PSMB9 (proteasome subunit beta type-9; LMP2), immunoproteazomun 20S nüvə hissəciyində yerləşən və antigenlərin emalı ilə əlaqəli zülal parçalanmasında iştirak edən katalitik alt vahiddir. Bu tədqiqat revmatoid artritdə (Rheumatoid Arthritis, RA) PSMB9-un xəstəliklə əlaqəsini və təbii alkaloid olan sinomeninin (SIN) PSMB9 ilə mümkün qarşılıqlı təsirini; çoxsaylı transkriptom məlumat dəstlərini, immun hüceyrə infiltrasiyası analizini, WGCNA-nı, yol analizlərini, single-cell RNA-seq-i, molekulyar docking-i və RAW264.7 makrofaq hüceyrə təcrübələrini birləşdirərək araşdırır.

Dörd GEO gen ekspressiyası məlumat dəstindən əldə edilən diferensial ifadə olunan genlər və GSE55457 üzərində qurulan çəkili gen birgə-ekspressiya şəbəkəsi birlikdə qiymətləndirildikdə PSMB9, TAP1 və CFB ortaq namizədlər arasında müəyyən edilmişdir. İmmun infiltrasiya analizləri RA sinoviumunda xüsusilə M1 makrofaqlarının zənginləşməsini göstərmişdir. PSMB9 daha sonra zülal–zülal qarşılıqlı təsir şəbəkələrində mərkəzi immunoproteazom/antigen emalı komponenti kimi araşdırılmışdır.

GSE109449 single-cell RNA-seq məlumat dəstindəki dörd donordan ümumilikdə 396 sinovial fibroblast hüceyrəsinin yenidən analizi RA mənşəli fibroblastabənzər sinoviositlərdə PSMB9 ekspressiyasının OA qrupu ilə müqayisədə artdığını və PSMB9 ekspressiyasının interferon-α, interferon-γ, IL6/JAK–STAT3 və allograft rejection kimi iltihabi Hallmark yolları ilə əlaqəli olduğunu göstərmişdir. Bununla belə, bu single-cell hissəsi yalnız dörd donora əsaslandığı üçün tədqiqatda kəşfiyyat xarakterli hesab edilir.

Sinomenin ilə PSMB9 arasında aparılan molekulyar docking analizində Vina skoru −9,0 kcal/mol müəyyən edilmişdir. Hüceyrəvi termal sürüşmə testi (Cellular Thermal Shift Assay, CETSA) sinomeninin mövcudluğunda PSMB9-un termal davranışında zəif stabilləşdirici təsir göstərmiş və mümkün hədəf qarşılıqlı təsirini dəstəkləmişdir. LPS ilə iltihab yaradılmış RAW264.7 makrofaqlarında 150–600 µM sinomenin IL-6 və TNF-α səviyyələrinin dozadan asılı azalması və PSMB9 zülal ekspressiyasının aşağı düşməsi ilə əlaqələndirilmişdir.

Bu nəticələr sinomeninin antiinflamatuar təsirlərinin ən azı bir hissəsinin PSMB9-un tənzimlənməsi ilə əlaqəli ola biləcəyini düşündürür. Lakin tədqiqat bunu qəti və yeganə mexanizm kimi sübut etmir. Funksional təcrübələr yalnız siçan mənşəli RAW264.7 hüceyrə xəttində aparılmış, heyvan modeli və ya RA xəstələrində birbaşa müalicə sınağı həyata keçirilməmişdir. Buna görə PSMB9 bu tədqiqatda namizəd biomarker və namizəd terapevtik hədəf xarakteri daşıyır; klinikada təsdiqlənmiş diaqnostik test və ya müalicə hədəfi deyil.

Revmatoid artritdə araşdırılan əsas problem nədir?

Revmatoid artrit xroniki sinovial iltihab və proqressiv oynaq zədələnməsi ilə xarakterizə olunan sistemik immun əlaqəli xəstəlikdir. Xəstəliyin patologiyasında yalnız dövr edən immun hüceyrələr deyil, sinovial toxumanın rezident stromal hüceyrələri də iltihabi mühitin davam etməsinə töhfə verə bilər.

Tədqiqatın araşdırma sualı bir-biri ilə əlaqəli iki hissəyə ayrılır. Birincisi, müxtəlif insan transkriptom məlumat dəstlərində RA ilə təkrar-təkrar əlaqəli görünən mərkəzi immun genin müəyyən edilə bilib-bilməməsidir. İkincisi isə sinomeninin antiinflamatuar təsirlərinin bu gen və onun zülal məhsulu vasitəsilə qismən izah edilə bilib-bilməməsidir.

Sinomenin nədir?

Sinomenin, Sinomenium acutum bitkisindən əldə edilən monomerik alkaloiddir. Mənbənin giriş hissəsində əvvəlki tədqiqatlar və klinik araşdırmalar əsasında sinomeninin antiinflamatuar, immunomodulyator, analjezik və sümük qoruyucu təsirlərlə əlaqələndirildiyi bildirilir.

Lakin bu məqalənin öz təcrübələri sinomeninin klinik RA effektivliyini yenidən sınaqdan keçirmir. Bu tədqiqat daha dar bir suala — sinomenin ilə PSMB9 arasında mümkün molekulyar və hüceyrəvi əlaqənin olub-olmamasına — yönəlir.

PSMB9 Revmatoid Artrit Baxımından Niyə Əhəmiyyətlidir?

PSMB9 və ya LMP2 immunoproteazomun katalitik beta alt vahidlərindən biridir; hüceyrədaxili zülalların peptidlərə parçalanmasına və bu peptidlərin TAP1 vasitəsilə endoplazmatik retikuluma daşınaraq MHC sinif I antigen təqdimatına hazırlanmasına töhfə verir. PSMB9 ekspressiyasının interferon-γ tərəfindən artırıla bilməsi zülalın immun aktivləşmə ilə birbaşa bağlı bioloji kontekstini gücləndirir.

Proteazom hüceyrədə lazımsız və ya zədələnmiş zülalların idarə olunan şəkildə parçalanmasını təmin edən böyük zülal kompleksidir. İmmunoproteazom, xüsusilə iltihabi və interferonla stimullaşdırılmış şəraitdə müəyyən katalitik alt vahidlərin standart proteazom alt vahidlərini əvəz etdiyi xüsusi proteazom formasıdır. PSMB9 bu xüsusi katalitik alt vahidlərdən biridir.

