Sikloalkanla kondensləşmiş 5H-pirido[3,2-b]indol-4-aminlər, indol və piridin əsaslı heterosiklik nüvəyə beş, altı, yeddi və ya səkkiz üzvlü doymuş karbon halqasının kondensləşdirildiyi birləşmələrdir. Bu tədqiqatda Lo’ay A. Al-Momani və həmkarları əvəzlənmiş 2-aminobenzonitrillərdən başlayaraq bu birləşmələr ailəsinə aparan dörd mərhələli sintez hazırlamış; alınan məhsulları NMR, FTIR və yüksək ayırdetməli kütlə spektrometriyası ilə xarakterizə etmiş; 6a–9f birləşmələrinin hüceyrə metabolik aktivliyi/canlılığı üzərindəki təsirlərini MTT testi ilə araşdırmış və seçilmiş 6c, 8f, 9c və 9f birləşmələri üçün xərçənglə əlaqəli dörd zülala qarşı kəşfiyyat xarakterli molekulyar dokinq hesablamaları aparmışdır.

Sintezin ilk mərhələsində 2-aminobenzonitrillər xolin xlorid/karbamid əsaslı dərin evtektik həlledici daxilində bromoasetonitrillə N-alkilləşdirilmişdir. Alınmış 2-[(siyanometil)amino]benzonitrillər daha sonra K₂CO₃ istifadə olunmaqla qapalı boruda tsiklləşdirilmiş və 3-aminoindol-2-karbonitrillərə çevrilmişdir. Bu aralıq məhsullar ZnI₂ iştirakı ilə siklopentanon, sikloheksanon, sikloheptanon və ya siklooktanonla kondensasiya edilmiş; sonda Zn tərkibli materialın sulu %40 NaOH ilə işlənməsi nəticəsində Zn-dən təmizlənmiş 6–9 birləşmə seriyaları əldə edilmişdir. İlk N-alkilləşmə məhsullarının təcrid olunmuş çıxımları %51–83, indol aralıq məhsullarının çıxımları %60–80 və son piridoindol törəmələrinin çıxımları %55–98 intervalında olmuşdur.

MTT təcrübələrində şiş mənşəli dörd hüceyrə xətti — SK-MEL-28, KB, BT-549 və SK-OV-3 — ilə iki təsbit olunmuş şişəmələgətirməyən böyrək epitel hüceyrə xətti — donuz mənşəli LLC-PK1 və Afrika yaşıl meymunu mənşəli Vero — istifadə edilmişdir. Ən yüksək görünən aktivlik 3-metil siklooktanla kondensləşmiş törəmə 9c-də müşahidə edilmişdir. 9c üçün SK-MEL-28, KB və BT-549 hüceyrələrində IC₅₀ dəyəri <12.5 µM kimi bildirilmiş, SK-OV-3 üçün 20 µM, LLC-PK1 və Vero üçün isə 19 µM müəyyən edilmişdir. Lakin <12.5 µM ifadəsi həqiqi IC₅₀-nin ölçüldüyü demək deyil; sınaqdan keçirilmiş ən aşağı konsentrasiya 12.5 µM olduğuna görə yalnız həqiqi dəyərin bu həddən aşağı olduğunu göstərir. Buna görə tədqiqatın məlumatları 9c-nin dəqiq potensini və ya şiş hüceyrələrinə qarşı əhəmiyyətli selektivliyini müəyyən etməyə kifayət etmir.

Molekulyar dokinq nəticələri B-RAF V600E, TOP2B, siklin D1 və GSK3β bağlanma sahələrində bəzi mümkün zülal-liqand qarşılıqlı təsirlərini göstərmişdir. Bununla belə, dokinq bir zülalın hüceyrə daxilində həqiqətən hədəf olduğunu, birləşmənin həmin zülalı inhibə etdiyini və ya müşahidə olunan MTT təsirinin bu mexanizmdən qaynaqlandığını sübut etmir. Tədqiqatçılar da dokinq nəticələrini birbaşa hədəf təsdiqi kimi deyil, daha sonrakı təcrübələrdə sınaqdan keçirilə biləcək mümkün bağlanma formalarını müəyyən edən kəşfiyyat xarakterli hesablamalar kimi şərh etmişlər.

Ən mühüm şərh məhdudiyyəti: Bu tədqiqat klinik müalicə tədqiqatı, heyvan təcrübəsi və ya birbaşa antixərçəng effektivliyi sübutu deyil. MTT məlumatları yalnız müəyyən hüceyrə xətlərində və müəyyən təcrübə şəraitində hüceyrə metabolik aktivliyi/canlılığına təsiri; dokinq nəticələri isə seçilmiş zülal strukturları üzərində hesablama yolu ilə bağlanma proqnozlarını göstərir.

Tədqiqat problemi

İndol nüvəsi tibbi kimyada geniş istifadə olunan heterosiklik strukturlardan biridir. İndol törəmələrinin müxtəlif bioloji aktivliklərlə əlaqələndirilmiş olması bu nüvənin struktur baxımından dəyişdirilməsini yeni birləşmə kitabxanalarının yaradılması baxımından maraqlı edir. Piridoindollar indol sisteminə əlavə azot tərkibli halqa əlavə etməklə struktur müxtəlifliyini artırdığı halda, buna müxtəlif ölçülü sikloalkan halqalarının kondensləşdirilməsi molekulun üçölçülü formasını və fiziki-kimyəvi xüsusiyyətlərini daha da dəyişə bilər.

Tədqiqatın məqsədi birbaşa dərman hazırlandığını göstərmək deyil. Tədqiqatçılar əvvəlcə müxtəlif aromatik əvəzləyicilər və müxtəlif ölçülü kondensləşmiş karbon halqaları daşıyan 5H-pirido[3,2-b]indol-4-amin kitabxanasını sintez etmiş, sonra bu struktur dəyişikliklərinin hüceyrə əsaslı MTT nəticələri ilə birlikdə necə dəyişdiyini araşdırmışlar. Seçilmiş dörd birləşmə mümkün zülal qarşılıqlı təsirlərini araşdırmaq məqsədilə əlavə olaraq molekulyar dokinq mərhələsinə daxil edilmişdir.

