Sikloalkan bilan kondensirlangan 5H-pirido[3,2-b]indol-4-aminlar — indol va piridin asosidagi geterotsiklik yadroga besh, olti, yetti yoki sakkiz a’zoli to‘yingan uglerod halqasi kondensirlangan birikmalardir. Ushbu tadqiqotda Lo’ay A. Al-Momani va hamkasblari almashingan 2-aminobenzonitrillardan boshlab ushbu birikmalar oilasiga olib boradigan to‘rt bosqichli sintezni ishlab chiqqan; olingan mahsulotlarni NMR, FTIR va yuqori aniqlikdagi massa spektrometriyasi bilan xarakterlagan; 6a–9f birikmalarining hujayraviy metabolik faollik/hayotchanlikka ta’sirini MTT testi bilan tekshirgan va tanlangan 6c, 8f, 9c hamda 9f birikmalari uchun saraton bilan bog‘liq to‘rtta oqsilga nisbatan tadqiqiy molekulyar doking hisoblarini bajargan.

Sintezning birinchi bosqichida 2-aminobenzonitrillar xolin xlorid/karbamid asosidagi chuqur evtektik erituvchi ichida bromoatsetonitril bilan N-alkillangan. Olingan 2-[(sianometil)amino]benzonitrillar keyin K₂CO₃ yordamida yopiq naychada halqalanib, 3-aminoindol-2-karbonitrillarga aylantirilgan. Ushbu oraliq mahsulotlar ZnI₂ ishtirokida siklopentanon, siklogeksanon, siklogeptanon yoki siklooktanon bilan kondensirlangan; oxirida Zn saqlovchi materialga suvli %40 NaOH bilan ishlov berish orqali Zn dan tozalangan 6–9 birikmalar seriyasi olingan. Dastlabki N-alkillash mahsulotlarining ajratib olingan unumlari %51–83, indol oraliq mahsulotlarining unumlari %60–80 va yakuniy piridoindol hosilalarining unumlari %55–98 oralig‘ida bo‘lgan.

MTT tajribalarida o‘smadan kelib chiqqan to‘rtta hujayra liniyasi — SK-MEL-28, KB, BT-549 va SK-OV-3 — hamda ikkita barqaror o‘sma hosil qilmaydigan buyrak epiteliy hujayra liniyasi — cho‘chqadan kelib chiqqan LLC-PK1 va Afrika yashil maymunidan kelib chiqqan Vero — ishlatilgan. Eng yuqori ko‘rinadigan faollik 3-metil siklooktan bilan kondensirlangan 9c hosilasida kuzatilgan. 9c uchun SK-MEL-28, KB va BT-549 hujayralarida IC₅₀ qiymati <12.5 µM deb xabar qilingan, SK-OV-3 uchun 20 µM, LLC-PK1 va Vero uchun esa 19 µM topilgan. Biroq <12.5 µM ifodasi haqiqiy IC₅₀ o‘lchanganini anglatmaydi; sinovdan o‘tkazilgan eng past konsentratsiya 12.5 µM bo‘lgani sababli faqat haqiqiy qiymat ushbu chegaradan past ekanini ko‘rsatadi. Shu sababli tadqiqot ma’lumotlari 9c ning aniq potensiyasini yoki o‘sma hujayralariga nisbatan mazmunli selektivligini aniqlash uchun yetarli emas.

Molekulyar doking natijalari B-RAF V600E, TOP2B, siklin D1 va GSK3β bog‘lanish joylarida ayrim ehtimoliy oqsil-ligand o‘zaro ta’sirlarini ko‘rsatgan. Shunga qaramay, doking oqsilning hujayra ichida haqiqatan ham nishon ekanini, birikma o‘sha oqsilni ingibitsiya qilishini yoki kuzatilgan MTT ta’siri aynan shu mexanizmdan kelib chiqishini isbotlamaydi. Tadqiqotchilar ham doking natijalarini to‘g‘ridan-to‘g‘ri nishonni tasdiqlash sifatida emas, balki keyingi tajribalarda sinab ko‘rish mumkin bo‘lgan ehtimoliy bog‘lanish holatlarini aniqlovchi tadqiqiy hisoblar sifatida talqin qilgan.

Eng muhim talqin cheklovi: Ushbu tadqiqot klinik davolash tadqiqoti, hayvonlar tajribasi yoki bevosita saratonga qarshi samaradorlik dalili emas. MTT ma’lumotlari faqat muayyan hujayra liniyalarida va muayyan tajriba sharoitlaridagi hujayraviy metabolik faollik/hayotchanlik ta’sirini; doking natijalari esa tanlangan oqsil tuzilmalaridagi hisoblash asosidagi bog‘lanish bashoratlarini ko‘rsatadi.

Tadqiqot muammosi

Indol yadrosi tibbiy kimyoda keng qo‘llanadigan geterotsiklik tuzilmalardan biridir. Indol hosilalarining turli biologik faolliklar bilan bog‘langanligi ushbu yadroni strukturaviy o‘zgartirishni yangi birikmalar kutubxonalarini yaratish nuqtai nazaridan qiziqarli qiladi. Piridoindollar indol tizimiga qo‘shimcha azot saqlovchi halqa qo‘shib strukturaviy xilma-xillikni oshiradi; unga turli kattalikdagi sikloalkan halqalarini kondensirlash esa molekulaning uch o‘lchamli shakli va fizik-kimyoviy xususiyatlarini yanada o‘zgartirishi mumkin.

Tadqiqotning maqsadi bevosita dori ishlab chiqilganini ko‘rsatish emas. Tadqiqotchilar avval turli aromatik o‘rinbosarlar va turli kattalikdagi kondensirlangan uglerod halqalarini saqlovchi 5H-pirido[3,2-b]indol-4-amin kutubxonasini sintez qilgan, keyin ushbu strukturaviy o‘zgarishlarning hujayra asosidagi MTT natijalari bilan birga qanday o‘zgarishini tekshirgan. Tanlangan to‘rtta birikma ehtimoliy oqsil o‘zaro ta’sirlarini o‘rganish maqsadida qo‘shimcha ravishda molekulyar doking bosqichiga kiritilgan.

