Hüceyrəsiz DNT (cell-free DNA; cfDNA), hüceyrələrdən hüceyrəxarici mühitə buraxılan DNT fraqmentlərinin ümumi adıdır; sirkulyasiya edən şiş DNT-si (circulating tumor DNA; ctDNA) isə qan dövranındakı cfDNA-nın xüsusilə şiş hüceyrələrindən qaynaqlanan hissəsidir. Bu tədqiqat kimyaterapiyaya bağlı hüceyrə zədələnməsinin və kimyaterapiya rezistentliyinin xərçəng hüceyrələrindən buraxılan cfDNA-nın miqdarına, zaman ərzində buraxılma kinetikasına və DNT fraqment ölçülərinə necə təsir etdiyini nəzarətli in vitro təcrübələrlə araşdırmışdır. İnsan ağciyər adenokarsinomu A549 ilə qida borusu adenokarsinomu FLO-1 və OE19 hüceyrələri cisplatin və 5-fluorourasil ilə işlənmiş; ümumi cfDNA Qubit florometriyası, şiş hüceyrəsinə xas mutasiya daşıyan cfDNA isə damcı rəqəmsal PCR (ddPCR) ilə ölçülmüşdür. Bundan əlavə, cisplatinə rezistent OE19 modeli hazırlanaraq kimyaterapiyaya həssas və rezistent hüceyrələrin cfDNA buraxılma kinetikaları birbaşa müqayisə edilmişdir.

Hüceyrə sayı artdıqca hüceyrə kulturası mühitinə buraxılan cfDNA miqdarı A549, FLO-1 və OE19 hüceyrələrinin hamısında artmışdır. Qubit ölçmələrində hüceyrə sayı ilə ümumi cfDNA arasındakı Pearson korrelyasiyaları A549 üçün \(r=0.9357\), FLO-1 üçün \(r=0.8599\) və OE19 üçün \(r=0.8767\) olaraq müəyyən edilmişdir. Mutasiyaya xas ddPCR ölçmələrində korrelyasiyalar müvafiq olaraq \(r=0.9864\), \(r=0.9863\) və \(r=0.8511\)-dir. Bu nəticə hüceyrə kulturası sistemində cfDNA miqdarının canlı şiş hüceyrələrinin bolluğu ilə güclü şəkildə əlaqəli olduğunu göstərir.

Kimyaterapiyanın tətbiqi hüceyrə sayına normallaşdırılmış cfDNA buraxılmasını hər üç hüceyrə xəttində artırmışdır. Ən mühüm müqayisədə, cisplatinə həssas parental OE19 hüceyrələri beş günlük cisplatin təsiri zamanı rezistent OE19 hüceyrələrindən daha çox cfDNA buraxmışdır. Rezistent hüceyrələrdə cisplatinə qarşı IC50 dəyəri 24.40 µM olduğu halda, parental hüceyrələrdə 10.43 µM-dir; təxminən 2.34 qatlıq bu artım rezistent fenotipi dəstəkləyir.

Cisplatin həmçinin cfDNA fraqment paylanmasını daha böyük DNT fraqmentlərinə doğru sürüşdürmüşdür. Təxminən 167 bp və onun qatlarında nukleosomal fraqmentlər, təxminən 50–100 bp kiçik fraqmentlər və 1000–15.000 bp aralığında daha böyük hüceyrəxarici DNT fraqmentləri müşahidə edilmişdir. Cisplatindən sonra 134–200 bp və 50–700 bp intervallarının nisbi payı azalarkən 1000–15.000 bp və 1000 bp-dən yuxarı fraqmentlərin nisbi payı artmışdır. Eyni dövrdə PI-müsbət və Annexin V/PI ikiqat-müsbət hüceyrə populyasiyalarındakı dəyişikliklər membran bütövlüyünün itməsi və gec mərhələ hüceyrə ölümü prosesləri ilə uyğun olmuşdur.

Tədqiqatın klinik baxımdan ən mühüm mesajı ctDNA/cfDNA səviyyəsinin yalnız şiş kütləsinin birbaşa göstəricisi kimi şərh edilməməli olmasıdır. Kimyaterapiyadan qısa müddət sonra yaranan müvəqqəti DNT artımı bəzi hallarda şişin irəliləməsindən deyil, müalicəyə həssas hüceyrələrin ölümündən qaynaqlana bilər. Bununla belə, bu tədqiqat xəstə qanında aparılmamışdır. Nəticələr 2D hüceyrə kulturlarından əldə edilmişdir və klinik nümunələrdə DNT-nin qana keçməsi, nukleazlarla parçalanması, immun hüceyrələri və böyrəklər vasitəsilə təmizlənməsi kimi bir çox əlavə proses mövcuddur. Buna görə klinik nümunə götürmə vaxtına dair nəticələr hipotez yaradan xarakter daşıyır və in vivo təsdiq tələb edir.

cfDNA ilə ctDNA Arasındakı Fərq Nədir?

cfDNA hüceyrəxarici bioloji mayelərdə olan bütün hüceyrəsiz DNT fraqmentlərini əhatə edən ümumi termindir; ctDNA isə bu cfDNA hovuzunun yalnız xərçəng hüceyrələrindən qaynaqlanan, şişə xas hissəsidir. Bu tədqiqatın əsas təcrübələri hüceyrə kulturası mühitində aparıldığı üçün tədqiqatçılar birbaşa “sirkulyasiya edən” DNT-ni deyil, kultura mühitinə buraxılan cfDNA-nı ölçmüşlər; mutasiyaya xas ddPCR isə xərçəng hüceyrəsindən qaynaqlanan DNT-ni daha seçici şəkildə müəyyən edən yanaşma kimi istifadə olunmuşdur.

