыкты көрсөткөн. GSEA DEG чеги менен көрүнбөй калышы мүмкүн болгон кеңири жол өзгөрүүлөрүн да аныктап, JAK–STAT, Toll-like receptor, интерферон жооптору жана NF-κB программалары менен байланыш көрсөткөн.

Экинчи негизги табылга: M1 макрофаг сигналы алдыга чыкты

GSE55457 жана GSE77298 xCell анализдеринде RA синовиумунда көптөгөн иммундук клеткалар үчүн жогорулаган enrichment байкалган. M1 макрофагдары эки анализде тең эң айкын өсүш көрсөткөн клеткалык кол тамгалардын бири болуп, кийинки механисттик анализдердин негизги контексттеринин бирин түзгөн.

Үчүнчү негизги табылга: PSMB9 бир нече тандоо катмарынан өттү

PSMB9 бир гана volcano plotтон тандалган эмес. DEG кесилиши, WGCNA модулу жана PPI анализи чогуу бааланып; PSMB9, TAP1 жана CFB кайталанган талапкер гендер катары аныкталган.

PSMB9дун өзгөчө иммунопротеасома жана антиген иштетүү компоненттери менен тыгыз байланышы белокту изилдөөнүн борбордук талапкерлеринин бири катары көзөмөлдөөгө алып келген.

Төртүнчү негизги табылга: PSMB9 иммундук клеткалар менен гана чектелген сигнал эмес

Single-cell кайра анализинде RAдан алынган фибробластка окшош синовиоциттерде PSMB9 экспрессиясы OAдан алынган FLSтерге караганда жогору.

Ошол эле профилдерде interferon-α, interferon-γ, allograft rejection жана IL6/JAK–STAT3 сыяктуу иммундук/сезгенүүчү Hallmark жолдорунун активдүүлүгү да RA тобунда жогорулаган.

Бул табылга RA синовиумундагы сезгенүү чөйрөсү инфильтрация кылган иммундук клеткалардан гана турбастан, резиденттик стромалык фибробласттар да сезгенүү программаларын көрсөтө аларын колдойт.

Бирок бул бөлүм төрт донорго гана негизделгендиктен, чоң популяция боюнча жыйынтык чыгарбоо керек.

Бешинчи негизги табылга: синоменин–PSMB9 docking упайы −9,0 kcal/mol болгон

CB-DOCK2 анализи PSMB9 менен синоменин ортосунда −9,0 kcal/mol Vina упайын берген docking позасын түзгөн. Бул маани булактын өз docking баалоо чектерине ылайык күчтүү байланыш тенденциясына шайкеш.

Бирок docking — симуляция/баалоо. Молекула тирүү клеткада чындап тиешелүү белокко байланышаар-байланышпасын аныктоо үчүн кошумча эксперименталдык далил керек.

Алтынчы негизги табылга: CETSA мүмкүн болгон target engagementды колдоду

CETSAда синоменин PSMB9дун температура менен эригичтигин толук өзгөрткөн драмалык турукташуу көрсөткөн эмес; булак муну алсыз/modest турукташтыруучу таасир деп түшүндүргөн.

Демек, CETSA табылгасы docking менен бир багытта мүмкүн болгон өз ара аракеттенүүнү колдойт, бирок SIN–PSMB9 байланышынын так биофизикалык мүнөздөмөсүн алмаштырбайт.

Жетинчи негизги табылга: 150–600 µM синоменин сезгенүү жоопту азайтты

CCK-8 тести 600 µMден жогору концентрацияларда цитотоксикалуулук ыктымалдыгы көбөйөрүн көрсөткөндүктөн, функционалдык эксперименттерде 150–600 µM аралыгы колдонулган.

LPS менен стимулданган RAW264.7 макрофагдарында синоменин колдонуу IL-6 жана TNF-α деңгээлдерин дозага көз каранды түрдө төмөндөттү.

Western blot жыйынтыктары да синоменин концентрациясы көбөйгөн сайын PSMB9 белок экспрессиясы азайганын көрсөткөн.

Dexamethasone контролу да PSMB9 экспрессиясына жана сезгенүү цитокиндерине ингибирлөө багытында таасир көрсөткөн.

Синоменин PSMB9га байланып, андан кийин эмне үчүн анын экспрессиясын азайтышы мүмкүн?

Бул изилдөө бул суроонун бардык молекулалык аралык этаптарын аныктабайт. Docking жана CETSA мүмкүн болгон физикалык target engagement багытында далил бергенде, Western blot дарылоодон кийин PSMB9 белок деңгээли азайганын көрсөтөт. Бирок лиганд байланышы PSMB9 белок экспрессиясын кайсы транскрипциялык, трансляциялык же белок ажыроо механизми аркылуу азайтары булакта түз чечилген эмес.