Asosiy strukturaviy tushunchalar nimani anglatadi?

Indol — benzol halqasi bilan azot saqlovchi besh a’zoli halqaning kondensirlanishidan hosil bo‘lgan aromatik geterotsiklik skeletdir. Piridoindol atamasi ushbu yadroga qo‘shimcha azot saqlovchi olti a’zoli aromatik halqa kiritilganini anglatadi. Sikloalkan bilan kondensirlangan ifodasi esa piridoindol tizimiga to‘yingan uglerod halqasi umumiy atomlar orqali birikkanini bildiradi. Tadqiqotdagi 6, 7, 8 va 9 seriyalar mos ravishda siklopentan, siklogeksan, siklogeptan va siklooktandan kelib chiqqan kondensirlangan halqa kattaliklarini ifodalaydi.

Aromatik halqadagi o‘rinbosarlar seriya ichida a–f harflari bilan kodlangan: a = H, b = metoksi (OCH₃), c = metil (CH₃), d = Cl, e = Br va f = F. Shunday qilib, masalan, 9c siklooktan bilan kondensirlangan va metil o‘rinbosarli a’zoni; 9f esa xuddi shu katta kondensirlangan halqani saqlaydigan, ammo ftor o‘rinbosarli a’zoni anglatadi.

Chuqur evtektik erituvchi nega muhim?

Tadqiqotning birinchi sintez bosqichida ishlatilgan chuqur evtektik erituvchi (deep eutectic solvent, DES) xolin xlorid va karbamidning 1:2 mol nisbatidagi aralashmasidir. Chuqur evtektik erituvchilar komponentlar orasidagi kuchli o‘zaro ta’sirlar tufayli alohida komponentlardan farq qiluvchi erish va erituvchilik xususiyatlarini ko‘rsata oladigan suyuq aralashmalardir. Ushbu tadqiqotda DES birinchi N-alkillash reaksiyasining reaksiya muhiti sifatida ishlatilgan. Tadqiqot ma’lumotlari DES barcha muqobil erituvchilardan ustunligini sinaydigan qiyosiy erituvchi skriningi emas; shu sababli bu yerda u faqat qo‘llanilgan reaksiya muhiti sifatida baholanishi kerak.

Yopiq naychada sintez nimani anglatadi?

Ikkinchi va uchinchi asosiy o‘zgarishlar qalin devorli va yopilgan shisha naychalarda amalga oshirilgan. GP2 uchun manba 15 mL sig‘imli va 10–12 bar gacha baholangan naycha ishlatilganini bildiradi. Etanol saqlovchi GP2 aralashmasi taxminan 140 °C gacha, ZnI₂ vositachiligidagi GP3 aralashmasi esa taxminan 130 °C gacha qizdirilgan. Yopiq tizim uchuvchan komponentlarni yuqori haroratda tizim ichida saqlab turish imkonini beradi; biroq manba reaksiya vaqtida hosil bo‘lgan haqiqiy bosimni o‘lchab xabar qilmaydi. Shu sababli naychaning 10–12 bar chidamlilik darajasi bilan reaksiyaning haqiqiy bosimini bir-biriga aralashtirmaslik kerak.

MTT testi va IC₅₀ ushbu tadqiqotda nimani ko‘rsatadi?

Ushbu tadqiqotda MTT testi berilgan birikma konsentratsiyalaridan keyin hujayralarning MTT ni formazanga aylantira oladigan metabolik faolligini o‘lchab, hujayra hayotchanligining bilvosita ko‘rsatkichini beradi; IC₅₀ esa MTT signali tashuvchi nazoratga nisbatan %50 ta’sir darajasiga yetadigan taxminiy konsentratsiyani anglatadi va o‘zi yakka holda hujayra o‘limi mexanizmini yoki saratonga qarshi selektivlikni isbotlamaydi.

MTT — 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliy bromiddir. Metabolik faol hujayralar tetrazoliy tuzilmasini rangli formazan mahsulotlariga aylantira oladi. Shu sababli 570 nm da o‘lchangan absorbansning kamayishi hujayraviy metabolik faollik/hayotchanlikning kamayishi bilan bog‘lanadi. Biroq MTT testi o‘zi yakka holda hujayralar apoptotik yoki nekrotik yo‘l bilan o‘lganini, hujayra sikli to‘xtagan-to‘xtamaganini yoki qaysi molekulyar nishon ta’sirlanganini aytib bermaydi.

Manbada sinov birikmalari faqat 12.5, 25 va 50 µM bo‘lgan uchta konsentratsiyada tekshirilgan. IC₅₀ qiymatlari GraphPad Prism 8.0.2 yordamida nochiziqli regressiyadan baholangan. Manba ishlatilgan nochiziqli regressiya tenglamasining batafsil ko‘rinishini bermaydi; shu sababli Verianla matnida manbada ko‘rsatilmagan to‘rt parametrli logistik egri kabi maxsus model faraz qilinmagan.

IC₅₀ qiymatining <12.5 µM deb yozilishi, masalan, uning 8 µM yoki 5 µM ekanligi ko‘rsatilganini anglatmaydi. Bu faqat %50 ta’sir darajasi sinovdan o‘tkazilgan eng past 12.5 µM konsentratsiyadan past ekanini ko‘rsatadi. Xuddi shuningdek, manbada NA 12.5–50 µM sinov oralig‘ida hujayra hayotchanligida %50 kamayish darajasiga erishilmaganini anglatadi.

Molekulyar doking skori ushbu tadqiqotda nimani isbotlaydi?

