Amini za 5H-pyrido[3,2-b]indol-4 zilizounganishwa na cycloalkane ni misombo ambamo pete ya kaboni iliyojaa yenye viungo vitano, sita, saba au nane imeunganishwa na kiini cha heterosiklo kinachotegemea indole na pyridine. Katika utafiti huu, Lo’ay A. Al-Momani na wenzake walitengeneza usanisi wa hatua nne unaoanzia kwenye 2-aminobenzonitrile zilizobadilishwa na kufikia familia hii ya misombo; walitambua sifa za bidhaa zilizopatikana kwa NMR, FTIR na spectrometri ya molekuli yenye azimio la juu; walichunguza athari za misombo 6a–9f kwenye shughuli ya kimetaboliki/uhai wa seli kwa kipimo cha MTT na kufanya hesabu za kiuchunguzi za docking ya molekuli dhidi ya protini nne zinazohusishwa na saratani kwa misombo teule 6c, 8f, 9c na 9f.

Katika hatua ya kwanza ya usanisi, 2-aminobenzonitrile zilifanyiwa N-alkylation kwa bromoacetonitrile ndani ya kiyeyusho cha eutektiki ya kina kinachotegemea choline chloride/urea. 2-[(cyanomethyl)amino]benzonitrile zilizopatikana kisha zilifanyiwa uundaji wa pete katika bomba lililofungwa kwa kutumia K₂CO₃ na kubadilishwa kuwa 3-aminoindole-2-carbonitrile. Viambatani hivi vya kati vilikondensishwa na cyclopentanone, cyclohexanone, cycloheptanone au cyclooctanone mbele ya ZnI₂; hatimaye, kwa kutibu nyenzo iliyo na Zn kwa %40 NaOH ya majini, mfululizo wa misombo 6–9 uliosafishwa Zn ulipatikana. Mavuno yaliyotengwa ya bidhaa za awali za N-alkylation yalikuwa %51–83, mavuno ya viambatani vya kati vya indole yalikuwa %60–80 na mavuno ya mwisho ya viambatani vya pyridoindole yalikuwa katika kiwango cha %55–98.

Katika majaribio ya MTT, mistari minne ya seli yenye asili ya uvimbe — SK-MEL-28, KB, BT-549 na SK-OV-3 — pamoja na mistari miwili thabiti ya seli za epitheliamu ya figo zisizotengeneza uvimbe — LLC-PK1 yenye asili ya nguruwe na Vero yenye asili ya tumbili wa kijani wa Afrika — ilitumika. Shughuli inayoonekana kuwa ya juu zaidi ilionekana katika kiambatani 9c cha 3-methyl kilichounganishwa na cyclooctane. Kwa 9c, thamani ya IC₅₀ katika seli za SK-MEL-28, KB na BT-549 iliripotiwa kuwa <12.5 µM, huku 20 µM ikipatikana kwa SK-OV-3 na 19 µM kwa LLC-PK1 na Vero. Hata hivyo, usemi <12.5 µM haumaanishi kwamba IC₅₀ halisi ilipimwa; kwa kuwa mkusanyiko wa chini zaidi uliopimwa ulikuwa 12.5 µM, unaonyesha tu kwamba thamani halisi iko chini ya kikomo hicho. Kwa hiyo, data za utafiti hazitoshi kubainisha potensi halisi ya 9c au uteuzi wenye maana dhidi ya seli za uvimbe.

Matokeo ya docking ya molekuli yalionyesha baadhi ya mwingiliano unaowezekana wa protini-ligandi katika maeneo ya kufungamana ya B-RAF V600E, TOP2B, cyclin D1 na GSK3β. Hata hivyo, docking haithibitishi kwamba protini kweli ni shabaha ndani ya seli, kwamba kiambatani kinaizuia protini hiyo, au kwamba athari ya MTT iliyoonekana inatokana na utaratibu huo. Watafiti pia walitafsiri matokeo ya docking si kama uthibitisho wa moja kwa moja wa shabaha, bali kama hesabu za kiuchunguzi zinazobainisha namna zinazowezekana za kufungamana ambazo zinaweza kupimwa katika majaribio ya baadaye.

Kikomo muhimu zaidi cha tafsiri: Utafiti huu si utafiti wa tiba ya kliniki, jaribio la wanyama wala ushahidi wa moja kwa moja wa ufanisi dhidi ya saratani. Data za MTT zinaonyesha tu athari kwenye shughuli ya kimetaboliki/uhai wa seli katika mistari maalumu ya seli na chini ya masharti maalumu ya majaribio; matokeo ya docking yanaonyesha makadirio ya kihesabu ya kufungamana kwenye miundo teule ya protini.

Tatizo la utafiti

Kiini cha indole ni mojawapo ya miundo ya heterosiklo inayotumiwa sana katika kemia ya dawa. Kwa kuwa viambatani vya indole vimehusishwa na shughuli mbalimbali za kibayolojia, kubadilisha kiini hiki kimuundo kunavutia katika kuunda maktaba mpya za misombo. Pyridoindole huongeza utofauti wa kimuundo kwa kuongeza pete ya ziada yenye nitrojeni kwenye mfumo wa indole; kuunganisha pete za cycloalkane zenye ukubwa tofauti kunaweza kubadilisha zaidi umbo la pande tatu la molekuli na sifa zake za fizikia-kemia.