Beləliklə, PSMB9 yalnız “bir gen adı” deyil. Gen ekspressiyasındakı dəyişiklik antigen emalı və iltihabi siqnal mühiti ilə əlaqəli daha böyük immunoloji sistemin bir hissəsidir. Bununla belə, şəbəkə analizində mərkəzi görünməsi təkbaşına xəstəliyi idarə etdiyi və ya inhibisiyasının müalicə təmin edəcəyi mənasına gəlmir; buna görə tədqiqat daha sonra müxtəlif analiz qatları və hüceyrəvi təcrübələrlə PSMB9-u izləməyə davam etmişdir.

Dörd GEO məlumat dəsti niyə birbaşa birləşdirilmədi?

Tədqiqatda GSE276772, GSE285977, GSE55457 və GSE77298 olmaqla dörd GEO gen ekspressiyası məlumat dəsti istifadə edilmişdir. GSE55457 və GSE77298 RA xəstələrinin və sağlam nəzarətlərin sinovial toxuma nümunələrini ehtiva etdiyi halda, GSE276772 və GSE285977 gen perturbasiyası və ya sitokin stimullaşdırılması tipli məlumat dəstləri kimi istifadə edilmişdir.

Məlumat dəstlərinin platformaları eyni olmadığı üçün tədqiqatçılar ekspressiya matrislərini vahid böyük matrisdə birləşdirməmişlər. Bunun əvəzinə hər məlumat dəsti müstəqil işlənmiş, diferensial ekspressiya nəticələri gen səviyyəsində müqayisə edilmişdir. Beləliklə, müxtəlif mikroarray və RNA-seq platformalarının yarada biləcəyi platformalararası batch effektinin birbaşa ümumi matrisə daşınmasının qarşısının alınmasına çalışılmışdır.

Mikroarray məlumatları necə işlənmişdir?

Mikroarray CEL faylları R mühitində affy v1.80.0 paketi ilə idxal edilmiş və Robust Multi-Array Average (RMA) ilə işlənmişdir. RMA prosesi üç əsas mərhələdən ibarətdir:

• fon düzəlişi,
• quantile normalization,
• probe-set summarization.

Nəticədə log2 miqyaslı gen ekspressiyası dəyərləri əldə edilmiş, prob dəstləri platformaya məxsus annotation paketləri ilə gen simvollarına və Entrez ID-lərinə uyğunlaşdırılmışdır. Çatışmayan dəyərlər impute v1.76.0 paketi ilə işlənmişdir.

RNA-seq məlumatları necə işlənmişdir?

RNA-seq məlumatı DESeq2 v1.42.1 ilə standart iş axınından istifadə edilərək analiz edilmişdir. Mikroarray məlumat dəstlərində diferensial ekspressiya üçün limma v3.58.1, RNA-seq məlumat dəstində isə DESeq2 istifadə edilmişdir.

Mənbədə diferensial ifadə olunan genin (Differentially Expressed Gene, DEG) tərifi:

\[ p < 0.05 \quad \text{ve} \quad |\log_2 FC| > 0.5 \]

şərtlərinə əsaslanır.

\(\log_2 FC\), iki qrup arasındakı ekspressiya dəyişiminin log2 əsaslı qat dəyişməsidir. Müsbət dəyər daha yüksək, mənfi dəyər isə daha aşağı ekspressiya istiqamətini göstərir. Mütləq dəyərin 0,5-dən böyük olması dəyişimin müəyyən böyüklüyü aşmasını tələb edir, \(p<0.05\) isə mənbədə istifadə olunan statistik seçim həddidir.

Burada mühüm bir detal var: mənbə DEG seçimi üçün birbaşa \(p<0.05\) yazır. Verianla bunu düzəldilmiş p-dəyəri və ya FDR həddi kimi dəyişdirmir.

Dörd məlumat dəstində neçə DEG tapılmışdır?

Bu rəqəmlərin bir-birindən çox fərqli olması təkbaşına bioloji təsirin bir məlumat dəstində “daha güclü” olduğu mənasına gəlmir. Məlumat dəstlərinin növləri, platformaları, təcrübə şərtləri və nümunə strukturları fərqlidir. Tədqiqatın strategiyası mütləq DEG saylarını müqayisə etməkdən daha çox, müxtəlif analizlərdə təkrarlanan bioloji siqnalları müəyyənləşdirməkdir.

GO və KEGG analizi nəyi araşdırır?

Bir DEG siyahısında yüzlərlə və ya minlərlə gen ola bilər. Gene Ontology (GO) və Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analizi bu gen siyahısındakı müəyyən bioloji funksiyaların və ya yolların gözləniləndən daha tez-tez təmsil olunub-olunmadığını araşdırır.

Tədqiqatda clusterProfiler v4.11.0 istifadə edilmişdir. İnsan genləri üçün org.Hs.eg.db, siçan genləri üçün org.Mm.eg.db annotation mənbələri istifadə edilmiş, genlər Entrez ID-lərinə çevrilmişdir.

GO analizində üç sinif qiymətləndirilmişdir:

• BP — Biological Process: genlərin iştirak etdiyi bioloji proseslər,
• CC — Cellular Component: məhsulların yerləşdiyi hüceyrəvi strukturlar,
• MF — Molecular Function: molekulyar səviyyədə funksiyalar.

GO üçün mənbə adjusted p-value < 0.05, KEGG üçün isə p < 0.05 həddini göstərir.

DEG əsaslı enrichment nəticələrində immunitet və iltihabla əlaqəli proseslər daha aydın görünmüş; makrofaq aktivləşməsinin tənzimlənməsi, iltihabi cavab, sümük rezorbsiyası və IL-15 vasitəli siqnal kimi mövzular önə çıxmışdır.

GSEA niyə DEG analizinə əlavə olaraq istifadə edilmişdir?

DEG yanaşması yalnız əvvəlcədən müəyyən edilmiş statistik hədləri keçən genlərdən istifadə edir. Buna qarşılıq Gene Set Enrichment Analysis (GSEA), bütün sıralanmış gen siyahısındakı kiçik, lakin koordinasiyalı dəyişiklikləri də qiymətləndirə bilər.

Bu səbəbdən tədqiqat yalnız “əhəmiyyətli DEG” siyahısından görünməyə biləcək daha geniş transkriptomik proqramları araşdırmaq üçün GSEA tətbiq etmişdir.

