Koryoallantoik membran (Chorioallantoic Membrane, CAM), gelişmekte olan tavuk embriyosunda gaz, metabolit ve mineral alışverişine katılan, yüzeye yakın ve yoğun damar ağı nedeniyle anjiyogenez araştırmalarında doğrudan görüntülenebilen bir ekstraembriyonik membrandır. Ekstrakorporeal şok dalga tedavisi (Extracorporeal Shock Wave Therapy, ESWT) ise dokulara akustik şok dalgaları aracılığıyla mekanik enerji aktaran biyofiziksel bir uygulamadır. Bu çalışma, ESWT'nin CAM damar ağına doğrudan ve yeniden üretilebilir biçimde uygulanabileceği standart bir deney düzeneği geliştirmeyi ve bu düzenek kullanıldığında damar ağında oluşan morfolojik yanıtı incelemeyi amaçlamaktadır.

Araştırmacılar tek bir deney düzeneğini doğrudan seçmek yerine üç aşamalı bir geliştirme süreci izlemiştir. İlk aşamada üç olası ESWT-CAM uygulaması k-Wave kullanılarak akustik olarak simüle edilmiş; ikinci aşamada bu düzenlerin pratik uygulanabilirliği test edilmiş; üçüncü aşamada ise en uygun bulunan düzen kullanılarak nihai biyolojik deney gerçekleştirilmiştir. Son protokolde ESWT, embriyonik 5. günde (E5) ex ovo CAM düzeneğinin bulunduğu plastik kabın tabanından uygulanmış; 400 şok dalgası, 0,07 mJ/mm² enerji akı yoğunluğu ve 3 Hz frekans kullanılmıştır. Damar ağı embriyonik 10. günde (E10) görüntülenmiştir.

Nihai biyolojik analizde kontrol ve ESWT gruplarında 16'şar CAM değerlendirilmiş, her CAM'den dört bağımsız bölge görüntülenerek grup başına 64 görüntü elde edilmiştir. IKOSA CAM Assay ile toplam 300.431 damar segmenti analiz edilmiştir. ESWT grubunda damar sayısı yaklaşık %14,3 daha yüksek bulunmuştur (p = 0,050; %95 GA 1,00–1,31). Dallanma noktaları yaklaşık %13,5 artmıştır ancak bu karşılaştırmanın p değeri 0,070'dir. Ortalama damar kalınlığı yaklaşık %8,0 azalmıştır (p = 0,047; %95 GA 0,85–1,00). Medyan damar uzunluğundaki yaklaşık %5,3 azalma istatistiksel olarak anlamlı değildir (p = 0,143) ve görüntü başına toplam damar alanı değişmemiştir (p = 0,760).

Sonuçların örüntüsü, bütün damar ağının aynı oranda büyümesinden çok kısa-orta uzunluktaki ve daha ince kalibreli damarların sayısında artışla uyumludur. Bununla birlikte çalışma, bu yeni damar örüntüsünün filizlenme tipi anjiyogenezden mi, intussuseptif anjiyogenezden mi veya bu mekanizmaların birleşiminden mi kaynaklandığını doğrudan göstermemektedir. İki boyutlu damar morfometrisi bu mekanizmaları birbirinden kesin biçimde ayıramaz. Ayrıca CAM, erişkin insan dokusundan farklı ve gelişmekte olan bir damar sistemidir; bu nedenle ölçülen etki büyüklükleri insan dokusuna veya klinik tedavi sonuçlarına doğrudan aktarılamaz.

Anjiyogenez nedir ve bu çalışmada ne ölçülüyor?

Anjiyogenez, önceden var olan damar sisteminden yeni kan damarlarının oluşması sürecidir. Doku yenilenmesi, yara iyileşmesi ve kanlanmanın yeniden kurulması açısından önemlidir. Bununla birlikte “anjiyogenez arttı” ifadesi yalnızca tek bir görüntü özelliğine bakılarak güvenilir biçimde kurulamaz. Damar genişlemesi, damar daralması veya görüntüleme geometrisi yalnız damar alanını ya da kalınlığı değiştirerek yanıltıcı bir görüntü oluşturabilir.