Əsas struktur anlayışları nə deməkdir?

İndol, benzol halqası ilə azot tərkibli beş üzvlü halqanın kondensləşməsindən yaranan aromatik heterosiklik skeletdir. Piridoindol adlandırması bu nüvəyə əlavə azot tərkibli altı üzvlü aromatik halqanın daxil olduğunu bildirir. Sikloalkanla kondensləşmiş ifadəsi isə piridoindol sisteminə doymuş karbon halqasının ortaq atomlar vasitəsilə bağlandığını göstərir. Tədqiqatdakı 6, 7, 8 və 9 seriyaları müvafiq olaraq siklopentan, sikloheksan, sikloheptan və siklooktan mənşəli kondensləşmiş halqa ölçülərini təmsil edir.

Aromatik halqadakı əvəzləyicilər seriya daxilində a–f hərfləri ilə kodlaşdırılmışdır: a = H, b = metoksi (OCH₃), c = metil (CH₃), d = Cl, e = Br və f = F. Beləliklə, məsələn, 9c siklooktanla kondensləşmiş və metillə əvəzlənmiş üzvü; 9f isə eyni böyük kondensləşmiş halqanı daşıyan, lakin flüorla əvəzlənmiş üzvü ifadə edir.

Dərin evtektik həlledici nə üçün vacibdir?

Tədqiqatın ilk sintez mərhələsində istifadə olunan dərin evtektik həlledici (deep eutectic solvent, DES), xolin xlorid və karbamidin 1:2 mol nisbətində qarışığıdır. Dərin evtektik həlledicilər komponentlər arasındakı güclü qarşılıqlı təsirlər səbəbindən ayrı-ayrı komponentlərdən fərqli ərimə və həlledici xüsusiyyətləri göstərə bilən maye qarışıqlardır. Bu tədqiqatda DES ilk N-alkilləşmə reaksiyasının reaksiya mühiti kimi istifadə edilmişdir. Tədqiqatın məlumatları DES-in bütün alternativ həlledicilərdən üstünlüyünü sınaqdan keçirən müqayisəli həlledici skrininqi deyil; buna görə burada yalnız istifadə olunmuş reaksiya mühiti kimi qiymətləndirilməlidir.

Qapalı boruda sintez nə deməkdir?

İkinci və üçüncü əsas çevrilmələr qalın divarlı və qapadılmış şüşə borularda həyata keçirilmişdir. GP2 üçün mənbə 15 mL tutumlu və 10–12 bar-a qədər dərəcələndirilmiş borunun istifadə edildiyini bildirir. Etanol tərkibli GP2 qarışığı təxminən 140 °C-yə, ZnI₂ vasitəçili GP3 qarışığı isə təxminən 130 °C-yə qızdırılmışdır. Qapalı sistem uçucu komponentlərin yüksək temperaturda sistem daxilində saxlanmasına imkan verir; lakin mənbə reaksiya zamanı yaranan həqiqi təzyiqi ölçüb bildirmir. Buna görə borunun 10–12 bar davamlılıq sinfi ilə reaksiyanın həqiqi təzyiqi bir-biri ilə qarışdırılmamalıdır.

MTT testi və IC₅₀ bu tədqiqatda nəyi göstərir?

Bu tədqiqatda MTT testi verilmiş birləşmə konsentrasiyalarından sonra hüceyrələrin MTT-ni formazana çevirə bilən metabolik aktivliyini ölçərək hüceyrə canlılığı üçün dolayı göstərici təmin edir; IC₅₀ isə MTT siqnalının daşıyıcı nəzarətə nisbətən %50 təsir səviyyəsinə çatdığı təxmini konsentrasiyanı ifadə edir və təkbaşına hüceyrə ölüm mexanizmini və ya antixərçəng selektivliyini sübut etmir.

MTT, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromiddir. Metabolik cəhətdən aktiv hüceyrələr tetrazolium strukturunu rəngli formazan məhsullarına çevirə bilər. Buna görə 570 nm-də ölçülən absorbansın azalması hüceyrə metabolik aktivliyinin/canlılığının azalması ilə əlaqələndirilir. Bununla belə, MTT testi təkbaşına hüceyrələrin apoptotik, yoxsa nekrotik yolla öldüyünü, hüceyrə dövrünün dayanıb-dayanmadığını və ya hansı molekulyar hədəfin təsirləndiyini göstərmir.

Mənbədə sınaq birləşmələri yalnız 12.5, 25 və 50 µM olmaqla üç konsentrasiyada araşdırılmışdır. IC₅₀ dəyərləri GraphPad Prism 8.0.2 ilə qeyri-xətti reqressiyadan təxmin edilmişdir. Mənbə istifadə olunan qeyri-xətti reqressiya tənliyinin ətraflı formasını bildirmir; buna görə Verianla mətnində dörd parametrli logistik əyri kimi mənbədə göstərilməyən xüsusi model fərz edilməmişdir.

IC₅₀ dəyərinin <12.5 µM kimi yazılması, məsələn, 8 µM və ya 5 µM olduğunun göstərildiyi demək deyil. Bu, yalnız %50 təsir səviyyəsinin sınaqdan keçirilmiş ən aşağı 12.5 µM konsentrasiyasından aşağı olduğunu göstərir. Eyni şəkildə, mənbədə NA 12.5–50 µM sınaq intervalında hüceyrə canlılığında %50 azalma səviyyəsinə çatılmadığını bildirir.

Molekulyar dokinq skoru bu tədqiqatda nəyi sübut edir?