Ошондуктан Verianla “синоменин PSMB9га байланышканы үчүн белок автоматтык түрдө ажырайт” сыяктуу булактан тыш механизм кошпойт.

Изилдөө колдогон жыйынтыктар

• PSMB9 бул изилдөөдө колдонулган көп транскриптомдук жана тармактык анализдерде RA менен байланышкан талапкер борбордук гендердин бири катары аныкталган.
• RA синовиалдык ткань экспрессия профилдеринде иммунитет жана сезгенүү жолдору күчтүү түрдө алдыга чыккан.
• xCell анализи айрыкча M1 макрофаг кол тамгасы RA үлгүлөрүндө байыганын көрсөткөн.
• RA FLSтеринде PSMB9 экспрессиясы OA FLSтерине караганда жогору табылган.
• PSMB9 экспрессиясы интерферон жана цитокинге байланышкан жол активдүүлүгү менен оң байланыш көрсөткөн.
• PSMB9–синоменин docking упайы −9,0 kcal/mol деп эсептелген.
• CETSA синомениндин PSMB9 үстүндөгү алсыз термалык турукташтыруучу таасирине шайкеш жыйынтык берген.
• 150–600 µM синоменин LPS менен стимулданган RAW264.7 клеткаларында IL-6 жана TNF-α деңгээлдеринин дозага көз каранды төмөндөшү менен байланышкан.
• Синоменин PSMB9 белок экспрессиясын дозага көз каранды түрдө азайткан.

Изилдөө колдобогон жыйынтыктар

PSMB9 азыр клиникада тастыкталган RA диагностикалык биомаркери экени бул изилдөө менен далилденген эмес. Изилдөө PSMB9ду талапкер биомаркер катары көрсөтөт жана авторлор чоңураак көз карандысыз когорттордо тастыктоо керектигин белгилешет.

Синоменин адам RA бейтаптарында PSMB9ду азайтып клиникалык жакшырууга алып келери бул изилдөөдө түз текшерилген эмес.

Docking упайы өзүнөн-өзү синомениндин PSMB9га так байланышарын далилдебейт.

CETSA табылгасы күчтүү жана толук биофизикалык байланыш мүнөздөмөсү эмес; булак муну алсыз турукташуу жана мүмкүн болгон target engagement катары талкуулайт.

PSMB9 синомениндин жалгыз сезгенүүгө каршы бутасы катары көрсөтүлгөн эмес. Авторлор синоменин Nrf2 сыяктуу башка жолдорду да камтыган бир нече механизм аркылуу таасирдүү болушу мүмкүн экенин өзгөчө белгилешет.

LPS менен стимулданган RAW264.7 макрофаг модели адам RA синовиумунун татаал өнөкөт аутоиммундук микрочөйрөсүнүн баарын чагылдырбайт.

Изилдөөдө in vivo жаныбар текшерүүсү жүргүзүлгөн эмес.

Изилдөөнүн күчтүү жактары

Изилдөөнүн күчтүү жактарынын бири PSMB9ду бир гана маалымат топтому же бир гана алгоритм менен тандабаганы. Ар түрдүү ген экспрессия маалымат топтомдору, WGCNA, PPI, иммундук инфильтрация жана single-cell анализдери бири-бирин толуктаган катмарлар катары колдонулган.

Экинчи күчтүү жак — эсептөөчү docking жыйынтыгы түздөн-түз акыркы механизм катары кабыл алынбай, клеткалык CETSA, Western blot жана цитокин өлчөөлөрү менен улантылганы.

Үчүнчү күчтүү жак — маалымат топтомдору ар башка платформалардан келгендиктен матрицалар түздөн-түз бириктирилбей, платформалар аралык batch эффектин азайтуу үчүн ген деңгээлиндеги жыйынтыктар консенсус анализинде колдонулган.

Негизги чектөөлөр

• Функционалдык эксперименттер RAW264.7 чычкан макрофаг клетка линиясында гана жүргүзүлгөн.
• Бир нече клетка линиясы же баштапкы адам RA клеткалары менен функционалдык текшерүү жүргүзүлгөн эмес.
• Жаныбар модели колдонулган эмес.
• Адамдарда синоменин–PSMB9 механизмин түздөн-түз текшерген жаңы клиникалык эксперимент жок.
• Single-cell маалыматы OA4, OA5, RA8 жана RA9 болгон төрт донордон гана турат.
• Single-cell жыйынтыктары ошондуктан чалгындоочу деп кабыл алынышы керек.
• PSMB9дун диагностикалык көрсөткүчү чоң көз карандысыз когорттордо проспективдүү түрдө тастыкталган эмес.
• Молекулалык docking физикалык байланыштын түз өлчөөсү эмес.
• CETSA алсыз термалык турукташтырууну гана көрсөткөн.
• Синоменин PSMB9 экспрессиясын азайтуусунун бардык молекулалык аралык этаптары чечилген эмес.
• Синоменин бир нече сезгенүүгө каршы механизм аркылуу таасирдүү болушу мүмкүн экенин эске алганда, PSMB9 жалгыз түшүндүрмө эмес.