Bu nedenle çalışma damar sayısını, dallanma noktalarını, damar kalınlığını, damar uzunluğunu ve toplam damar alanını birlikte değerlendirmiştir. Böylece yalnızca “görüntüde daha fazla kırmızı damar var” gibi öznel bir izlenim yerine, damar ağının geometrisinin hangi yönde değiştiği nicel olarak incelenmiştir.

CAM Modeli ile ESWT Neden Birlikte İncelendi?

CAM modeli, yüzeye yakın yoğun damar ağı doğrudan görüntülenebildiği için ESWT gibi biyofiziksel bir uyarının damar yapısı üzerindeki etkisini hızlı ve nicel biçimde incelemeye elverişlidir; çalışmanın özgün amacı da ESWT'yi CAM damar sistemine doğrudan uygulayan standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir protokol oluşturmaktır.

CAM, döllenmiş ve inkübe edilmiş tavuk yumurtasında bulunan yüksek derecede vaskülarize bir ekstraembriyonik zardır. Gelişen embriyonun gaz, metabolit ve mineral alışverişine katkı verir. Damarların yüzeye yakın olması, belirli bir bölgenin mikroskop altında görüntülenmesini ve damar ağındaki değişimlerin sayısal olarak ölçülmesini kolaylaştırır.

ESWT'de dokunun içine bir ilaç yerleştirilmez. Odaklanmış akustik dalgalar mekanik enerji taşır. Literatür arka planında bu mekanik uyarının hücre zarındaki mekanosensörlerle ilişkili mekanotransdüksiyon yollarını etkileyebildiği; caveolin-1 ve β1-integrin gibi yapılar üzerinden vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve endotelyal nitrik oksit sentazı (eNOS) ile ilişkili sinyalleri etkileyebildiği tartışılmaktadır. Ancak bu çalışmada VEGF, eNOS, caveolin-1 veya β1-integrin düzeyleri ölçülmemiştir. Bunlar çalışmanın morfolojik damar sonuçlarını açıklamak için kullanılan bilimsel arka plandır, bu deneyde doğrudan doğrulanmış moleküler sonuçlar değildir.

Araştırmanın üç aşamalı geliştirme mantığı

Çalışmanın temel gücü, biyolojik deneye geçmeden önce fiziksel uygulanabilirliği sınamasıdır. ESWT dalgası yumurta kabuğu, su, hava, tuzlu su ve plastik gibi farklı ortam sınırlarından geçerken yansıyabilir, kısmen soğurulabilir veya basınç dağılımı değişebilir. Dolayısıyla yalnızca aplikatörü CAM'e yaklaştırmak, hedef bölgeye öngörülebilir bir mekanik uyarı ulaştığı anlamına gelmez.

Ex ovo CAM modeli nasıl hazırlandı?

Çalışmada doğrudan erişim ve görüntüleme için ex ovo yaklaşımı kullanılmıştır. “In ovo”, embriyonun yumurta kabuğu içinde tutulduğu durumu; “ex ovo” ise yumurta içeriğinin kabuktan çıkarılarak kontrollü başka bir kapta inkübe edilmesini ifade eder.

Döllenmiş beyaz Lohmann tavuk yumurtaları yatay biçimde 37,6 °C ve %60 bağıl nem koşullarında otomatik döndürmeyle inkübe edilmiştir. Embriyonik 5. günde (E5) yumurtalar canlılık açısından ışıkla kontrol edilmiş, steril koşullarda kırılmış ve steril tek kullanımlık tartım kaplarına aktarılmıştır. Kaplar kapakla örtülmüş ve döndürme uygulanmadan tekrar inkübatöre konmuştur.

CAM damar ağı E4–E5 civarında gelişmeye başlar ve E10'a kadar hızla büyür. ESWT tedavi grubuna E5'te uygulanmış, yaşayan embriyolardaki CAM damar ağı E10'da görüntülenmiştir. Görüntülemenin hemen ardından embriyolar sonlandırılmıştır. Kaynak, bu gelişim döneminin önerilen nosiseptif işlem başlangıcından önce olduğunu ve çalışmanın kullandığı düzen için etik kurul onayının gerekli olmadığını belirtmektedir.

Üç aday ESWT-CAM uygulaması

Üç Aday Uygulama Düzeni Neden Aynı Sonucu Vermedi?

