Sikloalkan-kaynaşık 5H-pirido[3,2-b]indol-4-aminler, indol ve piridin temelli heterosiklik çekirdeğe beş, altı, yedi veya sekiz üyeli doymuş bir karbon halkasının kaynaştırıldığı bileşiklerdir. Bu çalışmada Lo’ay A. Al-Momani ve çalışma arkadaşları, sübstitüe 2-aminobenzonitrillerden başlayarak bu bileşik ailesine ulaşan dört basamaklı bir sentez geliştirmiş; elde edilen ürünleri NMR, FTIR ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisiyle karakterize etmiş; 6a–9f bileşiklerinin hücresel metabolik aktivite/viabilite üzerindeki etkilerini MTT testiyle incelemiş ve seçilen 6c, 8f, 9c ve 9f bileşikleri için dört kanserle ilişkili proteine karşı keşifsel moleküler docking hesaplamaları gerçekleştirmiştir.

Sentezin ilk basamağında 2-aminobenzonitriller, kolin klorür/üre esaslı derin ötektik çözücü içerisinde bromoasetonitril ile N-alkillenmiştir. Elde edilen 2-[(siyanometil)amino]benzonitriller daha sonra K₂CO₃ kullanılarak kapalı tüpte halkalaştırılmış ve 3-aminoindol-2-karbonitrillere dönüştürülmüştür. Bu ara ürünler ZnI₂ varlığında siklopentanon, sikloheksanon, sikloheptanon veya siklooktanonla yoğunlaştırılmış; son olarak Zn içeren materyalin sulu %40 NaOH ile işlenmesiyle Zn'den arındırılmış 6–9 bileşik serileri elde edilmiştir. İlk N-alkilleme ürünlerinin izole verimleri %51–83, indol ara ürünlerinin verimleri %60–80 ve nihai piridoindol türevlerinin verimleri %55–98 aralığındadır.

MTT deneylerinde dört tümör kökenli hücre hattı — SK-MEL-28, KB, BT-549 ve SK-OV-3 — ile iki yerleşik tümörijenik olmayan böbrek epitel hücre hattı — domuz kökenli LLC-PK1 ve Afrika yeşil maymunu kökenli Vero — kullanılmıştır. En yüksek görünen aktivite 3-metil siklooktan-kaynaşık türev 9c'de gözlenmiştir. 9c için SK-MEL-28, KB ve BT-549 hücrelerinde IC₅₀ değeri <12.5 µM olarak raporlanmış, SK-OV-3 için 20 µM ve LLC-PK1 ile Vero için 19 µM bulunmuştur. Ancak <12.5 µM ifadesi gerçek IC₅₀'nin ölçüldüğü anlamına gelmez; test edilen en düşük konsantrasyon 12.5 µM olduğu için yalnız gerçek değerin bu sınırın altında bulunduğunu gösterir. Bu nedenle çalışmanın verileri 9c'nin kesin potensini veya tümör hücrelerine karşı anlamlı seçiciliğini belirlemeye yetmemektedir.

Moleküler docking sonuçları B-RAF V600E, TOP2B, siklin D1 ve GSK3β bağlanma bölgelerinde bazı olası protein-ligand etkileşimleri göstermiştir. Bununla birlikte docking, bir proteinin hücre içinde gerçekten hedef olduğunu, bileşiğin o proteini inhibe ettiğini veya gözlenen MTT etkisinin bu mekanizmadan kaynaklandığını kanıtlamaz. Araştırmacılar da docking sonuçlarını doğrudan hedef doğrulaması olarak değil, daha ileri deneylerde sınanabilecek olası bağlanma biçimlerini belirleyen keşifsel hesaplamalar olarak yorumlamıştır.

En önemli yorum sınırı: Bu çalışma bir klinik tedavi çalışması, hayvan deneyi veya doğrudan antikanser etkinlik kanıtı değildir. MTT verileri yalnız belirli hücre hatlarında ve belirli deney koşullarındaki hücresel metabolik aktivite/viabilite etkisini; docking sonuçları ise seçilmiş protein yapıları üzerindeki hesaplamalı bağlanma tahminlerini göstermektedir.

Çalışmanın araştırma problemi

İndol çekirdeği tıbbi kimyada çok kullanılan heterosiklik yapılardan biridir. İndol türevlerinin farklı biyolojik etkinliklerle ilişkilendirilmiş olması, bu çekirdeğin yapısal olarak değiştirilmesini yeni bileşik kütüphaneleri oluşturmak açısından ilgi çekici hale getirmektedir. Piridoindoller, indol sistemine ilave azot içeren bir halka ekleyerek yapısal çeşitliliği artırırken; buna farklı büyüklükte sikloalkan halkalarının kaynaştırılması molekülün üç boyutlu biçimini ve fizikokimyasal özelliklerini daha da değiştirebilir.

Çalışmanın amacı doğrudan bir ilaç geliştirdiğini göstermek değildir. Araştırmacılar önce farklı aromatik sübstitüentleri ve farklı büyüklükte kaynaşmış karbon halkalarını taşıyan bir 5H-pirido[3,2-b]indol-4-amin kütüphanesi sentezlemiş, ardından bu yapısal değişikliklerin hücre temelli MTT sonuçlarıyla nasıl birlikte değiştiğini incelemiştir. Seçilmiş dört bileşik ayrıca olası protein etkileşimlerini araştırmak amacıyla moleküler docking aşamasına alınmıştır.

