Üropatogen Escherichia coli (uropathogenic Escherichia coli, UPEC), sidik yolu infeksiyaları ilə əlaqəli E. coli ştamlarını ifadə edən bakterial qrupdur. Bu kəsiyvari tədqiqat, təkrarlanan sidik yolu infeksiyası tarixçəsi bildirən 80 iştirakçıda piylənmə ilə əlaqəli sahib orqanizm iltihabını, IL6R rs2228145 genetik variasiyasını və sidikdəki bakterial xüsusiyyətləri eyni tədqiqat çərçivəsində qiymətləndirmişdir. Qırx iştirakçı piylənmə qrupunda, 40 iştirakçı isə normal çəki müqayisə qrupundadır. Qan nümunələrində IL-6 və həll olunan IL-6 reseptoru (sIL-6R) ELISA ilə ölçülmüş, IL6R rs2228145 TaqMan genotipləməsi ilə müəyyən edilmiş; sidik nümunələrində kultura və 16S rRNA, fimH və papG hədəfli qPCR tətbiq edilmiş, seçilmiş iki UPEC izolatında bütün genom ardıcıllamasına baxılmışdır.
Piylənmə qrupunda 4PL kalibrləməsi ilə təxmin edilən orta IL-6 səviyyəsi 28,04 ± 3,37 ng/L, normal çəki qrupunda isə 18,43 ± 1,41 ng/L olmuşdur. Orta fərq 9,61 ng/L-dir və %95 etibar intervalı 8,45–10,77 ng/L olaraq hesablanmışdır. sIL-6R səviyyələri də piylənmə qrupunda daha yüksək olmuşdur: 39,87 ± 9,15 ng/mL-yə qarşı 33,69 ± 8,44 ng/mL. Buna qarşılıq IL6R rs2228145 üçün AA, AC və CC genotiplərinin paylanması iki BMI qrupu arasında əhəmiyyətli fərq göstərməmişdir.
Genotip–biomarker əlaqələri kəşfiyyat xarakterli analizlərdir. BMI qrupu modelə daxil edildikdə hər əlavə C alleli üçün təxmin edilən IL-6 səviyyəsində 1,06 qat və sIL-6R səviyyəsində 1,34 qat dəyişiklik bildirilmişdir. Bu dəyərlər müvafiq olaraq təxminən %6 və %34-lük multiplikativ artıma uyğun gəlir; lakin müvafiq modellərə əlavə klinik kovariatlar daxil edilməmiş və bu kəşfiyyat xarakterli p dəyərləri çoxsaylı müqayisə üçün düzəldilməmişdir. Nəticələr genetik variantın biomarker səviyyələrinə səbəb olduğunu təkbaşına sübut etmir.
Sidik kulturasında 37/80 nümunə UPEC kimi təsnif edilmişdir. Digər kultura nəticələri 10 Klebsiella pneumoniae, 6 Proteus mirabilis, 4 Enterococcus faecalis, 3 Staphylococcus saprophyticus və əhəmiyyətli bakterial inkişaf olmayan 20 nümunədən ibarətdir. UPEC-müsbət 37 nümunədə fimH 33/37, papG 18/37 nisbətində qPCR ilə aşkarlanmışdır.
Bütün genom ardıcıllaması yalnız seçilmiş iki UPEC izolatında aparılmışdır. UPEC1 ST127/O6:H31, UPEC2 isə ST131/O25:H4 olaraq müəyyən edilmişdir. Hər iki genomda fimH üçün uyğun WGS eşleşməsi tapıldığı halda, papG yalnız UPEC2-də WGS hədlərini ödəmişdir. Bununla belə, seçilmiş hər iki nümunə qPCR-da papG-müsbət olduğuna görə qPCR ilə WGS arasında UPEC1 baxımından həll edilməmiş uyğunsuzluq mövcuddur.
Tədqiqatın əsas şərh sərhədi mühümdür: eyni iştirakçılarda iltihabi biomarkerlərin, genotipin və bakterial xüsusiyyətlərin birlikdə ölçülməsi bu elementlər arasında birbaşa səbəbli sahib orqanizm–patogen mexanizmini sübut etmir. Bundan əlavə, “təkrarlanan İYE” tarixçəsi bildirilsə də əvvəlki infeksiyaların tarixləri və diaqnostik sənədləri mövcud olmadığından tədqiqatçılar bu tarixçənin müəyyən standart rekurrensiya tərifinə uyğun olub-olmadığını təsdiqləyə bilməmişlər.
Tədqiqatın araşdırdığı əsas problem nədir?
Piylənmə aşağı dərəcəli sistemik iltihabla əlaqəli metabolik vəziyyətdir. IL-6 kimi sitokinlərin dövr edən səviyyələri bu iltihabi mühitdən təsirlənə bilər. Digər tərəfdən, sidik yolu infeksiyalarında UPEC; adheziya, dəmir əldə etmə, immun sistemindən yayınma, toksin istehsalı, hüceyrədaxili yaşam və biofilm əmələ gəlməsi kimi müxtəlif xüsusiyyətlərlə sidik sistemində infeksiya yarada və ya davam etdirə bilər.
Bu tədqiqat iki fərqli bioloji qatı eyni nümunə daxilində yanaşı təqdim edir: bir tərəfdə insan sahibinin IL-6/sIL-6R iltihab oxu və IL6R rs2228145 genotipi, digər tərəfdə isə sidikdəki bakteriyaların kultura, adhezin geni qPCR-ı və seçilmiş genomların WGS profili yer alır.
Bu inteqrasiya olunmuş yanaşmanın məqsədi bu qatlardan hər hansı birinin digərinə səbəb olduğunu göstərmək deyil; piylənmə və bildirilmiş təkrarlanan İYE kontekstində birlikdə necə paylandıqlarını təsvir etməkdir.
Bu Tədqiqat Piylənmə ilə Təkrarlanan Sidik Yolu İnfeksiyası Arasında Səbəbli Əlaqə Qururmu?