Çünkü şok dalgası hedefe ulaşmadan önce su, yumurta kabuğu, hava, NaCl çözeltisi ve plastik gibi farklı akustik özelliklere sahip ortam sınırlarından geçmektedir; bu sınırlar dalganın yansımasını, basınç profilini ve mekanik hasar riskini değiştirmiş, pratik deneyler de yalnız basınç aktarımının değil embriyo yaşamının ve standardizasyonun birlikte değerlendirilmesi gerektiğini göstermiştir.

Akustik simülasyon nasıl yapıldı?

ESWT'nin CAM damar ağına ulaşırken karşılaşacağı fiziksel koşullar MATLAB 2023b içindeki k-Wave sürüm 1.4 kullanılarak modellenmiştir. Şok dalgası aplikatörünün giriş sinyali, ilgili enerji seviyelerinde iğne hidrofon ile yapılan basınç ölçümlerinden yeniden oluşturulmuştur.

Orta büyüklükte bir yumurtayı temsil etmek için yarıçapları 28 mm ve 22 mm olan elipsoidal bir geometri kullanılmış ve yaklaşık 54,6 mL hacim elde edilmiştir. Yumurtadaki hava hacminin kaynak literatürde toplam hacmin yaklaşık %1,5–8'i arasında değişebildiği belirtilmiş ve simülasyonda %5 kullanılmıştır.

Simülasyon, NVIDIA RTX 4090 bulunan, toplam 512 GB RAM ve Intel Xeon Gold 6326 işlemci kullanan bir iş istasyonunda k-Wave CUDA koduyla yürütülmüştür. Uzaysal çözünürlük 0,14 mm olup bu çözünürlükte desteklenen maksimum frekans 1,225 MHz olarak bildirilmiştir.

Boş su banyosu referans simülasyonunda 0,17 mJ/mm² enerji ayarında yayılım ekseni boyunca yapılan ölçümler kullanılmış, odak uzaklığı 26 mm'ye uyarlanmış ve ortalama tepe basıncı yaklaşık 10,5 MPa olarak elde edilmiştir. Bu değer sonraki düzenlerin basınç aktarımını değerlendirmek için referans oluşturmuştur.

Simülasyonda hava yoğunluğu neden gerçek değerden farklı kullanıldı?

Su ve hava arasındaki çok büyük akustik özellik farkı, düşük simülasyon çözünürlüklerinde sayısal artefaktlara neden olabildiği için hava yoğunluğu nominal yaklaşık 1,2 kg/m³ yerine 100 kg/m³ olarak kullanılmıştır. Bu, gerçek havanın fiziksel olarak 100 kg/m³ olduğu anlamına gelmez; yalnızca sayısal modelleme tercihidir.

Yazarların Snell yasasına dayalı hata değerlendirmesinde nominal değerler enerji yansımasını yaklaşık %99,9, simülasyonda kullanılan değer ise yaklaşık %91,1 vermektedir. Dolayısıyla yansıyan enerji simülasyonda yaklaşık %9 düşük tahmin edilmektedir. Yazarlar bu nedenle simülasyonları mutlak dozimetri olarak değil, tedavi bölgesindeki basınç dağılımının tahmini olarak yorumlamaktadır.

Enerji akı yoğunluğu neyi ifade ediyor?

Enerji akı yoğunluğu (Energy Flux Density, EFD), ESWT uygulamasının şok dalgasıyla belirli bir yüzey alanına aktardığı enerji düzeyini tanımlamak için kullanılan parametredir ve bu çalışmada mJ/mm² birimiyle verilmiştir. Çalışmanın pratik testlerinde 400 şok dalgası; 0,24, 0,17 ve 0,07 mJ/mm² EFD seviyelerinde ve 3 Hz frekansta sınanmıştır.

3 Hz, saniyede üç şok dalgası anlamına gelir. 400 şok ise tek uygulama oturumunda verilen toplam şok sayısıdır. Bu üç parametre birbirinin yerine geçmez: EFD her şokun alan başına enerji düzeyini, frekans şokların ne kadar sık uygulandığını, şok sayısı ise toplam uygulama dizisinin uzunluğunu tanımlar.