Genlər \(\log_2 FC\)-yə görə sıralanmış, MSigDB gen dəstləri msigdbr v25.1.1 ilə alınmış və gen dəsti ölçüsü üçün:

\[ 10 \leq \text{gen setindeki gen sayısı} \leq 500 \]

intervalı istifadə edilmişdir.

GSEA-KEGG nəticələrində JAK–STAT və Toll-like receptor yolları, GSEA-GO nəticələrində isə interferon cavabları və NF-κB siqnal proqramları önə çıxmışdır. Bu nəticələr RA-da anadangəlmə immunitet və iltihabi transkripsiya proqramlarının koordinasiyalı şəkildə dəyişdiyi şərhini dəstəkləmişdir.

xCell immun infiltrasiyası analizi nəyi ölçür?

xCell, bulk gen ekspressiya profillərindən müxtəlif immun və stromal hüceyrə tiplərinə aid nisbi enrichment skorlarını təxmin edən hesablama üsuludur. Buradakı “infiltrasiya” mikroskop altında birbaşa hüceyrə sayımı deyil; ekspressiya imzalarından çıxarılan nisbi enrichment təxminidir.

Tədqiqatda xCell v1.1.0, R v4.3.2 daxilində GSE55457 və GSE77298 məlumat dəstlərinə tətbiq edilmişdir. Ekspressiya matrisləri normallaşdırılmış və log2 çevrilməsindən keçirilmişdir.

RA ilə nəzarət arasındakı xCell enrichment skorları Wilcoxon rank-sum testi ilə müqayisə edilmişdir.

Hər iki sinovial məlumat dəstində immun hüceyrələrin artmış enrichment nümunəsi müşahidə edilmiş, xüsusilə M1 makrofaqları ən aydın artımı göstərən hüceyrə tiplərindən biri kimi ortaya çıxmışdır. GSE77298-də plasma cells və CD8+ T cells də artım göstərmişdir.

Bu nəticə “RA toxumasında mikroskopla dəqiq bu sayda M1 makrofaq var” demək deyil. xCell nəticələri transkriptom məlumatından əldə edilən nisbi hüceyrəvi enrichment göstəriciləridir.

WGCNA PSMB9-un Seçilməsinə Necə Töhfə Verdi?

Çəkili gen birgə-ekspressiya şəbəkəsi analizi (Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA) ayrı-ayrı genlərin yalnız diferensial ekspressiyasına baxmaq əvəzinə birlikdə dəyişən gen qruplarını modullar şəklində müəyyən edir və bu modulların xəstəlik xüsusiyyəti ilə əlaqəsini araşdırır. Bu tədqiqatda WGCNA GSE55457 sinovial transkriptomunda RA ilə əlaqəli birgə-ekspressiya modullarını tapmaq üçün istifadə edilmişdir.

WGCNA analizində çox aşağı ekspressiyalı genlər istisna olmaqla tam gen ekspressiya matrisi istifadə edilmiş və signed co-expression network qurulmuşdur.

Mənbədə seçilmiş soft-thresholding power:

\[ \beta = 7 \]

kimi bildirilmişdir.

Soft-thresholding power genlər arasındakı korrelyasiyaların şəbəkə əlaqə çəkilərinə necə çevriləcəyini müəyyən edən parametrdir. Tədqiqatda scale-free topology meyarını ödəyən ən aşağı uyğun güc seçilmişdir.

Daha sonra topological overlap matrix (TOM) hesablanmış, TOM əsaslı məsafə üzərində hierarchical clustering aparılmış və modul sərhədləri dynamicTreeCut alqoritmi ilə düzəldilmişdir.

Modul–RA əlaqələri Pearson korrelyasiyası ilə araşdırılmış və p < 0.05 əhəmiyyətlilik meyarı istifadə edilmişdir. Lightcyan, black və lightgreen daxil olmaqla yeddi modul RA ilə güclü müsbət, dörd modul isə mənfi əlaqə göstərmişdir.

Bu modullardakı genlərin enrichment analizi immun cavab, iltihab və sitokin istehsalı ilə əlaqəli yolların RA ilə bağlı şəbəkə modullarında sıxlaşdığını göstərmişdir.

PSMB9 necə namizəd mərkəzi genə çevrildi?

Dörd müstəqil məlumat dəstindəki DEG nəticələri ilə RA əlaqəli WGCNA modulundakı genlərin kəsişməsi araşdırıldıqda PSMB9, TAP1 və CFB ortaq namizəd genlər arasında tapılmışdır.

Daha sonra STRING üzərində zülal–zülal qarşılıqlı təsir (Protein–Protein Interaction, PPI) şəbəkəsi qurulmuşdur. Mənbə minimum interaction confidence score dəyərini:

\[ 0.95 \]

kimi müəyyən etmişdir. Bu, yalnız yüksək etibar skorlu STRING əlaqələrinin şəbəkəyə daxil edilməsini məqsəd qoyur.

PSMB9 tək seed kimi istifadə edildikdə proteazom və antigen emalı komponentləri baxımından sıx qarşılıqlı təsir şəbəkəsi yaranmışdır. PSMB9, TAP1 və CFB birlikdə seed kimi istifadə edildikdə daha geniş və qarşılıqlı bağlı immun əlaqəli şəbəkə əldə edilmişdir.

Single-cell RNA-seq analizi niyə ayrıca aparılmışdır?

Bulk transkriptom bütün toxumadan gələn orta ekspressiyanı göstərir. Lakin sinovium fibroblastlar və müxtəlif immun hüceyrələr daxil olmaqla çoxlu fərqli hüceyrə tiplərini ehtiva edir. Single-cell RNA-seq analizi gen ekspressiyasının hansı hüceyrə alt qruplarında görüldüyünü daha ətraflı araşdırmağa kömək edir.

Tədqiqatda GSE109449 istifadə edilmişdir. Mənbəyə görə dörd donordan:

• OA4,
• OA5,
• RA8,
• RA9

olmaqla ümumilikdə 396 sinovial fibroblast hüceyrəsi analiz edilmişdir.

OA osteoartriti, RA isə revmatoid artriti ifadə edir. Bu bölmə xüsusilə fibroblastabənzər sinoviositləri (Fibroblast-Like Synoviocytes, FLS) qiymətləndirir.

CPM normallaşdırılması necə hesablanmışdır?