Xeyr. Tədqiqat kəsiyvari olduğuna, əvvəlki İYE epizodlarının tarix və diaqnostik qeydləri təsdiqlənmədiyinə və iltihab, genotip və bakterial xüsusiyyətlər eyni zaman çərçivəsində müşahidəvi şəkildə ölçüldüyünə görə piylənmənin IL-6 vasitəsilə UPEC virulentliyinə və ya təkrarlanan İYE-yə səbəb olduğunu göstərmir; müəlliflər nəticə bölməsində də bu məlumatların piylənmə, sahib orqanizm iltihabı və təkrarlanan İYE arasında səbəbli əlaqə qurmadığını açıq şəkildə bildirirlər.
İştirakçı qrupları necə yaradıldı?
Ümumilikdə 80 iştirakçı 19–66 yaş aralığındadır; 66-sı qadın, 14-ü kişidir. Piylənmə qrupu BMI ≥ 30 kg/m² olan 40 nəfərdən, normal çəki qrupu isə BMI 18,5–24,9 kg/m² olan 40 nəfərdən ibarətdir.
Qeydə alınmış İYE tarixçəsi iki ilə altı epizod arasında dəyişmişdir. Lakin tədqiqat bu epizodların hansı zaman aralığında baş verdiyini müəyyən edə bilmir. Epizod tarixləri və diaqnostik sənədlər mövcud olmadığından “rekurrent İYE” tarixçəsinin müəyyən klinik rekurrensiya tərifinə uyğun gəldiyi təsdiqlənə bilməmişdir.
IL-6 və sIL-6R nəyi təmsil edir?
İnterleykin-6 (IL-6), iltihabi və immun cavablarla əlaqəli sitokindir. Həll olunan IL-6 reseptoru (soluble IL-6 receptor, sIL-6R), IL-6-nın membrana bağlı reseptordan kənar trans-siqnallaşma yolunda rol oynaya bilən dövr edən reseptor formasıdır.
Tədqiqat bu oxu piylənmə ilə əlaqəli iltihabi mühiti kəmiyyətcə xarakterizə etmək məqsədilə ölçmüşdür. Bununla belə, IL-6 və ya sIL-6R-nin yüksək olması təkbaşına sidik yolu infeksiyasının səbəbi, şiddəti və ya təkrarlanma mexanizmi kimi şərh edilə bilməz.
IL6R rs2228145 nədir?
IL6R rs2228145, IL-6 reseptorunu kodlayan IL6R geni daxilində genetik variantdır. Tədqiqatda allellər A və C, genotiplər isə AA, AC və CC kimi təsnif edilmişdir.
Genotipləmə TaqMan üsulu ilə aparılmışdır. Hər 20 µL reaksiyada 10 µL 2× TaqMan Genotyping Master Mix, 0,5 µL 20× assay working solution, 6,5 µL nukleazasız su və 3 µL DNA istifadə edilmişdir. Termal profil 95 °C-də 10 dəqiqə; ardınca 40 dövr ərzində 95 °C-də 15 saniyə və 60 °C-də 1 dəqiqə tətbiq edilmişdir.
AA, AC və CC genotip paylanmaları nə göstərdi?
| Genotip / allel | Piylənmə qrupu | Normal çəki qrupu | Odds ratio (%95 EA) | p dəyəri |
|---|---|---|---|---|
| AA | 15 (%37,5) | 16 (%40,0) | Referans | Referans |
| AC | 16 (%40,0) | 18 (%45,0) | 0,95 (0,36–2,51) | 1,000 |
| CC | 9 (%22,5) | 6 (%15,0) | 1,60 (0,46–5,59) | 0,539 |
| C alleli | 34/80 (%42,5) | 30/80 (%37,5) | 1,23 (0,65–2,32) | 0,628 |
Bu nəticələr rs2228145 genotipi və ya C alleli tezliyinin piylənmə və normal çəki qrupları arasında əhəmiyyətli dərəcədə fərqli olduğunu göstərməmişdir.
Hardy–Weinberg tarazlığı niyə yoxlanıldı?
Hardy–Weinberg equilibrium (HWE), populyasiyada allel və genotip tezlikləri arasındakı gözlənilən əlaqəni qiymətləndirən genetik tarazlıq modelidir. Tədqiqatda HWE piylənmə və normal çəki qruplarında ayrıca xi-kvadrat testi ilə qiymətləndirilmişdir.
| Qrup | AA müşahidə olunan / gözlənilən | AC müşahidə olunan / gözlənilən | CC müşahidə olunan / gözlənilən | χ² | p |
|---|---|---|---|---|---|
| Piylənmə | 15 / 13,2 | 16 / 19,6 | 9 / 7,2 | 1,319 | 0,251 |
| Normal çəki | 16 / 15,6 | 18 / 18,8 | 6 / 5,6 | 0,064 | 0,800 |
Hər iki qrupda statistik cəhətdən əhəmiyyətli HWE sapması müşahidə edilməmişdir. Lakin məqalədə də qeyd olunduğu kimi, HWE testi təkbaşına genotipləmənin texniki düzgünlüyünü sübut etmir.
IL-6 Ölçümündə 4PL Modeli Niyə Kritikdir?
IL-6 konsentrasiyaları cihazın birbaşa verdiyi rəqəmlər deyil; 450 nm-də ölçülən optik sıxlıq dəyərləri altı kalibrasiya standartına uyğunlaşdırılan çəkisiz dörd parametrli loqistik əyri ilə konsentrasiyaya çevrilmişdir və xüsusilə aşağı konsentrasiya sahəsində nəticələrin seçilmiş kalibrasiya üsuluna həssas olması səbəbindən 4PL çevrilməsinin qeyri-müəyyənliyi əsas nəticələrin düzgün şərhi üçün kritikdir.