Temel yapısal kavramlar ne anlama geliyor?

İndol, benzen halkası ile azot içeren beş üyeli bir halkanın kaynaşmasından oluşan aromatik heterosiklik bir iskelettir. Piridoindol adlandırması, bu çekirdeğe ilave bir azot içeren altı üyeli aromatik halkanın dahil olduğunu ifade eder. Sikloalkan-kaynaşık ifadesi ise piridoindol sistemine doymuş bir karbon halkasının ortak atomlar üzerinden bağlandığını belirtir. Çalışmadaki 6, 7, 8 ve 9 serileri sırasıyla siklopentan, sikloheksan, sikloheptan ve siklooktan kökenli kaynaşmış halka boyutlarını temsil etmektedir.

Aromatik halkadaki sübstitüentler seri içinde a–f harfleriyle kodlanmıştır: a = H, b = metoksi (OCH₃), c = metil (CH₃), d = Cl, e = Br ve f = F. Böylece örneğin 9c, siklooktan-kaynaşık ve metil sübstitüe üyeyi; 9f ise aynı büyük kaynaşmış halkayı taşıyan fakat fluoro sübstitüe üyeyi ifade eder.

Derin ötektik çözücü neden önemlidir?

Çalışmanın ilk sentez basamağında kullanılan derin ötektik çözücü (deep eutectic solvent, DES), kolin klorür ve ürenin 1:2 mol oranındaki karışımıdır. Derin ötektik çözücüler, bileşenler arasındaki güçlü etkileşimler nedeniyle tek tek bileşenlerden farklı erime ve çözücü özellikleri gösterebilen sıvı karışımlardır. Bu çalışmada DES, ilk N-alkilleme reaksiyonunun reaksiyon ortamı olarak kullanılmıştır. Çalışmanın verileri DES'in bütün alternatif çözücülerden üstün olduğunu test eden karşılaştırmalı bir çözücü taraması değildir; dolayısıyla burada yalnız kullanılan reaksiyon ortamı olarak değerlendirilmelidir.

Kapalı tüpte sentez ne anlama geliyor?

İkinci ve üçüncü temel dönüşümler kalın cidarlı ve kapatılmış cam tüplerde gerçekleştirilmiştir. GP2 için kaynak, 15 mL kapasiteli ve 10–12 bar'a kadar derecelendirilmiş bir tüp kullanıldığını bildirir. Etanol içeren GP2 karışımı yaklaşık 140 °C'ye, ZnI₂ aracılı GP3 karışımı ise yaklaşık 130 °C'ye ısıtılmıştır. Kapalı sistem, uçucu bileşenlerin yüksek sıcaklıkta sistem içinde tutulmasına olanak verir; ancak kaynak reaksiyon sırasında oluşan gerçek basıncı ölçüp raporlamamaktadır. Bu nedenle tüpün 10–12 bar dayanım sınıfı ile reaksiyonun gerçek basıncı birbirine karıştırılmamalıdır.

MTT testi ve IC₅₀ bu çalışmada neyi gösteriyor?

Bu çalışmada MTT testi, verilen bileşik konsantrasyonlarından sonra hücrelerin MTT'yi formazana dönüştürebilen metabolik aktivitesini ölçerek hücre viabilitesi için dolaylı bir gösterge sağlamaktadır; IC₅₀ ise MTT sinyalinin araç kontrolüne göre %50 etki düzeyine ulaştığı tahmini konsantrasyonu ifade eder ve tek başına hücre ölüm mekanizmasını veya antikanser seçiciliği kanıtlamaz.

MTT, 3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromürdür. Metabolik olarak aktif hücreler tetrazolyum yapısını renkli formazan ürünlerine dönüştürebilir. Bu nedenle 570 nm'de ölçülen absorbansın azalması hücresel metabolik aktivitenin/viabilitenin azalmasıyla ilişkilendirilir. Bununla birlikte MTT testi tek başına hücrelerin apoptotik mi, nekrotik mi öldüğünü, hücre döngüsünün durup durmadığını veya hangi moleküler hedefin etkilendiğini söylemez.

Kaynakta test bileşikleri yalnız 12.5, 25 ve 50 µM olmak üzere üç konsantrasyonda incelenmiştir. IC₅₀ değerleri GraphPad Prism 8.0.2 ile doğrusal olmayan regresyondan tahmin edilmiştir. Kaynak kullanılan doğrusal olmayan regresyon denkleminin ayrıntılı biçimini raporlamamaktadır; bu nedenle Verianla metninde dört parametreli lojistik eğri gibi kaynakta belirtilmeyen özel bir model varsayılmamıştır.

Bir IC₅₀ değerinin <12.5 µM olarak yazılması, örneğin 8 µM veya 5 µM olduğunun gösterildiği anlamına gelmez. Yalnız %50 etki düzeyinin test edilen en düşük 12.5 µM konsantrasyonunun altında bulunduğunu gösterir. Aynı şekilde kaynakta NA, 12.5–50 µM test aralığında hücre viabilitesinde %50 azalma düzeyine ulaşılamadığı anlamına gelir.

Moleküler docking skoru bu çalışmada neyi kanıtlar?

