Циклоалкан менен конденсацияланган 5H-пиридо[3,2-b]индол-4-аминдер — индол жана пиридин негизиндеги гетероциклдик өзөккө беш, алты, жети же сегиз мүчөлүү каныккан көмүртек шакеги конденсацияланган бирикмелер. Бул изилдөөдө Lo’ay A. Al-Momani жана кесиптештери алмаштырылган 2-аминобензонитрилдерден баштап ушул бирикмелер үй-бүлөсүнө алып баруучу төрт баскычтуу синтезди иштеп чыгышкан; алынган продуктуларды NMR, FTIR жана жогорку ажыратуу жөндөмдүү масс-спектрометрия менен мүнөздөшкөн; 6a–9f бирикмелеринин клеткалык метаболизмдик активдүүлүккө/жашоого жөндөмдүүлүккө тийгизген таасирин MTT тести менен изилдешкен жана тандалган 6c, 8f, 9c жана 9f бирикмелери үчүн рак менен байланышкан төрт белокко карата изилдөөчү молекулалык докинг эсептөөлөрүн жүргүзүшкөн.

Синтездин биринчи баскычында 2-аминобензонитрилдер холин хлориди/мочевина негизиндеги терең эвтектикалык эриткичте бромоацетонитрил менен N-алкилденген. Алынган 2-[(цианометил)амино]бензонитрилдер андан кийин K₂CO₃ колдонулуп жабык түтүктө циклдештирилип, 3-аминоиндол-2-карбонитрилдерге айландырылган. Бул аралык продуктулар ZnI₂ катышуусунда циклопентанон, циклогексанон, циклогептанон же циклооктанон менен конденсацияланган; акырында Zn камтыган материалды суудагы %40 NaOH менен иштетүү аркылуу Zn ден тазаланган 6–9 бирикмелер сериясы алынган. Алгачкы N-алкилдөө продуктуларынын бөлүнүп алынган продуктунун чыгышы %51–83, индол аралык продуктуларынын чыгышы %60–80 жана акыркы пиридоиндол туундуларынын чыгышы %55–98 аралыгында болгон.

MTT тажрыйбаларында шишиктен келип чыккан төрт клетка линиясы — SK-MEL-28, KB, BT-549 жана SK-OV-3 — менен эки туруктуу шишик түзбөгөн бөйрөк эпителий клетка линиясы — чочкодон алынган LLC-PK1 жана африкалык жашыл маймылдан алынган Vero — колдонулган. Эң жогорку көрүнгөн активдүүлүк 3-метил циклооктан менен конденсацияланган 9c туундусунда байкалган. 9c үчүн SK-MEL-28, KB жана BT-549 клеткаларында IC₅₀ мааниси <12.5 µM деп билдирилген, SK-OV-3 үчүн 20 µM, LLC-PK1 жана Vero үчүн 19 µM табылган. Бирок <12.5 µM деген жазуу чыныгы IC₅₀ өлчөнгөнүн билдирбейт; текшерилген эң төмөн концентрация 12.5 µM болгондуктан, чыныгы маани ушул чектен төмөн экенин гана көрсөтөт. Ошондуктан изилдөөнүн маалыматтары 9cнин так потенциясын же шишик клеткаларына карата маанилүү селективдүүлүгүн аныктоого жетишсиз.

Молекулалык докингдин натыйжалары B-RAF V600E, TOP2B, циклин D1 жана GSK3β байланышуу аймактарында кээ бир мүмкүн болгон белок-лиганд өз ара аракеттенүүлөрүн көрсөткөн. Бирок докинг белок клетканын ичинде чындап бута экенин, бирикме ошол белокту ингибирлей турганын же байкалган MTT таасири ушул механизмден келип чыкканын далилдебейт. Изилдөөчүлөр да докингдин натыйжаларын түздөн-түз бутаны ырастоо катары эмес, андан кийинки тажрыйбаларда текшериле турган мүмкүн болгон байланышуу формаларын аныктоочу изилдөөчү эсептөөлөр катары чечмелешкен.

Эң маанилүү чечмелөө чеги: Бул изилдөө клиникалык дарылоо изилдөөсү, жаныбарлардагы тажрыйба же ракка каршы түздөн-түз натыйжалуулуктун далили эмес. MTT маалыматтары белгилүү клетка линияларында жана белгилүү тажрыйба шарттарында клеткалык метаболизмдик активдүүлүккө/жашоого жөндөмдүүлүккө болгон таасирди гана; докинг натыйжалары болсо тандалган белок түзүлүштөрүндөгү эсептөөчү байланышуу божомолдорун көрсөтөт.

Изилдөөнүн изилдөө маселеси

Индол өзөгү медициналык химияда кеңири колдонулган гетероциклдик түзүлүштөрдүн бири. Индол туундуларынын ар түрдүү биологиялык активдүүлүктөр менен байланыштырылышы бул өзөктү структуралык жактан өзгөртүүнү жаңы бирикмелер китепканаларын түзүү жагынан кызыктуу кылат. Пиридоиндолдор индол системасына кошумча азот камтыган шакек кошуу аркылуу структуралык ар түрдүүлүктү көбөйтөт; ага ар башка өлчөмдөгү циклоалкан шакектерин конденсациялоо молекуланын үч өлчөмдүү формасын жана физика-химиялык касиеттерин дагы өзгөртүшү мүмкүн.

Изилдөөнүн максаты түздөн-түз дары иштелип чыкканын көрсөтүү эмес. Изилдөөчүлөр адегенде ар түрдүү ароматтык орун басарларды жана ар башка өлчөмдөгү конденсацияланган көмүртек шакектерин камтыган 5H-пиридо[3,2-b]индол-4-амин китепканасын синтездеп, андан соң бул структуралык өзгөрүүлөр клетка негизиндеги MTT натыйжалары менен бирге кандай өзгөрөрүн изилдешкен. Тандалган төрт бирикме мүмкүн болгон белок өз ара аракеттенүүлөрүн изилдөө максатында кошумча молекулалык докинг баскычына алынган.