IL-6 üçün istifadə olunan standartlar
| IL-6 standartı (ng/L) | Orta xam OD450 |
|---|---|
| 0 | 0,185 |
| 20 | 0,276 |
| 40 | 0,512 |
| 80 | 0,918 |
| 160 | 1,537 |
| 320 | 2,169 |
Dörd parametrli loqistik tənlik
Formula nəyi hesablayır? Bu tənlik IL-6 konsentrasiyası ilə ELISA optik sıxlığı arasındakı siqmoidal kalibrasiya əlaqəsini təsvir edir.
Dəyişənlər: OD, 450 nm-də xam absorbans/optik sıxlıq dəyəridir. C, IL-6 konsentrasiyasıdır və ng/L vahidindədir. a aşağı asimptotu, d yuxarı asimptotu, b əyrinin formasını müəyyən edən parametri, k isə orta nöqtə konsentrasiyasını təmsil edir.
Riyazi rol: C çox aşağı olduqda əyri aşağı asimptota, C yüksəldikcə yuxarı asimptota yaxınlaşır. k və b keçid sahəsinin yerini və dikliyini müəyyən edir.
Tədqiqatda nümunə OD-sindən konsentrasiyaya keçmək üçün tənlik tərsinə çevrilmişdir:
Bu tərs tənlik ölçülmüş OD dəyərindən təxmini IL-6 konsentrasiyası yaradır. Mənbə altı standartın hamısını çəkisiz formada fit etmiş; standartları və nümunələri eyni assay run daxilində ölçmüş; əlavə blank subtraction tətbiq etməmişdir. Replikat səviyyəsində variasiyalar mövcud olmadığı üçün kalibrasiyada çəkiləndirmə aparılmamışdır.
20 ng/L xətti niyə kəmiyyətləndirmə həddi deyil?
Mənbə qrafiklərində 20 ng/L ilk sıfırdan fərqli standart kimi işarələnmişdir. Bu dəyər tədqiqatda təsdiqlənmiş lower limit of quantification (LLOQ) kimi müəyyən edilməmişdir.
4PL hesablamasında normal çəki qrupundakı 40 iştirakçının 34-nün təxmini IL-6 dəyəri 20 ng/L-dən aşağı olmuşdur. Buna qarşılıq yalnız altı normal çəki nümunəsinin xam OD dəyəri 20 ng/L standartının ölçülmüş OD-si olan 0,276-dan aşağıdır. Bu iki rəqəmin fərqli olmasının səbəbi fitted 4PL əyrisinin kalibrasiya nöqtəsindən tam keçməsinin məcburi olmamasıdır.
Alternativ kalibrasiya üsulları nə göstərdi?
| Kalibrasiya üsulu | Piylənmə qrupu ortalaması (ng/L) | Normal çəki qrupu ortalaması (ng/L) |
|---|---|---|
| 4PL | 28,04 | 18,43 |
| Tərs kubik | 27,01 | 16,56 |
| Lokal xətti interpolasiya | 28,63 | 20,87 |
Alternativ çevrilmələrdə də qruplar arasında fərq görünür; lakin mütləq konsentrasiya təxminləri dəyişir. Bu analiz ölçmənin düzgünlüyünü sübut etmir, yalnız nəticələrin kalibrasiya modelinə nə dərəcədə həssas olduğunu göstərir.
sIL-6R üçün istifadə olunan çevrilmə
sIL-6R ölçümü Human Soluble Interleukin 6 Receptor ELISA E0226Hu dəsti ilə aparılmışdır. Mənbə dəst üçün 0,5–150 ng/mL assay diapazonu, 0,24 ng/mL həssaslıq və 0, 5, 10, 20, 40 və 80 ng/mL iş standartlarını bildirir.
Bu üçüncü dərəcəli tənlik OD450 dəyərini sIL-6R konsentrasiyasına çevirmək üçün istifadə edilmişdir. Əmsallar bu kalibrasiya əlaqəsinin empirik əmsallarıdır; tədqiqat bu tənliyi yeni bioloji mexanizm kimi qiymətləndirmir.
Piylənmə və normal çəki qruplarında biomarker nəticələri
| Biomarker | Piylənmə | Normal çəki | Orta fərq (%95 EA) | Effekt ölçüsü | Çoxsaylı testdən sonra p |
|---|---|---|---|---|---|
| IL-6, 4PL təxmini | 28,04 ± 3,37 ng/L; median 28,42 | 18,43 ± 1,41 ng/L; median 18,44 | 9,61 ng/L (8,45–10,77) | Hedges g = 3,683 | 2,20 × 10−21 |
| sIL-6R | 39,87 ± 9,15 ng/mL; median 38,02 | 33,69 ± 8,44 ng/mL; median 33,66 | 6,18 ng/mL (2,26–10,10) | Hedges g = 0,695 | 0,011196 |
IL-6 üçün xam Welch p dəyəri 1,57 × 10−22, sIL-6R üçün 0,002399-dur. Benjamini–Hochberg düzəlişindən sonra hər iki müqayisə mənbədə statistik cəhətdən əhəmiyyətli qalmışdır.
Hedges g nəyi izah edir?
Hedges g iki qrupun ortalamaları arasındakı fərqi ümumi dəyişkənlik miqyasında standartlaşdıran və nümunə ölçüsü üçün düzəliş ehtiva edən effekt ölçüsüdür. Burada IL-6 üçün g = 3,683, sIL-6R üçün g = 0,695 bildirilmişdir. Bu dəyərlər p dəyərindən fərqli suala cavab verir: p dəyəri müşahidə olunan fərqin statistik uyğunluğunu, Hedges g isə fərqin standartlaşdırılmış böyüklüyünü ifadə edir.