Moleküler docking skoru, belirli bir protein modeli ve hesaplama protokolü içinde bir ligand pozunun hesaplamalı olarak ne kadar elverişli değerlendirildiğini gösterir; daha negatif AutoDock Vina skoru model içinde daha elverişli tahmini bağlanmayı ifade edebilse de gerçek bağlanma afinitesini, protein inhibisyonunu, hücresel hedef etkileşimini veya etki mekanizmasını tek başına kanıtlamaz.

Bu ayrım çalışmanın yorumlanmasında özellikle önemlidir. 9c ve 9f bazı hedeflerde diğer seçilmiş bileşiklerden daha negatif docking skorları vermiştir; ancak hücre temelli IC₅₀ sıralaması bütün hedeflerde docking sıralamasıyla örtüşmemektedir. Bu uyumsuzluk, hücresel davranışın yalnız statik bir protein-cebi modelinden ibaret olmadığını; çözünürlük, lipofilisite, metabolik kararlılık, hücreye erişim ve diğer olası hücresel etkileşimler gibi docking hesabında doğrudan temsil edilmeyen unsurların da önemli olabileceğini göstermektedir. Bu son faktörler kaynak tartışmasında olası açıklamalar olarak ele alınmakta, ölçülmüş yeni sonuçlar olarak sunulmamaktadır.

Docking skoruyla deneysel bağlanma afinitesi aynı şey değildir

AutoDock Vina'nın kcal mol⁻¹ cinsinden verdiği skor, deneysel olarak ölçülmüş bağlanma serbest enerjisinin doğrudan yerine geçmez. Ayrıca farklı protein hedefleri için elde edilen skorları birbirine karşı mutlak bir afinite sıralaması şeklinde okumak uygun değildir. Çalışmanın güvenilir yorumu, aynı hedefte aynı protokolle incelenen bileşiklerin göreli hesaplamalı sonuçlarını ve deneysel MTT verileriyle yalnız nitel düzeydeki olası paralellikleri değerlendirmektir.

RMSD neyi anlatıyor?

RMSD (root-mean-square deviation; kök-ortalama-kare sapma), burada kristal yapıda gözlenen ligand konumu ile docking protokolüyle yeniden elde edilen konum arasındaki ağır atom geometrik farkını değerlendirmek için kullanılmıştır. B-RAF V600E için PLX4032'nin RMSD'si 0.568 Å, TOP2B için mitoksantronun 1.199 Å ve GSK3β için SZW'nin 0.291 Å olarak bulunmuştur. Çalışmada 2.0 Å'nın altındaki değerler kabul edilebilir poz yeniden üretimi olarak değerlendirilmiştir.

Siklin D1 için kullanılan nomilin farklıdır: nomilin PDB 6P8E kristal yapısında ko-kristal ligand değildir. Bu nedenle 0.112 Å değeri deneysel kristal pozuna karşı doğrulama değildir; iki bağımsız docking çalıştırmasından elde edilen pozların birbirine ne kadar benzediğini gösteren poz tekrarlanabilirliği ölçüsüdür. 0.112 Å'nın çok küçük olması, nomilinin gerçek bağlanma geometrisinin deneysel olarak doğrulandığı anlamına gelmez.

Çalışmanın desteklediği ve desteklemediği sonuçlar

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Genel deneysel altyapı

Sentez reaksiyonlarının tamamı argon atmosferinde yürütülmüş; cam malzemeler ve manyetik karıştırıcı çubukları kullanım öncesinde fırında kurutulmuş, çözücüler kullanım öncesinde damıtılmıştır. Ticari reaktifler Fluka veya Sigma-Aldrich kaynaklıdır ve ek saflaştırma yapılmadan kullanılmıştır.

• TLC: Alugram Xtra SIL G/UV254, 20 × 20 cm plakalar; UV ışığı, iyot ve/veya fosfomolibdik asit ile görüntüleme.
• Kolon kromatografisi: 60–120 mesh silika jel.
• ¹H ve ¹³C NMR: Bruker Avance III 400 veya 500 MHz; CDCl₃ veya DMSO-d₆.
• FTIR: Agilent Cary 630 FTIR.
• Erime noktası: Stuart Scientific erime noktası cihazı, açık cam kapiler.
• HRMS: Agilent 1100 HPLC ile JEOL AccuTOF JMS-T100LC ESI-TOF veya Bruker Impact II ESI-Q-TOF/Apollo II ion-funnel ESI sistemi.

Dört basamaklı sentez akışı

Basamak 1 — N-alkilleme: 1 → 3

Başlangıç 2-aminobenzonitrili 1, kolin klorür/üre [ChCl/üre (1:2)] derin ötektik çözücüsünde, substrat başına yaklaşık 10 mL/g DES kullanılarak çözülmüştür. Bromoasetonitril 2 miktarı substrata göre 2.0–8.0 eşdeğer arasında değişmiştir. Karışım yaklaşık 50 °C'de 2–4 gün karıştırılmış ve reaksiyon TLC ile izlenmiştir. İşlem sonunda CHCl₃ ile ekstraksiyon ve silika jel kromatografisi uygulanmıştır.