Hər hüceyrə üçün kitabxana ölçüsü hesablanmış və ekspressiya dəyərləri counts-per-million (CPM) üsulu ilə normallaşdırılmışdır:

\[ CPM_{ij} = \frac{x_{ij}} {\sum_j x_{ij}} \times 10^6 \]

Burada:

• \(x_{ij}\), müvafiq genin müvafiq hüceyrədəki xam sayımını,
• \(\sum_j x_{ij}\), normallaşdırma üçün istifadə olunan hüceyrə kitabxanasındakı ümumi sayımı,
• \(10^6\), dəyəri milyon başına sayım miqyasına çevirən əmsalı

ifadə edir.

Mənbə formulun indeks notasiyasını bu şəkildə verir; Verianla indeksləri səssizcə yenidən müəyyən etmir.

Log çevrilməsi niyə aparılmışdır?

Normallaşdırılmış CPM dəyərləri daha sonra:

\[ \log_2(CPM+1) \]

formasına çevrilmişdir.

Buradakı +1 termini CPM dəyəri sıfır olduqda loqarifmin qeyri-müəyyən olmasının qarşısını alır. Log çevrilməsi yüksək sayım dəyərlərinin miqyas üzərində üstünlüyünü azaldaraq ekspressiya paylanmasını daha idarəolunan edir.

GSVA nəyi ölçür?

Gene Set Variation Analysis (GSVA), ayrı-ayrı genlərin ekspressiyası əvəzinə əvvəlcədən müəyyən edilmiş gen dəstlərinin nümunə və ya hüceyrəvi profil daxilində nisbi aktivliyini qiymətləndirən üsuldur.

Hallmark gen dəstləri msigdbr v25.1.1 ilə alınmış, GSVA skorları GSVA v1.50.5 ilə hesablanmışdır.

RA FLS profilləri interferon-α response, interferon-γ response, allograft rejection və IL6/JAK–STAT3 signaling daxil olmaqla müxtəlif iltihabi/immun Hallmark yollarında OA profillərindən daha yüksək aktivlik göstərmişdir.

PSMB9 ekspressiyası ilə bu yolların GSVA skorları arasında Spearman korrelyasiyası hesablanmışdır.

Mənbə korrelyasiya hissəsini dörd donor üzərindən təsvir edir və tədqiqatın müzakirə hissəsində bu single-cell analizinin məhdud donor sayı səbəbindən kəşfiyyat xarakterli olduğunu xüsusi vurğulayır. Buna görə bu korrelyasiyalar güclü populyasiya ümumiləşdirməsi kimi şərh edilməməlidir.

Molekulyar docking nəyi sınaqdan keçirir?

Molekulyar docking kiçik molekulun hədəf zülalın üçölçülü strukturu daxilində mümkün bağlanma pozalarını və hesablamalı uyğunluq skorlarını araşdırır. Docking fiziki bağlanmanın birbaşa laboratoriya ölçümü deyil.

PSMB9 kristal strukturu PDB verilənlər bazasından PDB ID: 6avo ilə alınmış, sinomeninin üçölçülü strukturu PubChem-dən SDF formatında yüklənmiş və struktur əsaslı docking CB-DOCK2 platforması ilə aparılmışdır.

Mənbə PSMB9 struktur faylının “PDF formatında” saxlanıldığını yazır. Bu qeyri-adi ifadə Verianla tərəfindən mənbədənkənar fərziyyə ilə dəyişdirilməmişdir.

Ən aşağı Vina skoruna malik docking pozası optimal poza kimi seçilmişdir.

Mənbənin istifadə etdiyi docking şərh hədləri:

PSMB9–SIN üçün hesablanan:

\[ \text{Vina score}=-9.0\ \text{kcal/mol} \]

dəyəri mənbənin öz təsnifatına görə güclü hesablamalı bağlanma meyli ilə uyğundur.

Lakin docking skoru təkbaşına sinomeninin hüceyrə daxilində PSMB9-a qəti şəkildə fiziki bağlandığını sübut etmir. Buna görə tədqiqat docking nəticəsini CETSA ilə hüceyrə səviyyəsində izləmişdir.

CETSA Sinomeninin PSMB9-a Birbaşa Bağlandığını Qəti Şəkildə Sübut Edirmi?

Xeyr. Bu tədqiqatda CETSA sinomeninin mövcudluğunda PSMB9-un termal stabilliyindəki zəif dəyişiklik səbəbindən mümkün hədəf qarşılıqlı təsirini dəstəkləyir; lakin müəlliflərin müzakirə hissəsindəki ehtiyatlı şərhinə görə SIN–PSMB9 əlaqəsi qəti və yeganə mexanizm kimi deyil, potensial mexanizm kimi qiymətləndirilməlidir.

CETSA-nın əsas məntiqi

Cellular Thermal Shift Assay (CETSA) zülalın müxtəlif temperaturlarda nə dərəcədə həll olmuş/stabil qaldığını qiymətləndirir. Liqand zülala bağlandıqda bəzi hallarda zülalın termal stabilliyi dəyişə bilər.

Buna görə liqand tətbiq edilmiş və nəzarət hüceyrələri müxtəlif temperaturlara məruz qoyulur; sonra həll olmuş qalan hədəf zülal Western blot kimi üsullarla ölçülür.

Bu tədqiqatda RAW264.7 hüceyrələri:

• DMSO vasitə nəzarəti və ya 600 µM sinomenin ilə 19 saat işlənmiş,
• 53, 63, 73, 83, 90 və 98 °C temperaturlara 3 dəqiqə məruz qoyulmuş,
• dərhal −80 °C-də 10 dəqiqə dondurulmuş,
• freeze–thaw prosesi üç dəfə təkrarlanmış,
• RIPA buferində buz üzərində 30 dəqiqə parçalanmış,
• 12.000 rpm-də, 4 °C-də 20 dəqiqə sentrifuqalanmış,
• sonra PSMB9 Western blot ilə analiz edilmişdir.

Mənbənin Figure 9B məlumatı temperatur yüksəldikcə PSMB9 zolağının zəiflədiyini, lakin sinomenin qrupunda zəif stabilləşdirici təsirin olduğunu göstərir.

Buna görə Verianla nəticəni “CETSA qəti birbaşa bağlanmanı sübut etdi” şəklində şişirtmir. Docking + CETSA birlikdə mümkün target engagement üçün dəstək verir.

RAW264.7 hüceyrə modeli nədir?