Genotiplə biomarker səviyyələri arasında nə tapıldı?
| Analiz | Təsviri nəticə | Effekt təxmini | Statistik şərh |
|---|---|---|---|
| IL-6 və genotip | AA: 19,70 [18,10–26,06]; AC: 20,76 [18,62–27,99]; CC: 28,73 [19,07–31,68] ng/L | Hər əlavə C alleli üçün 1,06 qat (%95 EA 1,03–1,09) | Kruskal–Wallis p = 0,051; BMI-yə uyğunlaşdırılmış doza modeli p < 0,001; kəşfiyyat xarakterli |
| sIL-6R və genotip | AA: 28,43 ± 4,13; AC: 37,89 ± 4,47; CC: 51,51 ± 3,56 ng/mL | Hər əlavə C alleli üçün 1,34 qat (%95 EA 1,30–1,38) | Kruskal–Wallis p < 0,001; BMI-yə uyğunlaşdırılmış doza modeli p < 0,001; kəşfiyyat xarakterli |
| IL-6 ilə sIL-6R | 80 cütləşdirilmiş ölçüm | Spearman ρ = 0,512 | p < 0,001; müsbət korrelyasiya, səbəbli təsir deyil |
IL-6 üçün bütün genotipləri birlikdə müqayisə edən Kruskal–Wallis testi p = 0,051 ilə 0,05 səviyyəsində əhəmiyyətli deyil. Buna qarşılıq BMI qrupu ilə C alleli dozasını eyni log-xətti modelə daxil edən analiz müsbət əlaqə tapmışdır. Bu iki test fərqli sualları və fərqli model fərziyyələrini qiymətləndirdiyinə görə nəticələri “biri digərini etibarsız edir” kimi şərh etmək düzgün deyil.
Mənbədə genotip–biomarker analizləri kəşfiyyat xarakterli kimi təsvir edilmişdir. Bu p dəyərləri çoxsaylı müqayisə üçün düzəldilməmişdir və log-xətti model BMI qrupundan başqa əlavə klinik kovariat ehtiva etmir.
Benjamini–Hochberg düzəlişi niyə istifadə edildi?
Bir tədqiqatda çox sayda hipotez testi aparıldıqda yalnız təsadüf nəticəsində aşağı p dəyərlərinin görülmə ehtimalı artır. Benjamini–Hochberg yanaşması çoxsaylı testlər daxilində yanlış kəşf nisbətini nəzarətdə saxlamağı hədəfləyən düzəlişdir.
Mənbə bu düzəlişi əvvəlcədən müəyyən edilmiş 14 testə tətbiq etmişdir: dörd BMI qrup müqayisəsi, genotip və allel paylanması testləri, üç UPEC status müqayisəsi, yaş–epizod korrelyasiyası və WGS seçiminə aid dörd müqayisə. HWE, pairwise Fisher və genotip–biomarker analizləri isə kəşfiyyat xarakterli saxlanılmış və bu 14 testlik düzəliş ailəsinə daxil edilməmişdir.
UPEC kultura nəticələri
| Kultura sinfi | n | Nisbət |
|---|---|---|
| UPEC / E. coli | 37 | %46,2 |
| Əhəmiyyətli bakterial inkişaf yoxdur | 20 | %25,0 |
| Klebsiella pneumoniae | 10 | %12,5 |
| Proteus mirabilis | 6 | %7,5 |
| Enterococcus faecalis | 4 | %5,0 |
| Staphylococcus saprophyticus | 3 | %3,8 |
UPEC-müsbət qrupun yaş paylanması daha gənc olmuşdur. UPEC-müsbət iştirakçıların yaşı 37,16 ± 11,70 il olduğu halda, digər orqanizm və ya əhəmiyyətli inkişaf olmayan qrupun median yaşı 46,00 [35,50–58,50] ildir. Yaş müqayisəsində xam p = 0,004, Benjamini–Hochberg düzəldilmiş p = 0,013 və Cliff delta = −0,379 bildirilmişdir.
Cinsiyyət paylanması və bildirilən təkrarlanan İYE epizodlarının sayı baxımından mənbədə çoxsaylı testdən sonra əhəmiyyətli fərq tapılmamışdır. Epizod sayı üçün düzəldilmiş p = 0,734; cinsiyyət paylanması üçün 0,839-dur.
fimH və papG nəyi ifadə edir?
fimH və papG, UPEC-in adheziya ilə əlaqəli strukturlarını xarakterizə etmək məqsədilə hədəflənmiş genlərdir. Tədqiqatda bu DNA hədəflərinin qPCR ilə aşkarlanması müvafiq hədəf ardıcıllığının nümunədə amplifikasiya olunduğunu göstərir.
Bunun mühüm sərhədi budur: gen ardıcıllığının aşkarlanması müvafiq adhezin zülalının həqiqətən ifadə olunduğunu və ya bakteriyanın müəyyən adheziya funksiyasını yerinə yetirdiyini birbaşa sübut etmir.
| Profil | n | UPEC daxilində nisbət |
|---|---|---|
| fimH+ / papG− | 18 | %48,6 |
| fimH+ / papG+ | 15 | %40,5 |
| fimH− / papG+ | 3 | %8,1 |
| fimH− / papG− | 1 | %2,7 |
Ümumilikdə fimH 33/37, papG 18/37 UPEC nümunəsində qPCR ilə aşkarlanmışdır.
qPCR-də Ct dəyəri nə deməkdir?
Ct, real vaxt PCR-da flüoresans siqnalının müəyyən edilmiş həddi keçdiyi dövr sayını ifadə edir. Eyni assay şərtlərində və eyni hədəf daxilində Ct dəyərləri amplifikasiya siqnalının nə qədər erkən meydana çıxdığını təsvir etmək üçün istifadə edilə bilər.
Lakin bu tədqiqat 16S, fimH və papG Ct dəyərlərini gen ifadəsinə, mütləq gen nüsxə sayına və ya bakterial yükə çevirməmişdir. Fərqli hədəflərin Ct dəyərləri arasında görünən fərqlər də bakterial yük və ya ifadə fərqi kimi şərh edilməmişdir. Bundan əlavə, “ND” qPCR-da amplifikasiyanın aşkarlanmadığını bildirir; bioloji olaraq genin qəti şəkildə mövcud olmadığını sübut etmir.
qPCR ilə WGS-dəki papG Nəticələri Niyə Eyni Deyildi?