Nihai CAM protokolünde 400 şok, 0,07 mJ/mm² ve 3 Hz seçilmiştir. Daha yüksek 0,17 ve 0,24 mJ/mm² seviyelerinde kapiller filizlerde küçük kanamalar gözlenmiştir. Bu seçim CAM modelinin kırılganlığı göz önüne alınarak yapılmıştır; yetişkin insan dokusu için optimal klinik doz belirlediği anlamına gelmez.

Kontrol grubu neden aynı süre boyunca inkübatörden çıkarıldı?

ESWT grubunun işlem sırasında inkübatörden çıkarılması sıcaklık, nem, hareket ve ışık maruziyetinde geçici değişiklik oluşturabilir. Bu değişikliklerin ESWT etkisiyle karışmaması için kontrol CAM'leri de tedavi grubuyla aynı süre boyunca inkübatör dışında tutulmuştur. Her iki grupta şeffaf kapaklar yerinde bırakılmıştır. Gruplar arasındaki amaçlanan temel fark, yalnız ESWT uygulamasıdır.

Çalışmada klasik bir sham ESWT uygulanmamıştır. Yazarlar, doğrudan CAM uygulaması için gerçekten etkisiz ve fiziksel olarak karşılaştırılabilir bir sham koşulunun bulunmadığını; çok düşük enerji düzeyindeki ESWT'nin bile biyolojik etki gösterebileceğini gerekçe göstermektedir. Dolayısıyla “sham yokluğu” tasarımın bilinçli bir seçimidir fakat yine de sonuçların yorumlanmasında dikkate alınması gereken yöntemsel bir özelliktir.

Görüntüleme ve IKOSA analizi

E10'da her yaşayan CAM'den damar ağının bağımsız bölgelerini temsil eden dört rastgele görüntü alınmıştır. Görüntüleme Leica M651 ışık mikroskobu ile 10× büyütmede ve Nikon D5600 SLR kamera kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Görüntüler, derin öğrenmeye dayalı IKOSA CAM Assay Application ile otomatik olarak analiz edilmiştir. Yazılım görüntü segmentasyonu kullanarak damarları arka plandan ayırır ve damar sayısı, dallanma noktası sayısı, ortalama kalınlık, toplam damar alanı, toplam damar uzunluğu ve tek tek damar segmentlerinin uzunluk/kalınlık özelliklerini ölçer.

Dallanma noktası, damar ağında bir segmentin iki veya daha fazla kola ayrıldığı ağ düğümünü ifade eder. Damar kalınlığı görüntüde segmentlenen damar yapısının genişliğini; damar uzunluğu segmentin görüntü üzerindeki uzunluğunu; toplam damar alanı ise görüntü içinde damar olarak sınıflandırılan toplam yüzey alanını temsil eder. Kaynaktaki uzunluk ve kalınlık değerleri piksel cinsindedir; fiziksel mikrometre değerlerine çevrilmemiştir.

İstatistiksel model neden basit bir ortalama karşılaştırmasından daha karmaşık?

Her CAM'den dört görüntü alınmıştır. Dolayısıyla aynı yumurtadan gelen dört görüntü birbirinden tamamen bağımsız dört biyolojik örnek değildir. Araştırmacılar bu iç içe geçmiş yapıyı dikkate almak için genelleştirilmiş doğrusal karma modeller (Generalized Linear Mixed Models, GLMM) kullanmış ve her yumurta için rastgele kesişim terimi tanımlamıştır. Böylece aynı CAM'den alınan görüntülerin ortak biyolojik kaynağı modele dâhil edilmiştir.

Damar sayısı ve dallanma noktası gibi sayım değişkenlerinde negatif binom dağılımı ve log bağlantısı; damar uzunluğu/kalınlığı gibi pozitif sürekli büyüklüklerde ise Gamma dağılımı ve log bağlantısı kullanılmıştır. Analiz RStudio 2026.05 ortamında glmmTMB/lme4 paketleriyle gerçekleştirilmiştir.

Log bağlantısı, modelin etkileri doğrudan “kaç piksel arttı?” biçiminde değil oranlar üzerinden değerlendirmesine olanak verir. Bu nedenle makale GLMM sonuçlarını yüzde değişim ve %95 güven aralığı biçiminde raporlamaktadır. Kaynak makalede bu model için açık bir matematiksel denklem basılmadığından burada kaynak dışı bir GLMM denklemi çalışmanın formülüymüş gibi eklenmemiştir.