RAW264.7 siçan mənşəli makrofaqabənzər hüceyrə xəttidir. Bu tədqiqat hüceyrələrin iltihabi cavabını LPS ilə stimullaşdıraraq sinomenin və PSMB9 arasındakı əlaqəni mexanistik səviyyədə qiymətləndirmişdir.

Hüceyrələr %10 fetal bovine serum ehtiva edən tam DMEM mühitində, 37 °C və %5 CO₂ şəraitində kultivasiya edilmişdir.

Bu model insan RA sinoviumunun çoxhüceyrəli, xroniki və autoimmun mikromühitinin hamısını təmsil etmir.

CCK-8 hüceyrə canlılığı testi

Hüceyrə canlılığında sinomenin üçün:

150, 300, 600, 1200 və 2400 µM

konsentrasiyaları sınaqdan keçirilmişdir.

96-well lövhələrdə hüceyrə sıxlığı 1,8 × 10⁵/mL, həcm 100 µL/well olaraq tənzimlənmiş və sinomenin tətbiqi 18 saat davam etmişdir.

Daha sonra hər quyucuğa 10 µL CCK-8 məhlulu əlavə edilmiş və 37 °C-də 45 dəqiqə–1 saat inkubasiya edilmişdir. Absorbans 450 nm-də ölçülmüşdür.

Mənbə hüceyrə canlılığını:

\[ \text{Göreli canlılık (\%)} = \frac{ OD_{treatment}-OD_{blank} }{ OD_{control}-OD_{blank} } \times100 \]

formulu ilə hesablamışdır.

Burada:

• \(OD_{treatment}\): sinomenin tətbiq edilən quyucuğun optik sıxlığı,
• \(OD_{blank}\): hüceyrəsiz və ya uyğun blank quyucuğunun fon dəyəri,
• \(OD_{control}\): nəzarət qrupunun optik sıxlığıdır.

Blank dəyərinin çıxılması ölçmə sisteminin fon absorbansını azaldır. Nəzarət qrupuna bölmə isə nəzarəti təxminən %100 canlılıq istinadına çevirir.

Mənbədə 600 µM-dən yuxarı sinomenin konsentrasiyalarında sitotoksik təsirin yarana biləcəyi qeyd edilmiş, buna görə sonrakı funksional təcrübələrdə 150–600 µM intervalı seçilmişdir.

LPS modeli və ELISA təcrübələri

IL-6 və TNF-α ölçümü üçün RAW264.7 hüceyrələri 3 × 10⁵ hüceyrə/mL sıxlıqda 6-well lövhələrə əlavə edilmiş və gecə boyunca 37 °C-də saxlanmışdır.

Hüceyrələr əvvəlcə 1 saat sinomenin və ya dexamethasone (DEX) ilə ilkin işlənməyə məruz qoyulmuş, sonra:

\[ LPS = 1\ \mu g/mL \]

konsentrasiyası ilə 18 saat stimullaşdırılmışdır.

LPS makrofaqlarda güclü iltihabi cavab yaratmaq üçün istifadə olunan lipopolisaxariddir. Bu model RA-nın hamısını deyil, makrofaq iltihabının eksperimental bir hissəsini təqlid edir.

Hüceyrə supernatantı 1200 rpm-də 10 dəqiqə sentrifuqalanmış; IL-6 və TNF-α ELISA ilə ölçülmüş, absorbans 450 nm-də oxunmuş və 570 nm fon düzəlişi istifadə edilmişdir.

Nəticələr sinomeninin IL-6 və TNF-α konsentrasiyalarını dozadan asılı şəkildə azaltdığını göstərmişdir. Dexamethasone qrupunda da oxşar antiinflamatuar istiqamət müşahidə edilmişdir.

Western blot təcrübəsi

PSMB9 zülal ekspressiyası Western blot ilə araşdırılmışdır. Sinomenin üçün 150, 300 və 600 µM səviyyələri istifadə edilmiş, DEX qrupu 1 µM olaraq təyin edilmişdir.

Bir saatlıq ilkin işlənmədən sonra LPS son konsentrasiyası 1 µg/mL olacaq şəkildə əlavə edilmiş və hüceyrələr daha 18 saat kultivasiya edilmişdir.

Zülallar 10% SDS-PAGE üzərində ayrılmış və PVDF membrana köçürülmüşdür.

Antikor durulaşdırmaları:

Primer antikor inkubasiyası 4 °C-də gecə boyunca, sekonder antikor inkubasiyası otaq temperaturunda 1 saat aparılmışdır.

Zolaqlar chemiluminescence görüntüləmə sistemi ilə görüntülənmiş və boz səviyyə kəmiyyətləndirilməsi ImageJ v1.53a ilə aparılmışdır.

Mənbənin Figure 9F–G nəticələri sinomeninin PSMB9 zülal ekspressiyasını dozadan asılı şəkildə azaltdığını göstərir.

Təcrübələrdə istifadə olunan mühüm cihaz və materiallar

Hüceyrəvi təcrübələrin statistik analizi

Statistika və məlumat vizuallaşdırması GraphPad Prism 8.0.2 ilə aparılmışdır.

Bir neçə qrupun müqayisəsi üçün one-way ANOVA və ardınca Tukey post hoc testi tətbiq edilmişdir.

Nəticələr:

\[ \text{ortalama} \pm \text{standart sapma} \]

formasında təqdim edilmiş və:

\[ p<0.05 \]

statistik əhəmiyyətlilik həddi kimi qəbul edilmişdir.

Figure 9 izahında normal qrupa qarşı ### p<0.001; model qrupuna qarşı isə *** p<0.001, ** p<0.01 və * p<0.05 işarələrindən istifadə edilmişdir.

Mənbə qrafiklərin bütün sütun hündürlüklərini rəqəmsal cədvəl şəklində bildirmədiyi üçün Verianla şəkildən təxmini oxuna biləcək IL-6, TNF-α və ya PSMB9 nisbətlərini dəqiq xam rəqəm kimi yaratmır.

Tədqiqatın Metodu və Nəticələri

Tədqiqat dizaynının sübut qatları

Birinci əsas nəticə: immunitet və iltihab yolları RA ilə güclü əlaqəli idi

Dörd məlumat dəstindəki DEG nümunələri fərqli olsa da enrichment analizləri immun və iltihabi proseslərdə ortaqlaşma göstərmişdir. GSEA DEG həddi ilə görünməyə biləcək daha geniş yol dəyişikliklərini də üzə çıxarmış və JAK–STAT, Toll-like receptor, interferon cavabları və NF-κB proqramları ilə əlaqə göstərmişdir.