Seçilmiş iki UPEC nümunəsi qPCR-da həm fimH, həm də papG baxımından müsbət olduğu halda, WGS əsaslı homolog taraması fimH-ni hər iki genomda, papG-ni isə yalnız UPEC2-də həddən yuxarı uyğunlaşma kimi aşkarlamışdır; mənbə UPEC1-dəki bu uyğunsuzluğu həll edilmiş xəta kimi şərh etmir və assay spesifikliyi, ardıcıllıq variasiyası, qarışıq template və ya assembly məhdudiyyətini yalnız mümkün izahlar kimi sadalayır.
“No qualifying hit” niyə “gen yoxdur” demək deyil?
WGS virulentlik taramasında ABRicate uyğunlaşmasının uyğun hesab edilməsi üçün ən azı %80 nukleotid identikliyi və ən azı %80 referans əhatəsi tələb edilmişdir. Bu hədlərin altında qalan nəticə “no qualifying hit” kimi təsnif edilmişdir.
Bu ifadə müəyyən tarama meyarının ödənmədiyini göstərir. Genin bioloji olaraq qəti şəkildə mövcud olmadığı demək deyil. Mənbə Şəkil 8-dəki boz “NH” hüceyrələrini də sıfır faiz identiklik kimi deyil, uyğun eşleşmə tapılmayan tarama kateqoriyası kimi təsvir edir.
Tədqiqatın Metodu və Nəticələri
Tədqiqat dizaynının inteqrasiya olunmuş quruluşu
Qan nümunələrinin işlənməsi
Hər iştirakçıdan aseptik periferik venoz qan götürülmüşdür. 200 µL tam qan EDTA ehtiva edən boruya ayrılaraq genomik DNA ekstraksiyası və IL6R rs2228145 genotipləməsi üçün istifadə edilmişdir. Qalan qan sentrifuqa edilmiş, ayrılmış plazma etiketli mikroborulara götürülmüş və IL-6 ilə sIL-6R ölçümünə qədər dondurulmuş şəraitdə saxlanmışdır.
Sidik kulturası
Eyni ziyarət zamanı steril və etiketli geniş ağızlı qablara sidik nümunələri götürülmüşdür. Nümunələr Al-Arabi Hospital mikrobiologiya laboratoriyasına sürətlə daşınmış, uyğun bakterioloji qida mühitlərinə əkilmiş və 37 °C-də aerob şəraitdə 18–24 saat inkubasiya edilmişdir. İnkişaf edən orqanizmlər standart mikrobioloji və biokimyəvi üsullarla müəyyən edilmişdir.
Bakterial qPCR üsulu
Bakterial genomik DNA ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit ilə ekstraksiya edilmişdir. ZR BashingBead lizis boruları ilə mexaniki parçalanma aparılmış; ardınca kolon əsaslı DNA təmizlənməsi və inhibitorların uzaqlaşdırılması tətbiq edilmişdir.
DNA konsentrasiyası Qubit dsDNA HS Assay Kit, saflıq isə Nabi spektrofotometri ilə qiymətləndirilmişdir.
16S rRNA, fimH və papG üçün real vaxt PCR istifadə edilmişdir. Hər 20 µL reaksiya 10 µL KAPA SYBR Green FAST qPCR Universal mix, 0,4 µL forward primer, 0,4 µL reverse primer, 3 µL ekstraksiya edilmiş DNA və 6,2 µL nukleazasız sudan ibarət olmuşdur.
Təkrar istehsal oluna bilmə qeydi: Mənbə bakterial qPCR reaksiya qarışığını və primer mənbələrini bildirir; lakin əsas mətndə bu qPCR üçün ayrıca termal cycling profili verilmir. Verianla çatışmayan termal profili təxmin edərək tamamlamır.
WGS laboratoriya və bioinformatika xətti
Seçilmiş iki UPEC izolatının kitabxanaları MGIEasy Fast FS Library Prep Set V2.0 ilə hazırlanmışdır. DNA fermentativ şəkildə parçalanmış, end-repair və A-tailing tətbiq edilmiş, dual-barcode adapterləri bağlanmış və PCR enrichment aparılmışdır.
Fraqment ölçüsü Qsep1 fragment analyzer ilə, kitabxana konsentrasiyası isə Qubit dsDNA HS ilə qiymətləndirilmişdir. Birləşdirilmiş kitabxanalardan DNBSEQ OneStep DNB Make Reagent Kit istifadə edilərək dairəvi təkzəncirli DNA template-ləri və DNA nanoball-lar yaradılmışdır.
Ardıcıllama DNBSEQ-G99 platformasında G99 FCL PE150 reagent set ilə aparılmış və paired-end 150 bp oxumalar yaradılmışdır.
| Addım | Proqram / üsul | Versiya / şərt |
|---|---|---|
| Oxuma keyfiyyətinə nəzarət | FastQC | v0.12.1 |
| Ümumi keyfiyyət xülasəsi | MultiQC | v1.33 |
| Oxumaların təmizlənməsi | fastp | v1.1.0 |
| Genome assembly | SPAdes | v4.2.0, isolate mode |
| MLST tipləməsi | mlst | v2.19.0 |
| Virulentlik/homologiya taraması | ABRicate | v1.2.0; ecoh, ecoli_vf, VFDB |
| Read mapping | minimap2 | v2.30-r1287 |
| Coverage xülasəsi | samtools | v1.20 |
| Uyğun virulentlik eşleşməsi | ABRicate hit | ≥ %80 nukleotid identikliyi və ≥ %80 referans əhatəsi |
Seçilmiş iki genomun nəticələri
| Xüsusiyyət | UPEC1 | UPEC2 |
|---|---|---|
| MLST / serotip | ST127/O6:H31 | ST131/O25:H4 |
| Q30 | %98,89 | %98,90 |
| Orta mapping depth | 256,7× | 212,5× |
| Assembly N50 | 197.534 bp | 159.148 bp |
| fimH | Aşkarlandı | Aşkarlandı |
| papG | Uyğun WGS eşleşməsi yoxdur | Aşkarlandı |
| Tip 1 fimbria sistemi | 8/8 gen | 8/8 gen |
| p fimbria sistemi | 0/12 uyğun gen eşleşməsi | 12/12 gen |
| Heme dəmir sistemi | 8/8 gen | 8/8 gen |
| Yersiniabactin sistemi | 11/11 gen | 11/11 gen |
Bu cədvəl yalnız iki genomu təsvir edir. UPEC1 və UPEC2-də aşkarlanan virulentlik genləri bütün 37 UPEC nümunəsində bu genlərin prevalansını göstərmir və genlərin ifadə olunduğunu və ya funksional aktiv olduğunu sübut etmir.