Bu fərq niyə vacibdir?

Xəstə qanında ölçülən ümumi cfDNA yalnız şiş hüceyrələrindən qaynaqlanmır. Normal toxumalar, iltihab, immun hüceyrələri və digər hüceyrəvi proseslər də cfDNA yaradır. Buna görə klinik plazma nümunəsində ümumi cfDNA ilə şişə xas ctDNA eyni kəmiyyət deyil.

Bu tədqiqatın nəzarətli in vitro sistemi mühüm eksperimental üstünlük verir: kultura mühitindəki DNT-nin mənbəyi böyük ölçüdə araşdırılan xərçəng hüceyrələri və kultura komponentləri ilə məhdudlaşır. Lakin bu sadələşdirilmiş quruluş real insan qan dövranında olan nukleaz aktivliyini, toxuma mənşəli fon cfDNA-sını və fizioloji təmizlənmə mexanizmlərini əhatə etmir.

Tədqiqatın əsas problemi

ctDNA hazırda xərçəngin aşkarlanması, müalicəyə cavabın izlənməsi və minimal rezidual xəstəliyin qiymətləndirilməsi kimi sahələrdə araşdırılan mühüm maye biopsiyası biomarkeridir. Lakin bir ctDNA dəyərinin nə məna verdiyini anlamaq üçün DNT-nin şiş hüceyrəsindən nə zaman, hansı hüceyrəvi proses nəticəsində və hansı ölçüdə fraqmentlər şəklində buraxıldığını bilmək lazımdır.

Məsələn, müalicədən sonra plazmada ctDNA səviyyəsinin yüksəlməsi ilk baxışda şiş yükünün artması kimi şərh edilə bilər. Lakin kimyaterapiya çox sayda şiş hüceyrəsini öldürürsə, eyni dövrdə hüceyrələrdən böyük miqdarda DNT-nin buraxılması da mümkündür. Bu tədqiqat həmin bioloji qarışıqlığı nəzarətli hüceyrə kulturası şəraitində araşdırır.

Tədqiqatda istifadə olunan hüceyrə modelləri

Hər kultura mühitinə %10 fetal bovine serum, %1 penisilin-streptomisin və 2 mM GlutaGro əlavə edilmişdir. Tədqiqatda istifadə olunan bütün hüceyrə xətlərinin mikoplazma testləri mənfi olmuşdur.

Kimyaterapiya şəraiti

cfDNA buraxılma təcrübələrində cisplatin konsentrasiyası 0.002 mg/mL, 5-fluorourasil (5-FU) konsentrasiyası isə 0.0032 mg/mL səviyyəsində sabit saxlanılmışdır. Cisplatin %0.9 NaCl-də, 5-FU isə dimetil sulfoksiddə (DMSO) həll edilmişdir. Cisplatin təcrübələrində həcm uyğunlaşdırılmış saline, 5-FU təcrübələrində isə həcm uyğunlaşdırılmış DMSO daşıyıcı nəzarəti istifadə edilmişdir.

Şəkil 2 təcrübəsində kultura mühitində son saline nisbəti %0.4 v/v, DMSO nisbəti isə %0.032 v/v-dir. Bununla dərmanın təsirinin həlledicidən qaynaqlanan təsirdən ayrılması məqsəd qoyulmuşdur.

Müəlliflər ilkin təcrübələrdə passajlama və tripsinizasiyadan sonrakı ilk 24 saatda hüceyrələrin yüksək miqdarda cfDNA buraxdığını müşahidə etdikləri üçün bütün əsas təcrübələrdə hüceyrələrə əvvəlcə 24 saat yapışmağa və böyüməyə imkan vermişlər. Bu detal vacibdir; əks halda hüceyrə ilə manipulyasiyanın özünün yaratdığı cfDNA buraxılması kimyaterapiya təsiri ilə qarışa bilərdi.

Hüceyrə kulturasının üst mayesi necə hazırlanmışdır?

Təcrübənin sonunda hüceyrə kulturasının üst mayesi əvvəlcə 300×g-də 5 dəqiqə, sonra isə 1000×g-də 10 dəqiqə sentrifuqalanmış və cfDNA izolyasiyasına qədər −20 °C-də saxlanılmışdır.

Müəlliflər kultura üst mayesində olan ayrılmış hüceyrələrin də cfDNA-ya töhfə verə biləcəyini düşündükləri üçün həm səthə yapışmış, həm də ayrılmış hüceyrələri saymış və normallaşdırma üçün ümumi hüceyrə sayından istifadə etmişlər. Hüceyrə sayı Countess 3 avtomatik hüceyrə sayğacı və trypan blue ilə müəyyən edilmiş; hər nümunə texniki olaraq iki dəfə ölçülmüşdür.