Lengo la utafiti si kuonyesha kwamba dawa imetengenezwa moja kwa moja. Watafiti kwanza walifanya usanisi wa maktaba ya 5H-pyrido[3,2-b]indol-4-amine yenye vibadala mbalimbali vya aromatiki na pete za kaboni zilizounganishwa zenye ukubwa tofauti, kisha wakachunguza jinsi mabadiliko haya ya kimuundo yanavyobadilika pamoja na matokeo ya MTT yanayotegemea seli. Misombo minne iliyochaguliwa pia iliingizwa katika hatua ya docking ya molekuli ili kuchunguza mwingiliano unaowezekana wa protini.

Dhana kuu za kimuundo zinamaanisha nini?

Indole ni kiunzi cha aromatiki cha heterosiklo kinachoundwa kwa kuunganishwa kwa pete ya benzene na pete ya viungo vitano yenye nitrojeni. Jina pyridoindole linaonyesha kwamba pete ya ziada ya aromatiki yenye viungo sita na nitrojeni imejumuishwa katika kiini hiki. Usemi iliyounganishwa na cycloalkane unaonyesha kwamba pete ya kaboni iliyojaa imeunganishwa na mfumo wa pyridoindole kupitia atomu za pamoja. Mfululizo 6, 7, 8 na 9 katika utafiti unawakilisha kwa mpangilio ukubwa wa pete zilizounganishwa zinazotokana na cyclopentane, cyclohexane, cycloheptane na cyclooctane.

Vibadala kwenye pete ya aromatiki vimekodishwa ndani ya mfululizo kwa herufi a–f: a = H, b = methoxy (OCH₃), c = methyl (CH₃), d = Cl, e = Br na f = F. Hivyo, kwa mfano, 9c inawakilisha mwanachama aliyeunganishwa na cyclooctane na mwenye kibadala cha methyl; 9f inawakilisha mwanachama mwenye pete hiyo hiyo kubwa iliyounganishwa lakini mwenye kibadala cha fluoro.

Kwa nini kiyeyusho cha eutektiki ya kina ni muhimu?

Kiyeyusho cha eutektiki ya kina (deep eutectic solvent, DES) kilichotumika katika hatua ya kwanza ya usanisi wa utafiti ni mchanganyiko wa choline chloride na urea katika uwiano wa moli wa 1:2. Viyeyusho vya eutektiki ya kina ni michanganyiko ya kioevu inayoweza kuonyesha sifa za kuyeyuka na za kiyeyusho tofauti na zile za kila sehemu peke yake kwa sababu ya mwingiliano mkubwa kati ya sehemu zake. Katika utafiti huu, DES ilitumika kama mazingira ya mmenyuko wa kwanza wa N-alkylation. Data za utafiti si uchunguzi linganishi wa viyeyusho unaopima kama DES ni bora kuliko viyeyusho vyote mbadala; kwa hiyo hapa inapaswa kutathminiwa tu kama mazingira ya mmenyuko yaliyotumika.

Usanisi katika bomba lililofungwa unamaanisha nini?

Mabadiliko makuu ya pili na ya tatu yalifanywa katika mabomba ya kioo yenye kuta nene na yaliyofungwa. Kwa GP2, chanzo kinaripoti matumizi ya bomba lenye ujazo wa 15 mL na lililokadiriwa hadi 10–12 bar. Mchanganyiko wa GP2 wenye ethanol ulipashwa hadi takriban 140 °C, huku mchanganyiko wa GP3 unaopatanishwa na ZnI₂ ukipashwa hadi takriban 130 °C. Mfumo uliofungwa huruhusu viambato vinavyovukiza kubaki ndani ya mfumo katika joto la juu; hata hivyo, chanzo hakikupima wala kuripoti shinikizo halisi lililotokea wakati wa mmenyuko. Kwa hiyo, kiwango cha ustahimilivu cha 10–12 bar cha bomba hakipaswi kuchanganywa na shinikizo halisi la mmenyuko.

Kipimo cha MTT na IC₅₀ vinaonyesha nini katika utafiti huu?

Katika utafiti huu, kipimo cha MTT hutoa kiashirio kisicho cha moja kwa moja cha uhai wa seli kwa kupima shughuli ya kimetaboliki ya seli inayoweza kubadilisha MTT kuwa formazan baada ya viwango vilivyotolewa vya kiambatani; IC₅₀ inaonyesha mkusanyiko unaokadiriwa ambapo ishara ya MTT hufikia kiwango cha athari cha %50 ikilinganishwa na udhibiti wa kibebaji, na peke yake haithibitishi utaratibu wa kifo cha seli wala uteuzi dhidi ya saratani.