Seçilmiş iki WGS nümunəsi digər UPEC nümunələrini təmsil edirmi?
Xeyr. İki WGS izolatının hər ikisi qPCR-da fimH+/papG+ olduğu halda, digər 35 UPEC nümunəsinin 13-ü ikiqat müsbətdir. Fisher exact testində xam p = 0,158 və düzəldilmiş p = 0,441 tapılmışdır. İki nümunədən ibarət WGS alt dəsti bütün UPEC qrupunun təmsilçiliyini sübut edə bilməz.
| Ölçüm | WGS üçün seçilmiş iki nümunə | Digər UPEC nümunələri | Düzəldilmiş p |
|---|---|---|---|
| 16S Ct | 22,65 ± 0,35; median 22,65 | 22,88 ± 0,60; median 22,90 | 0,781 |
| fimH Ct | 22,20 ± 0,14; median 22,20 | 22,64 ± 0,84; median 22,70 | 0,734 |
| papG Ct | 22,90 ± 0,85; median 22,90 | 22,85 ± 0,70; median 22,75 | 0,888 |
Mənbə bu Ct müqayisələrini mütləq bakterial yük müqayisəsi kimi şərh etmir.
Statistik analiz necə aparıldı?
Yenidən işlənmiş məqalənin statistikası Python 3.12.14 ilə təkrar yaradılmışdır. pandas 2.2.3, NumPy 2.3.5, SciPy 1.18.1 və statsmodels 0.15.0 istifadə edilmiş; şəkillər Matplotlib 3.10.9 və 3.11.2 ilə hazırlanmışdır.
Davamlı dəyişənlər mean ± SD və ya median [IQR], kateqorik dəyişənlər say və faiz kimi xülasə edilmişdir. Biomarker analizlərinin hamısı 80 iştirakçını əhatə etdiyi halda, digər analizlərdə mövcud müşahidələr istifadə edilmiş və çatışmayan dəyərlərin imputasiyası aparılmamışdır.
- Paylanma və variasiya qiymətləndirilməsi: Shapiro–Wilk və Brown–Forsythe/Levene.
- Davamlı dəyişənlərin müqayisəsi: Welch t-testi və ya Mann–Whitney U.
- Kateqorik müqayisələr: xi-kvadrat və ya Fisher exact.
- Genotiplərə görə biomarker: Kruskal–Wallis.
- Hardy–Weinberg tarazlığı: hər BMI qrupunda 1 sərbəstlik dərəcəli xi-kvadrat.
- Effekt ölçüləri: Hedges g, Cliff delta, odds ratio və ya Cramer V.
- Korrelyasiya: Spearman rho.
- Çoxsaylı test nəzarəti: əvvəlcədən müəyyən edilmiş 14 test üçün Benjamini–Hochberg.
- Genotip–biomarker modeli: log-çevrilmiş konsentrasiya üzərində BMI qrupu və C alleli dozasını ehtiva edən ordinary least squares model.
Log-xətti genotip modellərində əmsallar eksponensial formaya çevrilmiş və hər əlavə C alleli başına fold-change kimi bildirilmişdir. Bu modellər əlavə klinik kovariatlar ehtiva etməmişdir.
IL-6 etibar intervalları və p dəyərləri kalibrasiya əyrisindəki qeyri-müəyyənliyi ayrıca modelə daxil etməmişdir. Bu detal xüsusilə aşağı IL-6 sahəsində ölçümün şərhində vacibdir.
Tədqiqatın dəstəklədiyi və dəstəkləmədiyi nəticələr
| Tədqiqatın dəstəklədiyi | Tədqiqatın dəstəkləmədiyi |
|---|---|
| Piylənmə qrupunda IL-6 təxminləri və sIL-6R konsentrasiyaları normal çəki qrupundan daha yüksəkdir. | Piylənmənin IL-6 artımı vasitəsilə təkrarlanan İYE-yə səbəb olması. |
| IL6R rs2228145 genotip tezlikləri iki BMI qrupunda əhəmiyyətli fərq göstərməmişdir. | rs2228145-in piylənməni və ya İYE-ni birbaşa müəyyən etməsi. |
| C alleli dozası ilə sIL-6R və daha zəif olaraq IL-6 arasında kəşfiyyat xarakterli əlaqə müşahidə edilmişdir. | Bu genotip–biomarker əlaqələrinin səbəbli olması. |
| 37/80 kultura UPEC kimi təsnif edilmişdir. | 80 iştirakçının hamısında aktiv UPEC infeksiyasının olması. |
| fimH və papG hədəf DNA-ları bir çox UPEC nümunəsində qPCR ilə aşkarlanmışdır. | Bu genlərin bütün nümunələrdə ifadə olunması və ya funksional adheziya yaratması. |
| Seçilmiş iki genom ST127/O6:H31 və ST131/O25:H4-dür. | Bu iki soyun 37 UPEC daxilində prevalansının və ya dominantlığının müəyyən edilməsi. |
| WGS iki izolatın virulentliklə əlaqəli gen tərkibini təsvir edir. | Bu genlərin transkripsiyasının, zülal səviyyəsinin və ya funksional aktivliyinin ölçülməsi. |
| UPEC-müsbət qrupun yaş paylanması digər qrupdan daha gəncdir. | Gənc yaşın UPEC üçün səbəbli risk faktoru olduğunun bu tədqiqatla göstərilməsi. |
Tədqiqatın güclü tərəfləri
- Eyni 80 iştirakçıda sahib orqanizm və mikrobioloji ölçmələrin birlikdə aparılması.