Dağılımların bütünü Kolmogorov–Smirnov testi ile karşılaştırılmıştır. Bu test yalnız ortalamayı değil, iki grubun dağılım şekillerinin aynı olup olmadığını değerlendirir. Damarların uzunluk ve kalınlık çeyrekliklerine dağılımı Pearson χ² testiyle incelenmiştir. Ayrı ayrı çeyrekliklerde yapılan çoklu GLMM karşılaştırmaları için Holm düzeltmesi uygulanmıştır; bu düzeltme çok sayıda hipotez test edilirken yanlış pozitif sonuç riskini kontrol etmeye yardımcı olur.

Çalışmanın önceden belirlediği istatistiksel anlamlılık eşiği p < 0,05'tir. Bu eşik, p değerinin etkinin büyüklüğünü göstermediği gerçeğini değiştirmez; p değeri, kullanılan model ve sıfır hipotezi altında verinin ne kadar uyumsuz olduğunu değerlendiren istatistiksel bir ölçüdür. Etkinin büyüklüğü ayrıca yüzde değişim ve güven aralığıyla birlikte okunmalıdır.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Nihai CAM-ESWT protokolünün zaman çizelgesi

Örneklem nasıl oluştu?

Her üç aday CAM-ESWT düzeninin ön uygulanabilirlik deneyinde n = 10 yumurta kullanılmıştır. Nihai biyolojik çalışma için inkübatör kapasitesinin izin verdiği 64 döllenmiş yumurta ex ovo düzeneğe aktarılmış ve kontrol ile ESWT gruplarına 32'şer yumurta ayrılmıştır.

E10'a kadar toplam 32 CAM yaşamıştır: 16 kontrol ve 16 ESWT. Böylece ex ovo kültür için yaklaşık %50 toplam sağkalım elde edilmiştir. Kaynak, sağkalımın gruplar arasında farklı olmadığını ve kayıpların ESWT uygulamasına bağlanmasını destekleyen bir grup farkı görülmediğini belirtmektedir.

Her yaşayan CAM'den dört bağımsız bölge görüntülendiği için grup başına 64 görüntü, toplamda 128 görüntü analiz edilmiştir. IKOSA segmentasyonu bu görüntülerde toplam 300.431 damar değerlendirmiştir.

Kaynak Tablo 1'deki tanımlayıcı damar verileri

Bu tablo ham tanımlayıcı toplamları gösterir. Örneğin 159.380 ve 141.051 sayılarının basit oranı ile GLMM'nin verdiği %14,3 etki büyüklüğünün birebir aynı olması beklenmez; istatistiksel model görüntü düzeyinde çalışır ve aynı yumurtadan alınan görüntülerin kümelenmesini rastgele etki aracılığıyla hesaba katar.

GLMM ile elde edilen temel etkiler

p = 0,050 Sonucu Nasıl Yorumlanmalıdır?

Makalenin önceden belirlediği anlamlılık kriteri p < 0,05 iken damar sayısı için raporlanan değer p = 0,050 olduğundan sonuç kesin bir “istatistiksel olarak anlamlı artış” şeklinde büyütülmemelidir; yazarların kendi anlatımına uygun biçimde damar sayısında yaklaşık %14,3 artış gözlendiği, ancak sonucun sınırda olduğu ve daha büyük örneklemle doğrulanması gerektiği söylenmelidir.

Burada iki ayrıntı önemlidir. Birincisi, p değerinin üç ondalıkla verilmesi altında daha fazla basamaklı ham değerin ne olduğu makalede gösterilmemektedir; bu nedenle 0,050'yi kafadan 0,0499 veya 0,0501 gibi yorumlamak doğru değildir. İkincisi, yalnız p değerine bakmak da yeterli değildir. Etki büyüklüğü yaklaşık %14,3'tür ve %95 güven aralığı oran ölçeğinde 1,00–1,31 olarak raporlanmıştır. Bu da tahminin sınır bölgesinde olduğunu gösteren başka bir işarettir.

Damar uzunluğu ve kalınlığının dağılımı nasıl değişti?