Ümumi cfDNA necə ölçülmüşdür?

cfDNA QIAamp Circulating Nucleic Acid kiti ilə 3 mL nümunədən izolyasiya edilmişdir. Standart protokol dəyişdirilərək ATL toxuma lizis tamponundan istifadə edilməmiş və iki mərhələli elüsiya tətbiq olunmuşdur: əvvəlcə 20 µL, sonra 10 µL AVE tamponu. Beləliklə, ümumi elüsiya həcmi 30 µL olmuşdur.

Ümumi iki zəncirli DNT Qubit dsDNA High Sensitivity kiti ilə ölçülmüşdür. Hər ölçmədə 1 µL DNT istifadə olunmuş və nümunələr texniki duplikat kimi analiz edilmişdir.

Qubit bütün iki zəncirli DNT-ni ölçdüyü üçün xərçəng hüceyrəsinə xas deyil. Buna görə tədqiqatçılar FBS olan kultura mühitinin və ya ekstraksiya prosesinin yarada biləcəyi fonu nəzarətdə saxlamaq məqsədilə yalnız kultura mühiti olan nəzarətləri və PBS ekstraksiya blanklarını da emal etmişlər. Aşağı, lakin ölçülə bilən Qubit siqnalı aşkar edilmişdir. Buna baxmayaraq, eyni mühit və emal şəraitinin qruplar arasında paylaşılması və hüceyrə sayı ilə əlaqənin mutasiyaya xas ddPCR ilə də təsdiqlənməsi əsas hüceyrə-sayı əlaqəsini dəstəkləmişdir.

ddPCR Bu Tədqiqatda Niyə İstifadə Edildi?

Damcı rəqəmsal PCR (droplet digital PCR; ddPCR), A549, FLO-1 və OE19 hüceyrələrində olan spesifik KRAS və ya TP53 mutasiyalarını hədəfləyərək kultura mühitindəki DNT-nin müvafiq xərçəng hüceyrəsi xəttindən qaynaqlandığını seçici şəkildə kəmiyyətcə müəyyən etmək üçün istifadə edilmişdir; beləliklə, Qubit-in ölçdüyü ümumi DNT siqnalına mutasiyaya xas ikinci ölçmə qatı əlavə edilmişdir.

ddPCR-nin əsas məntiqi

ddPCR nümunəni çox sayda mikroskopik damcıya bölür. Hər damcı hədəf DNT ardıcıllığını ehtiva edə və ya etməyə bilər. PCR-dən sonra flüoresan-müsbət və flüoresan-mənfi damcıların sayı qiymətləndirilir və Poisson statistikasından istifadə etməklə başlanğıcdakı hədəf DNT konsentrasiyası təxmin edilir.

Tədqiqatda mutant və wild-type ardıcıllıqları ayırmaq üçün FAM və HEX işarəli zondlardan istifadə edilmişdir. Hər hüceyrə xətti üçün sintetik mutant və wild-type gBlock DNT nəzarətləri ilə annealing temperaturu optimallaşdırılmışdır.

Praymer və zond məlumatları

ddPCR reaksiya şəraiti

• 10 µL 2× ddPCR Supermix for Probes istifadə edilmişdir.
• Forward və reverse praymerlərin hər biri 900 nM-dir.
• FAM/HEX zondları 250 nM-dir.
• Hər reaksiyaya 2 µL DNT əlavə edilmişdir.
• Damcıların yaradılmasında 70 µL Droplet Generation Oil istifadə edilmişdir.
• Damcılar Bio-Rad QX200 Droplet Generator ilə yaradılmış və QX200 Droplet Reader ilə oxunmuşdur.
• Başlanğıc denaturasiyası 95 °C-də 10 dəqiqədir.
• Sonra 50 PCR dövrü tətbiq edilmişdir: 95 °C-də 30 saniyə, hüceyrə xəttinə xas 54–62 °C annealing temperaturunda 1 dəqiqə və 72 °C-də 30 saniyə.
• Son mərhələ 98 °C-də 5 dəqiqədir.
• Ramp sürəti 2 °C/s-dir.
• Bütün nümunələr texniki duplikat kimi analiz edilmişdir.
• 10.000-dən az damcı yaradan nümunələr analizdən çıxarılmışdır.

Mutant DNT nüsxələrinin sayı necə hesablandı?

Mənbədə ümumi mutant nüsxə sayının hesablanması aşağıdakı əlaqə ilə verilmişdir:

\[ \text{Mutant kopya sayısı} = \left(\text{ortalama mutant hedef konsantrasyonu}\right) \times 20\,\mu L \times \frac{30\,\mu L}{2\,\mu L} \]

Birinci vuruq QuantaSoft tərəfindən Poisson modelləşdirilməsi ilə təxmin edilən mutant hədəf konsentrasiyasıdır. 20 µL, tam PCR reaksiya həcmidir. Reaksiyaya ümumi 30 µL-lik DNT elüatının yalnız 2 µL-si əlavə olunduğu üçün \(30/2=15\) miqyaslama əmsalı analiz edilən aliquot-dan bütün ekstraksiya edilmiş DNT nümunəsinə geri hesablama aparmaq üçün istifadə olunur.

Buna görə formula yalnız PCR borusundakı mutant DNT-ni deyil, 30 µL-lik ümumi cfDNA elüatındakı təxmini mutant nüsxə sayını verir.