Molekulyar doking skori muayyan oqsil modeli va hisoblash protokoli doirasida ligand pozasi hisoblash nuqtai nazaridan qanchalik qulay deb baholanganini ko‘rsatadi; manfiyroq AutoDock Vina skori model ichida qulayroq bashorat qilingan bog‘lanishni anglatishi mumkin bo‘lsa-da, haqiqiy bog‘lanish affinitetini, oqsil ingibitsiyasini, hujayraviy nishon bilan o‘zaro ta’sirni yoki ta’sir mexanizmini o‘zi yakka holda isbotlamaydi.

Bu farq tadqiqotni talqin qilishda ayniqsa muhim. 9c va 9f ayrim nishonlarda boshqa tanlangan birikmalarga qaraganda manfiyroq doking skorlarini bergan; biroq hujayra asosidagi IC₅₀ reytingi barcha nishonlarda doking reytingiga mos kelmaydi. Bu nomuvofiqlik hujayraviy xatti-harakat faqat statik oqsil-cho‘ntak modelidan iborat emasligini; eruvchanlik, lipofillik, metabolik barqarorlik, hujayraga kirish va doking hisobida bevosita ifodalanmagan boshqa ehtimoliy hujayraviy o‘zaro ta’sirlar kabi omillar ham muhim bo‘lishi mumkinligini ko‘rsatadi. Ushbu so‘nggi omillar manba muhokamasida ehtimoliy izohlar sifatida ko‘rib chiqiladi, o‘lchangan yangi natijalar sifatida taqdim etilmaydi.

Doking skori bilan tajribaviy bog‘lanish affiniteti bir xil narsa emas

AutoDock Vina ning kcal mol⁻¹ birlikda bergan skori tajribada o‘lchangan bog‘lanish erkin energiyasining bevosita o‘rnini bosa olmaydi. Bundan tashqari, turli oqsil nishonlari uchun olingan skorlarni bir-biriga nisbatan mutlaq affinitet reytingi sifatida o‘qish to‘g‘ri emas. Tadqiqotning ishonchli talqini bir xil nishonda bir xil protokol bilan tekshirilgan birikmalarning nisbiy hisoblash natijalarini va tajribaviy MTT ma’lumotlari bilan faqat sifat darajasidagi ehtimoliy parallelliklarni baholashdan iborat.

RMSD nimani anglatadi?

RMSD (root-mean-square deviation; o‘rtacha kvadratik og‘ishning kvadrat ildizi) bu yerda kristall tuzilmada kuzatilgan ligand holati bilan doking protokoli orqali qayta olingan holat o‘rtasidagi og‘ir atomlarning geometrik farqini baholash uchun ishlatilgan. B-RAF V600E uchun PLX4032 ning RMSD si 0.568 Å, TOP2B uchun mitoksantronniki 1.199 Å va GSK3β uchun SZW niki 0.291 Å deb topilgan. Tadqiqotda 2.0 Å dan past qiymatlar pozani maqbul darajada qayta hosil qilish sifatida baholangan.

Siklin D1 uchun ishlatilgan nomilin boshqacha: nomilin PDB 6P8E kristall tuzilmasida ko-kristall ligand emas. Shu sababli 0.112 Å qiymati tajribaviy kristall pozaga nisbatan validatsiya emas; u ikki mustaqil doking ishga tushirishidan olingan pozalarning bir-biriga qanchalik o‘xshashligini ko‘rsatuvchi poza takrorlanuvchanligi o‘lchovidir. 0.112 Å ning juda kichik bo‘lishi nomilinning haqiqiy bog‘lanish geometriyasi tajribada tasdiqlanganini anglatmaydi.

Tadqiqot qo‘llab-quvvatlaydigan va qo‘llab-quvvatlamaydigan xulosalar

Tadqiqot Usuli va Natijalari

Umumiy tajribaviy infratuzilma

Barcha sintez reaksiyalari argon atmosferida olib borilgan; shisha jihozlar va magnit aralashtirgich sterjenlari ishlatishdan oldin pechda quritilgan, erituvchilar esa ishlatishdan oldin distillangan. Tijorat reagentlari Fluka yoki Sigma-Aldrich manbalaridan olingan va qo‘shimcha tozalashsiz ishlatilgan.

• TLC: Alugram Xtra SIL G/UV254, 20 × 20 cm plastinkalar; UV nuri, yod va/yoki fosfomolibden kislotasi bilan vizualizatsiya.
• Kolonka xromatografiyasi: 60–120 mesh silikagel.
• ¹H va ¹³C NMR: Bruker Avance III 400 yoki 500 MHz; CDCl₃ yoki DMSO-d₆.
• FTIR: Agilent Cary 630 FTIR.
• Erish nuqtasi: Stuart Scientific erish nuqtasi qurilmasi, ochiq shisha kapillyar.
• HRMS: Agilent 1100 HPLC bilan JEOL AccuTOF JMS-T100LC ESI-TOF yoki Bruker Impact II ESI-Q-TOF/Apollo II ion-funnel ESI tizimi.

To‘rt bosqichli sintez oqimi

Bosqich 1 — N-alkillash: 1 → 3

Boshlang‘ich 2-aminobenzonitril 1 xolin xlorid/karbamid [ChCl/karbamid (1:2)] chuqur evtektik erituvchisida, har bir substrat uchun taxminan 10 mL/g DES ishlatib eritilgan. Bromoatsetonitril 2 miqdori substratga nisbatan 2.0–8.0 ekvivalent oralig‘ida o‘zgargan. Aralashma taxminan 50 °C da 2–4 kun aralashtirilgan va reaksiya TLC bilan kuzatilgan. Jarayon oxirida CHCl₃ bilan ekstraksiya va silikagel xromatografiyasi qo‘llangan.