- IL-6 və sIL-6R ilə yanaşı IL6R rs2228145 genotipləməsinin qiymətləndirilməsi.
- Kultura nəticələrinin hədəfli qPCR ilə dəstəklənməsi.
- Seçilmiş izolatlarda WGS ilə soy və virulentlik profilləməsinin aparılması.
- WGS eşleşmələri üçün açıq ≥%80 identiklik və ≥%80 əhatə həddinin göstərilməsi.
- 14 testlik çoxsaylı müqayisə ailəsi üçün Benjamini–Hochberg düzəlişinin istifadə edilməsi.
- IL-6 üçün alternativ kalibrasiya yanaşmalarının həssaslıq analizi kimi göstərilməsi.
- Müəlliflərin Ct, WGS hit və kəşfiyyat xarakterli genotip əlaqələri üçün şərh sərhədlərini açıq şəkildə bildirməsi.
Tədqiqatın əsas məhdudiyyətləri
- Kəsiyvari dizayn səbəblilik və zaman ardıcıllığı qura bilməz.
- Əvvəlki İYE epizodlarının tarix və diaqnostik qeydləri olmadığından standart rekurrensiya tərifi təsdiqlənə bilməmişdir.
- IL-6-nın aşağı konsentrasiya sahəsində mütləq düzgünlüyü qeyri-müəyyəndir.
- IL-6 etibar intervalları və p dəyərləri kalibrasiya qeyri-müəyyənliyini ehtiva etmir.
- 4PL fitində replikat səviyyəsində variasiya olmadığı üçün çəkiləndirmə aparılmamışdır.
- Genotip–biomarker analizləri kəşfiyyat xarakterlidir və çoxsaylı müqayisə düzəlişi tətbiq edilməmişdir.
- Log-xətti genotip modelləri BMI qrupundan başqa əlavə klinik kovariat ehtiva etmir.
- Reseptor funksiyası ölçülməmişdir.
- qPCR hədəf DNA aşkarlanmasıdır; adhezin funksiyasını və ya gen ifadəsini ölçmür.
- WGS yalnız seçilmiş iki UPEC izolatında aparılmışdır.
- İki genom bütün UPEC nümunələrini təmsil edə bilməz.
- qPCR və WGS arasındakı UPEC1 papG uyğunsuzluğu həll edilməmişdir.
- “No qualifying hit” bioloji gen yoxluğu mənasına gəlmir.
- WGS ilə gen mövcudluğu, gen ifadəsi və ya funksional virulentlik göstərilməmişdir.
- İki genomun xam SRA accession nömrələri nəşr tarixində hələ ictimaiyyətə açıq deyil.
Tədqiqatın əsas elmi mesajı
Bu tədqiqatın əsas nəticəsi “piylənmə UPEC mənşəli təkrarlanan İYE-yə səbəb olur” deyil. Tədqiqat, təkrarlanan İYE tarixçəsi bildirən bu 80 nəfərlik nümunədə piylənmə qrupunun daha yüksək IL-6 təxminlərinə və sIL-6R konsentrasiyalarına malik olduğunu; IL6R rs2228145 genotip paylanmasının BMI qrupları arasında əhəmiyyətli fərq göstərmədiyini; C alleli dozası ilə xüsusilə sIL-6R arasında kəşfiyyat xarakterli əlaqə tapıldığını və sidik kulturası/qPCR/WGS analizlərinin UPEC qrupunda müxtəlif adhezin və virulentlik xüsusiyyətlərini təsvir etdiyini göstərir.
Sahib orqanizm iltihabı, genetik variasiya və bakterial xüsusiyyətlərin eyni tədqiqatda birlikdə ölçülməsi elmi baxımdan dəyərlidir; lakin mövcud dizayn onların vahid səbəbli mexanizm üzərində bir-birinə bağlandığını göstərmir.
Mənbə və Metod Qeydi
Özgün başlıq: Integrated Host IL-6 Axis, IL6R rs2228145, and Uropathogenic Escherichia coli Virulence Profiling in Obesity and Recurrent Urinary Tract Infection
Müəlliflər: Zahra K. Saeed; Hibbat Al-Rahman R. Rickad; Basil A. Abbas.
Məsul müəllif: Basil A. Abbas.
Bərabər töhfə: Mənbədə bərabər birinci müəlliflik və ya bərabər töhfə bəyanı göstərilməmişdir.
Qurum 1: College of Dentistry, University of Basrah, Basrah 61001, Iraq.
Qurum 2: College of Medical and Health Technology, Al-Kunooze University, Basrah 61001, Iraq.
Jurnal: Acta Microbiologica Hellenica.
Nəşriyyat: MDPI, Hellenic Society for Microbiology adından.
Mənbə növü: Article; kəsiyvari müşahidəvi insan tədqiqatı.
Biblioqrafik qeyd: Acta Microbiologica Hellenica, 2026, cild 71, məqalə 45.
DOI: 10.3390/amh71040045
Nəşr zaman xətti: Received: 14 Sentyabr 2026; Revised: 16 Oktyabr 2026; Accepted: 22 Oktyabr 2026; Published: 27 Oktyabr 2026.
Resenziya statusu: Dərc olunmuş tədqiqat məqaləsidir; Acta Microbiologica Hellenica beynəlxalq resenziyalı açıq girişli tibbi mikrobiologiya jurnalıdır.
Lisenziya: Creative Commons Attribution (CC BY).
Preprint statusu: İncelənən mənbə dərc olunmuş jurnal versiyasıdır; mənbədə ayrıca preprint identifikatoru göstərilməmişdir.