Yanlış-müsbət ddPCR siqnalı necə nəzarətdə saxlanıldı?

Hər mutasiyaya xas test üçün 10 müstəqil təcrübədə 10 no-template control reaksiyası qiymətləndirilmişdir. Hər hansı bir NTC reaksiyasında ən çox bir mutant-müsbət damcı müşahidə edilmişdir. Tədqiqatçılar bu fon səviyyəsini nəzərə alaraq iki və ya daha az mutant-müsbət damcı olan eksperimental nümunələri konservativ şəkildə mənfi qəbul etmişlər.

Hüceyrə sayı ilə cfDNA arasındakı əlaqə

Bütün korrelyasiya əmsallarının müsbət və yüksək olması daha çox hüceyrə olan kulturalarda daha çox cfDNA olduğunu göstərir. Pearson korrelyasiyası xətti əlaqənin gücünü ölçür; \(r=1\)-ə yaxınlaşan dəyərlər güclü müsbət xətti əlaqəyə uyğun gəlir. Bununla belə, korrelyasiya təkbaşına bioloji səbəbiyyət mexanizmini sübut etmir.

Kimyaterapiyadan sonra hüceyrə başına cfDNA

A549, FLO-1 və OE19 hüceyrələri kimyaterapiya təcrübələrində müvafiq olaraq 50.000, 125.000 və 500.000 hüceyrə şəklində əkilmişdir. Bu başlanğıc sayları müxtəlif proliferasiya sürətlərinə baxmayaraq üst maye toplanarkən təxminən %80 konfluensiya əldə etmək məqsədilə seçilmişdir.

72 saatlıq cisplatin və ya 5-FU tətbiqindən sonra cfDNA dəyərləri, müalicələrin hüceyrə proliferasiyasını və ümumi hüceyrə sayını dəyişdirməsi səbəbindən nümunə toplama anındakı ümumi hüceyrə sayına normallaşdırılmışdır. Beləliklə, tədqiqat “kulturada ümumilikdə nə qədər DNT var?” sualından daha çox “bir hüceyrə başına nisbi DNT buraxılması müalicədən necə təsirlənir?” sualını qiymətləndirmişdir.

Hər üç hüceyrə xəttində kimyaterapiyadan sonra hüceyrə başına cfDNA buraxılmasında artım müşahidə edilmişdir. Mənbə bunu kimyaterapiyaya bağlı sitotoksikliyin cfDNA buraxılmasını artırması kimi şərh edir.

Kimyaterapiyadan Sonra cfDNA Artımı Necə Şərh Edilməlidir?

Bu tədqiqata görə kimyaterapiyadan sonra erkən dövrdə artan cfDNA yalnız şiş hüceyrələrinin sayının artdığını göstərməyə bilər; sitotoksik müalicəyə həssas xərçəng hüceyrələrinin ölməsi və DNT-ni hüceyrəxarici mühitə buraxması da cfDNA səviyyəsini müvəqqəti yüksəldə bilər. Lakin bu nəticə in vitro modelə əsaslanır və xəstədə müalicə uğurunun birbaşa göstəricisi kimi istifadə edilməzdən əvvəl zamanlama, DNT-nin təmizlənməsi və klinik şiş yükü kimi dəyişənlərlə təsdiqlənməlidir.

Cisplatinə rezistent OE19 modeli necə yaradıldı?

Parental OE19 hüceyrələri 5 µmol/L cisplatinə 72 saat məruz qoyulmuş, sonra kimyaterapiyasız mühitdə bərpa olmalarına imkan verilmişdir. Hüceyrələr %70–80 konfluensiyaya çatdıqda passajlanmış, 24 saat sonra eyni proses təkrarlanmışdır.

Bu dövr 3 ay davam etdirilmişdir. Rezistent fenotip sonradan hər üç passajdan bir cisplatin tətbiqi ilə qorunmuşdur. Əsas təcrübələrdən əvvəl rezistent hüceyrələr ən azı bir tam passaj müddətində cisplatinsiz mühitdə kultivasiya edilmişdir.

CCK-8 ilə rezistentliyin təsdiqi

CCK-8 təcrübəsində hər quyuya 4000 hüceyrə əlavə edilmiş və təcrübələr triplikat aparılmışdır. Hüceyrələr 24 saat sonra 1, 2, 4, 8, 16, 32 və ya 64 µg/mL cisplatinlə 48 saat işlənmişdir. Daha sonra CCK-8 reagenti əlavə edilmiş və 450 nm absorbans ölçülmüşdür.

CCK-8 hüceyrələrin metabolik aktivliyi ilə əlaqəli rəng dəyişməsindən istifadə edərək nisbi hüceyrə canlılığını qiymətləndirən testdir. Doza artdıqca canlılığın nə qədər azaldığı ölçülərək dərmana həssaslıq əyrisi əldə edilir.

IC50 nədir?

IC50, müəyyən eksperimental şəraitdə hüceyrə canlılığını və ya ölçülən bioloji təsiri yarım-maksimal səviyyəyə endirmək üçün lazım olan dərman konsentrasiyasıdır. Eyni eksperimental sistem daxilində daha yüksək IC50 hüceyrələrin eyni inhibəedici təsiri yaratmaq üçün daha yüksək dərman konsentrasiyasına ehtiyac duyduğunu və buna görə daha rezistent olduğunu göstərir.