Molekulyar dokinq skoru müəyyən zülal modeli və hesablama protokolu daxilində liqand pozasının hesablama baxımından nə dərəcədə əlverişli qiymətləndirildiyini göstərir; daha mənfi AutoDock Vina skoru model daxilində daha əlverişli təxmini bağlanmanı ifadə edə bilsə də, həqiqi bağlanma affinitetini, zülal inhibisiyasını, hüceyrə hədəfi ilə qarşılıqlı təsiri və ya təsir mexanizmini təkbaşına sübut etmir.

Bu fərq tədqiqatın şərhində xüsusilə vacibdir. 9c və 9f bəzi hədəflərdə digər seçilmiş birləşmələrdən daha mənfi dokinq skorları vermişdir; lakin hüceyrə əsaslı IC₅₀ sıralaması bütün hədəflərdə dokinq sıralaması ilə üst-üstə düşmür. Bu uyğunsuzluq hüceyrə davranışının yalnız statik zülal-cib modelindən ibarət olmadığını; həllolma qabiliyyəti, lipofillik, metabolik sabitlik, hüceyrəyə daxilolma və digər mümkün hüceyrə qarşılıqlı təsirləri kimi dokinq hesablamasında birbaşa təmsil olunmayan amillərin də əhəmiyyətli ola biləcəyini göstərir. Bu son amillər mənbənin müzakirəsində mümkün izahlar kimi nəzərdən keçirilir, ölçülmüş yeni nəticələr kimi təqdim edilmir.

Dokinq skoru ilə eksperimental bağlanma affiniteti eyni şey deyil

AutoDock Vina-nın kcal mol⁻¹ vahidində verdiyi skor eksperimental olaraq ölçülmüş bağlanmanın sərbəst enerjisini birbaşa əvəz etmir. Bundan əlavə, müxtəlif zülal hədəfləri üçün alınan skorları bir-birinə qarşı mütləq affinitet sıralaması kimi oxumaq uyğun deyil. Tədqiqatın etibarlı şərhi eyni hədəfdə eyni protokolla araşdırılan birləşmələrin nisbi hesablama nəticələrini və eksperimental MTT məlumatları ilə yalnız keyfiyyət səviyyəsindəki mümkün paralelləri qiymətləndirməkdir.

RMSD nəyi ifadə edir?

RMSD (root-mean-square deviation; orta kvadrat sapmanın kvadrat kökü), burada kristal strukturda müşahidə olunan liqand mövqeyi ilə dokinq protokolu vasitəsilə yenidən alınan mövqe arasındakı ağır atomların həndəsi fərqini qiymətləndirmək üçün istifadə edilmişdir. B-RAF V600E üçün PLX4032-nin RMSD-si 0.568 Å, TOP2B üçün mitoksantronun 1.199 Å və GSK3β üçün SZW-nin 0.291 Å olduğu müəyyən edilmişdir. Tədqiqatda 2.0 Å-dan aşağı dəyərlər pozanın məqbul səviyyədə yenidən alınması kimi qiymətləndirilmişdir.

Siklin D1 üçün istifadə olunan nomilin fərqlidir: nomilin PDB 6P8E kristal strukturunda ko-kristal liqand deyil. Buna görə 0.112 Å dəyəri eksperimental kristal pozaya qarşı doğrulama deyil; iki müstəqil dokinq icrasından alınan pozaların bir-birinə nə qədər bənzədiyini göstərən poza təkrarlana bilməsi ölçüsüdür. 0.112 Å-nın çox kiçik olması nomilinin həqiqi bağlanma həndəsəsinin eksperimental olaraq doğrulandığı demək deyil.

Tədqiqatın dəstəklədiyi və dəstəkləmədiyi nəticələr

Tədqiqatın Metodu və Nəticələri

Ümumi eksperimental infrastruktur

Bütün sintez reaksiyaları arqon atmosferində aparılmış; şüşə materiallar və maqnit qarışdırıcı çubuqları istifadədən əvvəl sobada qurudulmuş, həlledicilər isə istifadədən əvvəl distillə edilmişdir. Kommersiya reagentləri Fluka və ya Sigma-Aldrich mənbəlidir və əlavə təmizlənmə aparılmadan istifadə edilmişdir.

• TLC: Alugram Xtra SIL G/UV254, 20 × 20 cm lövhələr; UV işığı, yod və/və ya fosfomolibdik turşu ilə görüntüləmə.
• Sütun xromatoqrafiyası: 60–120 mesh silika gel.
• ¹H və ¹³C NMR: Bruker Avance III 400 və ya 500 MHz; CDCl₃ və ya DMSO-d₆.
• FTIR: Agilent Cary 630 FTIR.
• Ərimə nöqtəsi: Stuart Scientific ərimə nöqtəsi cihazı, açıq şüşə kapilyar.
• HRMS: Agilent 1100 HPLC ilə JEOL AccuTOF JMS-T100LC ESI-TOF və ya Bruker Impact II ESI-Q-TOF/Apollo II ion-funnel ESI sistemi.

Dörd mərhələli sintez axını

Mərhələ 1 — N-alkilləşmə: 1 → 3

Başlanğıc 2-aminobenzonitril 1, xolin xlorid/karbamid [ChCl/karbamid (1:2)] dərin evtektik həlledicisində, hər substrat üçün təxminən 10 mL/g DES istifadə olunaraq həll edilmişdir. Bromoasetonitril 2 miqdarı substrata nisbətən 2.0–8.0 ekvivalent arasında dəyişmişdir. Qarışıq təxminən 50 °C-də 2–4 gün qarışdırılmış və reaksiya TLC ilə izlənmişdir. Prosesin sonunda CHCl₃ ilə ekstraksiya və silika gel xromatoqrafiyası tətbiq edilmişdir.

Mərhələ 2 — 3-aminoindol-2-karbonitrilin əmələ gəlməsi: 3 → 4

3a–f aralıq məhsulları, təxminən 0.043–0.065 M başlanğıc substrat konsentrasiyasında etanol daxilində 0.5 ekvivalent toz K₂CO₃ ilə işlənmişdir. Qarışıq qapalı qalın divarlı boruda əvvəlcədən qızdırılmış yağ vannasında təxminən 140 °C-də 20 dəqiqə saxlanmışdır. Soyutma, su ilə durulaşdırma, dixlormetan ekstraksiyası və xromatoqrafik təmizlənmədən sonra 4a–f əldə edilmişdir.