Bosqich 2 — 3-aminoindol-2-karbonitril hosil bo‘lishi: 3 → 4

3a–f oraliq mahsulotlari taxminan 0.043–0.065 M boshlang‘ich substrat konsentratsiyasida etanol ichida 0.5 ekvivalent kukun K₂CO₃ bilan ishlov berilgan. Aralashma yopiq qalin devorli naychada oldindan qizdirilgan moy hammomida taxminan 140 °C da 20 daqiqa ushlab turilgan. Sovitish, suv bilan suyultirish, dixlormetan bilan ekstraksiya va xromatografik tozalashdan keyin 4a–f olingan.

Halqalanish spektroskopik jihatdan qanday kuzatilgan?

3 → 4 o‘zgarishida manba boshlang‘ich cyanomethyl guruhiga tegishli ¹H NMR CH₂ signallarining taxminan δ_H 4.20–4.40 sohasidan yo‘qolishini muhim strukturaviy ko‘rsatkich sifatida xabar qiladi. Buning o‘rniga yangi NH₂ signallari taxminan δ_H 5.50–5.80, indol NH signallari esa taxminan δ_H 10.00–11.00 sohasida paydo bo‘lgan. FTIR da taxminan 2200 cm⁻¹ atrofidagi nitril C≡N tasmasining saqlanishi halqalanish vaqtida nitril funksiyasi tuzilmada qolganini qo‘llab-quvvatlagan.

Bunday ma’lumotlarning roli muhim: NMR turli vodorod va uglerodlarning kimyoviy muhitlarini; FTIR muayyan funksional bog‘larning xarakterli tebranishlarini; HRMS esa birikmaning o‘lchangan yuqori aniqlikdagi massasi kutilgan molekulyar tarkibga mos kelishini tekshiradi. Ushbu usullarning birgalikda qo‘llanishi strukturaviy tayinlashning bitta o‘lchovga tayanib qolmasligini ta’minlaydi.

Bosqich 3 va 4 — Sikloalkan halqasini hosil qilish va Zn dan tozalash

4a–f birikmalari siklopentanon, siklogeksanon, siklogeptanon yoki siklooktanon bilan ZnI₂ (0.5 ekvivalent) ishtirokida yopiq naychada taxminan 130 °C da 20 daqiqa davomida ishlov berilgan. Bu jarayon Zn saqlovchi materiallarni hosil qilgan. Aralashma sovitilgach, geksan qo‘shilib Zn saqlovchi tuzlarning cho‘kishi ta’minlangan; cho‘kma geksan, so‘ng DCM bilan yuvilgan. Qolgan qattiq modda i-PrOH ichida eritilib, teng hajmdagi %40 suvli NaOH bilan xona haroratida tun davomida ishlov berilgan. Ushbu bosqich bog‘langan Zn ni olib tashlash uchun qo‘llangan.

Zn saqlovchi va Zn dan tozalangan namunalarning ¹H NMR spektrlari taqqoslanganda, ayniqsa indol NH va ekzosiklik NH₂ signallarida siljish hamda chiziq shaklining o‘zgarishi kuzatilgan. Zn saqlovchi materialda NH signallari kengroq va pastroq maydonda kuzatilgan. Bu topilma geterotsiklik azot funksiyalarining Zn bilan o‘zaro ta’siriga mos keladi; biroq tadqiqot ushbu ma’lumotlardan Zn ning aniq koordinatsion geometriyasi yoki stoxiometriyasini aniqlamaydi.

Yakuniy mahsulot unumlari

Yakuniy mahsulotlar ichida manbada eng yuqori ajratib olingan unum 7c uchun %98, eng past ajratib olingan unum esa 6f uchun %55 bo‘lgan. Ushbu unumlar reaksiyaning sintetik jihatdan erishilishini ko‘rsatadi; biologik faollik bilan bevosita bog‘lanish o‘rnatib bo‘lmaydi.

MTT hujayra-hayotchanlik tajribasining tafsilotlari

Tadqiqotda SK-MEL-28 melanoma, KB, BT-549 ko‘krak karsinomasi va SK-OV-3 tuxumdon karsinomasidan kelib chiqqan hujayra liniyalari hamda o‘sma hosil qilmaydigan buyrak epiteliyidan kelib chiqqan LLC-PK1 va Vero hujayralari ishlatilgan. LLC-PK1 cho‘chqa, Vero esa Afrika yashil maymunidan kelib chiqqan. Shu sababli ushbu ikki nazorat hujayra liniyasini “normal inson hujayrasi” deb talqin qilmaslik kerak.

Olti hujayra liniyasi RPMI-1640 muhitida %10 bovine calf serum va 60 mg L⁻¹ amikasin saqlovchi standart sharoitlarda, 37 °C va %5 CO₂ saqlovchi namlantirilgan atmosferada kultivatsiya qilingan.

6a–9f birikmalari DMSO ichida 10 mM stok eritma sifatida tayyorlangan. Yakuniy DMSO ulushi %0.5 (v/v) qiymatidan oshmagan. Tashuvchi nazorat sinov birikmasini saqlamaydigan, biroq ayni DMSO konsentratsiyasiga ega kultura muhitidir. Doksorubitsin musbat nazorat sifatida 1.25, 2.5 va 5 µg mL⁻¹ konsentratsiyalarda ishlatilgan.

Hujayralar 96 quduqli plastinkalarga har bir quduqqa 1 × 10⁴ hujayradan ekilgan va 24 soat yopishishi uchun qoldirilgan. Keyin sinov birikmalari 12.5, 25 va 50 µM yakuniy konsentratsiyalarda 48 soat qo‘llangan. So‘ng har bir quduqqa 15 µL MTT eritmasi qo‘shilib, 37 °C da yana 4 soat inkubatsiya qilingan. Muhit olib tashlangach, hosil bo‘lgan formazan kristallarini eritish uchun 100 µL DMSO qo‘shilgan. Absorbans Synergy HTX multimode mikroplastinka o‘quvchisida 570 nm da o‘lchangan.