Негизги структуралык түшүнүктөр эмнени билдирет?

Индол — бензол шакеги менен азот камтыган беш мүчөлүү шакектин конденсациясынан түзүлгөн ароматтык гетероциклдик каркас. Пиридоиндол аталышы бул өзөккө кошумча азот камтыган алты мүчөлүү ароматтык шакек киргенин билдирет. Циклоалкан менен конденсацияланган деген түшүнүк болсо пиридоиндол системасына каныккан көмүртек шакеги жалпы атомдор аркылуу кошулганын көрсөтөт. Изилдөөдөгү 6, 7, 8 жана 9 сериялары тиешелүүлүгүнө жараша циклопентан, циклогексан, циклогептан жана циклооктандан келип чыккан конденсацияланган шакек өлчөмдөрүн билдирет.

Ароматтык шакектеги орун басарлар сериянын ичинде a–f тамгалары менен коддолгон: a = H, b = метокси (OCH₃), c = метил (CH₃), d = Cl, e = Br жана f = F. Ошентип, мисалы, 9c циклооктан менен конденсацияланган жана метил орун басарлуу мүчөнү; 9f болсо ошол эле чоң конденсацияланган шакекти алып жүргөн, бирок фтор орун басарлуу мүчөнү билдирет.

Терең эвтектикалык эриткич эмне үчүн маанилүү?

Изилдөөнүн биринчи синтез баскычында колдонулган терең эвтектикалык эриткич (deep eutectic solvent, DES) холин хлориди менен мочевинанын 1:2 моль катышындагы аралашмасы. Терең эвтектикалык эриткичтер компоненттердин ортосундагы күчтүү өз ара аракеттенүүлөрдөн улам өз-өзүнчө компоненттерден айырмаланган эрүү жана эриткичтик касиеттерди көрсөтө алган суюк аралашмалар. Бул изилдөөдө DES биринчи N-алкилдөө реакциясынын реакциялык чөйрөсү катары колдонулган. Изилдөөнүн маалыматтары DESтин бардык альтернативдүү эриткичтерден артык экенин текшерген салыштырма эриткич скрининги эмес; ошондуктан бул жерде ал колдонулган реакциялык чөйрө катары гана бааланышы керек.

Жабык түтүктөгү синтез эмнени билдирет?

Экинчи жана үчүнчү негизги айлануулар калың дубалдуу жана жабылган айнек түтүктөрдө жүргүзүлгөн. GP2 үчүн булак 15 mL сыйымдуулуктагы жана 10–12 bar чейин бааланган түтүк колдонулганын билдирет. Этанол камтыган GP2 аралашмасы болжол менен 140 °C ге, ZnI₂ ортомчулугундагы GP3 аралашмасы болсо болжол менен 130 °C ге чейин ысытылган. Жабык система учуучу компоненттерди жогорку температурада системанын ичинде кармоого мүмкүндүк берет; бирок булак реакция учурунда пайда болгон чыныгы басымды өлчөп билдирген эмес. Ошондуктан түтүктүн 10–12 bar чыдамдуулук классы менен реакциянын чыныгы басымын чаташтырбоо керек.

MTT тести жана IC₅₀ бул изилдөөдө эмнени көрсөтөт?

Бул изилдөөдө MTT тести берилген бирикме концентрацияларынан кийин клеткалардын MTTни формазанга айландыра алган метаболизмдик активдүүлүгүн өлчөө аркылуу клетканын жашоого жөндөмдүүлүгүнүн кыйыр көрсөткүчүн берет; IC₅₀ болсо MTT сигналы ташуучу көзөмөлгө салыштырмалуу %50 таасир деңгээлине жеткен болжолдуу концентрацияны билдирет жана өзүнчө клетка өлүмүнүн механизмин же ракка каршы селективдүүлүктү далилдебейт.

MTT — 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромиди. Метаболизмдик жактан активдүү клеткалар тетразолий түзүлүшүн түстүү формазан продуктуларына айландыра алат. Ошондуктан 570 nm де өлчөнгөн абсорбанстын азайышы клеткалык метаболизмдик активдүүлүктүн/жашоого жөндөмдүүлүктүн азайышы менен байланышат. Бирок MTT тести өзүнчө клеткалар апоптоздук же некроздук жол менен өлгөнүн, клетка цикли токтогон-токтобогонун же кайсы молекулалык бута таасирленгенин айтпайт.

Булакта сыноо бирикмелери болгону 12.5, 25 жана 50 µM болгон үч концентрацияда изилденген. IC₅₀ маанилери GraphPad Prism 8.0.2 аркылуу сызыктуу эмес регрессиядан бааланган. Булак колдонулган сызыктуу эмес регрессия теңдемесинин кеңири формасын билдирбейт; ошондуктан Verianla текстинде төрт параметрлүү логистикалык ийри сыяктуу булакта көрсөтүлбөгөн атайын модель болжолдонгон эмес.

IC₅₀ маанисинин <12.5 µM деп жазылышы, мисалы, анын 8 µM же 5 µM экени көрсөтүлгөнүн билдирбейт. Бул %50 таасир деңгээли текшерилген эң төмөн 12.5 µM концентрациядан төмөн экенин гана көрсөтөт. Ошол сыяктуу эле, булакта NA 12.5–50 µM сыноо аралыгында клетка жашоого жөндөмдүүлүгүнүн %50 азайыш деңгээлине жетпегенин билдирет.

Молекулалык докинг упайы бул изилдөөдө эмнени далилдейт?