Kontrol ve ESWT gruplarında damar uzunluğu dağılımları Kolmogorov–Smirnov testinde D = 0,027, damar kalınlığı dağılımları ise D = 0,054 ile farklı bulunmuş ve her iki karşılaştırmada p ≪ 0,001 raporlanmıştır. Bu sonuç, gruplar arasındaki farkın yalnız tek bir ortalama değerin kaymasından ibaret olmadığını, dağılımın bileşiminin de değiştiğini göstermektedir.

Çeyrekliklerin gruplar içindeki oransal bileşimi de uzunluk için χ² = 281,2, kalınlık için χ² = 725,6 ile farklıdır; her ikisinde de p ≪ 0,001'dir.

Kalınlıkta en büyük artış Q1'de, yani en ince damar sınıfında görülmekte; Q2 ve Q3'te etki giderek azalmakta, Q4'te ise yaklaşık değişim bulunmamaktadır. Uzunluk açısından artış Q1–Q3 arasında benzer büyüklüktedir ve en uzun Q4 sınıfında yalnız +%2'dir. Bu nedenle damar fazlası, büyük damarların homojen biçimde çoğalmasından çok ince ve kısa-orta uzunlukta damar segmentlerinde yoğunlaşmaktadır.

Ancak burada önemli bir istatistiksel sınır vardır: Q1–Q4 için ayrı ayrı yapılan GLMM testlerine Holm düzeltmesi uygulandıktan sonra hiçbir tekil çeyreklik istatistiksel anlamlılığa ulaşmamıştır. Dolayısıyla çeyreklik değerleri bağımsız “kanıtlanmış dört etki” gibi sunulmamalıdır. Kaynağın savunduğu şey, dağılımın bütününde tutarlı bir kompozisyon kayması olduğudur.

Daha fazla damar varken toplam damar alanı neden değişmedi?

Damar sayısının artması ile toplam damar alanının aynı kalması ilk bakışta çelişkili görünebilir. Ancak damarların ortalama olarak daha ince hale gelmesi, görüntüde daha çok sayıda damar segmenti bulunurken bunların kapladığı toplam alanın yaklaşık aynı kalmasına olanak verir. Kaynak bu örüntüyü, geniş çaplı damarların genel büyümesinden çok daha yoğun bir mikrodamar ağı ortaya çıkmasıyla uyumlu bulmaktadır.

Bu yorumun anahtarı tek bir değişkene değil, birlikte değişen dört özelliğe bakmaktır: damar sayısı artıyor, dallanma noktaları artış yönünde, ortalama kalınlık azalıyor ve toplam damar alanı değişmiyor. Bu kombinasyon, “bütün damarlar genişlediği için damar olarak görülen alan arttı” açıklamasıyla uyumlu değildir.

Filizlenme ve intussuseptif anjiyogenez ne demektir?

Filizlenme tipi anjiyogenez (sprouting angiogenesis), mevcut bir damardan yeni, ince endotelyal uzantıların gelişerek yeni damar kolları oluşturmasıdır. Intussuseptif anjiyogenez ise mevcut damar lümeni içinde doku sütunlarının oluşmasıyla bir damarın iki daha küçük damar yoluna bölünmesini içeren farklı bir damar çoğalma mekanizmasıdır.

Çalışmada gözlenen daha ince ve kısa-orta uzunluktaki damar artışı her iki mekanizmayla da uyumlu olabilir. CAM gelişiminin E5–E7 döneminde filizlenmenin, E8–E12 döneminde ise intussuseptif büyümenin daha baskın olduğu literatür bilgisiyle birlikte düşünüldüğünde yazarlar ESWT'nin fizyolojik damar gelişimini güçlendirmiş olabileceğini tartışmaktadır.

Ancak bu açıklama mekanistik bir çıkarımdır. Çalışmada iki boyutlu damar morfometrisi kullanılmıştır ve bu yöntem filizlenme ile intussusepsiyonu doğrudan birbirinden ayıramaz. Aynı şekilde yeni görünen damarların olgun ve fonksiyonel dolaşım ağına ne ölçüde entegre olduğunu da ölçmez.

Moleküler mekanizmalar bu çalışmada doğrulandı mı?

Hayır. Bu çalışmada VEGF, VEGF-A, FGF-2, HIF-1α, eNOS, Ang-1/Ang-2, Erk1/2 veya Akt gibi moleküler belirteçler ölçülmemiştir. Yazarlar qPCR, Western blot ve immünohistokimya gibi yöntemlerin gelecekte ESWT'nin CAM'deki moleküler etkilerini doğrulamak için kullanılabileceğini önermektedir.