MTT ni 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Seli zenye shughuli ya kimetaboliki zinaweza kubadilisha muundo wa tetrazolium kuwa bidhaa zenye rangi za formazan. Kwa hiyo, kupungua kwa absorbance iliyopimwa katika 570 nm kunahusishwa na kupungua kwa shughuli ya kimetaboliki/uhai wa seli. Hata hivyo, kipimo cha MTT peke yake hakiwezi kusema kama seli zilikufa kwa apoptosis au necrosis, kama mzunguko wa seli ulisimama, au ni shabaha gani ya molekuli iliyoathiriwa.

Katika chanzo, misombo ya majaribio ilichunguzwa katika viwango vitatu tu vya 12.5, 25 na 50 µM. Thamani za IC₅₀ zilikadiriwa kwa regresheni isiyo ya mstari kwa kutumia GraphPad Prism 8.0.2. Chanzo hakiripoti muundo wa kina wa mlinganyo wa regresheni isiyo ya mstari uliotumika; kwa hiyo, katika maandishi ya Verianla hakuna modeli maalumu isiyotajwa kwenye chanzo, kama mkunjo wa logistiki wa vigezo vinne, iliyodhaniwa.

Kuandika thamani ya IC₅₀ kama <12.5 µM hakumaanishi kwamba imeonyeshwa kuwa, kwa mfano, 8 µM au 5 µM. Kunaonyesha tu kwamba kiwango cha athari cha %50 kiko chini ya mkusanyiko wa chini zaidi uliopimwa wa 12.5 µM. Vivyo hivyo, katika chanzo NA inamaanisha kwamba kiwango cha kupungua kwa uhai wa seli kwa %50 hakikufikiwa katika kiwango cha majaribio cha 12.5–50 µM.

Alama ya docking ya molekuli inathibitisha nini katika utafiti huu?

Alama ya docking ya molekuli inaonyesha jinsi mkao wa ligandi unavyotathminiwa kuwa unaofaa kihesabu ndani ya modeli fulani ya protini na itifaki ya kihesabu; ingawa alama ya AutoDock Vina iliyo hasi zaidi inaweza kuonyesha kufungamana kunakokadiriwa kuwa kunafaa zaidi ndani ya modeli, peke yake haithibitishi afiniti halisi ya kufungamana, uzuiaji wa protini, mwingiliano na shabaha ya seli au utaratibu wa athari.

Tofauti hii ni muhimu hasa katika kutafsiri utafiti. 9c na 9f zilitoa alama hasi zaidi za docking kuliko baadhi ya misombo mingine iliyochaguliwa kwenye baadhi ya shabaha; hata hivyo, mpangilio wa IC₅₀ unaotegemea seli haulingani na mpangilio wa docking kwenye shabaha zote. Kutolingana huku kunaonyesha kwamba tabia ya seli si modeli tuli ya mfuko wa protini pekee; mambo kama umumunyifu, lipophilicity, uthabiti wa kimetaboliki, ufikaji ndani ya seli na mwingiliano mwingine unaowezekana wa seli ambao hauwakilishwi moja kwa moja katika hesabu ya docking pia yanaweza kuwa muhimu. Mambo haya ya mwisho yanajadiliwa katika chanzo kama maelezo yanayowezekana, si kama matokeo mapya yaliyopimwa.

Alama ya docking si sawa na afiniti ya kufungamana iliyopimwa kwa majaribio

Alama inayotolewa na AutoDock Vina katika kcal mol⁻¹ si mbadala wa moja kwa moja wa nishati huru ya kufungamana iliyopimwa kwa majaribio. Zaidi ya hayo, si sahihi kusoma alama zilizopatikana kwa shabaha tofauti za protini kama mpangilio wa afiniti kamili dhidi ya kila moja. Tafsiri inayotegemewa ya utafiti ni kutathmini matokeo ya kihesabu ya jamaa ya misombo iliyochunguzwa kwenye shabaha moja kwa itifaki ileile na ulinganifu unaowezekana wa kiwango cha ubora pekee na data za MTT za majaribio.

RMSD inaeleza nini?

RMSD (root-mean-square deviation; mkengeuko wa mzizi wa wastani wa mraba), hapa ilitumika kutathmini tofauti ya kijiometri ya atomu nzito kati ya nafasi ya ligandi iliyoonekana katika muundo wa kioo na nafasi iliyopatikana tena kwa itifaki ya docking. RMSD ya PLX4032 kwa B-RAF V600E ilikuwa 0.568 Å, ya mitoxantrone kwa TOP2B 1.199 Å na ya SZW kwa GSK3β 0.291 Å. Katika utafiti, thamani zilizo chini ya 2.0 Å zilitathminiwa kuwa urejeshaji unaokubalika wa mkao.

Nomilin iliyotumika kwa cyclin D1 ni tofauti: nomilin si ligandi iliyokristalishwa pamoja katika muundo wa kioo wa PDB 6P8E. Kwa hiyo, thamani ya 0.112 Å si uthibitishaji dhidi ya mkao wa kioo wa majaribio; ni kipimo cha kurudiwa kwa mkao kinachoonyesha jinsi mikao iliyopatikana kutoka kwa uendeshaji mbili huru wa docking inavyofanana. Kuwa kwa 0.112 Å ndogo sana hakumaanishi kwamba jiometri halisi ya kufungamana ya nomilin imethibitishwa kwa majaribio.