Hujayraviy metabolik faollik tashuvchi nazoratga nisbatan ifodalangan va tashuvchi nazorat %100 deb qabul qilingan. IC₅₀ qiymatlari GraphPad Prism 8.0.2 yordamida nochiziqli regressiya orqali baholangan. Tajriba uch mustaqil vaqtda bajarilgan va har bir konsentratsiya/sharoit uchun beshta texnik takror quduq ishlatilgan.

Muhim statistik cheklov: IC₅₀ qiymatlari har bir mustaqil tajriba uchun alohida hisoblanmagani sababli tadqiqotchilar xabar qilingan IC₅₀ qiymatlariga ishonchli SD yoki SEM tayinlamagan. Manba ushbu natijalar uchun p-qiymati, ishonch oralig‘i yoki alohida gipoteza testini ham xabar qilmaydi. Shu sababli jadvaldagi kichik sonli farqlarni statistik jihatdan ahamiyatli farqlar sifatida talqin qilish to‘g‘ri emas.

Jadvalni o‘qish izohi: 6a–9f uchun qiymatlarning birligi µM. Doksorubitsin qiymatlari esa µg mL⁻¹ birlikda. Birliklar turlicha bo‘lgani sababli doksorubitsin qatoridagi sonlarni sinov birikmalari bilan faqat raqam kattaligiga qarab bevosita molyar potensiya taqqoslashiga aylantirish to‘g‘ri emas. Manba bunday aylantirishni amalga oshirmaydi.

NA: Sinovdan o‘tkazilgan 12.5–50 µM oralig‘ida hayotchanlikning %50 kamayish darajasiga erishilmagan. <12.5 µM: IC₅₀ 12.5 µM dan past ekani anglashiladi, biroq aniq qiymat mavjud konsentratsiya seriyasi bilan aniqlanmagan.

MTT natijalarida tuzilma-faollik munosabati

Butun seriya ko‘rib chiqilganda ham kondensirlangan halqa kattaligi, ham aromatik o‘rinbosarlanish hujayraviy faollik bilan bog‘liq ekani ko‘rinadi; biroq barcha birikmalarga tatbiq etiladigan sodda va bir yo‘nalishli tuzilma-faollik munosabati aniqlanmagan.

Metoksi o‘rinbosarli 6b va 8b tekshirilgan konsentratsiya oralig‘ida hech bir hujayra liniyasida %50 ta’sir darajasiga yetmagan. Aksincha, ayni metoksi guruhini saqlovchi 7b va 9b o‘lchash mumkin bo‘lgan IC₅₀ qiymatlarini bergan. Bu holat faqat “metoksi faollikni kamaytiradi” yoki faqat “halqa kattalashgan sari faollik ortadi” kabi bitta o‘zgaruvchili izoh ma’lumotlar bilan qo‘llab-quvvatlanmasligini ko‘rsatadi.

Metil o‘rinbosarli seriyada BT-549 uchun 6c = 13 µM, 7c = 18 µM va 8c = 20 µM bo‘lgan, 9c uchun esa qiymat <12.5 µM bo‘lgan. Biroq ayni halqa kattaligi ta’siri boshqa o‘rinbosar sinflarida xuddi shu tarzda takrorlanmagani sababli halqa kattaligi uchun umumiy monoton tendensiya o‘rnatib bo‘lmagan.

9f o‘smadan kelib chiqqan to‘rtta hujayra liniyasida 16–20 µM IC₅₀ qiymatlarini bergan; biroq LLC-PK1 uchun 14 µM va Vero uchun 19 µM qiymatlari kuzatilgan. Shu sababli 9f o‘smadan kelib chiqqan hujayralarga afzal ta’sir ko‘rsatadi deyish uchun ma’lumotlar yetarli emas.

9c SK-MEL-28, KB va BT-549 uchun <12.5 µM, SK-OV-3 uchun 20 µM; LLC-PK1 va Vero uchun esa 19 µM natija bergan. 9c ushbu tajriba seriyasida eng yuqori ko‘rinadigan faollikka ega bo‘lsa-da, dastlabki uch o‘sma liniyasidagi haqiqiy qiymat noma’lum bo‘lgani sababli o‘sma va o‘sma hosil qilmaydigan hujayralar o‘rtasidagi farq kattaligini aniq hisoblab bo‘lmaydi. Shu sababli manba mazmunli o‘sma hujayrasi selektivligi aniqlanganini da’vo qilmaydi.

Molekulyar doking uchun ligand tayyorlash

MTT natijalariga asoslanib 6c, 8f, 9c va 9f tanlangan. Ligand geometriyalari Open Babel 3.1.0 yordamida MMFF94s kuch maydoni bilan optimallashtirilgan. Molekulalar pH 7.0 uchun kimyoviy jihatdan mos protonlanish holatlariga keltirilgan; gidrogenlanish va formal zaryadlar vizual tekshirilgan. Gasteiger qisman atom zaryadlari berilgan va tuzilmalar AutoDock atom tiplari bilan PDBQT formatiga aylantirilgan. Aylanadigan bog‘lar PDBQT tayyorlash jarayonida aniqlangan.

Doking nishonlari nega tanlangan?

B-RAF V600E SK-MEL-28 hujayralari BRAF V600E mutatsiyasini saqlagani sababli melanoma kontekstida tanlangan. TOP2B saratonga qarshi dori ta’sirlari bilan bog‘liq va strukturaviy jihatdan xarakterlangan II tur topoizomeraza nishonidir. Siklin D1 uch karra manfiy ko‘krak saratoni bilan bog‘liqligi va BT-549 hujayralaridagi tajribaviy kontekst sababli; GSK3β esa tuxumdon saratoni va SK-OV-3 hujayralarida PI3K/AKT/GSK3B signal konteksti bilan bog‘langanligi sababli baholashga kiritilgan.