Молекулалык докинг упайы белгилүү белок модели жана эсептөө протоколунун ичинде лиганд позасы эсептөө жагынан канчалык ыңгайлуу деп бааланганын көрсөтөт; терсирээк AutoDock Vina упайы моделдин ичинде ыңгайлуураак деп божомолдонгон байланышууну билдириши мүмкүн болсо да, чыныгы байланышуу аффиндүүлүгүн, белок ингибициясын, клеткалык бута менен өз ара аракеттенүүнү же таасир механизмин өзүнчө далилдебейт.

Бул айырма изилдөөнү чечмелөөдө өзгөчө маанилүү. 9c жана 9f айрым буталарда башка тандалган бирикмелерге караганда терсирээк докинг упайларын берген; бирок клетка негизиндеги IC₅₀ ирети бардык буталарда докинг ирети менен дал келбейт. Бул дал келбестик клеткалык жүрүм-турум статикалык белок-чөнтөк моделинен гана турбасын; эригичтик, липофилдүүлүк, метаболизмдик туруктуулук, клеткага жетүү жана докинг эсептөөсүндө түздөн-түз көрсөтүлбөгөн башка мүмкүн болгон клеткалык өз ара аракеттенүүлөр сыяктуу факторлор да маанилүү болушу мүмкүн экенин көрсөтөт. Бул акыркы факторлор булактын талкуусунда мүмкүн болгон түшүндүрмөлөр катары каралат, өлчөнгөн жаңы натыйжалар катары берилбейт.

Докинг упайы менен эксперименттик байланышуу аффиндүүлүгү бир эле нерсе эмес

AutoDock Vina берген kcal mol⁻¹ бирдигиндеги упай эксперименттик түрдө өлчөнгөн байланышуу эркин энергиясынын түздөн-түз ордун баспайт. Мындан тышкары, ар башка белок буталары үчүн алынган упайларды бири-бирине салыштырган абсолюттук аффиндүүлүк ирети катары окуу туура эмес. Изилдөөнүн ишенимдүү чечмелениши — бир эле бутада бир эле протокол менен изилденген бирикмелердин салыштырмалуу эсептөө натыйжаларын жана эксперименттик MTT маалыматтары менен сапаттык деңгээлдеги гана мүмкүн болгон параллелдерди баалоо.

RMSD эмнени түшүндүрөт?

RMSD (root-mean-square deviation; орточо квадраттык четтөөнүн квадраттык тамыры) бул жерде кристалл түзүлүшүндө байкалган лиганд абалы менен докинг протоколу аркылуу кайра алынган абалдын ортосундагы оор атомдордун геометриялык айырмасын баалоо үчүн колдонулган. B-RAF V600E үчүн PLX4032нин RMSDси 0.568 Å, TOP2B үчүн митоксантрондуку 1.199 Å жана GSK3β үчүн SZWники 0.291 Å болгон. Изилдөөдө 2.0 Å дан төмөн маанилер позаны кабыл алууга боло турган деңгээлде кайра жаратуу катары бааланган.

Циклин D1 үчүн колдонулган номилин башкача: номилин PDB 6P8E кристалл түзүлүшүндө ко-кристалл лиганд эмес. Ошондуктан 0.112 Å мааниси эксперименттик кристалл позасына карата валидация эмес; ал эки көз карандысыз докинг иштетүүсүнөн алынган позалардын бири-бирине канчалык окшош экенин көрсөткөн позанын кайталануучулугу өлчөмү. 0.112 Å нын өтө кичине болушу номилиндин чыныгы байланышуу геометриясы эксперименттик түрдө ырасталганын билдирбейт.

Изилдөө колдогон жана колдобогон жыйынтыктар

Изилдөөнүн Ыкмасы жана Жыйынтыктары

Жалпы эксперименттик инфраструктура

Синтез реакцияларынын бардыгы аргон атмосферасында жүргүзүлгөн; айнек материалдар жана магниттик аралаштыргыч таякчалар колдонууга чейин меште кургатылган, эриткичтер болсо колдонууга чейин дистилляцияланган. Коммерциялык реагенттер Fluka же Sigma-Aldrich булагынан алынган жана кошумча тазалоосуз колдонулган.

• TLC: Alugram Xtra SIL G/UV254, 20 × 20 cm пластиналар; UV жарыгы, йод жана/же фосфомолибден кислотасы менен визуалдаштыруу.
• Колонкалык хроматография: 60–120 mesh силикагель.
• ¹H жана ¹³C NMR: Bruker Avance III 400 же 500 MHz; CDCl₃ же DMSO-d₆.
• FTIR: Agilent Cary 630 FTIR.
• Эрүү чекити: Stuart Scientific эрүү чекити аппараты, ачык айнек капилляр.
• HRMS: Agilent 1100 HPLC менен JEOL AccuTOF JMS-T100LC ESI-TOF же Bruker Impact II ESI-Q-TOF/Apollo II ion-funnel ESI системасы.

Төрт баскычтуу синтез агымы

Баскыч 1 — N-алкилдөө: 1 → 3

Баштапкы 2-аминобензонитрил 1 холин хлориди/мочевина [ChCl/мочевина (1:2)] терең эвтектикалык эриткичинде, ар бир субстратка болжол менен 10 mL/g DES колдонулуп эритилген. Бромоацетонитрил 2 өлчөмү субстратка салыштырмалуу 2.0–8.0 эквивалент арасында өзгөргөн. Аралашма болжол менен 50 °C де 2–4 күн аралаштырылып, реакция TLC менен көзөмөлдөнгөн. Процесстин аягында CHCl₃ менен экстракция жана силикагель хроматографиясы колдонулган.