Matokeo ambayo utafiti unaunga mkono na hauungi mkono

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Miundombinu ya jumla ya majaribio

Miitikio yote ya usanisi ilifanywa katika anga ya argon; vifaa vya kioo na vijiti vya kichanganyaji cha sumaku vilikaushwa kwenye tanuru kabla ya kutumika, na viyeyusho vilidistiliwa kabla ya kutumika. Reajenti za kibiashara zilitoka Fluka au Sigma-Aldrich na zilitumika bila usafishaji wa ziada.

• TLC: Alugram Xtra SIL G/UV254, sahani za 20 × 20 cm; uoneshaji kwa mwanga wa UV, iodini na/au asidi ya phosphomolybdic.
• Kromatografia ya safu: silica gel ya 60–120 mesh.
• ¹H na ¹³C NMR: Bruker Avance III 400 au 500 MHz; CDCl₃ au DMSO-d₆.
• FTIR: Agilent Cary 630 FTIR.
• Kiwango cha kuyeyuka: kifaa cha kupima kiwango cha kuyeyuka cha Stuart Scientific, kapilari ya kioo iliyo wazi.
• HRMS: JEOL AccuTOF JMS-T100LC ESI-TOF pamoja na Agilent 1100 HPLC au mfumo wa Bruker Impact II ESI-Q-TOF/Apollo II ion-funnel ESI.

Mtiririko wa usanisi wa hatua nne

Hatua 1 — N-alkylation: 1 → 3

2-aminobenzonitrile ya kuanzia 1 iliyeyushwa katika kiyeyusho cha eutektiki ya kina cha choline chloride/urea [ChCl/urea (1:2)], kwa kutumia takriban 10 mL/g DES kwa kila substrate. Kiasi cha bromoacetonitrile 2 kilitofautiana kati ya 2.0–8.0 sawa ikilinganishwa na substrate. Mchanganyiko ulikorogwa kwa siku 2–4 katika takriban 50 °C na mmenyuko ulifuatiliwa kwa TLC. Mwishoni mwa mchakato, uchimbaji kwa CHCl₃ na kromatografia ya silica gel vilitumika.

Hatua 2 — Uundaji wa 3-aminoindole-2-carbonitrile: 3 → 4

Viambatani vya kati 3a–f vilitibiwa kwa 0.5 sawa ya K₂CO₃ ya unga ndani ya ethanol katika mkusanyiko wa substrate ya kuanzia wa takriban 0.043–0.065 M. Mchanganyiko uliwekwa katika bomba lililofungwa lenye kuta nene ndani ya bafu la mafuta lililopashwa awali katika takriban 140 °C kwa dakika 20. Baada ya kupozwa, kupunguzwa kwa maji, uchimbaji kwa dichloromethane na usafishaji wa kromatografia, 4a–f zilipatikana.

Uundaji wa pete ulifuatiliwa vipi kwa spectroskopi?

Katika mabadiliko ya 3 → 4, chanzo kinaripoti kutoweka kwa ishara za ¹H NMR CH₂ za kundi la cyanomethyl la kuanzia kutoka eneo la takriban δ_H 4.20–4.40 kama kiashirio muhimu cha kimuundo. Badala yake, ishara mpya za NH₂ zilionekana katika takriban δ_H 5.50–5.80 na ishara za NH za indole katika takriban δ_H 10.00–11.00. Kuhifadhiwa kwa ukanda wa nitrile C≡N karibu na takriban 2200 cm⁻¹ katika FTIR kuliunga mkono kwamba kazi ya nitrile ilibaki katika muundo wakati wa uundaji wa pete.

Jukumu la data kama hizi ni muhimu: NMR huchunguza mazingira ya kikemia ya hidrojeni na kaboni tofauti; FTIR mitetemo tabia ya vifungo maalumu vya kikazi; HRMS nayo huangalia ulinganifu wa molekuli yenye uzito wa azimio la juu uliopimwa na muundo wa molekuli unaotarajiwa. Matumizi ya pamoja ya mbinu hizi hufanya uteuzi wa muundo usitegemee kipimo kimoja pekee.

Hatua 3 na 4 — Uundaji wa pete ya cycloalkane na kuondoa Zn

Misombo 4a–f ilitibiwa na cyclopentanone, cyclohexanone, cycloheptanone au cyclooctanone mbele ya ZnI₂ (0.5 sawa) katika bomba lililofungwa kwa takriban 130 °C kwa dakika 20. Mchakato huu ulitengeneza nyenzo zenye Zn. Baada ya mchanganyiko kupozwa, hexane iliongezwa ili chumvi zenye Zn zishuke; mashapo yakaoshwa kwa hexane kisha DCM. Kigumu kilichobaki kiliyeyushwa katika i-PrOH na kutibiwa kwa ujazo sawa wa %40 NaOH ya majini katika joto la chumba usiku kucha. Hatua hii ilitumika kuondoa Zn iliyofungamana.