Tsiklləşmə spektroskopik olaraq necə izlənmişdir?

3 → 4 çevrilməsində mənbə başlanğıc cyanomethyl qrupuna aid ¹H NMR CH₂ siqnallarının təxminən δ_H 4.20–4.40 sahəsindən yox olmasını mühüm struktur göstəricisi kimi bildirir. Bunun əvəzinə yeni NH₂ siqnalları təxminən δ_H 5.50–5.80, indol NH siqnalları isə təxminən δ_H 10.00–11.00 sahəsində meydana çıxmışdır. FTIR-də təxminən 2200 cm⁻¹ ətrafındakı nitril C≡N zolağının qorunması tsiklləşmə zamanı nitril funksiyasının strukturda qaldığını dəstəkləmişdir.

Bu tip məlumatların rolu vacibdir: NMR müxtəlif hidrogen və karbonların kimyəvi mühitlərini; FTIR müəyyən funksional rabitələrin xarakterik titrəyişlərini; HRMS isə birləşmənin ölçülmüş yüksək ayırdetməli kütləsinin gözlənilən molekulyar tərkiblə uyğunluğunu yoxlayır. Bu üsulların birlikdə istifadəsi struktur təyinatının tək bir ölçməyə əsaslanmamasını təmin edir.

Mərhələ 3 və 4 — Sikloalkan halqasının yaradılması və Zn-dən təmizlənmə

4a–f birləşmələri siklopentanon, sikloheksanon, sikloheptanon və ya siklooktanonla ZnI₂ (0.5 ekvivalent) iştirakı ilə qapalı boruda təxminən 130 °C-də 20 dəqiqə işlənmişdir. Bu proses Zn tərkibli materiallar əmələ gətirmişdir. Qarışıq soyudulduqdan sonra heksan əlavə edilərək Zn tərkibli duzların çökməsi təmin edilmiş; çöküntü heksan və sonra DCM ilə yuyulmuşdur. Qalan bərk maddə i-PrOH daxilində həll edilmiş və bərabər həcmdə %40 sulu NaOH ilə otaq temperaturunda gecə boyunca işlənmişdir. Bu mərhələ bağlı Zn-nin uzaqlaşdırılması üçün tətbiq edilmişdir.

Zn tərkibli və Zn-dən təmizlənmiş nümunələrin ¹H NMR spektrləri müqayisə edildikdə, xüsusilə indol NH və ekzosiklik NH₂ siqnallarında yerdəyişmə və xətt formasında dəyişikliklər müşahidə edilmişdir. Zn tərkibli materialda NH siqnalları daha geniş və daha aşağı sahədə müşahidə olunmuşdur. Bu tapıntı heterosiklik azot funksiyalarının Zn ilə qarşılıqlı təsiri ilə uyğundur; lakin tədqiqat bu məlumatlardan Zn-nin dəqiq koordinasiya həndəsəsini və ya stoxiometriyasını müəyyən etmir.

Son məhsulların çıxımları

Son məhsullar arasında mənbədə ən yüksək təcrid olunmuş çıxım 7c üçün %98, ən aşağı təcrid olunmuş çıxım isə 6f üçün %55-dir. Bu çıxımlar reaksiyanın sintetik əlçatanlığını göstərir; bioloji aktivliklə birbaşa əlaqə qurula bilməz.

MTT hüceyrə-canlılıq təcrübəsinin təfərrüatları

Tədqiqatda SK-MEL-28 melanoma, KB, BT-549 süd vəzi karsinoması və SK-OV-3 yumurtalıq karsinoması mənşəli hüceyrə xətləri ilə şişəmələgətirməyən böyrək epiteli mənşəli LLC-PK1 və Vero hüceyrələri istifadə edilmişdir. LLC-PK1 donuz, Vero isə Afrika yaşıl meymunu mənşəlidir. Buna görə bu iki nəzarət hüceyrə xətti “normal insan hüceyrəsi” kimi şərh edilməməlidir.

Altı hüceyrə xətti RPMI-1640 mühitində %10 bovine calf serum və 60 mg L⁻¹ amikasin olan standart şəraitdə, 37 °C və %5 CO₂ ehtiva edən nəmləndirilmiş atmosferdə kultivasiya edilmişdir.

6a–9f birləşmələri DMSO daxilində 10 mM stok məhlul kimi hazırlanmışdır. Son DMSO nisbəti %0.5 (v/v) dəyərini aşmamışdır. Daşıyıcı nəzarət, sınaq birləşməsi olmayan, lakin eyni DMSO konsentrasiyasını daşıyan kultura mühitidir. Doksorubisin müsbət nəzarət kimi 1.25, 2.5 və 5 µg mL⁻¹ konsentrasiyalarında istifadə edilmişdir.

Hüceyrələr 96 quyulu lövhələrə hər quyuya 1 × 10⁴ hüceyrə olmaqla əkilmiş və 24 saat yapışmağa buraxılmışdır. Sonra sınaq birləşmələri 12.5, 25 və 50 µM son konsentrasiyalarda 48 saat tətbiq edilmişdir. Daha sonra hər quyuya 15 µL MTT məhlulu əlavə edilmiş və 37 °C-də əlavə 4 saat inkubasiya edilmişdir. Mühit uzaqlaşdırıldıqdan sonra yaranmış formazan kristallarını həll etmək məqsədilə 100 µL DMSO əlavə edilmişdir. Absorbans Synergy HTX multimode mikroplaka oxuyucusunda 570 nm-də ölçülmüşdür.