Basamak 2 — 3-aminoindol-2-karbonitril oluşumu: 3 → 4

3a–f ara ürünleri, yaklaşık 0.043–0.065 M başlangıç substrat derişiminde etanol içerisinde 0.5 eşdeğer toz K₂CO₃ ile işlenmiştir. Karışım kapalı kalın cidarlı tüpte önceden ısıtılmış yağ banyosunda yaklaşık 140 °C'de 20 dakika tutulmuştur. Soğutma, suyla seyreltme, diklorometan ekstraksiyonu ve kromatografik saflaştırma sonrasında 4a–f elde edilmiştir.

Spektroskopik olarak halkalaşma nasıl izlenmiş?

3 → 4 dönüşümünde kaynak, başlangıç cyanomethyl grubuna ait ¹H NMR CH₂ sinyallerinin yaklaşık δ_H 4.20–4.40 bölgesinden kaybolmasını önemli bir yapısal gösterge olarak raporlamaktadır. Bunun yerine yeni NH₂ sinyalleri yaklaşık δ_H 5.50–5.80, indol NH sinyalleri ise yaklaşık δ_H 10.00–11.00 bölgesinde ortaya çıkmıştır. FTIR'de yaklaşık 2200 cm⁻¹ civarındaki nitril C≡N bandının korunması, halkalaşma sırasında nitril fonksiyonunun yapıda kaldığını desteklemiştir.

Bu tür verilerin rolü önemlidir: NMR farklı hidrojen ve karbonların kimyasal çevrelerini; FTIR belirli fonksiyonel bağların karakteristik titreşimlerini; HRMS ise bileşiğin ölçülen yüksek çözünürlüklü kütlesinin beklenen moleküler bileşimle uyumunu kontrol eder. Bu tekniklerin birlikte kullanılması, yapısal atamanın tek bir ölçüme dayanmamasını sağlar.

Basamak 3 ve 4 — Sikloalkan halkasının oluşturulması ve Zn'den arındırma

4a–f bileşikleri siklopentanon, sikloheksanon, sikloheptanon veya siklooktanonla ZnI₂ (0.5 eşdeğer) varlığında kapalı tüpte yaklaşık 130 °C'de 20 dakika işlenmiştir. Bu işlem Zn içeren materyaller oluşturmuştur. Karışım soğutulduktan sonra hekzan eklenerek Zn içeren tuzların çökelmesi sağlanmış; çökelti hekzan ve ardından DCM ile yıkanmıştır. Geriye kalan katı i-PrOH içerisinde çözülmüş ve eşit hacimde %40 sulu NaOH ile oda sıcaklığında gece boyunca işlenmiştir. Bu aşama bağlı Zn'nin uzaklaştırılması için uygulanmıştır.

Zn içeren ve Zn'den arındırılmış örneklerin ¹H NMR spektrumları karşılaştırıldığında özellikle indol NH ve ekzosiklik NH₂ sinyallerinde kayma ve çizgi biçimi değişiklikleri görülmüştür. Zn içeren materyalde NH sinyalleri daha geniş ve daha aşağı alanda gözlenmiştir. Bu bulgu heterosiklik azot fonksiyonlarının Zn ile etkileşimiyle uyumludur; ancak çalışma bu verilerden Zn'nin kesin koordinasyon geometrisini veya stokiyometrisini belirlememektedir.

Nihai ürün verimleri

Nihai ürünler içinde kaynakta en yüksek izole verim 7c için %98, en düşük izole verim ise 6f için %55'tir. Bu verimler reaksiyonun sentetik erişilebilirliğini gösterir; biyolojik aktiviteyle doğrudan ilişki kurulamaz.

MTT hücre-viabilite deneyinin ayrıntıları

Çalışmada SK-MEL-28 melanoma, KB, BT-549 meme karsinomu ve SK-OV-3 over karsinomu kökenli hücre hatları ile tümörijenik olmayan böbrek epitel kökenli LLC-PK1 ve Vero hücreleri kullanılmıştır. LLC-PK1 domuz, Vero ise Afrika yeşil maymunu kökenlidir. Dolayısıyla bu iki kontrol hücre hattı “normal insan hücresi” olarak yorumlanmamalıdır.

Altı hücre hattı RPMI-1640 ortamında %10 bovine calf serum ve 60 mg L⁻¹ amikasin içeren standart koşullarda, 37 °C ve %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş atmosferde kültüre edilmiştir.

6a–9f bileşikleri DMSO içerisinde 10 mM stok çözelti olarak hazırlanmıştır. Nihai DMSO oranı %0.5 (v/v) değerini aşmamıştır. Araç kontrolü, test bileşiği içermeyen fakat aynı DMSO konsantrasyonunu taşıyan kültür ortamıdır. Doksorubisin pozitif kontrol olarak 1.25, 2.5 ve 5 µg mL⁻¹ konsantrasyonlarında kullanılmıştır.

Hücreler 96 kuyucuklu plakalara kuyucuk başına 1 × 10⁴ hücre olacak şekilde ekilmiş ve 24 saat tutunmaya bırakılmıştır. Ardından test bileşikleri 12.5, 25 ve 50 µM nihai konsantrasyonlarda 48 saat uygulanmıştır. Sonrasında her kuyucuğa 15 µL MTT çözeltisi eklenmiş ve 37 °C'de 4 saat daha inkübe edilmiştir. Ortam uzaklaştırıldıktan sonra oluşan formazan kristallerini çözmek amacıyla 100 µL DMSO eklenmiştir. Absorbans Synergy HTX multimode mikroplaka okuyucusunda 570 nm'de ölçülmüştür.