Wakati spectra za ¹H NMR za sampuli zenye Zn na zilizosafishwa Zn zilipolinganishwa, mabadiliko ya kuhama na umbo la mstari yalionekana hasa katika ishara za NH za indole na NH₂ za nje ya pete. Katika nyenzo yenye Zn, ishara za NH zilionekana pana zaidi na katika eneo la chini zaidi. Ugunduzi huu unaendana na mwingiliano wa kazi za nitrojeni za heterosiklo na Zn; hata hivyo, utafiti hauamui jiometri sahihi ya uratibu au stoichiometry ya Zn kutokana na data hizi.

Mavuno ya bidhaa za mwisho

Kati ya bidhaa za mwisho, mavuno ya juu zaidi yaliyotengwa katika chanzo yalikuwa %98 kwa 7c, na mavuno ya chini zaidi yaliyotengwa yalikuwa %55 kwa 6f. Mavuno haya yanaonyesha ufikivu wa usanisi wa mmenyuko; hayawezi kuhusishwa moja kwa moja na shughuli ya kibayolojia.

Maelezo ya jaribio la MTT la uhai wa seli

Katika utafiti, mistari ya seli yenye asili ya melanoma SK-MEL-28, KB, saratani ya matiti BT-549 na saratani ya ovari SK-OV-3 pamoja na seli za LLC-PK1 na Vero zenye asili ya epitheliamu ya figo na zisizotengeneza uvimbe zilitumika. LLC-PK1 ina asili ya nguruwe, huku Vero ikiwa na asili ya tumbili wa kijani wa Afrika. Kwa hiyo, mistari hii miwili ya seli za udhibiti haipaswi kutafsiriwa kama “seli za kawaida za binadamu”.

Mistari sita ya seli ilikuzwa katika mazingira ya RPMI-1640 chini ya masharti ya kawaida yenye %10 bovine calf serum na 60 mg L⁻¹ amikacin, katika anga yenye unyevunyevu ya 37 °C na %5 CO₂.

Misombo 6a–9f iliandaliwa katika DMSO kama suluhisho la akiba la 10 mM. Uwiano wa mwisho wa DMSO haukuzidi %0.5 (v/v). Udhibiti wa kibebaji ni mazingira ya ukuzaji yasiyo na kiambatani cha majaribio lakini yenye mkusanyiko uleule wa DMSO. Doxorubicin ilitumika kama udhibiti chanya katika viwango vya 1.25, 2.5 na 5 µg mL⁻¹.

Seli zilipandwa kwenye sahani zenye visima 96 kwa 1 × 10⁴ seli kwa kila kisima na kuachwa zishikamane kwa saa 24. Kisha misombo ya majaribio ilitumika kwa saa 48 katika viwango vya mwisho vya 12.5, 25 na 50 µM. Baadaye, 15 µL ya suluhisho la MTT iliongezwa katika kila kisima na kuinkubishwa kwa saa nyingine 4 katika 37 °C. Baada ya mazingira kuondolewa, 100 µL DMSO iliongezwa ili kuyeyusha fuwele za formazan zilizoundwa. Absorbance ilipimwa katika 570 nm kwa kisomaji cha mikroplati cha Synergy HTX multimode.

Shughuli ya kimetaboliki ya seli ilionyeshwa ikilinganishwa na udhibiti wa kibebaji, na udhibiti wa kibebaji ulikubaliwa kuwa %100. Thamani za IC₅₀ zilikadiriwa kwa regresheni isiyo ya mstari kwa kutumia GraphPad Prism 8.0.2. Jaribio lilifanywa katika nyakati tatu huru na visima vitano vya marudio ya kiufundi vilitumika kwa kila mkusanyiko/sharti.

Kikomo muhimu cha kitakwimu: Kwa kuwa thamani za IC₅₀ hazikuhesabiwa kando kwa kila jaribio huru, watafiti hawakuweza kuzipa thamani za IC₅₀ zilizoripotiwa SD au SEM ya kuaminika. Chanzo pia hakiripoti p-value, muda wa kujiamini au jaribio tofauti la dhana kwa matokeo haya. Kwa hiyo, si sahihi kutafsiri tofauti ndogo za namba katika jedwali kama tofauti zenye umuhimu wa kitakwimu.

Dokezo la kusoma jedwali: Kitengo cha thamani za 6a–9f ni µM. Thamani za doxorubicin ziko katika µg mL⁻¹. Kwa kuwa vitengo ni tofauti, si sahihi kubadilisha namba katika mstari wa doxorubicin kuwa ulinganisho wa moja kwa moja wa potensi ya moli na misombo ya majaribio kwa kuangalia ukubwa wa namba pekee. Chanzo hakifanyi ubadilishaji kama huo.