Dolayısıyla “ESWT bu deneyde VEGF'yi artırdı” veya “β1-integrin mekanizması bu çalışmada kanıtlandı” demek kaynak sınırını aşar. Mevcut çalışma esas olarak protokol geliştirme + damar morfolojisinin nicel analizi çalışmasıdır.

Çalışmanın desteklediği sonuçlar

• ESWT'yi CAM damar ağına doğrudan uygulamak için standardize edilebilir bir ex ovo yöntem geliştirilmiştir.
• Üç aday düzen içinde plastik tartım kabının tabanından uygulama, pratik uygulanabilirlik ve embriyo yaşamı açısından en uygun düzen olarak seçilmiştir.
• 400 şok, 0,07 mJ/mm² ve 3 Hz kombinasyonu nihai CAM deneyinde uygulanabilir bulunmuştur.
• ESWT grubunda modellenmiş damar sayısı yaklaşık %14,3 daha yüksektir; raporlanan p değeri 0,050'dir.
• Dallanma noktaları yaklaşık %13,5 artış yönündedir ancak p = 0,070 olduğundan anlamlılık eşiğine ulaşmamıştır.
• ESWT grubunda ortalama damar kalınlığı yaklaşık %8 daha düşüktür ve p = 0,047'dir.
• Toplam damar alanı değişmeden kalmıştır.
• Dağılım analizi, farklılığın özellikle ince ve kısa-orta uzunluktaki damar segmentlerinde yoğunlaştığıyla uyumludur.

Çalışmanın desteklemediği genellemeler

• Çalışma ESWT'nin insanlarda yeni damar oluşturduğunu kanıtlamaz.
• Çalışma belirli bir klinik hastalıkta ESWT'nin tedavi başarısını ölçmez.
• CAM'de bulunan %14,3 damar sayısı değişimi insan dokusunda beklenen etki büyüklüğü değildir.
• Çalışma filizlenme ve intussuseptif anjiyogenez mekanizmalarını doğrudan birbirinden ayırmaz.
• VEGF, eNOS veya diğer moleküler sinyal yollarının bu deneyde değiştiği doğrudan ölçülmemiştir.
• Tekrarlayan ESWT seanslarının etkisi araştırılmamıştır.
• 0,07 mJ/mm² değeri insanlar için evrensel optimal ESWT dozu olarak belirlenmemiştir.
• Simülasyon sonuçları mutlak akustik dozimetri değildir.

Temel sınırlılıklar

Tek doz ve tek seans: Nihai deney yalnız 0,07 mJ/mm² düzeyinde tek ESWT oturumunu incelemiştir. Birden fazla düşük enerjili uygulamanın veya farklı dozların uzun dönem yanıtı bu deney tasarımında değerlendirilmemiştir.

CAM dokusunun yapısı: CAM gelişmekte olan, olgunlaşmamış ve erişkin dokulardaki koruyucu çevre dokularından yoksun bir damar sistemidir. Bu nedenle mekanik hasara yetişkin memeli dokusundan farklı duyarlılık gösterebilir.

Ex ovo sağkalım: Başlangıçtaki 64 yumurtanın 32'si E10'a ulaşmıştır. Bu yaklaşık %50 sağkalım ex ovo kültür için kaynakta beklenen aralıkla uyumlu olarak değerlendirilse de kullanılabilir biyolojik örnek sayısını sınırlar.

İki boyutlu morfometri: Damar görüntüleri çok sayıda morfolojik değişkeni ölçebilse de damar oluşumunun hücresel mekanizmasını veya yeni damarların fonksiyonel olgunlaşmasını doğrudan göstermez.

Simülasyon yaklaşımı: Hava yoğunluğunun sayısal kararlılık amacıyla değiştirilmesi yansımayı yaklaşık %9 düşük tahmin etmektedir. Simülasyon kesme dalgalarını da tam olarak hesaba katmamaktadır. Bu nedenle basınç haritaları kesin fiziksel dozimetri olarak yorumlanmamalıdır.