Hücresel metabolik aktivite araç kontrolüne göre ifade edilmiş ve araç kontrolü %100 kabul edilmiştir. IC₅₀ değerleri GraphPad Prism 8.0.2 kullanılarak doğrusal olmayan regresyonla tahmin edilmiştir. Deney üç bağımsız zamanda gerçekleştirilmiş ve her konsantrasyon/koşul için beş teknik tekrar kuyucuğu kullanılmıştır.

Önemli istatistiksel sınırlılık: IC₅₀ değerleri her bağımsız deney için ayrı ayrı hesaplanmadığından araştırmacılar raporlanan IC₅₀ değerlerine güvenilir SD veya SEM atamamıştır. Kaynak ayrıca bu sonuçlar için p-değeri, güven aralığı veya ayrı bir hipotez testi raporlamamaktadır. Bu nedenle tablodaki küçük sayısal farkları istatistiksel olarak anlamlı farklar şeklinde yorumlamak doğru değildir.

Tabloyu okuma notu: 6a–9f için değerlerin birimi µM'dir. Doksorubisin değerleri ise µg mL⁻¹ cinsindedir. Birimler farklı olduğundan doksorubisin satırındaki sayıları test bileşikleriyle yalnız rakam büyüklüğüne bakarak doğrudan molar potens karşılaştırmasına çevirmek doğru değildir. Kaynak böyle bir dönüşüm yapmamaktadır.

NA: Test edilen 12.5–50 µM aralığında %50 viabilite azalmasına ulaşılamamıştır. <12.5 µM: IC₅₀'nin 12.5 µM'nin altında olduğu anlaşılmaktadır ancak kesin değer mevcut konsantrasyon serisiyle belirlenmemiştir.

MTT sonuçlarında yapı-etkinlik ilişkisi

Bütün seri incelendiğinde hem kaynaşmış halka büyüklüğünün hem de aromatik sübstitüsyonun hücresel etkinlikle ilişkili olduğu görülmektedir; ancak bütün bileşiklere uygulanabilecek basit ve tek yönlü bir yapı-etkinlik ilişkisi ortaya çıkmamıştır.

Metoksi sübstitüe 6b ve 8b, incelenen konsantrasyon aralığında hiçbir hücre hattında %50 etki düzeyine ulaşmamıştır. Buna karşılık aynı metoksi grubunu taşıyan 7b ve 9b ölçülebilir IC₅₀ değerleri vermiştir. Bu durum yalnız “metoksi aktiviteyi azaltır” veya yalnız “halka büyüdükçe aktivite artar” gibi tek değişkenli bir açıklamanın veri tarafından desteklenmediğini gösterir.

Metil sübstitüe seride BT-549 için 6c = 13 µM, 7c = 18 µM ve 8c = 20 µM iken 9c için değer <12.5 µM olmuştur. Bununla birlikte aynı halka büyüklüğü etkisi diğer sübstitüent sınıflarında aynı biçimde tekrarlanmadığından halka boyutu için genel bir monoton eğilim kurulamamıştır.

9f dört tümör kökenli hücre hattında 16–20 µM IC₅₀ değerleri vermiştir; ancak LLC-PK1 için 14 µM ve Vero için 19 µM değerleri gözlenmiştir. Bu nedenle 9f'nin tümör kökenli hücrelere tercihli bir etki gösterdiğini söylemek için veri desteği yoktur.

9c, SK-MEL-28, KB ve BT-549 için <12.5 µM, SK-OV-3 için 20 µM; LLC-PK1 ve Vero için ise 19 µM sonuç vermiştir. 9c bu deney serisinin en yüksek görünen aktivitesine sahip olsa da ilk üç tümör hattındaki gerçek değer bilinmediği için tümör ve tümörijenik olmayan hücreler arasındaki farkın büyüklüğü kesin biçimde hesaplanamamaktadır. Kaynak bu nedenle anlamlı tümör hücre seçiciliğinin kurulmuş olduğunu ileri sürmemektedir.

Moleküler docking için ligand hazırlama

MTT sonuçlarına dayanılarak 6c, 8f, 9c ve 9f seçilmiştir. Ligand geometrileri Open Babel 3.1.0 kullanılarak MMFF94s kuvvet alanıyla optimize edilmiştir. Moleküller pH 7.0 için kimyasal olarak uygun protonasyon durumlarına getirilmiş; hidrojenlenme ve formal yükler görsel olarak kontrol edilmiştir. Gasteiger kısmi atom yükleri atanmış ve yapılar AutoDock atom tipleri ile PDBQT biçimine dönüştürülmüştür. Döndürülebilir bağlar PDBQT hazırlığı sırasında tanımlanmıştır.

Docking hedefleri neden seçilmiş?

B-RAF V600E, SK-MEL-28 hücrelerinin BRAF V600E mutasyonunu taşıması nedeniyle melanoma bağlamında seçilmiştir. TOP2B, antikanser ilaç etkileriyle ilişkili ve yapısal olarak karakterize edilmiş bir tip II topoizomeraz hedefidir. Siklin D1, üçlü-negatif meme kanseriyle ilişkisi ve BT-549 hücrelerindeki deneysel bağlam nedeniyle; GSK3β ise over kanseri ve SK-OV-3 hücrelerinde PI3K/AKT/GSK3B sinyal bağlamıyla ilişkilendirilmesi nedeniyle değerlendirmeye alınmıştır.