Oqsil tuzilmalari RCSB Protein Data Bank dan olingan va BIOVIA Discovery Studio 16.1 yordamida tayyorlangan. Kristallografik suv molekulalari va keraksiz geteroatomlar olib tashlangan. Ko-kristall ligand mavjud tuzilmalarda ligand bog‘lanish cho‘ntagini aniqlash uchun ishlatilgan, so‘ng dokingdan oldin olib tashlangan. Polar vodorodlar va Kollman zaryadlari AutoDockTools 1.5.7 yordamida qo‘shilgan.

Doking AutoDock Vina 1.1.2 bilan amalga oshirilgan. Grid qutilari 20 × 20 × 20 Å o‘lchamda. Manbada boshqacha ko‘rsatilmagan bo‘lsa, Vina standart sozlamalari ishlatilgan; exhaustiveness = 8, ko‘pi bilan 9 chiqish pozasi va 3 kcal mol⁻¹ energiya oralig‘i qo‘llangan. Eng manfiy Vina skoriga ega yuqori o‘rindagi poza o‘zaro ta’sir tahlili uchun tanlangan.

TOP2B modelidagi muhim maxsus cheklov

PDB 4G0V tuzilmasidagi DNA zanjiri doking retseptoridan olib tashlangan va faqat oqsil komponenti saqlangan. Bu tafsilot juda muhim; chunki ko‘plab TOP2 nishonli birikmalarning ta’siri TOP2–DNA–ligand uchlamchi komplekslari bilan bog‘liq. Shu sababli tadqiqotdagi TOP2B natijalari to‘liq TOP2B–DNA kesilish kompleksining modeli emas va faqat oqsil komponenti bilan ehtimoliy o‘zaro ta’sirlarning tadqiqiy bashorati sifatida o‘qilishi kerak.

Doking protokolini nazorat qilish

AutoDock Vina skorlari

B-RAF V600E natijalari

6c, 8f, 9c va 9f uchun Vina skorlari −8.2 dan −9.0 kcal mol⁻¹ gacha. Eng manfiy skorlar 9c va 9f uchun −9.0 kcal mol⁻¹, undan keyin 8f uchun −8.6 va 6c uchun −8.2.

6c ning tanlangan pozasida indol NH guruhi Cys532 bilan, birlamchi amino guruhi esa Gly534 bilan vodorod bog‘i hosil qilishi bashorat qilingan. Aromatik tizim uchun Trp531 va Phe583 bilan bashorat qilingan π–π o‘zaro ta’sirlar hamda Ile463/Val471 bilan gidrofob kontaktlar xabar qilingan. 8f da birlamchi amino guruhi Gln530 bilan vodorod bog‘i hosil qilishi bashorat qilingan. 9c va 9f ning tanlangan pozalarida indol NH Asp594 bilan o‘zaro ta’sirlashishi va Phe468, Val471, Leu514 hamda Phe583 bilan qo‘shimcha kontaktlar mavjudligi taxmin qilingan.

SK-MEL-28 MTT natijalarida 9c <12.5 µM, 9f 16 µM, 6c va 8f esa 18 µM qiymatlarni bergan. Bu reyting B-RAF doking skorlari bilan qisman o‘xshash ko‘rinsa-da, halqa kattaligi va aromatik o‘rinbosarlanish bir vaqtda o‘zgargani uchun farq qaysi strukturaviy xususiyatdan kelib chiqqanini aniqlab bo‘lmaydi. Eng muhimi, ushbu sifat jihatidagi parallellik B-RAF V600E ingibitsiyasi hujayraviy faollik mexanizmi ekanini isbotlamaydi.

TOP2B natijalari

To‘rtta birikmaning TOP2B skorlari juda tor oraliqda, −4.3 dan −4.4 kcal mol⁻¹ gacha qolgan. 6c va 8f uchun indol NH va ekzosiklik amino guruhi orqali Glu522 ga yo‘nalgan ikkita vodorod bog‘i; kattaroq 9c va 9f uchun esa Arg503 bilan o‘zaro ta’sirlar bashorat qilingan. To‘rtta birikmaning barchasida kondensirlangan alitsiklik halqa bilan Leu507 o‘rtasida gidrofob kontakt taxmin qilingan.

KB hujayralaridagi MTT natijalari doking reytingiga mos kelmagan: 9c uchun IC₅₀ <12.5 µM bo‘lsa, 6c, 8f va 9f uchun 20 µM; buning aksiga TOP2B skorlarining barchasi deyarli bir xil. Demak, faqat-oqsil TOP2B modeli hujayraviy farqlarni tushuntirmaydi.

Siklin D1 natijalari

Siklin D1 uchun skorlar −6.2 dan −7.1 kcal mol⁻¹ gacha. 9c va 9f −7.1 bilan eng manfiy skorni bergan va tashqi referens ligand nomilinning skori bilan bir xil qiymatga yetgan. 8f −6.9, 6c esa −6.2 kcal mol⁻¹ deb topilgan.

To‘rtta birikmaning barchasida Gln71 va Glu115 bilan indol NH va/yoki ekzosiklik amino guruhlari orqali bashorat qilingan vodorod bog‘lari; shuningdek Ile117, Leu119 va Thr116 bilan kontaktlar xabar qilingan. 9c va 9f uchun kattaroq kondensirlangan halqa qo‘shimcha gidrofob kontaktlar bilan bog‘liq bo‘lishi mumkinligi taxmin qilingan.

Biroq BT-549 natijalari doking reytingiga to‘liq mos kelmaydi. Masalan, doking nuqtai nazaridan eng kam manfiy skor 6c da −6.2 bo‘lishiga qaramay, BT-549 IC₅₀ qiymati 13 µM; manfiyroq −6.9 skorga ega 8f ning IC₅₀ qiymati esa 19 µM. Shu sababli siklin D1 dokingi hujayraviy faollik farqlarini o‘zi yakka holda tushuntira olmaydi.