İkinci əsas nəticə: M1 makrofaq siqnalı önə çıxdı

GSE55457 və GSE77298 xCell analizlərində RA sinoviumunda bir çox immun hüceyrə üçün artmış enrichment müşahidə edilmişdir. M1 makrofaqlar hər iki analizdə ən aydın artım göstərən hüceyrəvi imzalardan biri olmuş və sonrakı mexanistik analizlərin əsas kontekstlərindən birini təşkil etmişdir.

Üçüncü əsas nəticə: PSMB9 çoxsaylı seçim qatlarından keçdi

PSMB9 yalnız bir volcano plot-dan seçilməmişdir. DEG kəsişməsi, WGCNA modulu və PPI analizi birlikdə qiymətləndirilmiş; PSMB9, TAP1 və CFB təkrarlanan namizəd genlər kimi müəyyən edilmişdir.

PSMB9-un xüsusilə immunoproteazom və antigen emalı komponentləri ilə sıx əlaqəsi zülalın tədqiqatın mərkəzi namizədlərindən biri kimi izlənməsinə səbəb olmuşdur.

Dördüncü əsas nəticə: PSMB9 yalnız immun hüceyrələrlə məhdud siqnal deyildi

Single-cell yenidən analizində RA mənşəli fibroblastabənzər sinoviositlərdə PSMB9 ekspressiyası OA mənşəli FLS-lərlə müqayisədə daha yüksəkdir.

Eyni profillərdə interferon-α, interferon-γ, allograft rejection və IL6/JAK–STAT3 kimi immun/iltihabi Hallmark yollarının aktivliyi də RA qrupunda yüksəlmişdir.

Bu tapıntı RA sinoviumundakı iltihabi mühitin yalnız infiltrasiya edən immun hüceyrələrdən ibarət olmadığı; rezident stromal fibroblastların da iltihabi proqramlar göstərə bildiyi modelini dəstəkləyir.

Lakin bu bölmə yalnız dörd donora əsaslandığı üçün böyük populyasiya üzrə nəticə çıxarılmamalıdır.

Beşinci əsas nəticə: sinomenin–PSMB9 docking skoru −9,0 kcal/mol idi

CB-DOCK2 analizi PSMB9 ilə sinomenin arasında −9,0 kcal/mol Vina skoru verən docking pozası yaratmışdır. Bu dəyər mənbənin öz docking qiymətləndirmə hədlərinə görə güclü bağlanma meyli ilə uyğundur.

Lakin docking simulyasiya/təxmindir. Molekulun canlı hüceyrədə həqiqətən müvafiq zülala bağlanıb-bağlanmadığını müəyyən etmək üçün əlavə eksperimental sübut tələb olunur.

Altıncı əsas nəticə: CETSA mümkün target engagement-ı dəstəklədi

CETSA-da sinomenin PSMB9-un temperaturla həllolma qabiliyyətini tam dəyişən dramatik stabilləşmə göstərməmiş; mənbə bunu zəif/modest stabilləşdirici təsir kimi şərh etmişdir.

Beləliklə, CETSA tapıntısı docking ilə eyni istiqamətdə mümkün qarşılıqlı təsiri dəstəkləyir, lakin SIN–PSMB9 bağlanmasının qəti biofiziki xarakterizasiyasını əvəz etmir.

Yeddinci əsas nəticə: 150–600 µM sinomenin iltihabi cavabı azaltdı

CCK-8 testi 600 µM-dən yüksək konsentrasiyalarda sitotoksiklik ehtimalının artdığını göstərdiyi üçün funksional təcrübələrdə 150–600 µM intervalı istifadə edilmişdir.

LPS ilə stimullaşdırılmış RAW264.7 makrofaqlarında sinomenin tətbiqi IL-6 və TNF-α səviyyələrini dozadan asılı şəkildə azaltmışdır.

Western blot nəticələri də sinomenin konsentrasiyası artdıqca PSMB9 zülal ekspressiyasının azaldığını göstərmişdir.

Dexamethasone nəzarəti də PSMB9 ekspressiyası və iltihabi sitokinlər üzərində inhibisiya istiqamətində təsir göstərmişdir.

Sinomenin PSMB9-a bağlandıqdan sonra niyə onun ekspressiyasını azalda bilər?

Bu tədqiqat bu sualın bütün molekulyar ara mərhələlərini müəyyən etmir. Docking və CETSA mümkün fiziki target engagement istiqamətində sübut təqdim etdiyi halda Western blot müalicədən sonra PSMB9 zülal səviyyəsinin azaldığını göstərir. Lakin liqand bağlanmasının PSMB9 zülal ekspressiyasını hansı transkripsion, translasion və ya zülal parçalanma mexanizmi ilə azaltdığı mənbədə birbaşa həll edilməmişdir.

Buna görə Verianla “sinomenin PSMB9-a bağlandığı üçün zülal avtomatik parçalanır” kimi mənbədənkənar mexanizm əlavə etmir.

Tədqiqatın dəstəklədiyi nəticələr

• PSMB9 bu tədqiqatda istifadə olunan çoxsaylı transkriptom və şəbəkə analizlərində RA ilə əlaqəli namizəd mərkəzi genlərdən biri kimi müəyyən edilmişdir.
• RA sinovial toxuma ekspressiya profillərində immunitet və iltihab yolları güclü şəkildə önə çıxmışdır.
• xCell analizi xüsusilə M1 makrofaq imzasının RA nümunələrində zənginləşdiyini göstərmişdir.
• RA FLS-lərində PSMB9 ekspressiyası OA FLS-lərinə nisbətən daha yüksək tapılmışdır.
• PSMB9 ekspressiyası interferon və sitokinlə əlaqəli yol aktivliyi ilə müsbət əlaqə göstərmişdir.
• PSMB9–sinomenin docking skoru −9,0 kcal/mol olaraq hesablanmışdır.
• CETSA sinomeninin PSMB9 üzərində zəif termal stabilləşdirici təsiri ilə uyğun nəticə vermişdir.
• 150–600 µM sinomenin LPS ilə stimullaşdırılmış RAW264.7 hüceyrələrində IL-6 və TNF-α səviyyələrinin dozadan asılı azalması ilə əlaqəlidir.
• Sinomenin PSMB9 zülal ekspressiyasını dozadan asılı şəkildə azaltmışdır.