Hüceyrə metabolik aktivliyi daşıyıcı nəzarətə nisbətən ifadə edilmiş və daşıyıcı nəzarət %100 qəbul edilmişdir. IC₅₀ dəyərləri GraphPad Prism 8.0.2 istifadə olunmaqla qeyri-xətti reqressiya ilə təxmin edilmişdir. Təcrübə üç müstəqil vaxtda aparılmış və hər konsentrasiya/şərait üçün beş texniki təkrar quyu istifadə edilmişdir.

Mühüm statistik məhdudiyyət: IC₅₀ dəyərləri hər müstəqil təcrübə üçün ayrıca hesablanmadığına görə tədqiqatçılar bildirilmiş IC₅₀ dəyərlərinə etibarlı SD və ya SEM təyin etməmişlər. Mənbə həmçinin bu nəticələr üçün p-dəyəri, etimad intervalı və ya ayrıca hipotez testi bildirmir. Buna görə cədvəldəki kiçik ədədi fərqləri statistik baxımdan əhəmiyyətli fərqlər kimi şərh etmək düzgün deyil.

Cədvəlin oxunması üçün qeyd: 6a–9f üçün dəyərlərin vahidi µM-dir. Doksorubisin dəyərləri isə µg mL⁻¹ vahidindədir. Vahidlər fərqli olduğuna görə doksorubisin sətrindəki ədədləri sınaq birləşmələri ilə yalnız rəqəmlərin böyüklüyünə baxaraq birbaşa molyar potens müqayisəsinə çevirmək düzgün deyil. Mənbə belə çevirmə aparmır.

NA: Sınaqdan keçirilən 12.5–50 µM intervalında canlılığın %50 azalması səviyyəsinə çatılmamışdır. <12.5 µM: IC₅₀-nin 12.5 µM-dən aşağı olduğu anlaşılır, lakin dəqiq dəyər mövcud konsentrasiya seriyası ilə müəyyən edilməmişdir.

MTT nəticələrində struktur-aktivlik əlaqəsi

Bütün seriya araşdırıldıqda həm kondensləşmiş halqa ölçüsünün, həm də aromatik əvəzlənmənin hüceyrə aktivliyi ilə əlaqəli olduğu görünür; lakin bütün birləşmələrə tətbiq oluna biləcək sadə və tək istiqamətli struktur-aktivlik əlaqəsi ortaya çıxmamışdır.

Metoksi ilə əvəzlənmiş 6b və 8b araşdırılan konsentrasiya intervalında heç bir hüceyrə xəttində %50 təsir səviyyəsinə çatmamışdır. Buna qarşılıq eyni metoksi qrupunu daşıyan 7b və 9b ölçülə bilən IC₅₀ dəyərləri vermişdir. Bu vəziyyət yalnız “metoksi aktivliyi azaldır” və ya yalnız “halqa böyüdükcə aktivlik artır” kimi tək dəyişənli izahın məlumatlarla dəstəklənmədiyini göstərir.

Metillə əvəzlənmiş seriyada BT-549 üçün 6c = 13 µM, 7c = 18 µM və 8c = 20 µM olduğu halda, 9c üçün dəyər <12.5 µM olmuşdur. Bununla belə, eyni halqa ölçüsü təsiri digər əvəzləyici siniflərində eyni şəkildə təkrarlanmadığına görə halqa ölçüsü üçün ümumi monoton meyl qurmaq mümkün olmamışdır.

9f şiş mənşəli dörd hüceyrə xəttində 16–20 µM IC₅₀ dəyərləri vermişdir; lakin LLC-PK1 üçün 14 µM və Vero üçün 19 µM dəyərləri müşahidə edilmişdir. Buna görə 9f-nin şiş mənşəli hüceyrələrə üstünlük verən təsir göstərdiyini demək üçün məlumat dəstəyi yoxdur.

9c SK-MEL-28, KB və BT-549 üçün <12.5 µM, SK-OV-3 üçün 20 µM; LLC-PK1 və Vero üçün isə 19 µM nəticə vermişdir. 9c bu təcrübə seriyasında ən yüksək görünən aktivliyə malik olsa da, ilk üç şiş xəttində həqiqi dəyər məlum olmadığı üçün şiş və şişəmələgətirməyən hüceyrələr arasındakı fərqin böyüklüyü dəqiq hesablana bilmir. Mənbə buna görə əhəmiyyətli şiş hüceyrəsi selektivliyinin müəyyən edildiyini irəli sürmür.

Molekulyar dokinq üçün liqand hazırlığı

MTT nəticələrinə əsasən 6c, 8f, 9c və 9f seçilmişdir. Liqand həndəsələri Open Babel 3.1.0 istifadə edilərək MMFF94s qüvvə sahəsi ilə optimallaşdırılmışdır. Molekullar pH 7.0 üçün kimyəvi baxımdan uyğun protonlaşma vəziyyətlərinə gətirilmiş; hidrogenləşmə və formal yüklər vizual olaraq yoxlanmışdır. Gasteiger qismən atom yükləri təyin edilmiş və strukturlar AutoDock atom tipləri ilə PDBQT formatına çevrilmişdir. Fırlana bilən rabitələr PDBQT hazırlığı zamanı müəyyən edilmişdir.

Dokinq hədəfləri niyə seçilmişdir?

B-RAF V600E, SK-MEL-28 hüceyrələrinin BRAF V600E mutasiyasını daşıması səbəbilə melanoma kontekstində seçilmişdir. TOP2B, antixərçəng dərman təsirləri ilə əlaqəli və struktur baxımından xarakterizə olunmuş tip II topoizomeraza hədəfidir. Siklin D1, üçlü-mənfi süd vəzi xərçəngi ilə əlaqəsi və BT-549 hüceyrələrindəki eksperimental kontekst səbəbilə; GSK3β isə yumurtalıq xərçəngi və SK-OV-3 hüceyrələrində PI3K/AKT/GSK3B siqnal konteksti ilə əlaqələndirildiyinə görə qiymətləndirməyə daxil edilmişdir.