Баскыч 2 — 3-аминоиндол-2-карбонитрилдин түзүлүшү: 3 → 4

3a–f аралык продуктулары болжол менен 0.043–0.065 M баштапкы субстрат концентрациясында этанол ичинде 0.5 эквивалент порошок K₂CO₃ менен иштетилген. Аралашма жабык калың дубалдуу түтүктө алдын ала ысытылган май ваннасында болжол менен 140 °C де 20 мүнөт кармалган. Муздатуу, суу менен суюлтуу, дихлорметан экстракциясы жана хроматографиялык тазалоодон кийин 4a–f алынган.

Циклдешүү спектроскопиялык жактан кантип көзөмөлдөнгөн?

3 → 4 айлануусунда булак баштапкы цианометил тобуна тиешелүү ¹H NMR CH₂ сигналдарынын болжол менен δ_H 4.20–4.40 аймагынан жоголушун маанилүү структуралык көрсөткүч катары билдирет. Анын ордуна жаңы NH₂ сигналдары болжол менен δ_H 5.50–5.80, индол NH сигналдары болсо болжол менен δ_H 10.00–11.00 аймагында пайда болгон. FTIRде болжол менен 2200 cm⁻¹ тегерегиндеги нитрил C≡N тилкесинин сакталышы циклдешүү учурунда нитрил функциясы түзүлүштө калганын колдогон.

Мындай маалыматтардын ролу маанилүү: NMR ар башка суутек жана көмүртектердин химиялык чөйрөлөрүн; FTIR белгилүү функционалдык байланыштардын мүнөздүү термелүүлөрүн; HRMS болсо бирикменин өлчөнгөн жогорку ажыратуу жөндөмдүү массасы күтүлгөн молекулалык курамга шайкеш экенин текшерет. Бул ыкмаларды бирге колдонуу структуралык аныктоонун бир эле өлчөөгө таянбашын камсыз кылат.

Баскыч 3 жана 4 — Циклоалкан шакегин түзүү жана Zn ден тазалоо

4a–f бирикмелери циклопентанон, циклогексанон, циклогептанон же циклооктанон менен ZnI₂ (0.5 эквивалент) катышуусунда жабык түтүктө болжол менен 130 °C де 20 мүнөт иштетилген. Бул процесс Zn камтыган материалдарды түзгөн. Аралашма муздатылгандан кийин гексан кошулуп, Zn камтыган туздардын чөгүшү камсыздалган; чөкмө гексан, андан кийин DCM менен жуулган. Калган катуу зат i-PrOH ичинде эритилип, бирдей көлөмдөгү %40 суудагы NaOH менен бөлмө температурасында түн бою иштетилген. Бул баскыч байланышкан Zn ни алып салуу үчүн колдонулган.

Zn камтыган жана Zn ден тазаланган үлгүлөрдүн ¹H NMR спектрлери салыштырылганда, өзгөчө индол NH жана экзоциклдик NH₂ сигналдарында жылыш жана сызык формасынын өзгөрүүлөрү байкалган. Zn камтыган материалда NH сигналдары кеңирээк жана төмөнкү талаада байкалган. Бул табылга гетероциклдик азот функцияларынын Zn менен өз ара аракеттенүүсүнө шайкеш келет; бирок изилдөө бул маалыматтардан Zn нин так координациялык геометриясын же стехиометриясын аныктабайт.

Акыркы продуктулардын чыгышы

Акыркы продуктулардын ичинде булакта эң жогорку бөлүнүп алынган продуктунун чыгышы 7c үчүн %98, эң төмөн бөлүнүп алынган продуктунун чыгышы болсо 6f үчүн %55. Бул чыгыш көрсөткүчтөрү реакциянын синтетикалык жеткиликтүүлүгүн көрсөтөт; биологиялык активдүүлүк менен түздөн-түз байланыш түзүүгө болбойт.

MTT клетка-жашоого жөндөмдүүлүк тажрыйбасынын деталдары

Изилдөөдө SK-MEL-28 меланома, KB, BT-549 эмчек карциномасы жана SK-OV-3 энелик без карциномасынан келип чыккан клетка линиялары менен шишик түзбөгөн бөйрөк эпителийинен келип чыккан LLC-PK1 жана Vero клеткалары колдонулган. LLC-PK1 чочкодон, Vero болсо африкалык жашыл маймылдан алынган. Ошондуктан бул эки көзөмөл клетка линиясын “кадимки адам клеткасы” катары чечмелөөгө болбойт.

Алты клетка линиясы RPMI-1640 чөйрөсүндө %10 bovine calf serum жана 60 mg L⁻¹ амикацин камтыган стандарттуу шарттарда, 37 °C жана %5 CO₂ камтыган нымдалган атмосферада өстүрүлгөн.

6a–9f бирикмелери DMSO ичинде 10 mM запас эритме катары даярдалган. Акыркы DMSO үлүшү %0.5 (v/v) маанисинен ашкан эмес. Ташуучу көзөмөл — сыноо бирикмесин камтыбаган, бирок ошол эле DMSO концентрациясын камтыган культура чөйрөсү. Доксорубицин оң көзөмөл катары 1.25, 2.5 жана 5 µg mL⁻¹ концентрацияларында колдонулган.

Клеткалар 96 уячалуу пластиналарга ар бир уячага 1 × 10⁴ клеткадан себилип, 24 саат жабышууга калтырылган. Андан кийин сыноо бирикмелери 12.5, 25 жана 50 µM акыркы концентрацияларда 48 саат колдонулган. Андан соң ар бир уячага 15 µL MTT эритмеси кошулуп, 37 °C де дагы 4 саат инкубацияланган. Чөйрө алынгандан кийин пайда болгон формазан кристаллдарын эритүү үчүн 100 µL DMSO кошулган. Абсорбанс Synergy HTX multimode микропластина окугучунда 570 nm де өлчөнгөн.