Rezistent hüceyrələrdə IC50 təxminən 2.34 qat artmışdır. İki-yönlü ANOVA cisplatin konsentrasiyası, hüceyrə xətti və onların qarşılıqlı təsiri üçün \(p<0.0001\) bildirmişdir.

Doza-cavab əyriləri dörd parametrli, dəyişən mailli inhibitor doza-cavab modeli ilə uyğunlaşdırılmışdır. Modelin yuxarı sərhədi %100 normallaşdırılmış canlılığa sabitlənmiş, aşağı sərhəd 0-dan böyük olacaq şəkildə məhdudlaşdırılmış; IC50 və Hill mailliyi sərbəst buraxılmışdır. Mənbə bu modelin açıq cəbri formulunu vermədiyi üçün Verianla mənbəyə aid olmayan tənlik əlavə etmir.

Kimyarezistentlik cfDNA Buraxılma Kinetikasına Necə Təsir Etdi?

Cisplatinə həssas parental OE19 hüceyrələri və cisplatinə rezistent OE19 hüceyrələri beş gün ərzində gündəlik cisplatin aldıqda hər iki qrupda hüceyrə başına cfDNA artmış, lakin həssas hüceyrələr bir çox zaman nöqtəsində rezistent hüceyrələrdən əhəmiyyətli dərəcədə daha çox cfDNA buraxmışdır; buna görə mənbə cfDNA buraxılmasının böyüklüyünün kimyaterapiyanın yaratdığı sitotoksiklik dərəcəsi ilə əlaqəli olduğunu qiymətləndirmişdir.

Beş günlük kinetika təcrübəsi

Parental və rezistent OE19 hüceyrələrinə beş gün ərzində gündəlik cisplatin tətbiq edilmiş və kultura üst mayesi hər 24 saatdan bir toplanmışdır. Ümumi cfDNA Qubit ilə, mutasiyaya xas cfDNA isə ddPCR ilə ölçülmüşdür.

Bütün dəyərlər hər nümunə toplama anındakı ümumi hüceyrə sayına normallaşdırılmışdır. İki-yönlü ANOVA-da zaman, eksperimental şərait və zaman × şərait qarşılıqlı təsirinin hamısı üçün \(p<0.0001\) bildirilmişdir.

Həssas parental OE19 hüceyrələrində cisplatinə bağlı cfDNA buraxılması rezistent hüceyrələrdən daha yüksəkdir və Sidak düzəlişli müqayisələrdə bir neçə zaman nöqtəsində \(p<0.05\) səviyyəsində fərq vardır.

Bu tapıntı “rezistent hüceyrə heç cfDNA buraxmır” mənasına gəlmir. Rezistent hüceyrələrdə də cisplatin altında buraxılma artır; əsas fərq buraxılmanın böyüklüyü və zaman ərzində davranışıdır.

cfDNA Fraqment Ölçüsündəki Dəyişiklik Nəyi Göstərir?

Cisplatindən sonra həm həssas, həm də rezistent OE19 kulturalarında cfDNA paylanmasının daha böyük DNT fraqmentlərinə doğru sürüşməsi kimyaterapiyanın yalnız buraxılan DNT miqdarına deyil, DNT-nin hansı hüceyrə ölümü və hüceyrəxarici emal proseslərindən keçdiyinə də təsir göstərə biləcəyini düşündürür; lakin Annexin V/PI və fraqment ölçüsü təkbaşına müəyyən bir ölüm yolunu qəti şəkildə müəyyən edə bilməz.

DNT fraqment ölçüsü necə ölçüldü?

DNT ölçüsü Agilent 4150 TapeStation avtomatlaşdırılmış elektroforez sistemi ilə qiymətləndirilmişdir. İki müxtəlif ScreenTape sistemi tamamlayıcı məqsədlə istifadə edilmişdir:

• Genomic DNA ScreenTape: 150–50.000 bp aralığında ümumi fraqment paylanması və orta fraqment ölçüsü.
• Cell-free DNA ScreenTape: 50–700 bp arasındakı qısa DNT fraqmentlərinin nisbəti.

Fraqment analizi cisplatin müalicəsinin 3. günündə aparılmışdır. Eyni gün Annexin V/PI axın sitometriyası aparılmış, beləliklə DNT ölçüsü ilə hüceyrə ölümü profili eyni eksperimental zaman nöqtəsində qiymətləndirilə bilmişdir.

Hansı fraqment ölçüləri müşahidə edildi?

Cisplatin müalicəsi həm parental, həm də rezistent OE19 hüceyrələrində orta DNT fraqment ölçüsünü artırmışdır. 134–200 bp və 50–700 bp aralığındakı DNT-nin ümumi cfDNA daxilindəki nisbəti azalarkən 1000–15.000 bp və 1000 bp-dən yuxarı fraqmentlərin nisbəti artmışdır.

Annexin V və propidium iodide nəyi göstərir?

Annexin V hüceyrə membranında fosfatidilserinin xarici səthə daşınmasını müəyyən etmək üçün istifadə olunur və apoptozla əlaqəli göstəricidir. Propidium iodide (PI) sağlam hüceyrə membranından asanlıqla keçə bilmədiyi üçün PI-müsbətlik membran bütövlüyünün itirildiyini göstərir.