Жыйынтыктардын туура биологиялык мааниси

Бул изилдөөнүн бардык анализ катмарлары чогуу бааланганда PSMB9 RA синовиумундагы иммундук активдешүү менен стромалык фибробласттардын сезгенүү программалары ортосунда байланыш түзө алган талапкер иммунопротеасома түйүнү катары көрүнөт.

Синоменин жагында далилдер чынжыры үч өзүнчө деңгээлден турат: docking эсептөө аркылуу мүмкүн болгон байланыш позасын көрсөткөн, CETSA клетканын ичиндеги мүмкүн болгон бута өз ара аракеттенүүсүн колдогон, Western blot жана ELISA болсо синоменин колдонуу PSMB9 белок деңгээлине жана IL-6/TNF-α сезгенүү чыгыштарына кандай таасир этерин көрсөткөн.

Бул катмарлардын чогуу болушу механисттик гипотезаны күчөтөт; бирок алардын эч бири өзүнөн-өзү синомениндин адамдын ревматоиддик артритинде PSMB9 аркылуу так дарылоо механизмин далилдебейт.

Ошондуктан эң ылайыктуу жыйынтык сүйлөм төмөнкүдөй: PSMB9 ревматоиддик артритте мындан ары тастыктоого татыктуу иммундук байланыштагы талапкер бута/биомаркер жана синоменин PSMB9ду жөнгө салуу аркылуу сезгенүүнү жарым-жартылай азайтышы мүмкүн.

Булак жана Ыкма Жөнүндө Эскертүү

Түпнуска аталыш: Sinomenine Regulates PSMB9 to Mediate Therapeutic Effects in Rheumatoid Arthritis

Авторлор: Cui Zhang; Chonkit Lio; Nana Li; Yang Yu; Jinfang Luo.

Авторлордун ирети: Булактагы ирети так сакталган.

Тең салым: Cui Zhang жана Chonkit Lio тең салым кошкон авторлор.

Жооптуу авторлор: Chonkit Lio жана Jinfang Luo.

Мекеме 1: Department of Basic Medicine, Department of Pharmacy, Key Laboratory on the Property & Effect of Chinese Medicine (Ethnic Medicine), Guizhou Genuine Herbs Center of Consistency of Utility, Guizhou Key Laboratory of Miao Medicine, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China.

Мекеме 2: Faculty of Chinese Medicine, Macau University of Science and Technology, Avenida Wailong, Taipa, Macao, China.

Мекеме 3: State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine, Macau University of Science and Technology, Avenida Wailong, Taipa, Macao, China.

Chonkit Lio үчүн булакта берилген учурдагы дарек: Department of Medical Biochemistry, Tohoku University Graduate School of Medicine, Sendai, Japan.

Журнал: Cells.

Басмачы: MDPI, Basel, Switzerland.

Том / сан / макала номери: 15 / 11 / 1005.

DOI: 10.3390/cells15111005.

Расмий DOI шилтемеси: https://doi.org/10.3390/cells15111005

Кабыл алынган дата: 1-апрель 2026.

Кайра кароо датасы: 4-май 2026.

Кабыл алуу датасы: 26-май 2026.

Жарыялоо датасы: 29-май 2026.

Булак түрү: Article — интеграцияланган транскриптомдук/биоинформатикалык анализди, молекулалык dockingти жана in vitro клеткалык эксперименттерди бириктирген оригиналдуу изилдөө макаласы.

Рецензия статусу: Жарыяланган, рецензияланган журнал макаласы.

Лицензия: Creative Commons Attribution — CC BY.

Негизги маалымат булактары: GEO GSE276772, GSE285977, GSE55457 жана GSE77298; single-cell кайра анализи үчүн GSE109449.

Дифференциалдык экспрессия чеги: p < 0.05 жана |log2FC| > 0.5.

Микроarray иштетүү: affy v1.80.0 + RMA; limma v3.58.1.

RNA-seq анализи: DESeq2 v1.42.1.

Жетишпеген маанилерди иштетүү: impute v1.76.0.

GO/KEGG: clusterProfiler v4.11.0; org.Hs.eg.db жана org.Mm.eg.db.

GSEA: clusterProfiler; MSigDB ген топтомдору msigdbr v25.1.1; минималдуу ген топтому 10, максималдуу 500.