Tədqiqatın dəstəkləmədiyi nəticələr

PSMB9-un hazırda klinikada təsdiqlənmiş RA diaqnostik biomarkeri olduğu bu tədqiqatla sübut edilməmişdir. Tədqiqat PSMB9-u namizəd biomarker kimi göstərir və müəlliflər daha böyük müstəqil kohortlarda təsdiqə ehtiyac olduğunu bildirirlər.

Sinomeninin insan RA xəstələrində PSMB9-u azaldaraq klinik yaxşılaşma yaratdığı bu tədqiqatda birbaşa sınaqdan keçirilməmişdir.

Docking skoru təkbaşına sinomeninin PSMB9-a qəti şəkildə bağlandığını sübut etmir.

CETSA tapıntısı güclü və tam biofiziki bağlanma xarakterizasiyası deyil; mənbə bunu zəif stabilləşmə və mümkün target engagement kimi müzakirə edir.

PSMB9 sinomeninin yeganə antiinflamatuar hədəfi kimi göstərilməmişdir. Müəlliflər sinomeninin Nrf2 kimi digər yollar da daxil olmaqla bir neçə mexanizm vasitəsilə təsirli ola biləcəyini xüsusi qeyd edirlər.

LPS ilə stimullaşdırılmış RAW264.7 makrofaq modeli insan RA sinoviumunun mürəkkəb xroniki autoimmun mikromühitinin hamısını təmsil etmir.

Tədqiqatda in vivo heyvan təsdiqi aparılmamışdır.

Tədqiqatın güclü tərəfləri

Tədqiqatın güclü tərəflərindən biri PSMB9-u yalnız bir məlumat dəsti və ya bir alqoritmlə seçməməsidir. Müxtəlif gen ekspressiya məlumat dəstləri, WGCNA, PPI, immun infiltrasiya və single-cell analizləri bir-birini tamamlayan qatlar kimi istifadə edilmişdir.

İkinci güclü tərəf hesablamalı docking nəticəsinin birbaşa yekun mexanizm kimi qəbul edilməməsi və hüceyrəvi CETSA, Western blot və sitokin ölçmələri ilə izlənməsidir.

Üçüncü güclü tərəf məlumat dəstlərinin fərqli platformalardan gəlməsi səbəbindən matrislərin birbaşa birləşdirilməməsi və platformalararası batch effektinin azaldılması üçün gen səviyyəli nəticələrin konsensus analizində istifadə edilməsidir.

Əsas məhdudiyyətlər

• Funksional təcrübələr yalnız RAW264.7 siçan makrofaq hüceyrə xəttində aparılmışdır.
• Bir neçə hüceyrə xətti və ya primer insan RA hüceyrələri ilə funksional təsdiq aparılmamışdır.
• Heyvan modeli istifadə edilməmişdir.
• İnsanlarda sinomenin–PSMB9 mexanizmini birbaşa sınaqdan keçirən yeni klinik tədqiqat yoxdur.
• Single-cell məlumatı yalnız OA4, OA5, RA8 və RA9 olmaqla dörd donordan ibarətdir.
• Single-cell nəticələri buna görə kəşfiyyat xarakterli hesab edilməlidir.
• PSMB9-un diaqnostik performansı böyük müstəqil kohortlarda prospektiv şəkildə təsdiqlənməmişdir.
• Molekulyar docking fiziki bağlanmanın birbaşa ölçümü deyil.
• CETSA yalnız zəif termal stabilləşmə göstərmişdir.
• Sinomeninin PSMB9 ekspressiyasını azaltmasının bütün molekulyar ara mərhələləri aydınlaşdırılmamışdır.
• Sinomeninin bir neçə antiinflamatuar mexanizm vasitəsilə təsirli ola biləcəyi nəzərə alındıqda PSMB9 yeganə izah deyil.

Nəticələrin düzgün bioloji mənası

Bu tədqiqatın bütün analiz qatları birlikdə qiymətləndirildikdə PSMB9 RA sinoviumundakı immun aktivləşmə ilə stromal fibroblastların iltihabi proqramları arasında əlaqə yarada bilən namizəd immunoproteazom düyünü kimi ortaya çıxır.

Sinomenin tərəfində sübut zənciri üç ayrı səviyyədədir: docking hesablamalı şəkildə mümkün bağlanma pozası göstərmiş, CETSA hüceyrə daxilində mümkün hədəf qarşılıqlı təsirini dəstəkləmiş, Western blot və ELISA isə sinomenin tətbiqinin PSMB9 zülal səviyyəsi ilə IL-6/TNF-α iltihabi çıxışlarına təsirini göstərmişdir.

Bu qatların birlikdə olması mexanistik hipotezi gücləndirir; lakin heç biri təkbaşına sinomeninin insan revmatoid artritində PSMB9 vasitəsilə qəti müalicə mexanizmini sübut etmir.

Buna görə ən uyğun nəticə cümləsi belədir: PSMB9 revmatoid artritdə daha irəli təsdiqi haqq edən immun əlaqəli namizəd hədəf/biomarkerdir və sinomenin PSMB9-un tənzimlənməsi vasitəsilə iltihabı qismən azalda bilər.

Mənbə və Metod Qeydi

Orijinal başlıq: Sinomenine Regulates PSMB9 to Mediate Therapeutic Effects in Rheumatoid Arthritis

Müəlliflər: Cui Zhang; Chonkit Lio; Nana Li; Yang Yu; Jinfang Luo.

Müəllif sırası: Mənbədəki sıra eynilə qorunmuşdur.

Bərabər töhfə: Cui Zhang və Chonkit Lio bərabər töhfəli müəlliflərdir.

Məsul müəlliflər: Chonkit Lio və Jinfang Luo.

Qurum 1: Department of Basic Medicine, Department of Pharmacy, Key Laboratory on the Property & Effect of Chinese Medicine (Ethnic Medicine), Guizhou Genuine Herbs Center of Consistency of Utility, Guizhou Key Laboratory of Miao Medicine, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China.

Qurum 2: Faculty of Chinese Medicine, Macau University of Science and Technology, Avenida Wailong, Taipa, Macao, China.

Qurum 3: State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine, Macau University of Science and Technology, Avenida Wailong, Taipa, Macao, China.

Chonkit Lio üçün mənbədə verilən cari ünvan: Department of Medical Biochemistry, Tohoku University Graduate School of Medicine, Sendai, Japan.