Ümumi şərhdə Annexin V-mənfi / PI-mənfi hüceyrələr canlı populyasiya ilə; Annexin V-müsbət / PI-mənfi hüceyrələr erkən apoptotik proseslə; ikiqat-müsbətlik isə gec mərhələ apoptoz, ikincili nekroz və ya membran keçiriciliyinin itirildiyi digər gec mərhələ ölüm vəziyyətləri ilə uyğun gəlir.

Bu tədqiqat üçün xüsusilə mühüm məhdudiyyət Annexin V/PI analizinin gec apoptozu, ikincili nekrozu, nekroptozu və ya digər tənzimlənən hüceyrə ölümü yollarını bir-birindən qəti şəkildə ayıra bilməməsidir.

Axın sitometriyası şəraiti

Təxminən 20.000 hüceyrə/nümunə BD FACS-CANTO II ilə təxminən 500 hüceyrə/saniyə sürətində analiz edilmişdir. Əvvəlcə FSC-A/SSC-A ilə debris xaric edilmiş, sonra singlet hüceyrələr seçilmiş və Annexin V/PI quadrant gating tətbiq edilmişdir. Analiz FlowJo V11 ilə aparılmışdır.

Cisplatin parental OE19 hüceyrələrində Annexin V/PI ikiqat-mənfi canlı fraksiyanı əhəmiyyətli dərəcədə azaltmışdır:

\[ p_{\text{Sidak}}=0.0120 \]

Rezistent OE19 hüceyrələrindəki azalma daha kiçikdir və statistik olaraq əhəmiyyətli deyil:

\[ p_{\text{Sidak}}=0.2908 \]

Hər iki hüceyrə qrupunda PI-müsbət və Annexin V/PI ikiqat-müsbət populyasiyaların artması membran keçiriciliyinin pozulması və gec mərhələ hüceyrə ölümü proseslərinin artması ilə uyğun gəlir.

Bu sxemin əsas mesajı

Mənbənin bütün təcrübələri birlikdə oxunduqda cfDNA-nın birölçülü “şiş miqdarı sayğacı” olmadığı görünür. Eyni cfDNA ölçməsi dörd ayrı bioloji komponentdən təsirlənə bilər: hüceyrə sayı, müalicəyə bağlı sitotoksiklik, dərmana həssaslıq/rezistentlik və DNT-nin hansı hüceyrə ölümü və ya hüceyrəxarici emal mexanizmi ilə buraxılması.

Tədqiqatın Metodu və Nəticələri

Eksperimental dizaynın addım-addım xülasəsi

Statistik analiz

Statistikalar GraphPad Prism 10, versiya 10.6.1 ilə aparılmışdır. Məlumatlar müstəqil bioloji təkrarların orta ± standart sapması kimi təqdim edilmişdir.

• Hüceyrə sayı ilə cfDNA arasındakı xətti əlaqə üçün Pearson korrelyasiya əmsalından istifadə edilmişdir.
• İki qrupun müqayisəsində iki tərəfli müstəqil nümunə t-testindən istifadə edilmişdir.
• Bir neçə qrup və ya eksperimental faktor olan təcrübələrdə iki-yönlü ANOVA tətbiq edilmişdir.
• Cütlərarası müqayisələr Sidak çoxsaylı müqayisə testi ilə düzəldilmişdir.
• CCK-8 doza-cavab əyriləri dörd parametrli dəyişən mailli nonlinear reqressiya ilə modelləşdirilmişdir.
• IC50 üçün %95 profile-likelihood etibar intervalı bildirilmişdir.
• Statistik əhəmiyyətlilik həddi \(p<0.05\)-dir.

Müstəqil bioloji təkrar ilə texniki təkrar arasındakı fərq

Bioloji təkrar təcrübənin müstəqil kultura/nümunə şəraitində yenidən aparılmasıdır və bioloji dəyişkənliyi təmsil edir. Texniki təkrar eyni bioloji nümunənin ölçmə prosesinin bir neçə dəfə aparılmasıdır və cihazdan və ya ölçmədən qaynaqlanan dəyişkənliyi nəzarətdə saxlamağa kömək edir.

Tədqiqatın əsas təcrübələrinin çoxu n=3 müstəqil bioloji təkrar ilə aparılmışdır. Qubit, TapeStation və ddPCR kimi bir çox ölçmə əlavə olaraq texniki duplikat şəklində həyata keçirilmişdir. Müəlliflər n=3-ün xüsusilə əhəmiyyətli olmayan nəticələrin şərhində statistik gücü məhdudlaşdıra biləcəyini açıq şəkildə bildirirlər.