Zülal strukturları RCSB Protein Data Bank-dan götürülmüş və BIOVIA Discovery Studio 16.1 ilə hazırlanmışdır. Kristalloqrafik su molekulları və lazım olmayan heteroatomlar çıxarılmışdır. Ko-kristal liqand olan strukturlarda liqand bağlanma cibini müəyyən etmək üçün istifadə edilmiş, sonra dokinqdən əvvəl uzaqlaşdırılmışdır. Polar hidrogenlər və Kollman yükləri AutoDockTools 1.5.7 ilə əlavə edilmişdir.

Dokinq AutoDock Vina 1.1.2 ilə həyata keçirilmişdir. Grid qutuları 20 × 20 × 20 Å ölçüsündədir. Mənbədə əksi göstərilmədiyi halda Vina-nın standart parametrləri istifadə edilmiş; exhaustiveness = 8, ən çox 9 çıxış pozası və 3 kcal mol⁻¹ enerji intervalı tətbiq edilmişdir. Ən mənfi Vina skoruna malik ən yüksək sıralı poza qarşılıqlı təsir analizi üçün seçilmişdir.

TOP2B modelində mühüm xüsusi məhdudiyyət

PDB 4G0V strukturunda olan DNA zənciri dokinq reseptorundan çıxarılmış və yalnız zülal komponenti saxlanmışdır. Bu detal kritik əhəmiyyət daşıyır; çünki bir çox TOP2 hədəfli birləşmənin təsiri TOP2–DNA–liqand üçlü kompleksləri ilə əlaqəlidir. Buna görə tədqiqatdakı TOP2B nəticələri tam TOP2B–DNA kəsilmə kompleksinin modeli deyil və yalnız zülal komponenti ilə mümkün qarşılıqlı təsirlərin kəşfiyyat xarakterli proqnozu kimi oxunmalıdır.

Dokinq protokolunun nəzarəti

AutoDock Vina skorları

B-RAF V600E nəticələri

6c, 8f, 9c və 9f üçün Vina skorları −8.2 ilə −9.0 kcal mol⁻¹ arasındadır. Ən mənfi skorlar 9c və 9f üçün −9.0 kcal mol⁻¹, sonra 8f üçün −8.6 və 6c üçün −8.2-dir.

6c-nin seçilmiş pozasında indol NH qrupunun Cys532 ilə, birincili amino qrupunun isə Gly534 ilə hidrogen rabitəsi yaratması proqnozlaşdırılmışdır. Aromatik sistem üçün Trp531 və Phe583 ilə proqnozlaşdırılan π–π qarşılıqlı təsirləri və Ile463/Val471 ilə hidrofob təmaslar bildirilmişdir. 8f-də birincili amino qrupunun Gln530 ilə hidrogen rabitəsi yaratması proqnozlaşdırılmışdır. 9c və 9f-nin seçilmiş pozalarında indol NH-nin Asp594 ilə qarşılıqlı təsir göstərdiyi və Phe468, Val471, Leu514 və Phe583 ilə əlavə təmasların olduğu təxmin edilmişdir.

SK-MEL-28 MTT nəticələrində 9c <12.5 µM, 9f 16 µM, 6c və 8f isə 18 µM dəyərləri vermişdir. Bu sıralama B-RAF dokinq skorları ilə qismən oxşar görünsə də, halqa ölçüsü və aromatik əvəzlənmə eyni vaxtda dəyişdiyi üçün fərqin hansı struktur xüsusiyyətdən qaynaqlandığını müəyyən etmək mümkün deyil. Daha vacibi, bu keyfiyyət paralelliyi B-RAF V600E inhibisiyasının hüceyrə aktivliyinin mexanizmi olduğunu sübut etmir.

TOP2B nəticələri

Dörd birləşmənin TOP2B skorları çox dar intervalda, −4.3 ilə −4.4 kcal mol⁻¹ arasında qalmışdır. 6c və 8f üçün indol NH və ekzosiklik amino qrupu vasitəsilə Glu522-yə yönəlmiş iki hidrogen rabitəsi; daha böyük 9c və 9f üçün isə Arg503 ilə qarşılıqlı təsirlər proqnozlaşdırılmışdır. Dörd birləşmənin hamısında kondensləşmiş alisiklik halqa ilə Leu507 arasında hidrofob təmas təxmin edilmişdir.

KB hüceyrələrindəki MTT nəticələri dokinq sıralaması ilə uyğunluq göstərməmişdir: 9c üçün IC₅₀ <12.5 µM olduğu halda 6c, 8f və 9f üçün 20 µM-dir; buna qarşılıq TOP2B skorlarının hamısı demək olar ki, eynidir. Buna görə yalnız-zülal TOP2B modeli hüceyrə fərqlərini izah etmir.

Siklin D1 nəticələri

Siklin D1 üçün skorlar −6.2 ilə −7.1 kcal mol⁻¹ arasındadır. 9c və 9f −7.1 ilə ən mənfi skoru vermiş və xarici referens liqand nomilinin skoru ilə eyni dəyərə çatmışdır. 8f −6.9, 6c isə −6.2 kcal mol⁻¹ müəyyən edilmişdir.

Dörd birləşmənin hamısında Gln71 və Glu115 ilə indol NH və/və ya ekzosiklik amino qrupları vasitəsilə proqnozlaşdırılan hidrogen rabitələri; həmçinin Ile117, Leu119 və Thr116 ilə təmaslar bildirilmişdir. 9c və 9f üçün daha böyük kondensləşmiş halqanın əlavə hidrofob təmaslarla əlaqəli ola biləcəyi təxmin edilmişdir.

Lakin BT-549 nəticələri dokinq sıralaması ilə tam üst-üstə düşmür. Məsələn, dokinq baxımından ən az mənfi skor 6c-də −6.2 olmasına baxmayaraq, BT-549 IC₅₀-si 13 µM-dir; daha mənfi −6.9 skorlu 8f-nin IC₅₀-si isə 19 µM-dir. Buna görə siklin D1 dokinqi hüceyrə aktivliyi fərqlərini təkbaşına izah edə bilməz.