Клеткалык метаболизмдик активдүүлүк ташуучу көзөмөлгө салыштырмалуу көрсөтүлүп, ташуучу көзөмөл %100 деп кабыл алынган. IC₅₀ маанилери GraphPad Prism 8.0.2 колдонуу менен сызыктуу эмес регрессия аркылуу бааланган. Тажрыйба үч көз карандысыз убакта жүргүзүлүп, ар бир концентрация/шарт үчүн беш техникалык кайталоо уячасы колдонулган.

Маанилүү статистикалык чектөө: IC₅₀ маанилери ар бир көз карандысыз тажрыйба үчүн өзүнчө эсептелбегендиктен, изилдөөчүлөр билдирилген IC₅₀ маанилерине ишенимдүү SD же SEM ыйгарган эмес. Булак бул натыйжалар үчүн p-маанисин, ишеним аралыгын же өзүнчө гипотеза тестин да билдирбейт. Ошондуктан таблицадагы майда сандык айырмачылыктарды статистикалык жактан маанилүү айырмачылыктар катары чечмелөө туура эмес.

Таблицаны окуу эскертүүсү: 6a–9f үчүн маанилердин бирдиги µM. Доксорубицин маанилери болсо µg mL⁻¹ бирдигинде. Бирдиктер ар башка болгондуктан, доксорубицин сапындагы сандарды сыноо бирикмелери менен цифранын чоңдугуна гана карап түздөн-түз молярдык потенция салыштыруусуна айлантуу туура эмес. Булак мындай айлантууну жасабайт.

NA: Текшерилген 12.5–50 µM аралыгында жашоого жөндөмдүүлүктүн %50 азайыш деңгээлине жеткен эмес. <12.5 µM: IC₅₀ 12.5 µM ден төмөн экени түшүнүлөт, бирок так маани учурдагы концентрация сериясы менен аныкталган эмес.

MTT натыйжаларындагы түзүлүш-активдүүлүк байланышы

Бүт серия каралганда конденсацияланган шакек өлчөмү да, ароматтык орун басуу да клеткалык активдүүлүк менен байланыштуу экени көрүнөт; бирок бардык бирикмелерге колдонууга боло турган жөнөкөй жана бир багыттуу түзүлүш-активдүүлүк байланышы чыккан эмес.

Метокси орун басарлуу 6b жана 8b изилденген концентрация аралыгында эч бир клетка линиясында %50 таасир деңгээлине жеткен эмес. Тескерисинче, ошол эле метокси тобун камтыган 7b жана 9b өлчөөгө боло турган IC₅₀ маанилерин берген. Бул жагдай “метокси активдүүлүктү азайтат” же “шакек чоңойгон сайын активдүүлүк өсөт” деген сыяктуу бир өзгөрмөлүү түшүндүрмө маалыматтар тарабынан колдоого алынбаганын көрсөтөт.

Метил орун басарлуу серияда BT-549 үчүн 6c = 13 µM, 7c = 18 µM жана 8c = 20 µM болсо, 9c үчүн маани <12.5 µM болгон. Бирок ошол эле шакек өлчөмүнүн таасири башка орун басар класстарында ошол эле түрдө кайталанбагандыктан, шакек өлчөмү үчүн жалпы монотондуу тенденция түзүү мүмкүн болгон эмес.

9f шишиктен келип чыккан төрт клетка линиясында 16–20 µM IC₅₀ маанилерин берген; бирок LLC-PK1 үчүн 14 µM жана Vero үчүн 19 µM маанилери байкалган. Ошондуктан 9f шишиктен келип чыккан клеткаларга артыкчылыктуу таасир көрсөтөт деп айтууга маалыматтык негиз жок.

9c SK-MEL-28, KB жана BT-549 үчүн <12.5 µM, SK-OV-3 үчүн 20 µM; LLC-PK1 жана Vero үчүн 19 µM натыйжа берген. 9c бул тажрыйба сериясында эң жогорку көрүнгөн активдүүлүккө ээ болсо да, алгачкы үч шишик линиясындагы чыныгы маани белгисиз болгондуктан, шишик жана шишик түзбөгөн клеткалардын ортосундагы айырманын чоңдугун так эсептөө мүмкүн эмес. Ошондуктан булак маанилүү шишик клетка селективдүүлүгү аныкталды деп ырастабайт.

Молекулалык докинг үчүн лиганд даярдоо

MTT натыйжаларынын негизинде 6c, 8f, 9c жана 9f тандалган. Лиганд геометриялары Open Babel 3.1.0 колдонулуп MMFF94s күч талаасы менен оптималдаштырылган. Молекулалар pH 7.0 үчүн химиялык жактан ылайыктуу протондолуу абалдарына келтирилген; гидрогенденүү жана формалдык заряддар визуалдык текшерилген. Gasteiger жарым-жартылай атомдук заряддары берилген жана түзүлүштөр AutoDock атом түрлөрү менен PDBQT форматына айландырылган. Айлануучу байланыштар PDBQT даярдоо учурунда аныкталган.

Докинг буталары эмне үчүн тандалган?

B-RAF V600E SK-MEL-28 клеткалары BRAF V600E мутациясын алып жүргөндүктөн меланома контекстинде тандалган. TOP2B ракка каршы дары таасирлери менен байланышкан жана структуралык жактан мүнөздөлгөн II типтеги топоизомераза бутасы. Циклин D1 үч эселенген терс эмчек рагы менен байланышы жана BT-549 клеткаларындагы эксперименттик контексттен улам; GSK3β болсо энелик без рагы жана SK-OV-3 клеткаларында PI3K/AKT/GSK3B сигналдык контекст менен байланыштырылгандыктан баалоого алынган.