Tədqiqatın ən güclü birbaşa tapıntıları

Tədqiqatın dəstəkləmədiyi nəticələr

• Xəstə plazmasında kimyaterapiyadan sonra ctDNA artımının qəti şəkildə müalicə uğurunu göstərdiyi nəticəsinə gəlmək olmaz.
• Bu tədqiqat ctDNA üçün klinik diaqnostik hədd və ya müalicəni dəyişdirmə alqoritmi hazırlamamışdır.
• Yalnız cfDNA fraqment ölçüsünə əsasən hüceyrənin qəti olaraq apoptoz, nekroz, nekroptoz və ya başqa ölüm mexanizmi ilə öldüyünü demək olmaz.
• Cisplatinin fraqment ölçüsünə verdiyi töhfə ilə hüceyrə ölümü mexanizminin töhfəsi bir-birindən tam ayrılmamışdır.
• Üç hüceyrə xəttindəki nəticələr bütün xərçəng növlərinə ümumiləşdirilə bilməz.
• İkiölçülü hüceyrə kulturasındakı cfDNA kinetikası insan qan dövranındakı ctDNA kinetikası ilə tam ekvivalent deyil.
• İmmunoterapiya, hədəfə yönəlmiş müalicə və ya digər dərman siniflərində eyni fraqmentasiya nümunələrinin yarandığı bu tədqiqatla göstərilməmişdir.
• Müxtəlif kimyaterapiya dozalarının cfDNA buraxılması və fraqmentasiyası üzərində doza-cavab əlaqəsi sistematik şəkildə yoxlanılmamışdır.

In vitro ilə klinik mühit arasındakı əsas fərqlər

Hüceyrə kulturasında buraxılan cfDNA birbaşa ətrafdakı kultura mühitində toplanır. İnsan orqanizmində isə şiş DNT-si toxuma aralığından qana və ya digər bioloji mayelərə keçməlidir. Klinik nümunədə ölçülə bilən ctDNA səviyyəsinə aşağıdakı proseslər də təsir edir:

• Şişin anatomik yerləşməsi və qan dövranına yaxınlığı.
• Normal toxumalardan gələn böyük cfDNA fonu.
• DNT-nin nukleazlarla parçalanması.
• İmmun hüceyrələri tərəfindən təmizlənmə.
• Renal filtrasiya.
• DNT-nin qan və ya digər bioloji mayelərdə daşınması.

Tədqiqatdakı in vitro sistemdə fizioloji nukleazlar olmadığı üçün müşahidə olunan fraqment profilləri böyük ölçüdə ilk buraxılan DNT-nin xüsusiyyətlərini təmsil edir. Xəstə plazmasındakı DNT isə buraxıldıqdan sonra əlavə emala və təmizlənməyə məruz qalır.

Fraqmentasiya nəticəsini məhdudlaşdıran texniki faktorlar

Müəlliflər DNT fraqment paylanmasının yalnız hüceyrə ölümü ilə müəyyən olunmadığını xüsusilə vurğulayırlar. Cisplatin DNT çarpaz bağları və iki zəncirli qırılmalar yaradaraq fraqment ölçüsünə birbaşa təsir göstərə bilər. DNT izolyasiya metodunun müxtəlif ölçülü fraqmentləri müxtəlif səmərəliliklə geri əldə etməsi də ölçülən paylanmanı dəyişə bilər.

Bundan əlavə, üst maye 300×g və 1000×g sentrifuqadan keçirilsə də, bütün hüceyrə debrisinin tam çıxarıldığına zəmanət verilə bilməz. Qalan debris xüsusilə böyük DNT fraqmentlərinin bir hissəsinə töhfə vermiş ola bilər.

Nümunə götürmə vaxtı klinik baxımdan niyə vacib ola bilər?

Mənbənin müzakirə etdiyi zamandan asılı modelə görə sitotoksik müalicədən dərhal sonra çox sayda həssas şiş hüceyrəsinin ölməsi müvəqqəti ctDNA yüksəlişinə səbəb ola bilər. Müalicə təsirli olmağa davam etdikcə həssas şiş hüceyrələrinin azalması ilə sonrakı ölçmələrdə ctDNA-nın azalması gözlənilə bilər. Buna qarşılıq, müalicə prosesi irəlilədikcə ctDNA-nın təmizlənməməsi və ya yüksək qalması rezistent xəstəliyin davam etməsi ilə əlaqəli ola bilər.

Bu model bu məqalənin hüceyrə kulturası tapıntıları ilə müəlliflərin müzakirə etdiyi əvvəlki klinik tədqiqatların birlikdə şərhinə əsaslanır. Tədqiqat öz daxilində bu zaman ardıcıllığını xəstələrdə sınaqdan keçirməmişdir. Buna görə klinik praktikada uyğun qan götürmə vaxtlarının müəyyən edilməsi üçün yüksək tezlikli longitudinal xəstə nümunələnməsi tələb olunur.

Preklinik dərman skrininqində mümkün mənası

Müəlliflər cfDNA-nın yalnız genetik mutasiyaları deyil, müalicəyə bağlı hüceyrə ölümü və fraqmentasiya davranışını da əks etdirə biləcəyini düşündükləri üçün cfDNA profilini preklinik dərman skrininqində tamamlayıcı funksional biomarker kimi qiymətləndirirlər.

Bu istifadə hələ təsdiqlənmiş klinik test deyil. Tədqiqat 2D hüceyrə kulturasına əsaslanır. Xəstə mənşəli orqanoidlər və organ-on-chip sistemləri kimi daha fizioloji modellər eyni mexanizmlərin gələcəkdə təsdiqlənə biləcəyi eksperimental platformalar kimi təklif edilir.