NA: Kiwango cha kupungua kwa uhai kwa %50 hakikufikiwa katika kiwango kilichopimwa cha 12.5–50 µM. <12.5 µM: Inaeleweka kwamba IC₅₀ iko chini ya 12.5 µM, lakini thamani halisi haijabainishwa kwa mfululizo wa sasa wa viwango.

Uhusiano wa muundo-shughuli katika matokeo ya MTT

Unapochunguzwa mfululizo mzima, inaonekana kwamba ukubwa wa pete iliyounganishwa pamoja na ubadilishaji wa aromatiki vinahusiana na shughuli ya seli; hata hivyo, hakuna uhusiano rahisi na wa mwelekeo mmoja wa muundo-shughuli unaoweza kutumika kwa misombo yote uliojitokeza.

6b na 8b zenye kibadala cha methoxy hazikufikia kiwango cha athari cha %50 katika mstari wowote wa seli ndani ya kiwango cha mkusanyiko kilichochunguzwa. Kinyume chake, 7b na 9b zenye kundi hilo hilo la methoxy zilitoa thamani za IC₅₀ zinazoweza kupimwa. Hali hii inaonyesha kwamba maelezo ya kigezo kimoja kama “methoxy hupunguza shughuli” au “shughuli huongezeka kadiri pete inavyokuwa kubwa” hayaungwi mkono na data.

Katika mfululizo wenye kibadala cha methyl, kwa BT-549 6c = 13 µM, 7c = 18 µM na 8c = 20 µM, huku thamani ya 9c ikiwa <12.5 µM. Hata hivyo, kwa sababu athari ileile ya ukubwa wa pete haikujirudia kwa namna ileile katika madarasa mengine ya vibadala, mwelekeo wa jumla wa monotoni kwa ukubwa wa pete haukuweza kuanzishwa.

9f ilitoa thamani za IC₅₀ za 16–20 µM katika mistari minne ya seli yenye asili ya uvimbe; hata hivyo, 14 µM kwa LLC-PK1 na 19 µM kwa Vero zilionekana. Kwa hiyo, hakuna msaada wa data wa kusema kwamba 9f ina athari inayopendelea seli zenye asili ya uvimbe.

9c ilitoa <12.5 µM kwa SK-MEL-28, KB na BT-549, 20 µM kwa SK-OV-3; na 19 µM kwa LLC-PK1 na Vero. Ingawa 9c ina shughuli inayoonekana kuwa ya juu zaidi katika mfululizo huu wa majaribio, kwa kuwa thamani halisi katika mistari mitatu ya kwanza ya uvimbe haijulikani, ukubwa wa tofauti kati ya seli za uvimbe na seli zisizotengeneza uvimbe hauwezi kuhesabiwa kwa usahihi. Kwa hiyo, chanzo hakidai kwamba uteuzi wenye maana wa seli za uvimbe umeanzishwa.

Maandalizi ya ligandi kwa docking ya molekuli

Kulingana na matokeo ya MTT, 6c, 8f, 9c na 9f zilichaguliwa. Jiometri za ligandi ziliboreshwa kwa uga wa nguvu wa MMFF94s kwa kutumia Open Babel 3.1.0. Molekuli ziliwekwa katika hali za protonation zinazofaa kikemia kwa pH 7.0; uwekaji wa hidrojeni na chaji rasmi zilikaguliwa kwa kuona. Chaji sehemu za atomu za Gasteiger ziliwekwa na miundo ikabadilishwa kuwa umbizo la PDBQT kwa aina za atomu za AutoDock. Vifungo vinavyoweza kuzunguka vilibainishwa wakati wa maandalizi ya PDBQT.

Kwa nini shabaha za docking zilichaguliwa?

B-RAF V600E ilichaguliwa katika muktadha wa melanoma kwa sababu seli za SK-MEL-28 zina mabadiliko ya BRAF V600E. TOP2B ni shabaha ya topoisomerase aina ya II inayohusishwa na athari za dawa dhidi ya saratani na iliyotambuliwa kimuundo. Cyclin D1 ilijumuishwa kwa sababu ya uhusiano wake na saratani ya matiti yenye vipokezi vitatu hasi na muktadha wa majaribio katika seli za BT-549; GSK3β ilitathminiwa kwa sababu ya kuhusishwa na saratani ya ovari na muktadha wa uashiriaji wa PI3K/AKT/GSK3B katika seli za SK-OV-3.

Miundo ya protini ilichukuliwa kutoka RCSB Protein Data Bank na kuandaliwa kwa BIOVIA Discovery Studio 16.1. Molekuli za maji za kioo na heteroatomu zisizohitajika ziliondolewa. Katika miundo yenye ligandi iliyokristalishwa pamoja, ligandi ilitumika kufafanua mfuko wa kufungamana na kisha kuondolewa kabla ya docking. Hidrojeni za polar na chaji za Kollman ziliongezwa kwa AutoDockTools 1.5.7.