GSK3β natijalari

GSK3β uchun to‘rtta birikmaning skorlari −9.6 dan −9.9 kcal mol⁻¹ gacha bo‘lib, bir-biriga juda yaqin. 9c −9.9, 9f −9.8, 6c va 8f −9.6 kcal mol⁻¹ skor bergan. 6c ning tanlangan pozasida vodorod bog‘i xabar qilinmagan va o‘zaro ta’sirlar asosan gidrofob ekani qayd etilgan. 8f da ftor o‘rinbosari bilan Lys85 ning N–H guruhi o‘rtasida qo‘shimcha qutbli kontakt taxmin qilingan. 9c va 9f kengroq o‘zaro ta’sir tarmoqlarini ko‘rsatsa-da, skor farqlari kichik.

SK-OV-3 MTT qiymatlari ham 18–21 µM kabi tor oraliqda qolgan: 6c 19, 8f 21, 9c 20 va 9f 18 µM. Doking hamda MTT qiymatlarining bir-biriga yaqin bo‘lishi ushbu to‘rtta birikma bu cheklangan modelda o‘xshash xatti-harakat ko‘rsatishini taxmin qilishga imkon beradi; biroq GSK3β hujayraviy faollikning sababi ekanini isbotlamaydi.

Formula va tenglama holati

Manba tadqiqot mustaqil matematik model tenglamasi yoki mexanistik kinetik tenglama bermaydi. IC₅₀ hisoblashda nochiziqli regressiya ishlatilgani ko‘rsatiladi, biroq regressiya funksiyasining ochiq tenglamasi xabar qilinmaydi. Shu sababli Verianla matniga manbada mavjud bo‘lmagan doza-javob tenglamasi qo‘shilmagan. Doking skorlari va RMSD qiymatlari ham manbada hisoblash chiqishi sifatida berilgan; maqola yangi matematik doking tenglamasini keltirib chiqarmagan.

Tadqiqotning asosiy cheklovlari

• MTT testi faqat uchta sinov konsentratsiyasidan foydalangan: 12.5, 25 va 50 µM.
• 9c ning o‘smadan kelib chiqqan uchta hujayra liniyasidagi haqiqiy IC₅₀ qiymatlari 12.5 µM dan past bo‘lib qolgani sababli aniq aniqlanmagan.
• IC₅₀ qiymatlari har bir mustaqil tajriba uchun alohida hisoblanmagani sababli SD yoki SEM xabar qilib bo‘lmagan.
• MTT hujayraviy metabolik faollik/hayotchanlik o‘lchovidir; hujayra o‘limi mexanizmini aniqlamaydi.
• LLC-PK1 va Vero o‘sma hosil qilmaydigan buyrak epiteliy hujayra liniyalaridir, ammo normal inson to‘qimasini ifodalovchi klinik nazorat emas; biri cho‘chqa, ikkinchisi Afrika yashil maymunidan kelib chiqqan.
• 9c uchun mazmunli o‘sma hujayrasi selektivligini mavjud konsentratsiya seriyasidan aniq belgilab bo‘lmagan.
• Doking faqat tanlangan to‘rtta birikma va tanlangan to‘rtta oqsil modeli bilan bajarilgan.
• Doking bevosita oqsil bog‘lanishi yoki ferment ingibitsiyasi tajribasi emas.
• TOP2B doking modelidan DNA chiqarib tashlangani sababli to‘liq TOP2B–DNA–ligand kompleksi ifodalanmaydi.
• Nomilin uchun RMSD tajribaviy kristall pozaga validatsiya emas, balki ikki hisoblash o‘rtasidagi takrorlanuvchanlik o‘lchovidir.
• Tadqiqotda bevosita biokimyoviy nishonni tasdiqlash, hujayraviy target-engagement tajribasi, in vivo tajriba yoki klinik baholash amalga oshirilmagan.

Natijaning to‘g‘ri ilmiy talqini

Tadqiqotning eng kuchli natijasi — turli aromatik o‘rinbosarlar va to‘rt xil kondensirlangan sikloalkan halqa kattaligini saqlovchi keng 5H-pirido[3,2-b]indol-4-amin seriyasini sintez qilish mumkinligi va ularning dastlabki hujayra asosidagi biologik baholanishi amalga oshirilganidir. 9c sinovdan o‘tkazilgan oralig‘da ajralib turgan; biroq haqiqiy IC₅₀ qiymatlarining bir qismi o‘lchash oralig‘idan tashqarida qolishi va o‘sma hosil qilmaydigan hujayralarga nisbatan qiymatlarning yaqinligi sababli ushbu birikmaga aniq potensiya yoki selektivlik sifati berilmasligi kerak.

Doking hisoblari B-RAF V600E, TOP2B, siklin D1 va GSK3β uchun o‘rganish mumkin bo‘lgan ehtimoliy bog‘lanish pozalarini hosil qilgan. Biroq hisoblar bevosita nishon bilan o‘zaro ta’sirni yoki ta’sir mexanizmini ko‘rsatmaydi. Manbaning o‘z xulosasiga ko‘ra ham batafsilroq konsentratsiya-javob tajribalari, bevosita biokimyoviy tajribalar, hujayraviy nishon bilan o‘zaro ta’sir tadqiqotlari va kengroq mexanistik izlanishlar zarur.

Manba va Usul Haqida Izoh

Asl sarlavha: Cycloalkane-Fused 5H-Pyrido[3,2-b]indol-4-amines: Synthesis, Characterization, Molecular Docking, and In Vitro Cell-Viability Evaluation

Mualliflar: Lo’ay A. Al-Momani; Panayiotis A. Koutentis; Stavros Panagiotou; Mohammad K. Abu-Sini; Fadi G. Saqallah; Samir A. Ross.

Mas’ul muallif: Lo’ay A. Al-Momani — Department of Chemistry, Faculty of Science, The Hashemite University, Zarqa, Jordan.