Sham uygulamasının bulunmaması: Kontrol ve tedavi gruplarının inkübatör dışındaki süre ve işlem koşulları eşleştirilmiş olsa da fiziksel olarak tamamen benzer fakat biyolojik olarak etkisiz ayrı bir sham ESWT işlemi uygulanmamıştır.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün çalışma: A Novel Chorioallantoic Membrane (CAM) Setup to Investigate Angiogenic Effects of Extracorporeal Shock Wave Therapy (ESWT)

Yazarlar: Lorenz Faihs; Jonas Flatscher; Cyrill Slezak; Bardia Firouz; Nassim Ghaffari Tabrizi-Wizsy; Kurt Schicho; Paul Slezak; Peter Dungel.

Eşit katkı: Lorenz Faihs ve Jonas Flatscher çalışmaya eşit katkıda bulunmuştur.

Sorumlu yazar: Peter Dungel.

Kurumlar: Ludwig Boltzmann Institute for Experimental and Clinical Traumatology, Vienna, Austria; Department of Orthopedics, Herz Jesu Hospital, Vienna, Austria; Department of Physics, Utah Valley University, Orem, Utah, USA; Department of Urology, Klinik Ottakring, Vienna, Austria; SFL Chicken CAM Lab, Otto Loewi Research Center, Department of Immunology and Pathophysiology, Medical University of Graz, Graz, Austria; Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Medical University of Vienna, Vienna, Austria.

Dergi: Cells.

Yayıncı: MDPI, Basel, Switzerland.

Cilt / sayı / makale numarası: Volume 15, Issue 16, Article 1471.

DOI: 10.3390/cells15161471.

Gönderim tarihi: 7 Temmuz 2026.

Revizyon tarihi: 11 Ağustos 2026.

Kabul tarihi: 13 Ağustos 2026.

Yayın tarihi: 17 Ağustos 2026.

Kaynak türü: Hakemli, açık erişimli özgün araştırma makalesi. Kaynak, nihai yayımlanmış dergi sürümüdür; çalışma bu metinde preprint olarak ele alınmamıştır.

Lisans: Creative Commons Attribution (CC BY).

Resmî bağlantı: https://www.mdpi.com/2073-4409/15/16/1471

DOI bağlantısı: https://doi.org/10.3390/cells15161471

Finansman: Araştırma Austrian Research Promotion Agency (FFG) tarafından 853128 ve 47396168 numaralı hibeler kapsamında kısmen finanse edilmiştir. Endüstriyel ortak Repuls Lichtmedizintechnik GmbH, Vienna, Austria olarak bildirilmiştir.

Veri erişilebilirliği: Çalışmada sunulan verilerin sorumlu yazardan talep üzerine edinilebileceği belirtilmiştir. Veriler, CAM uygulama yazılımının (V39) devam eden endüstriyel geliştirilmesi nedeniyle kamuya açık değildir.

Çıkar çatışması: Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmiştir.

Etik durum: Kaynak, kullanılan tavuk embriyolarının bu gelişim aşamasında korunan hayvan sınıfına girmemesi nedeniyle etik kurul onayının uygulanabilir olmadığını bildirmektedir. Bu ifade kaynağın deney bağlamına aittir ve farklı mevzuatlara genel bir etik muafiyet olarak yorumlanmamalıdır.

Yazar katkıları: Kavramsallaştırma P.D., L.F., J.F., K.S. ve P.S.; yöntem L.F., J.F. ve N.G.T.-W.; yazılım J.F.; doğrulama L.F. ve B.F.; biçimsel analiz P.S., C.S. ve P.D.; araştırma L.F. ve J.F.; kaynaklar P.D. ve P.S.; veri düzenleme J.F. ve L.F.; ilk taslak L.F. ve J.F.; gözden geçirme ve düzenleme J.F., L.F., P.D. ve C.S.; görselleştirme J.F.; danışmanlık P.D. ve C.S.; proje yönetimi P.D. ve N.G.T.-W. tarafından yürütülmüştür.

Temel yöntemsel sınır: Çalışma, in silico akustik simülasyonları, ön uygulanabilirlik deneylerini ve tavuk embriyosu CAM üzerinde in vivo morfolojik damar analizini bir araya getirmektedir. Bulgular insan klinik etkinliği, insan dokusunda optimal ESWT dozu veya moleküler anjiyogenez mekanizmalarının doğrudan doğrulanması olarak yorumlanmamalıdır.