Tədqiqatın əsas məhdudiyyətləri

• Bütün təcrübələr in vitro aparılmışdır.
• İnsan orqanizmindəki DNT təmizlənmə prosesləri modeldə yoxdur.
• Fizioloji nukleazlar yoxdur.
• Annexin V/PI spesifik hüceyrə ölümü yollarını qəti şəkildə ayıra bilmir.
• Cisplatin DNT-nin fiziki fraqmentasiyasına birbaşa təsir göstərə bilər.
• DNT ekstraksiya metodu fraqment ölçüsünə görə fərqli geri əldə etmə səmərəliliyi göstərə bilər.
• Sentrifuqadan sonra qalıq hüceyrə debrisinin tam xaric edilməsi mümkün olmamışdır.
• Tədqiqat yalnız sitotoksik kimyaterapiya və solid şiş hüceyrə modellərinə yönəlmişdir.
• Kimyaterapiya dozası cfDNA buraxılması baxımından sistematik doza seriyası şəklində araşdırılmamışdır.
• Əsas təcrübələrin çoxunda yalnız üç müstəqil bioloji təkrar vardır.
• Daha çox hüceyrə modeli, müalicə növü və in vivo təsdiq tələb olunur.

Mənbə və Metod Qeydi

Orijinal başlıq: Cell-Free DNA Release Kinetics and Fragmentation Reflect Treatment Response and Resistance In Vitro

Müəlliflər: Alexandra Bartolomucci; Laura Kienzle; Sarah Tadhg Ferrier; Benjamin Forgie; Thupten Tsering; Kyle Dickinson; Lorenzo Ferri; Jonathan Cools-Lartigue; Julia V. Burnier.

Müəllif sırası: Mənbədəki sıra qorunmuşdur.

Məsul müəllif: Julia V. Burnier.

Bərabər töhfə: Mənbədə bərabər töhfə / ortaq birinci müəlliflik bəyanatı yoxdur.

Qurumlar: Cancer Research Program, Research Institute of the McGill University Health Centre; Department of Pathology, McGill University; Division of Thoracic Surgery, McGill University Health Centre; Gerald Bronfman Department of Oncology, McGill University; Goodman Cancer Institute, McGill University; Montreal, Kanada.

Jurnal: Cells.

Nəşriyyat: MDPI.

İl: 2026.

Cild / say / məqalə nömrəsi: 15(17), 1561.

DOI: 10.3390/cells15171561.

Qəbul tarixi: 26 iyun 2026.

Reviziya: 22 avqust 2026.

Qəbul: 26 avqust 2026.

Nəşr: 28 avqust 2026.

Mənbə növü: Orijinal tədqiqat məqaləsi.

Resenziya statusu: Jurnalda dərc olunmuş və qəbul/reviziya prosesindən keçmiş resenziyalı tədqiqat.

Lisenziya: Creative Commons Attribution, CC BY.

Açar sözlər: ctDNA; cfDNA; biomarker; chemotherapy resistance; treatment response; esophageal adenocarcinoma.

Maliyyələşdirmə: Canadian Cancer Society Emerging Scholar Award #707153 və Fonds de Recherche du Québec en Santé dəstəkləri; mənbə J.V.B. üçün #312831 və A.B. üçün #330312 nömrələrini bildirir.

Etik komitə: Institutional Review Board Statement: tətbiq edilmir.

Məlumatlandırılmış razılıq: Tətbiq edilmir.

Məlumatların əlçatanlığı: Məqalənin nəticələrini dəstəkləyən xam məlumatların müəlliflərdən sorğu əsasında əldə edilə biləcəyi bildirilir.

Maraqların toqquşması: Müəlliflər maraqların toqquşmasının olmadığını bəyan edirlər.

Müəllif töhfələri: Konseptuallaşdırma J.V.B.; metod A.B. və J.V.B.; validasiya A.B.; formal analiz A.B., S.T.F., B.F., T.T. və K.D.; tədqiqat A.B., L.K., S.T.F., B.F., T.T. və K.D.; resurslar L.F. və J.V.B.; ilkin layihə A.B.; nəzərdən keçirmə və redaktə A.B., L.K., S.T.F., T.T., K.D., L.F., J.C.-L. və J.V.B.; vizuallaşdırma A.B.; superviziya J.V.B.; maliyyələşdirmənin əldə edilməsi J.C.-L. və J.V.B.

Əsas metodlar: Qubit florometriyası; mutasiyaya xas ddPCR; CCK-8 doza-cavab analizi; Agilent 4150 TapeStation fraqment analizi; Annexin V/PI axın sitometriyası; Pearson korrelyasiyası; iki tərəfli müstəqil t-testi; iki-yönlü ANOVA; Sidak çoxsaylı müqayisəsi; dörd parametrli nonlinear doza-cavab reqressiyası.

Əsas eksperimental sərhəd: Tədqiqat 2D xərçəng hüceyrə kulturalarında aparılmışdır. Xəstə plazması, in vivo ctDNA təmizlənməsi və real klinik müalicə qərarları birbaşa sınaqdan keçirilməmişdir.

Əsas şərh sərhədi: Mənbə erkən müalicədən sonra ctDNA/cfDNA artımının sitotoksik hüceyrə ölümündən qaynaqlana biləcəyinə mexanistik dəstək verir; lakin tək bir yüksələn ctDNA ölçməsinin xəstədə müalicə uğuru və ya irəliləmə kimi necə təsnif edilməli olduğunu müəyyən edən klinik hədd təqdim etmir.