Protein yapıları RCSB Protein Data Bank'tan alınmış ve BIOVIA Discovery Studio 16.1 ile hazırlanmıştır. Kristalografik su molekülleri ve gerekli olmayan heteroatomlar çıkarılmıştır. Ko-kristal ligand bulunan yapılarda ligand bağlanma cebini tanımlamak için kullanılmış, ardından docking öncesinde uzaklaştırılmıştır. Polar hidrojenler ve Kollman yükleri AutoDockTools 1.5.7 ile eklenmiştir.

Docking AutoDock Vina 1.1.2 ile gerçekleştirilmiştir. Grid kutuları 20 × 20 × 20 Å boyutundadır. Kaynakta aksi belirtilmediği sürece Vina varsayılan ayarları kullanılmış; exhaustiveness = 8, en fazla 9 çıktı pozu ve 3 kcal mol⁻¹ enerji aralığı uygulanmıştır. En negatif Vina skoruna sahip üst sıradaki poz etkileşim analizi için seçilmiştir.

TOP2B modelindeki önemli özel sınırlılık

PDB 4G0V yapısında bulunan DNA zinciri docking reseptöründen çıkarılmış ve yalnız protein bileşeni tutulmuştur. Bu ayrıntı kritik önemdedir; çünkü birçok TOP2 hedefli bileşiğin etkisi TOP2–DNA–ligand üçlü kompleksleriyle ilişkilidir. Bu nedenle çalışmadaki TOP2B sonuçları tam TOP2B–DNA kesim kompleksinin modeli değildir ve yalnız protein bileşeniyle olası etkileşimlerin keşifsel tahmini olarak okunmalıdır.

Docking protokolünün kontrolü

AutoDock Vina skorları

B-RAF V600E sonuçları

6c, 8f, 9c ve 9f için Vina skorları −8.2 ile −9.0 kcal mol⁻¹ arasındadır. En negatif skorlar 9c ve 9f için −9.0 kcal mol⁻¹, ardından 8f için −8.6 ve 6c için −8.2'dir.

6c'nin seçilen pozunda indol NH grubunun Cys532, birincil amino grubunun Gly534 ile hidrojen bağı kurması öngörülmüştür. Aromatik sistem için Trp531 ve Phe583 ile öngörülen π–π etkileşimleri ve Ile463/Val471 ile hidrofobik temaslar bildirilmiştir. 8f'de birincil amino grubunun Gln530 ile hidrojen bağı yapması öngörülmüştür. 9c ve 9f'nin seçilen pozlarında indol NH'nin Asp594 ile etkileştiği ve Phe468, Val471, Leu514 ve Phe583 ile ek temasların bulunduğu tahmin edilmiştir.

SK-MEL-28 MTT sonuçlarında 9c <12.5 µM, 9f 16 µM, 6c ve 8f ise 18 µM değerleri vermiştir. Bu sıralama B-RAF docking skorlarıyla kısmen benzer görünse de halka büyüklüğü ve aromatik sübstitüsyon aynı anda değiştiği için farkın hangi yapısal özellikten kaynaklandığı belirlenememektedir. Daha önemlisi, bu nitel paralellik B-RAF V600E inhibisyonunun hücresel etkinliğin mekanizması olduğunu kanıtlamaz.

TOP2B sonuçları

Dört bileşiğin TOP2B skorları çok dar bir aralıkta, −4.3 ile −4.4 kcal mol⁻¹ arasında kalmıştır. 6c ve 8f için indol NH ve ekzosiklik amino grubuyla Glu522'ye yönelik iki hidrojen bağı; daha büyük 9c ve 9f için Arg503 ile etkileşimler öngörülmüştür. Dört bileşikte de kaynaşmış alisiklik halka ile Leu507 arasında hidrofobik temas tahmin edilmiştir.

KB hücrelerindeki MTT sonuçları docking sıralamasıyla uyum göstermemiştir: 9c için IC₅₀ <12.5 µM iken 6c, 8f ve 9f için 20 µM'dir; buna karşılık TOP2B skorlarının tamamı neredeyse aynıdır. Dolayısıyla protein-only TOP2B modeli hücresel farkları açıklamamaktadır.

Siklin D1 sonuçları

Siklin D1 için skorlar −6.2 ile −7.1 kcal mol⁻¹ arasındadır. 9c ve 9f −7.1 ile en negatif skoru vermiş ve dış referans ligand nomilinin skoruyla aynı değere ulaşmıştır. 8f −6.9, 6c ise −6.2 kcal mol⁻¹ bulunmuştur.

Dört bileşikte de Gln71 ve Glu115 ile indol NH ve/veya ekzosiklik amino grupları üzerinden öngörülen hidrojen bağları; ayrıca Ile117, Leu119 ve Thr116 ile temaslar raporlanmıştır. 9c ve 9f için daha büyük kaynaşmış halkanın ek hidrofobik temaslarla ilişkili olabileceği tahmin edilmiştir.

Ancak BT-549 sonuçları docking sıralamasıyla tam örtüşmemektedir. Örneğin docking açısından en az negatif skor 6c'de −6.2 olmasına rağmen BT-549 IC₅₀'si 13 µM'dir; daha negatif −6.9 skorlu 8f'nin IC₅₀'si ise 19 µM'dir. Bu nedenle siklin D1 docking'i hücresel etkinlik farklarını tek başına açıklayamaz.