Белок түзүлүштөрү RCSB Protein Data Bankтан алынып, BIOVIA Discovery Studio 16.1 менен даярдалган. Кристаллографиялык суу молекулалары жана керексиз гетероатомдор чыгарылган. Ко-кристалл лиганд бар түзүлүштөрдө лиганд байланышуу чөнтөгүн аныктоо үчүн колдонулуп, андан кийин докингге чейин алынып салынган. Полярдык суутектер жана Kollman заряддары AutoDockTools 1.5.7 менен кошулган.

Докинг AutoDock Vina 1.1.2 менен жүргүзүлгөн. Grid кутулары 20 × 20 × 20 Å өлчөмүндө. Булакта башкача көрсөтүлбөсө, Vinaнын демейки жөндөөлөрү колдонулган; exhaustiveness = 8, эң көп 9 чыгаруу позасы жана 3 kcal mol⁻¹ энергия аралыгы колдонулган. Эң терс Vina упайына ээ жогорку орундагы поза өз ара аракеттенүү анализи үчүн тандалган.

TOP2B моделиндеги маанилүү өзгөчө чектөө

PDB 4G0V түзүлүшүндөгү DNA чынжыры докинг рецепторунан чыгарылып, белок компоненти гана калтырылган. Бул детал өтө маанилүү; анткени көптөгөн TOP2 бутага багытталган бирикмелердин таасири TOP2–DNA–лиганд үчтүк комплекстери менен байланыштуу. Ошондуктан изилдөөдөгү TOP2B натыйжалары толук TOP2B–DNA кесүү комплексинин модели эмес жана белок компоненти менен мүмкүн болгон өз ара аракеттенүүлөрдүн изилдөөчү божомолу катары гана окулушу керек.

Докинг протоколун көзөмөлдөө

AutoDock Vina упайлары

B-RAF V600E натыйжалары

6c, 8f, 9c жана 9f үчүн Vina упайлары −8.2 менен −9.0 kcal mol⁻¹ арасында. Эң терс упайлар 9c жана 9f үчүн −9.0 kcal mol⁻¹, андан кийин 8f үчүн −8.6 жана 6c үчүн −8.2.

6cнин тандалган позасында индол NH тобу Cys532 менен, биринчилик амино тобу болсо Gly534 менен суутек байланышын түзөрү божомолдонгон. Ароматтык система үчүн Trp531 жана Phe583 менен божомолдонгон π–π өз ара аракеттенүүлөр жана Ile463/Val471 менен гидрофобдук контакттар билдирилген. 8fде биринчилик амино тобу Gln530 менен суутек байланышын түзөрү божомолдонгон. 9c жана 9fнин тандалган позаларында индол NH Asp594 менен өз ара аракеттенери жана Phe468, Val471, Leu514 жана Phe583 менен кошумча контакттар бар экени болжолдонгон.

SK-MEL-28 MTT натыйжаларында 9c <12.5 µM, 9f 16 µM, 6c жана 8f болсо 18 µM маанилерин берген. Бул ирет B-RAF докинг упайларына жарым-жартылай окшош көрүнгөнү менен, шакек өлчөмү жана ароматтык орун басуу бир убакта өзгөргөндүктөн, айырма кайсы структуралык касиеттен келип чыкканын аныктоо мүмкүн эмес. Андан да маанилүүсү, бул сапаттык параллель B-RAF V600E ингибициясы клеткалык активдүүлүктүн механизми экенин далилдебейт.

TOP2B натыйжалары

Төрт бирикменин TOP2B упайлары өтө тар аралыкта, −4.3 менен −4.4 kcal mol⁻¹ арасында калган. 6c жана 8f үчүн индол NH жана экзоциклдик амино тобу аркылуу Glu522ге багытталган эки суутек байланышы; чоңураак 9c жана 9f үчүн Arg503 менен өз ара аракеттенүүлөр божомолдонгон. Төрт бирикменин баарында конденсацияланган алициклдик шакек менен Leu507 ортосунда гидрофобдук контакт болжолдонгон.

KB клеткаларындагы MTT натыйжалары докинг иретине шайкеш келген эмес: 9c үчүн IC₅₀ <12.5 µM болсо, 6c, 8f жана 9f үчүн 20 µM; ошол эле учурда TOP2B упайларынын баары дээрлик бирдей. Демек, белок-гана TOP2B модели клеткалык айырмачылыктарды түшүндүрбөйт.

Циклин D1 натыйжалары

Циклин D1 үчүн упайлар −6.2 менен −7.1 kcal mol⁻¹ арасында. 9c жана 9f −7.1 менен эң терс упайды берип, тышкы референс лиганд номилиндин упайы менен бирдей мааниге жеткен. 8f −6.9, 6c болсо −6.2 kcal mol⁻¹ болгон.

Төрт бирикменин баарында Gln71 жана Glu115 менен индол NH жана/же экзоциклдик амино топтору аркылуу божомолдонгон суутек байланыштары; ошондой эле Ile117, Leu119 жана Thr116 менен контакттар билдирилген. 9c жана 9f үчүн чоңураак конденсацияланган шакек кошумча гидрофобдук контакттар менен байланыштуу болушу мүмкүн деп болжолдонгон.

Бирок BT-549 натыйжалары докинг ирети менен толук дал келбейт. Мисалы, докинг жагынан эң аз терс упай 6cде −6.2 болгонуна карабастан, BT-549 IC₅₀ мааниси 13 µM; терсирээк −6.9 упайлуу 8fнин IC₅₀ мааниси болсо 19 µM. Ошондуктан циклин D1 докинги клеткалык активдүүлүк айырмачылыктарын өзүнчө түшүндүрө албайт.