Jurnal: Cells.

Nəşriyyat: MDPI, Basel, Switzerland.

Cild / nömrə / məqalə nömrəsi: 15 / 11 / 1005.

DOI: 10.3390/cells15111005.

Rəsmi DOI bağlantısı: https://doi.org/10.3390/cells15111005

Qəbul olunma tarixi: 1 aprel 2026.

Reviziya tarixi: 4 may 2026.

Qəbul tarixi: 26 may 2026.

Nəşr tarixi: 29 may 2026.

Mənbə növü: Article — inteqrasiya olunmuş transkriptomik/bioinformatik analiz, molekulyar docking və in vitro hüceyrəvi təcrübələri birləşdirən orijinal tədqiqat məqaləsi.

Rəyçilik statusu: Nəşr olunmuş, resenziyalı jurnal məqaləsidir.

Lisenziya: Creative Commons Attribution — CC BY.

Əsas məlumat mənbələri: GEO GSE276772, GSE285977, GSE55457 və GSE77298; single-cell yenidən analizi üçün GSE109449.

Diferensial ekspressiya həddi: p < 0.05 və |log2FC| > 0.5.

Mikroarray emalı: affy v1.80.0 + RMA; limma v3.58.1.

RNA-seq analizi: DESeq2 v1.42.1.

Çatışmayan dəyərlərin işlənməsi: impute v1.76.0.

GO/KEGG: clusterProfiler v4.11.0; org.Hs.eg.db və org.Mm.eg.db.

GSEA: clusterProfiler; MSigDB gen dəstləri msigdbr v25.1.1; minimum gen dəsti 10, maksimum 500.

İmmun infiltrasiyası: xCell v1.1.0; Wilcoxon rank-sum testi.

WGCNA: WGCNA v1.73; signed network; soft-thresholding power β = 7; TOM və dynamicTreeCut; modul–trait qiymətləndirilməsi Pearson korrelyasiyası, p < 0.05.

PPI: STRING; minimum interaction confidence score = 0.95.

Single-cell məlumatı: GSE109449; OA4, OA5, RA8 və RA9 olmaqla dörd donordan 396 synovial fibroblast hüceyrəsi.

Single-cell normallaşdırılması: CPM və log2(CPM + 1).

Yol aktivliyi: GSVA v1.50.5; Hallmark gen dəstləri.

Korrelyasiya: PSMB9 ekspressiyası ilə immun yol aktivliyi üçün Spearman korrelyasiyası.

Molekulyar docking: CB-DOCK2; PSMB9 PDB ID 6avo; SIN strukturu PubChem; ən aşağı Vina skoruna malik poza seçilmişdir.

Mənbədaxili texniki qeyd: PSMB9 kristal strukturunun PDB-dən alındığı bildirilsə də, metod mətnində strukturun “PDF formatında” saxlanıldığı yazılmışdır. Verianla bu ifadəni mənbədənkənar fərziyyə ilə düzəltməmişdir.

Docking nəticəsi: PSMB9–SIN Vina skoru −9,0 kcal/mol.

Hüceyrə xətti: RAW264.7 siçan makrofaq hüceyrələri.

Hüceyrə kulturası: DMEM + %10 fetal bovine serum; 37 °C; %5 CO₂.

Sinomenin saflığı: >%99.

CCK-8 dozaları: 150, 300, 600, 1200 və 2400 µM SIN; 18 saat.

Funksional təcrübə SIN dozaları: 150–600 µM.

LPS: 1 µg/mL.

DEX: Western blot təcrübəsində 1 µM.

ELISA: IL-6 və TNF-α; 450 nm ölçmə, 570 nm background correction.

Western blot: PSMB9 1:1000; β-actin 1:3000; HRP sekonder 1:3000; ImageJ v1.53a kəmiyyətləndirilməsi.

CETSA: SIN 600 µM / 19 saat; 53, 63, 73, 83, 90 və 98 °C; hər temperatur üçün 3 dəqiqə; −80 °C-də 10 dəqiqə; üç freeze–thaw dövrü.

Hüceyrəvi statistika: GraphPad Prism 8.0.2; one-way ANOVA + Tukey post hoc; mean ± SD; p < 0.05.

Maliyyələşdirmə: National Science Foundation of China (82160779, 82505133); Research Project of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine No. GuiZhong, Yi Ke Yu (2025)54; Guizhou University of Traditional Chinese Medicine Talent Innovation Team [Gui Traditional Chinese Medicine TD He Zi [2023] 002]; Guizhou University of Traditional Chinese Medicine National and Provincial Science and Technology Innovation Talent Team Cultivation Project TD NO.[2022]004; Guizhou Provincial Basic Research Program No. ZK[2024]358.

Etik komitə: Tətbiq edilmir.

Məlumatlandırılmış razılıq: Tətbiq edilmir.

Məlumatların əlçatanlığı: GSE276772, GSE285977, GSE55457 və GSE77298 GEO-da açıq şəkildə əlçatandır; əlavə eksperimental məlumatların institusional məlumat idarəetməsi və saxlama qaydalarına görə əsaslandırılmış sorğu əsasında məsul müəllifdən əldə edilə biləcəyi bildirilmişdir.

Maraqların toqquşması: Müəlliflər maraqların toqquşmasının olmadığını bəyan etmişlər.

Müəllif töhfələri: Cui Zhang, Chonkit Lio və Jinfang Luo: metodologiya, formal analiz, təsdiqləmə və ilkin layihə. Nana Li və Yang Yu: məlumatların idarə edilməsi və formal analiz. Chonkit Lio və Jinfang Luo: nəzərdən keçirmə, redaktə və resurslar. Bütün müəlliflər dərc olunmuş versiyanı oxumuş və qəbul etmişlər.

Əsas metodoloji məhdudiyyət: Funksional SIN–PSMB9 təsdiqi yalnız LPS ilə stimullaşdırılmış RAW264.7 siçan makrofaqlarında aparılmışdır. Tədqiqatda in vivo təcrübə və ya yeni insan klinik təsdiqi yoxdur. Single-cell analiz dörd donorla məhduddur və kəşfiyyat xarakterli hesab edilmişdir. PSMB9-un diaqnostik və terapevtik dəyəri daha böyük müstəqil kohortlar, primer xəstə hüceyrələri və in vivo modellərlə təsdiqlənməlidir.