Teng hissa: Manba maqolada teng hissa/teng birinchi mualliflik bayonoti ko‘rsatilmagan.

Muassasalar: Department of Chemistry, Faculty of Science, The Hashemite University, Zarqa, Jordan; Department of Chemistry, University of Cyprus, Nicosia, Cyprus; Department of Pharmacy, Faculty of Pharmacy, Al-Zaytoonah University of Jordan, Amman, Jordan; National Center for Natural Products Research, School of Pharmacy, The University of Mississippi, Oxford, Mississippi, USA; Division of Pharmacognosy, Department of Biomolecular Sciences, School of Pharmacy, The University of Mississippi, Oxford, Mississippi, USA.

Jurnal: Chemistry.

Nashriyot: MDPI, Basel, Switzerland.

Bibliografik yozuv: Chemistry 2026, 8(10), 132.

DOI: 10.3390/chemistry8100132

Rasmiy havola: https://doi.org/10.3390/chemistry8100132

Qabul qilinish / qayta ko‘rib chiqish / qabul / nashr: Received 22 Avgust 2026; Revised 17 Sentabr 2026; Accepted 21 Sentabr 2026; Published 24 Sentabr 2026.

Manba turi va taqriz: Chemistry jurnalida nashr etilgan tadqiqot maqolasidir. Chemistry, MDPI tomonidan nashr etiladigan taqrizdan o‘tuvchi ochiq kirishli kimyo jurnalidir.

Litsenziya: Creative Commons Attribution (CC BY) ochiq kirish litsenziyasi; jurnalning ochiq kirish shartlari CC BY 4.0 litsenziyasini ko‘rsatadi.

Preprint holati: Manba maqolada preprint versiyasi yoki preprint identifikatori ko‘rsatilmagan.

Tadqiqot turi: Tajribaviy organik/meditsinal kimyo sintezi va xarakterizatsiyasi + in vitro MTT hujayra-hayotchanlik baholashi + tadqiqiy in silico molekulyar doking.

Moliyalashtirish: Tadqiqot Fulbright Foundation, Tafila Technical University (TTU), Hashemite University Research Grant No. 113/2022 va University of Mississippi National Center for Natural Products Research (NCNPR) tomonidan qo‘llab-quvvatlangan. Manba moliyalashtiruvchilar tadqiqot dizayni, ma’lumot to‘plash, tahlil/talqin, maqola tayyorlash yoki nashr qilish qarorida rol o‘ynamaganini bildiradi.

Ma’lumotlarning mavjudligi: Tadqiqotda taqdim etilgan ma’lumotlar maqola va Supplementary Materials ichida mavjudligi bildirilgan.

Qo‘shimcha materiallar: Supplementary Materials ichida FTIR spektrlari uchun Figures S1–S36; ¹H va ¹³C NMR, DEPT, HMBC va HMQC ma’lumotlari uchun Figures S37–S164; HRMS uchun Figures S165–S200 hamda birikmalarning bog‘lanish o‘zaro ta’sir tahlilini o‘z ichiga olgan Table S1 mavjud.

Manfaatlar to‘qnashuvi: Mualliflar manfaatlar to‘qnashuvi yo‘qligini bayon qilgan.

Etika kengashi / xabardor rozilik: Manba maqolaning yakuniy bayonotlarida alohida Institutional Review Board yoki Informed Consent Statement xabar qilinmagan. Tadqiqotning biologik qismi barqaror hujayra liniyalarida olib borilgan.

Muallif hissalari: Konseptuallashtirish: Panayiotis A. Koutentis, Lo’ay A. Al-Momani va Samir A. Ross. Metodologiya: Panayiotis A. Koutentis, Stavros Panagiotou, Lo’ay A. Al-Momani, Mohammad K. Abu-Sini va Fadi G. Saqallah. Dasturiy ta’minot: Fadi G. Saqallah. Formal tahlil: Lo’ay A. Al-Momani, Stavros Panagiotou va Panayiotis A. Koutentis. Resurslar: Samir A. Ross va Lo’ay A. Al-Momani. Ma’lumotlarni kuratsiya qilish: Lo’ay A. Al-Momani, Mohammad K. Abu-Sini va Fadi G. Saqallah. Dastlabki qoralama: Lo’ay A. Al-Momani. Ko‘rib chiqish va tahrirlash: Panayiotis A. Koutentis va Samir A. Ross. Superviziya: Samir A. Ross va Panayiotis A. Koutentis. Loyiha boshqaruvi: Lo’ay A. Al-Momani, Samir A. Ross va Panayiotis A. Koutentis. Moliyalashtirishni ta’minlash: Samir A. Ross va Lo’ay A. Al-Momani.

Minnatdorchilik: Mualliflar sintetik tadqiqotlar uchun laboratoriya imkoniyatlarini taqdim etgan Amar Chittiboyina ga, University of Mississippi da MTT o‘lchovlarini bajargan Shabana Khan ga hamda yuqori aniqlikdagi massa spektrometriyasi o‘lchovlaridagi yordamlari uchun Charles Cantrell (USDA-ARS) va Naba Hikma Labs ga minnatdorlik bildiradi.

Asosiy metodologik cheklov: Hujayraviy sinov faqat uchta birikma konsentratsiyasiga asoslangan va ayrim IC₅₀ qiymatlari tajriba oralig‘idan tashqarida qolgan. MTT natijalari hujayraviy metabolik faollik/hayotchanlik ko‘rsatkichidir; bevosita saratonga qarshi mexanizm dalili emas. Molekulyar doking hisoblari nishonga bog‘lanishni yoki mexanizmni tajribaviy tasdiqlamaydi. TOP2B modelida DNA chiqarib tashlangan va siklin D1 uchun ishlatilgan nomilin poza nazorati kristallografik validatsiya emas, hisoblar orasidagi poza takrorlanuvchanligidir. Tadqiqotda in vivo yoki klinik validatsiya amalga oshirilmagan.