GSK3β натыйжалары

GSK3β үчүн төрт бирикменин упайлары −9.6 менен −9.9 kcal mol⁻¹ арасында болуп, бири-бирине өтө жакын. 9c −9.9, 9f −9.8, 6c жана 8f −9.6 kcal mol⁻¹ упай берген. 6cнин тандалган позасында суутек байланышы билдирилген эмес жана өз ара аракеттенүүлөр негизинен гидрофобдук экени белгиленген. 8fде фтор орун басары менен Lys85тин N–H тобунун ортосунда кошумча полярдык контакт болжолдонгон. 9c жана 9f кеңирээк өз ара аракеттенүү тармактарын көрсөткөнү менен, упай айырмачылыктары кичине.

SK-OV-3 MTT маанилери да 18–21 µM сыяктуу тар аралыкта калган: 6c 19, 8f 21, 9c 20 жана 9f 18 µM. Докинг жана MTT маанилеринин бири-бирине жакын болушу бул төрт бирикме ушул чектелген моделде окшош жүрүм-турум көрсөтөт деп ойлонууга мүмкүндүк берет; бирок GSK3β клеткалык активдүүлүктүн себеби экенин далилдебейт.

Формула жана теңдеме абалы

Булак изилдөө өз алдынча математикалык модель теңдемесин же механисттик кинетикалык теңдемени бербейт. IC₅₀ эсептөөсүндө сызыктуу эмес регрессия колдонулганы көрсөтүлөт, бирок регрессия функциясынын ачык теңдемеси билдирилбейт. Ошондуктан Verianla текстине булакта жок доза-жооп теңдемеси кошулган эмес. Докинг упайлары жана RMSD маанилери да булакта эсептөө натыйжасы катары берилген; макала жаңы математикалык докинг теңдемесин чыгарган эмес.

Изилдөөнүн негизги чектөөлөрү

• MTT тести болгону үч сыноо концентрациясын колдонгон: 12.5, 25 жана 50 µM.
• 9cнин шишиктен келип чыккан үч клетка линиясындагы чыныгы IC₅₀ маанилери 12.5 µM ден төмөн калгандыктан так аныкталган эмес.
• IC₅₀ маанилери ар бир көз карандысыз тажрыйба үчүн өзүнчө эсептелбегендиктен SD же SEM билдирүүгө мүмкүн болгон эмес.
• MTT клеткалык метаболизмдик активдүүлүктү/жашоого жөндөмдүүлүктү өлчөйт; клетка өлүмүнүн механизмин аныктабайт.
• LLC-PK1 жана Vero шишик түзбөгөн бөйрөк эпителий клетка линиялары, бирок кадимки адам ткандарын көрсөткөн клиникалык көзөмөл эмес; бири чочкодон, экинчиси африкалык жашыл маймылдан алынган.
• 9c үчүн маанилүү шишик клетка селективдүүлүгүн учурдагы концентрация сериясынан так аныктоо мүмкүн болгон эмес.
• Докинг тандалган төрт бирикме жана тандалган төрт белок модели менен гана жүргүзүлгөн.
• Докинг түздөн-түз белок байланышы же фермент ингибициясы тажрыйбасы эмес.
• TOP2B докинг моделинен DNA чыгарылгандыктан толук TOP2B–DNA–лиганд комплекси көрсөтүлбөйт.
• Номилин үчүн RMSD эксперименттик кристалл позасына валидация эмес, эки эсептөөнүн ортосундагы кайталануучулуктун өлчөмү.
• Изилдөөдө түздөн-түз биохимиялык бутаны ырастоо, клеткалык target-engagement тажрыйбасы, in vivo тажрыйба же клиникалык баалоо жүргүзүлгөн эмес.

Натыйжанын туура илимий чечмелениши

Изилдөөнүн эң күчтүү натыйжасы — ар түрдүү ароматтык орун басарларды жана төрт башка конденсацияланган циклоалкан шакек өлчөмүн камтыган кеңири 5H-пиридо[3,2-b]индол-4-амин сериясын синтездөөгө боло турганы жана алардын алгачкы клетка негизиндеги биологиялык баалоосу жүргүзүлгөнү. 9c текшерилген аралыкта өзгөчөлөнгөн; бирок чыныгы IC₅₀ маанилеринин бир бөлүгү өлчөө аралыгынан тышкары калышы жана шишик түзбөгөн клеткаларга карата маанилердин жакын болушу себептүү бул бирикмеге так потенция же селективдүүлүк мүнөздөмөсү берилбеши керек.

Докинг эсептөөлөрү B-RAF V600E, TOP2B, циклин D1 жана GSK3β үчүн изилдөөгө боло турган мүмкүн болгон байланышуу позаларын түзгөн. Бирок эсептөөлөр түздөн-түз бута менен өз ара аракеттенүүнү же таасир механизмин көрсөтпөйт. Булактын өз жыйынтыгы да кеңири концентрация-жооп тажрыйбалары, түздөн-түз биохимиялык тажрыйбалар, клеткалык бута менен өз ара аракеттенүү изилдөөлөрү жана кеңири механисттик изилдөөлөр зарыл экенин көрсөтөт.

Булак жана Ыкма Жөнүндө Эскертүү

Түпнуска аталыш: Cycloalkane-Fused 5H-Pyrido[3,2-b]indol-4-amines: Synthesis, Characterization, Molecular Docking, and In Vitro Cell-Viability Evaluation

Авторлор: Lo’ay A. Al-Momani; Panayiotis A. Koutentis; Stavros Panagiotou; Mohammad K. Abu-Sini; Fadi G. Saqallah; Samir A. Ross.

Жооптуу автор: Lo’ay A. Al-Momani — Department of Chemistry, Faculty of Science, The Hashemite University, Zarqa, Jordan.

Тең салым: Булак макалада тең салым/тең биринчи авторлук жөнүндө билдирүү көрсөтүлгөн эмес.