Иммундук инфильтрация: xCell v1.1.0; Wilcoxon rank-sum тести.

WGCNA: WGCNA v1.73; signed network; soft-thresholding power β = 7; TOM жана dynamicTreeCut; модул–trait баалоосу Pearson корреляциясы, p < 0.05.

PPI: STRING; minimum interaction confidence score = 0.95.

Single-cell маалыматы: GSE109449; OA4, OA5, RA8 жана RA9 болгон төрт донордон 396 synovial fibroblast клеткасы.

Single-cell нормалдаштыруу: CPM жана log2(CPM + 1).

Жол активдүүлүгү: GSVA v1.50.5; Hallmark ген топтомдору.

Корреляция: PSMB9 экспрессиясы менен иммундук жол активдүүлүгү үчүн Spearman корреляциясы.

Молекулалык docking: CB-DOCK2; PSMB9 PDB ID 6avo; SIN түзүлүшү PubChem; эң төмөн Vina упайына ээ поза тандалган.

Булак ичиндеги техникалык эскертүү: PSMB9 кристалл түзүлүшү PDBден алынганы айтылганына карабастан, ыкма текстинде түзүлүш “PDF форматында” сакталганы жазылган. Verianla бул билдирүүнү булактан тыш божомол менен оңдогон эмес.

Docking жыйынтыгы: PSMB9–SIN Vina упайы −9,0 kcal/mol.

Клетка линиясы: RAW264.7 чычкан макрофаг клеткалары.

Клетка культурасы: DMEM + %10 fetal bovine serum; 37 °C; %5 CO₂.

Синоменин тазалыгы: >%99.

CCK-8 дозалары: 150, 300, 600, 1200 жана 2400 µM SIN; 18 саат.

Функционалдык эксперимент SIN дозалары: 150–600 µM.

LPS: 1 µg/mL.

DEX: Western blot экспериментинде 1 µM.

ELISA: IL-6 жана TNF-α; 450 nm өлчөө, 570 nm background correction.

Western blot: PSMB9 1:1000; β-actin 1:3000; HRP экинчилик 1:3000; ImageJ v1.53a квантификациясы.

CETSA: SIN 600 µM / 19 саат; 53, 63, 73, 83, 90 жана 98 °C; ар бир температура үчүн 3 мүнөт; −80 °Cде 10 мүнөт; үч freeze–thaw цикли.

Клеткалык статистика: GraphPad Prism 8.0.2; one-way ANOVA + Tukey post hoc; mean ± SD; p < 0.05.

Каржылоо: National Science Foundation of China (82160779, 82505133); Research Project of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine No. GuiZhong, Yi Ke Yu (2025)54; Guizhou University of Traditional Chinese Medicine Talent Innovation Team [Gui Traditional Chinese Medicine TD He Zi [2023] 002]; Guizhou University of Traditional Chinese Medicine National and Provincial Science and Technology Innovation Talent Team Cultivation Project TD NO.[2022]004; Guizhou Provincial Basic Research Program No. ZK[2024]358.

Этика комитети: Колдонулбайт.

Маалымдалган макулдук: Колдонулбайт.

Маалыматтын жеткиликтүүлүгү: GSE276772, GSE285977, GSE55457 жана GSE77298 GEOдо ачык жеткиликтүү; кошумча эксперименталдык маалыматтар институционалдык маалымат башкаруу жана сактоо эрежелерине байланыштуу негиздүү суроо боюнча жооптуу автордон алынышы мүмкүн экени айтылган.

Кызыкчылыктардын кагылышы: Авторлор кызыкчылыктардын кагылышы жок экенин билдиришкен.

Авторлордун салымдары: Cui Zhang, Chonkit Lio жана Jinfang Luo: ыкма, формалдуу анализ, текшерүү жана биринчи долбоор. Nana Li жана Yang Yu: маалыматтарды уюштуруу жана формалдуу анализ. Chonkit Lio жана Jinfang Luo: карап чыгуу, редакциялоо жана ресурстар. Бардык авторлор жарыяланган версияны окуп, кабыл алышкан.

Негизги методологиялык чектөө: Функционалдык SIN–PSMB9 текшерүүсү LPS менен стимулданган RAW264.7 чычкан макрофагдарында гана жүргүзүлгөн. Изилдөөдө in vivo эксперимент же жаңы адам клиникалык текшерүүсү жок. Single-cell анализ төрт донор менен чектелген жана чалгындоочу деп кабыл алынган. PSMB9дун диагностикалык жана терапиялык баалуулугу чоңураак көз карандысыз когорттор, баштапкы бейтап клеткалары жана in vivo моделдер менен тастыкталышы керек.