GSK3β sonuçları

GSK3β için dört bileşiğin skorları −9.6 ile −9.9 kcal mol⁻¹ arasında birbirine çok yakındır. 9c −9.9, 9f −9.8, 6c ve 8f −9.6 kcal mol⁻¹ skor vermiştir. 6c'nin seçilen pozunda hidrojen bağı bildirilmemiş ve etkileşimlerin ağırlıklı olarak hidrofobik olduğu belirtilmiştir. 8f'de flor sübstitüenti ile Lys85'in N–H grubu arasında ek bir polar temas tahmin edilmiştir. 9c ve 9f daha geniş etkileşim ağları gösterse de skor farkları küçüktür.

SK-OV-3 MTT değerleri de 18–21 µM gibi dar bir aralıkta kalmıştır: 6c 19, 8f 21, 9c 20 ve 9f 18 µM. Hem docking hem MTT değerlerinin birbirine yakın olması, bu dört bileşiğin bu sınırlı modelde benzer davranış gösterdiğini düşündürür; fakat GSK3β'nın hücresel etkinliğin nedeni olduğunu kanıtlamaz.

Formül ve denklem durumu

Kaynak çalışma bağımsız bir matematiksel model denklemi veya mekanistik kinetik denklem vermemektedir. IC₅₀ hesaplamasında doğrusal olmayan regresyon kullanıldığı belirtilmekte, ancak regresyon fonksiyonunun açık denklemi raporlanmamaktadır. Bu nedenle Verianla metnine kaynakta bulunmayan bir doz-cevap denklemi eklenmemiştir. Docking skorları ve RMSD değerleri de kaynakta hesaplama çıktısı olarak verilmiş; makale yeni bir matematiksel docking denklemi türetmemiştir.

Araştırmanın temel sınırlılıkları

• MTT testi yalnız üç test konsantrasyonu kullanmıştır: 12.5, 25 ve 50 µM.
• 9c'nin üç tümör kökenli hücre hattındaki gerçek IC₅₀ değerleri 12.5 µM'nin altında kaldığından kesin olarak belirlenmemiştir.
• IC₅₀ değerleri her bağımsız deney için ayrı hesaplanmadığından SD veya SEM raporlanamamıştır.
• MTT hücresel metabolik aktivite/viabilite ölçümüdür; hücre ölüm mekanizmasını tanımlamaz.
• LLC-PK1 ve Vero tümörijenik olmayan böbrek epitel hücre hatlarıdır ancak insan normal dokusunu temsil eden klinik kontrol değildir; biri domuz, diğeri Afrika yeşil maymunu kökenlidir.
• 9c için anlamlı tümör hücre seçiciliği mevcut konsantrasyon serisinden kesinleştirilememiştir.
• Docking yalnız dört seçilmiş bileşik ve dört seçilmiş protein modeliyle yapılmıştır.
• Docking, doğrudan protein bağlanması veya enzim inhibisyonu deneyi değildir.
• TOP2B docking modelinden DNA çıkarıldığı için tam TOP2B–DNA–ligand kompleksi temsil edilmemektedir.
• Nomilin için RMSD deneysel kristal pozuna doğrulama değil iki hesaplama arasındaki tekrarlanabilirlik ölçüsüdür.
• Çalışmada doğrudan biyokimyasal hedef doğrulama, hücresel target-engagement deneyi, in vivo deney veya klinik değerlendirme yapılmamıştır.

Sonucun doğru bilimsel yorumu

Çalışmanın en güçlü sonucu, farklı aromatik sübstitüentler ve dört farklı kaynaşmış sikloalkan halka boyutu taşıyan geniş bir 5H-pirido[3,2-b]indol-4-amin serisinin sentezlenebilmesi ve bunların ilk hücre-temelli biyolojik değerlendirmesinin gerçekleştirilmesidir. 9c test edilen aralıkta öne çıkmıştır; fakat gerçek IC₅₀ değerlerinin bir kısmının ölçüm aralığının dışında kalması ve tümörijenik olmayan hücrelere karşı değerlerin yakın olması nedeniyle bu bileşiğe kesin potens veya seçicilik sıfatı verilmemelidir.

Docking hesaplamaları B-RAF V600E, TOP2B, siklin D1 ve GSK3β için araştırılabilir olası bağlanma pozları üretmiştir. Fakat hesaplamalar doğrudan hedef etkileşimi veya etki mekanizması göstermemektedir. Kaynağın kendi sonucu da daha ayrıntılı konsantrasyon-cevap deneyleri, doğrudan biyokimyasal deneyler, hücresel hedef etkileşimi çalışmaları ve daha geniş mekanistik araştırmaların gerekli olduğudur.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün başlık: Cycloalkane-Fused 5H-Pyrido[3,2-b]indol-4-amines: Synthesis, Characterization, Molecular Docking, and In Vitro Cell-Viability Evaluation

Yazarlar: Lo’ay A. Al-Momani; Panayiotis A. Koutentis; Stavros Panagiotou; Mohammad K. Abu-Sini; Fadi G. Saqallah; Samir A. Ross.

Sorumlu yazar: Lo’ay A. Al-Momani — Department of Chemistry, Faculty of Science, The Hashemite University, Zarqa, Jordan.