Мекемелер: Department of Chemistry, Faculty of Science, The Hashemite University, Zarqa, Jordan; Department of Chemistry, University of Cyprus, Nicosia, Cyprus; Department of Pharmacy, Faculty of Pharmacy, Al-Zaytoonah University of Jordan, Amman, Jordan; National Center for Natural Products Research, School of Pharmacy, The University of Mississippi, Oxford, Mississippi, USA; Division of Pharmacognosy, Department of Biomolecular Sciences, School of Pharmacy, The University of Mississippi, Oxford, Mississippi, USA.

Журнал: Chemistry.

Басмакана: MDPI, Basel, Switzerland.

Библиографиялык жазуу: Chemistry 2026, 8(10), 132.

DOI: 10.3390/chemistry8100132

Расмий шилтеме: https://doi.org/10.3390/chemistry8100132

Келип түшүү / кайра кароо / кабыл алуу / жарыялоо: Received 22 Август 2026; Revised 17 Сентябрь 2026; Accepted 21 Сентябрь 2026; Published 24 Сентябрь 2026.

Булак түрү жана рецензия: Chemistry журналында жарыяланган изилдөө макаласы. Chemistry — MDPI тарабынан чыгарылган рецензияланган ачык жеткиликтүү химия журналы.

Лицензия: Creative Commons Attribution (CC BY) ачык жеткиликтүүлүк лицензиясы; журналдын ачык жеткиликтүүлүк шарттары CC BY 4.0 лицензиясын көрсөтөт.

Preprint абалы: Булак макалада preprint версиясы же preprint идентификатору көрсөтүлгөн эмес.

Изилдөө түрү: Эксперименттик органикалык/медициналык химия синтези жана мүнөздөмөсү + in vitro MTT клетка-жашоого жөндөмдүүлүк баалоосу + изилдөөчү in silico молекулалык докинг.

Каржылоо: Изилдөө Fulbright Foundation, Tafila Technical University (TTU), Hashemite University Research Grant No. 113/2022 жана University of Mississippi National Center for Natural Products Research (NCNPR) тарабынан колдоого алынган. Булак каржылоочулар изилдөөнүн дизайнында, маалымат чогултууда, анализ/чечмелөөдө, макаланы даярдоодо же жарыялоо чечиминде роль ойнобогонун билдирет.

Маалыматтардын жеткиликтүүлүгү: Изилдөөдө берилген маалыматтар макалада жана Supplementary Materials ичинде бар экени көрсөтүлгөн.

Кошумча материалдар: Supplementary Materials ичинде FTIR спектрлери үчүн Figures S1–S36; ¹H жана ¹³C NMR, DEPT, HMBC жана HMQC маалыматтары үчүн Figures S37–S164; HRMS үчүн Figures S165–S200 жана бирикмелердин байланышуу өз ара аракеттенүү анализин камтыган Table S1 бар.

Кызыкчылыктардын кагылышы: Авторлор кызыкчылыктардын кагылышы жок экенин билдиришкен.

Этика кеңеши / маалымдалган макулдук: Булак макаланын акыркы билдирүүлөрүндө өзүнчө Institutional Review Board же Informed Consent Statement көрсөтүлгөн эмес. Изилдөөнүн биологиялык бөлүгү туруктуу клетка линияларында жүргүзүлгөн.

Авторлордун салымдары: Концептуалдаштыруу: Panayiotis A. Koutentis, Lo’ay A. Al-Momani жана Samir A. Ross. Методология: Panayiotis A. Koutentis, Stavros Panagiotou, Lo’ay A. Al-Momani, Mohammad K. Abu-Sini жана Fadi G. Saqallah. Программалык камсыздоо: Fadi G. Saqallah. Формалдык анализ: Lo’ay A. Al-Momani, Stavros Panagiotou жана Panayiotis A. Koutentis. Ресурстар: Samir A. Ross жана Lo’ay A. Al-Momani. Маалыматтарды курациялоо: Lo’ay A. Al-Momani, Mohammad K. Abu-Sini жана Fadi G. Saqallah. Алгачкы долбоор: Lo’ay A. Al-Momani. Карап чыгуу жана редакциялоо: Panayiotis A. Koutentis жана Samir A. Ross. Супервизия: Samir A. Ross жана Panayiotis A. Koutentis. Долбоорду башкаруу: Lo’ay A. Al-Momani, Samir A. Ross жана Panayiotis A. Koutentis. Каржылоону алуу: Samir A. Ross жана Lo’ay A. Al-Momani.

Ыраазычылык: Авторлор синтетикалык изилдөөлөр үчүн лабораториялык мүмкүнчүлүктөрдү камсыздаган Amar Chittiboyinaга, University of Mississippiде MTT өлчөөлөрүн жүргүзгөн Shabana Khanга жана жогорку ажыратуу жөндөмдүү масс-спектрометрия өлчөөлөрүндөгү колдоосу үчүн Charles Cantrell (USDA-ARS) менен Naba Hikma Labsка ыраазычылык билдиришет.

Негизги методологиялык чек: Клеткалык сыноо болгону үч бирикме концентрациясына негизделген жана айрым IC₅₀ маанилери тажрыйба аралыгынан тышкары калган. MTT натыйжалары клеткалык метаболизмдик активдүүлүктүн/жашоого жөндөмдүүлүктүн көрсөткүчү; ракка каршы механизмдин түздөн-түз далили эмес. Молекулалык докинг эсептөөлөрү бутага байланышууну же механизмди эксперименттик түрдө ырастабайт. TOP2B моделинен DNA чыгарылган жана циклин D1 үчүн колдонулган номилин поза көзөмөлү кристаллографиялык валидация эмес, эсептөөлөр ортосундагы поза кайталануучулугу. Изилдөөдө in vivo же клиникалык валидация жүргүзүлгөн эмес.