Docking ilifanywa kwa AutoDock Vina 1.1.2. Masanduku ya grid yana ukubwa wa 20 × 20 × 20 Å. Isipokuwa ilipoelezwa vingine katika chanzo, mipangilio chaguo-msingi ya Vina ilitumika; exhaustiveness = 8, kiwango cha juu cha mikao 9 ya matokeo na kiwango cha nishati cha 3 kcal mol⁻¹ vilitumika. Mkao wa nafasi ya juu wenye alama hasi zaidi ya Vina ulichaguliwa kwa uchanganuzi wa mwingiliano.

Kikomo maalumu muhimu katika modeli ya TOP2B

Mnyororo wa DNA uliopo katika muundo wa PDB 4G0V uliondolewa kutoka kwenye kipokezi cha docking na sehemu ya protini pekee ikahifadhiwa. Maelezo haya ni muhimu sana; kwa sababu athari za misombo mingi inayolenga TOP2 zinahusishwa na kompleksi tatu za TOP2–DNA–ligandi. Kwa hiyo, matokeo ya TOP2B katika utafiti si modeli ya kompleksi kamili ya kukata TOP2B–DNA na yanapaswa kusomwa tu kama makadirio ya kiuchunguzi ya mwingiliano unaowezekana na sehemu ya protini.

Udhibiti wa itifaki ya docking

Alama za AutoDock Vina

Matokeo ya B-RAF V600E

Alama za Vina kwa 6c, 8f, 9c na 9f ziko kati ya −8.2 na −9.0 kcal mol⁻¹. Alama hasi zaidi ni −9.0 kcal mol⁻¹ kwa 9c na 9f, zikifuatiwa na −8.6 kwa 8f na −8.2 kwa 6c.

Katika mkao uliochaguliwa wa 6c, kundi la NH la indole lilitabiriwa kuunda kifungo cha hidrojeni na Cys532, na kundi la amino la msingi na Gly534. Kwa mfumo wa aromatiki, mwingiliano wa π–π uliotabiriwa na Trp531 na Phe583 pamoja na migusano ya hidrofobiki na Ile463/Val471 iliripotiwa. Katika 8f, kundi la amino la msingi lilitabiriwa kuunda kifungo cha hidrojeni na Gln530. Katika mikao iliyochaguliwa ya 9c na 9f, ilikadiriwa kuwa NH ya indole inaingiliana na Asp594 na kwamba kuna migusano ya ziada na Phe468, Val471, Leu514 na Phe583.

Katika matokeo ya MTT ya SK-MEL-28, 9c ilitoa <12.5 µM, 9f 16 µM, huku 6c na 8f zikitoa 18 µM. Ingawa mpangilio huu unaonekana kufanana kwa kiasi na alama za docking za B-RAF, kwa sababu ukubwa wa pete na ubadilishaji wa aromatiki hubadilika kwa wakati mmoja, haiwezekani kubainisha ni sifa gani ya kimuundo iliyosababisha tofauti hiyo. Muhimu zaidi, ulinganifu huu wa ubora hauthibitishi kwamba uzuiaji wa B-RAF V600E ndio utaratibu wa shughuli ya seli.

Matokeo ya TOP2B

Alama za TOP2B za misombo minne zilibaki katika kiwango chembamba sana, kati ya −4.3 na −4.4 kcal mol⁻¹. Kwa 6c na 8f, vifungo viwili vya hidrojeni kuelekea Glu522 kupitia NH ya indole na kundi la amino la nje ya pete; kwa 9c na 9f kubwa zaidi, mwingiliano na Arg503 ulitabiriwa. Katika misombo yote minne, mgusano wa hidrofobiki kati ya pete ya alicyclic iliyounganishwa na Leu507 ulikadiriwa.

Matokeo ya MTT katika seli za KB hayakulingana na mpangilio wa docking: kwa 9c IC₅₀ ilikuwa <12.5 µM, huku kwa 6c, 8f na 9f ikiwa 20 µM; kinyume chake, alama zote za TOP2B zilikuwa karibu sawa. Kwa hiyo, modeli ya TOP2B ya protini pekee haielezi tofauti za seli.

Matokeo ya cyclin D1

Kwa cyclin D1, alama ziko kati ya −6.2 na −7.1 kcal mol⁻¹. 9c na 9f zilitoa alama hasi zaidi ya −7.1 na kufikia thamani sawa na alama ya ligandi rejea ya nje nomilin. 8f ilikuwa −6.9, huku 6c ikiwa −6.2 kcal mol⁻¹.

Katika misombo yote minne, vifungo vya hidrojeni vilivyotabiriwa na Gln71 na Glu115 kupitia NH ya indole na/au makundi ya amino ya nje ya pete; pamoja na migusano na Ile117, Leu119 na Thr116 viliripotiwa. Kwa 9c na 9f, ilikadiriwa kuwa pete kubwa zaidi iliyounganishwa inaweza kuhusishwa na migusano ya ziada ya hidrofobiki.

Hata hivyo, matokeo ya BT-549 hayalingani kikamilifu na mpangilio wa docking. Kwa mfano, ingawa alama iliyo hasi kwa kiwango kidogo zaidi kwa docking ni −6.2 katika 6c, IC₅₀ ya BT-549 ni 13 µM; IC₅₀ ya 8f yenye alama hasi zaidi ya −6.9 ni 19 µM. Kwa hiyo, docking ya cyclin D1 peke yake haiwezi kueleza tofauti za shughuli ya seli.