Eş katkı: Kaynak makalede eşit katkı/eş birinci yazarlık beyanı belirtilmemiştir.

Kurumlar: Department of Chemistry, Faculty of Science, The Hashemite University, Zarqa, Jordan; Department of Chemistry, University of Cyprus, Nicosia, Cyprus; Department of Pharmacy, Faculty of Pharmacy, Al-Zaytoonah University of Jordan, Amman, Jordan; National Center for Natural Products Research, School of Pharmacy, The University of Mississippi, Oxford, Mississippi, USA; Division of Pharmacognosy, Department of Biomolecular Sciences, School of Pharmacy, The University of Mississippi, Oxford, Mississippi, USA.

Dergi: Chemistry.

Yayınevi: MDPI, Basel, Switzerland.

Bibliyografik kayıt: Chemistry 2026, 8(10), 132.

DOI: 10.3390/chemistry8100132

Resmî bağlantı: https://doi.org/10.3390/chemistry8100132

Alınma / revizyon / kabul / yayın: Received 22 Ağustos 2026; Revised 17 Eylül 2026; Accepted 21 Eylül 2026; Published 24 Eylül 2026.

Kaynak türü ve hakemlik: Chemistry dergisinde yayımlanmış araştırma makalesidir. Chemistry, MDPI tarafından yayımlanan hakemli açık erişim kimya dergisidir.

Lisans: Creative Commons Attribution (CC BY) açık erişim lisansı; derginin açık erişim koşulları CC BY 4.0 lisansını belirtmektedir.

Preprint durumu: Kaynak makalede bir preprint sürümü veya preprint kimliği belirtilmemiştir.

Çalışma türü: Deneysel organik/medisinal kimya sentezi ve karakterizasyonu + in vitro MTT hücre-viabilite değerlendirmesi + keşifsel in silico moleküler docking.

Finansman: Çalışma Fulbright Foundation, Tafila Technical University (TTU), Hashemite University Research Grant No. 113/2022 ve University of Mississippi National Center for Natural Products Research (NCNPR) tarafından desteklenmiştir. Kaynak, fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama, analiz/yorum, makale hazırlığı veya yayımlama kararında rol almadığını belirtmektedir.

Veri erişilebilirliği: Çalışmada sunulan verilerin makale ve Supplementary Materials içinde bulunduğu belirtilmiştir.

Ek materyaller: Supplementary Materials içerisinde FTIR spektrumları için Figures S1–S36; ¹H ve ¹³C NMR, DEPT, HMBC ve HMQC verileri için Figures S37–S164; HRMS için Figures S165–S200 ve bileşiklerin bağlanma etkileşim analizini içeren Table S1 bulunmaktadır.

Çıkar çatışması: Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmiştir.

Etik kurul / bilgilendirilmiş onam: Kaynak makalenin son beyanlarında ayrı bir Institutional Review Board veya Informed Consent Statement raporlanmamıştır. Çalışmanın biyolojik bölümü yerleşik hücre hatları üzerinde yürütülmüştür.

Yazar katkıları: Kavramsallaştırma: Panayiotis A. Koutentis, Lo’ay A. Al-Momani ve Samir A. Ross. Metodoloji: Panayiotis A. Koutentis, Stavros Panagiotou, Lo’ay A. Al-Momani, Mohammad K. Abu-Sini ve Fadi G. Saqallah. Yazılım: Fadi G. Saqallah. Formal analiz: Lo’ay A. Al-Momani, Stavros Panagiotou ve Panayiotis A. Koutentis. Kaynaklar: Samir A. Ross ve Lo’ay A. Al-Momani. Veri kürasyonu: Lo’ay A. Al-Momani, Mohammad K. Abu-Sini ve Fadi G. Saqallah. İlk taslak: Lo’ay A. Al-Momani. Gözden geçirme ve düzenleme: Panayiotis A. Koutentis ve Samir A. Ross. Süpervizyon: Samir A. Ross ve Panayiotis A. Koutentis. Proje yönetimi: Lo’ay A. Al-Momani, Samir A. Ross ve Panayiotis A. Koutentis. Finansman temini: Samir A. Ross ve Lo’ay A. Al-Momani.

Teşekkür: Yazarlar sentetik çalışmalar için laboratuvar olanakları sağlayan Amar Chittiboyina'ya, University of Mississippi'de MTT ölçümlerini gerçekleştiren Shabana Khan'a ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi ölçümlerindeki destekleri için Charles Cantrell (USDA-ARS) ile Naba Hikma Labs'a teşekkür etmektedir.

Temel yöntemsel sınır: Hücresel test yalnız üç bileşik konsantrasyonuna dayanmaktadır ve bazı IC₅₀ değerleri deney aralığının dışında kalmıştır. MTT sonuçları hücresel metabolik aktivite/viabilite göstergesidir; doğrudan antikanser mekanizma kanıtı değildir. Moleküler docking hesaplamaları hedef bağlanmasını veya mekanizmayı deneysel olarak doğrulamamaktadır. TOP2B modelinde DNA çıkarılmıştır ve siklin D1 için kullanılan nomilin poz kontrolü kristalografik doğrulama değil hesaplamalar arası poz tekrarlanabilirliğidir. Çalışmada in vivo veya klinik doğrulama yapılmamıştır.