GSK3β nəticələri

GSK3β üçün dörd birləşmənin skorları −9.6 ilə −9.9 kcal mol⁻¹ arasında bir-birinə çox yaxındır. 9c −9.9, 9f −9.8, 6c və 8f −9.6 kcal mol⁻¹ skor vermişdir. 6c-nin seçilmiş pozasında hidrogen rabitəsi bildirilməmiş və qarşılıqlı təsirlərin əsasən hidrofob olduğu qeyd edilmişdir. 8f-də flüor əvəzləyicisi ilə Lys85-in N–H qrupu arasında əlavə polar təmas təxmin edilmişdir. 9c və 9f daha geniş qarşılıqlı təsir şəbəkələri göstərsə də, skor fərqləri kiçikdir.

SK-OV-3 MTT dəyərləri də 18–21 µM kimi dar intervalda qalmışdır: 6c 19, 8f 21, 9c 20 və 9f 18 µM. Həm dokinq, həm də MTT dəyərlərinin bir-birinə yaxın olması bu dörd birləşmənin bu məhdud modeldə oxşar davranış göstərdiyini düşündürür; lakin GSK3β-nın hüceyrə aktivliyinin səbəbi olduğunu sübut etmir.

Formul və tənlik vəziyyəti

Mənbə tədqiqatı müstəqil riyazi model tənliyi və ya mexanistik kinetik tənlik təqdim etmir. IC₅₀ hesablamasında qeyri-xətti reqressiyadan istifadə edildiyi bildirilir, lakin reqressiya funksiyasının açıq tənliyi göstərilmir. Buna görə Verianla mətninə mənbədə olmayan doza-cavab tənliyi əlavə edilməmişdir. Dokinq skorları və RMSD dəyərləri də mənbədə hesablama çıxışı kimi verilmiş; məqalə yeni riyazi dokinq tənliyi törətməmişdir.

Tədqiqatın əsas məhdudiyyətləri

• MTT testi yalnız üç sınaq konsentrasiyasından istifadə etmişdir: 12.5, 25 və 50 µM.
• 9c-nin şiş mənşəli üç hüceyrə xəttində həqiqi IC₅₀ dəyərləri 12.5 µM-dən aşağı qaldığı üçün dəqiq müəyyən edilməmişdir.
• IC₅₀ dəyərləri hər müstəqil təcrübə üçün ayrıca hesablanmadığından SD və ya SEM bildirilə bilməmişdir.
• MTT hüceyrə metabolik aktivliyi/canlılığı ölçümüdür; hüceyrə ölüm mexanizmini müəyyən etmir.
• LLC-PK1 və Vero şişəmələgətirməyən böyrək epitel hüceyrə xətləridir, lakin normal insan toxumasını təmsil edən klinik nəzarət deyil; biri donuz, digəri Afrika yaşıl meymunu mənşəlidir.
• 9c üçün əhəmiyyətli şiş hüceyrəsi selektivliyi mövcud konsentrasiya seriyasından dəqiqləşdirilə bilməmişdir.
• Dokinq yalnız seçilmiş dörd birləşmə və seçilmiş dörd zülal modeli ilə aparılmışdır.
• Dokinq birbaşa zülal bağlanması və ya ferment inhibisiyası təcrübəsi deyil.
• TOP2B dokinq modelindən DNA çıxarıldığı üçün tam TOP2B–DNA–liqand kompleksi təmsil edilmir.
• Nomilin üçün RMSD eksperimental kristal pozaya qarşı doğrulama deyil, iki hesablama arasındakı təkrarlana bilmə ölçüsüdür.
• Tədqiqatda birbaşa biokimyəvi hədəf doğrulaması, hüceyrə target-engagement təcrübəsi, in vivo təcrübə və ya klinik qiymətləndirmə aparılmamışdır.

Nəticənin düzgün elmi şərhi

Tədqiqatın ən güclü nəticəsi müxtəlif aromatik əvəzləyicilər və dörd fərqli kondensləşmiş sikloalkan halqa ölçüsü daşıyan geniş 5H-pirido[3,2-b]indol-4-amin seriyasının sintez edilə bilməsi və onların ilk hüceyrə əsaslı bioloji qiymətləndirilməsinin həyata keçirilməsidir. 9c sınaqdan keçirilən intervalda önə çıxmışdır; lakin həqiqi IC₅₀ dəyərlərinin bir hissəsinin ölçmə intervalından kənarda qalması və şişəmələgətirməyən hüceyrələrə qarşı dəyərlərin yaxın olması səbəbilə bu birləşməyə dəqiq potens və ya selektivlik xüsusiyyəti verilməməlidir.

Dokinq hesablamaları B-RAF V600E, TOP2B, siklin D1 və GSK3β üçün araşdırıla bilən mümkün bağlanma pozaları yaratmışdır. Lakin hesablamalar birbaşa hədəf qarşılıqlı təsirini və ya təsir mexanizmini göstərmir. Mənbənin öz nəticəsi də daha ətraflı konsentrasiya-cavab təcrübələrinin, birbaşa biokimyəvi təcrübələrin, hüceyrə hədəfi ilə qarşılıqlı təsir tədqiqatlarının və daha geniş mexanistik araşdırmaların zəruri olduğudur.

Mənbə və Metod Qeydi

Orijinal başlıq: Cycloalkane-Fused 5H-Pyrido[3,2-b]indol-4-amines: Synthesis, Characterization, Molecular Docking, and In Vitro Cell-Viability Evaluation

Müəlliflər: Lo’ay A. Al-Momani; Panayiotis A. Koutentis; Stavros Panagiotou; Mohammad K. Abu-Sini; Fadi G. Saqallah; Samir A. Ross.

Məsul müəllif: Lo’ay A. Al-Momani — Department of Chemistry, Faculty of Science, The Hashemite University, Zarqa, Jordan.