Tədqiqatın yeri və vaxtı: İraqdakı bir neçə xəstəxana; Dekabr 2025–Fevral 2026.
Nümunə: 19–66 yaş arasında 80 iştirakçı; 66 qadın və 14 kişi. Piylənmə n = 40, normal çəki n = 40.
BMI tərifləri: Piylənmə BMI ≥ 30 kg/m²; normal çəki BMI 18,5–24,9 kg/m².
İYE tarixçəsinin sərhədi: İki ilə altı epizod bildirilmişdir; epizod tarixləri və diaqnostik sənədlər mövcud olmadığından standart rekurrensiya tərifi təsdiqlənə bilməmişdir.
Sahib orqanizm ölçmələri: IL-6 ELISA, sIL-6R ELISA, IL6R rs2228145 TaqMan genotipləməsi.
Mikrobioloji ölçmələr: Sidik kulturası, 16S rRNA/fimH/papG hədəfli qPCR və seçilmiş iki UPEC izolatında WGS.
IL-6 üsulu: Human IL-6 kit E0090Hu; 450 nm; altı standarta çəkisiz 4PL fit; konsentrasiya tərs əyri ilə hesablanmışdır.
IL-6 ölçmə sərhədi: 20 ng/L ilk sıfırdan fərqli standartdır; təsdiqlənmiş LLOQ deyil. Aşağı diapazondakı düzgünlük qeyri-müəyyəndir.
sIL-6R üsulu: Human Soluble Interleukin 6 Receptor kit E0226Hu; mənbədə assay diapazonu 0,5–150 ng/mL və həssaslıq 0,24 ng/mL kimi verilmişdir.
Bakterial qPCR təkrar istehsal oluna bilmə sərhədi: Reaksiya qarışığı bildirilmişdir; əsas mətn ayrıca termal cycling profilini bildirmir.
WGS platforması: DNBSEQ-G99; paired-end 150 bp.
WGS keyfiyyət/tarama proqramları: FastQC v0.12.1, MultiQC v1.33, fastp v1.1.0, SPAdes v4.2.0, mlst v2.19.0, ABRicate v1.2.0, minimap2 v2.30-r1287 və samtools v1.20.
WGS hit həddi: ≥%80 nukleotid identikliyi və ≥%80 referans əhatəsi.
Statistik proqram: Python 3.12.14; pandas 2.2.3; NumPy 2.3.5; SciPy 1.18.1; statsmodels 0.15.0; Matplotlib 3.10.9/3.11.2.
Çoxsaylı test düzəlişi: Əvvəlcədən müəyyən edilmiş 14 test üçün Benjamini–Hochberg.
Kəşfiyyat xarakterli analizlər: HWE, pairwise Fisher və genotip–biomarker analizləri mənbədə kəşfiyyat xarakterli və çoxsaylı müqayisə üçün düzəldilməmişdir.
Əsas biomarker nəticəsi: Piylənmə qrupunda IL-6 28,04 ± 3,37 ng/L, normal çəkidə 18,43 ± 1,41 ng/L; sIL-6R 39,87 ± 9,15-ə qarşı 33,69 ± 8,44 ng/mL.
Əsas genetik nəticə: IL6R rs2228145 genotip tezlikləri BMI qrupları arasında əhəmiyyətli fərq göstərməmişdir.
Kəşfiyyat xarakterli allel nəticəsi: BMI-yə uyğunlaşdırılmış modeldə hər əlavə C alleli başına fold-change IL-6 üçün 1,06 və sIL-6R üçün 1,34-dür.
Kultura nəticəsi: UPEC 37/80; əhəmiyyətli inkişaf yoxdur 20/80; K. pneumoniae 10/80; P. mirabilis 6/80; E. faecalis 4/80; S. saprophyticus 3/80.
qPCR nəticəsi: UPEC nümunələrində fimH 33/37, papG 18/37.
WGS nəticəsi: UPEC1 ST127/O6:H31; UPEC2 ST131/O25:H4.
qPCR–WGS uyğunsuzluğu: Seçilmiş hər iki nümunə papG qPCR-müsbət olduğu halda papG üçün uyğun WGS eşleşməsi yalnız UPEC2-də tapılmışdır; səbəb qəti müəyyən edilməmişdir.
Etika komitəsi: University of Basrah Review Board Ethics Committee; UOB-ETH-2025-13; Noyabr 2025.
Məlumatlandırılmış razılıq: Bütün fərdi iştirakçılardan alınmış və nümunə toplanmazdan əvvəl yazılı sənədləşdirmə arxivləşdirilmişdir.
Maliyyələşdirmə: Xarici maliyyə dəstəyi alınmamışdır.
Maraqlar toqquşması: Müəlliflər maraqlar toqquşması bildirməmişlər.
Məlumatların əlçatanlığı: Məqalənin orijinal töhfələri məqalə daxilində təqdim edilmişdir. Seçilmiş iki izolatın xam paired-end oxumalarının NCBI SRA-ya yerləşdirilməsi planlaşdırılmışdır; məqalə dərc olunanda BioProject, BioSample və SRA run accession nömrələri hələ mövcud deyildi.
Müəllif töhfələri: Conceptualization, methodology, investigation, data curation, formal analysis, visualization, writing—original draft, writing—review and editing, supervision və project administration Zahra K. Saeed və Hibbat Al-Rahman R. Rickad tərəfindən bildirilmişdir. Basil A. Abbas-ın mənbədə göstərilən töhfəsi jurnalla correspondence-dır.
Əsas şərh sərhədi: Nəticələr piylənmə qrupunda daha yüksək IL-6 təxminlərini və sIL-6R konsentrasiyalarını, həmçinin iki UPEC genomunun ətraflı xarakteristikasını göstərir; lakin piylənmə, sahib orqanizm iltihabı, UPEC virulentliyi və təkrarlanan İYE arasında səbəbli mexanizmi sübut etmir.
Şərh yazın
E-poçt ünvanınız yayımlanmayacaq. Məcburi sahələr * ilə işarələnib