Bərabər töhfə: Mənbə məqalədə bərabər töhfə/bərabər birinci müəlliflik bəyanı göstərilməmişdir.

Qurumlar: Department of Chemistry, Faculty of Science, The Hashemite University, Zarqa, Jordan; Department of Chemistry, University of Cyprus, Nicosia, Cyprus; Department of Pharmacy, Faculty of Pharmacy, Al-Zaytoonah University of Jordan, Amman, Jordan; National Center for Natural Products Research, School of Pharmacy, The University of Mississippi, Oxford, Mississippi, USA; Division of Pharmacognosy, Department of Biomolecular Sciences, School of Pharmacy, The University of Mississippi, Oxford, Mississippi, USA.

Jurnal: Chemistry.

Nəşriyyat: MDPI, Basel, Switzerland.

Biblioqrafik qeyd: Chemistry 2026, 8(10), 132.

DOI: 10.3390/chemistry8100132

Rəsmi keçid: https://doi.org/10.3390/chemistry8100132

Qəbul edilmə / reviziya / qəbul / nəşr: Received 22 Avqust 2026; Revised 17 Sentyabr 2026; Accepted 21 Sentyabr 2026; Published 24 Sentyabr 2026.

Mənbə növü və resenziya: Chemistry jurnalında dərc olunmuş tədqiqat məqaləsidir. Chemistry, MDPI tərəfindən nəşr olunan resenziyalı açıq girişli kimya jurnalıdır.

Lisenziya: Creative Commons Attribution (CC BY) açıq giriş lisenziyası; jurnalın açıq giriş şərtləri CC BY 4.0 lisenziyasını göstərir.

Preprint statusu: Mənbə məqalədə preprint versiyası və ya preprint identifikatoru göstərilməmişdir.

Tədqiqat növü: Eksperimental üzvi/medisinal kimya sintezi və xarakterizasiyası + in vitro MTT hüceyrə-canlılıq qiymətləndirilməsi + kəşfiyyat xarakterli in silico molekulyar dokinq.

Maliyyələşdirmə: Tədqiqat Fulbright Foundation, Tafila Technical University (TTU), Hashemite University Research Grant No. 113/2022 və University of Mississippi National Center for Natural Products Research (NCNPR) tərəfindən dəstəklənmişdir. Mənbə maliyyələşdiricilərin tədqiqatın dizaynında, məlumatların toplanmasında, analiz/şərhində, məqalənin hazırlanmasında və ya nəşr qərarında rol oynamadığını bildirir.

Məlumatların əlçatanlığı: Tədqiqatda təqdim olunan məlumatların məqalə və Supplementary Materials daxilində olduğu bildirilmişdir.

Əlavə materiallar: Supplementary Materials daxilində FTIR spektrləri üçün Figures S1–S36; ¹H və ¹³C NMR, DEPT, HMBC və HMQC məlumatları üçün Figures S37–S164; HRMS üçün Figures S165–S200 və birləşmələrin bağlanma qarşılıqlı təsir analizini ehtiva edən Table S1 mövcuddur.

Maraqların toqquşması: Müəlliflər maraqların toqquşmasının olmadığını bəyan etmişlər.

Etika komitəsi / məlumatlandırılmış razılıq: Mənbə məqalənin son bəyanlarında ayrıca Institutional Review Board və ya Informed Consent Statement bildirilməmişdir. Tədqiqatın bioloji hissəsi təsbit olunmuş hüceyrə xətləri üzərində aparılmışdır.

Müəllif töhfələri: Konseptuallaşdırma: Panayiotis A. Koutentis, Lo’ay A. Al-Momani və Samir A. Ross. Metodologiya: Panayiotis A. Koutentis, Stavros Panagiotou, Lo’ay A. Al-Momani, Mohammad K. Abu-Sini və Fadi G. Saqallah. Proqram təminatı: Fadi G. Saqallah. Formal analiz: Lo’ay A. Al-Momani, Stavros Panagiotou və Panayiotis A. Koutentis. Resurslar: Samir A. Ross və Lo’ay A. Al-Momani. Məlumatların kurasiyası: Lo’ay A. Al-Momani, Mohammad K. Abu-Sini və Fadi G. Saqallah. İlkin qaralama: Lo’ay A. Al-Momani. Nəzərdən keçirmə və redaktə: Panayiotis A. Koutentis və Samir A. Ross. Superviziya: Samir A. Ross və Panayiotis A. Koutentis. Layihənin idarə edilməsi: Lo’ay A. Al-Momani, Samir A. Ross və Panayiotis A. Koutentis. Maliyyənin əldə edilməsi: Samir A. Ross və Lo’ay A. Al-Momani.

Təşəkkür: Müəlliflər sintetik tədqiqatlar üçün laboratoriya imkanları təmin edən Amar Chittiboyina-ya, University of Mississippi-də MTT ölçmələrini həyata keçirən Shabana Khan-a və yüksək ayırdetməli kütlə spektrometriyası ölçmələrində göstərdikləri dəstəyə görə Charles Cantrell (USDA-ARS) və Naba Hikma Labs-a təşəkkür edirlər.

Əsas metodoloji məhdudiyyət: Hüceyrə sınağı yalnız üç birləşmə konsentrasiyasına əsaslanır və bəzi IC₅₀ dəyərləri təcrübə intervalından kənarda qalmışdır. MTT nəticələri hüceyrə metabolik aktivliyi/canlılığı göstəricisidir; birbaşa antixərçəng mexanizmi sübutu deyil. Molekulyar dokinq hesablamaları hədəfə bağlanmanı və ya mexanizmi eksperimental olaraq doğrulamır. TOP2B modelində DNA çıxarılmışdır və siklin D1 üçün istifadə olunan nomilin poza nəzarəti kristalloqrafik doğrulama deyil, hesablamalar arasında poza təkrarlana bilməsidir. Tədqiqatda in vivo və ya klinik doğrulama aparılmamışdır.