Matokeo ya GSK3β

Kwa GSK3β, alama za misombo minne ziko karibu sana, kati ya −9.6 na −9.9 kcal mol⁻¹. 9c ilitoa −9.9, 9f −9.8, huku 6c na 8f zikitoa −9.6 kcal mol⁻¹. Katika mkao uliochaguliwa wa 6c hakuna kifungo cha hidrojeni kilichoripotiwa na mwingiliano ulielezwa kuwa hasa wa hidrofobiki. Katika 8f, mgusano wa ziada wa polar kati ya kibadala cha fluorine na kundi la N–H la Lys85 ulikadiriwa. Ingawa 9c na 9f zinaonyesha mitandao mipana zaidi ya mwingiliano, tofauti za alama ni ndogo.

Thamani za MTT za SK-OV-3 pia zilibaki katika kiwango chembamba cha 18–21 µM: 6c 19, 8f 21, 9c 20 na 9f 18 µM. Ukaribu wa thamani za docking na MTT unaashiria kwamba misombo hii minne ina tabia inayofanana katika modeli hii yenye mipaka; lakini hauthibitishi kwamba GSK3β ndiyo sababu ya shughuli ya seli.

Hali ya fomula na mlinganyo

Utafiti wa chanzo hautoi mlinganyo huru wa modeli ya kihisabati wala mlinganyo wa kinetiki wa kimekanisti. Inaelezwa kwamba regresheni isiyo ya mstari ilitumika katika hesabu ya IC₅₀, lakini mlinganyo wazi wa kazi ya regresheni haujaripotiwa. Kwa hiyo, hakuna mlinganyo wa dozi-mwitikio ambao haupo katika chanzo ulioongezwa kwenye maandishi ya Verianla. Alama za docking na thamani za RMSD pia zimetolewa katika chanzo kama matokeo ya kihesabu; makala haikutengeneza mlinganyo mpya wa kihisabati wa docking.

Vikwazo vikuu vya utafiti

• Kipimo cha MTT kilitumia viwango vitatu tu vya majaribio: 12.5, 25 na 50 µM.
• Thamani halisi za IC₅₀ za 9c katika mistari mitatu ya seli yenye asili ya uvimbe hazikubainishwa kwa usahihi kwa sababu zilibaki chini ya 12.5 µM.
• Kwa kuwa thamani za IC₅₀ hazikuhesabiwa kando kwa kila jaribio huru, SD au SEM haikuweza kuripotiwa.
• MTT ni kipimo cha shughuli ya kimetaboliki/uhai wa seli; hakibainishi utaratibu wa kifo cha seli.
• LLC-PK1 na Vero ni mistari ya seli za epitheliamu ya figo zisizotengeneza uvimbe lakini si vidhibiti vya kliniki vinavyowakilisha tishu za kawaida za binadamu; mmoja una asili ya nguruwe na mwingine ya tumbili wa kijani wa Afrika.
• Uteuzi wenye maana wa seli za uvimbe kwa 9c haukuweza kuthibitishwa kutoka kwenye mfululizo wa sasa wa viwango.
• Docking ilifanywa kwa misombo minne tu iliyochaguliwa na modeli nne tu za protini zilizochaguliwa.
• Docking si jaribio la moja kwa moja la kufungamana kwa protini au uzuiaji wa kimeng'enya.
• Kwa kuwa DNA iliondolewa kwenye modeli ya docking ya TOP2B, kompleksi kamili ya TOP2B–DNA–ligandi haiwakilishwi.
• RMSD kwa nomilin si uthibitishaji dhidi ya mkao wa kioo wa majaribio, bali ni kipimo cha kurudiwa kati ya hesabu mbili.
• Hakuna uthibitishaji wa moja kwa moja wa shabaha kwa biokemia, jaribio la target-engagement la seli, jaribio la in vivo wala tathmini ya kliniki iliyofanywa katika utafiti.

Tafsiri sahihi ya kisayansi ya hitimisho

Matokeo yenye nguvu zaidi ya utafiti ni kwamba mfululizo mpana wa 5H-pyrido[3,2-b]indol-4-amine wenye vibadala mbalimbali vya aromatiki na ukubwa minne tofauti wa pete za cycloalkane zilizounganishwa unaweza kusanisiwa, na tathmini yao ya kwanza ya kibayolojia inayotegemea seli ilifanywa. 9c ilijitokeza katika kiwango kilichopimwa; hata hivyo, kwa sababu baadhi ya thamani halisi za IC₅₀ zilibaki nje ya kiwango cha kipimo na thamani dhidi ya seli zisizotengeneza uvimbe zilikuwa karibu, kiambatani hiki hakipaswi kupewa sifa ya potensi au uteuzi wa uhakika.

Hesabu za docking zilitengeneza mikao inayowezekana ya kufungamana inayoweza kuchunguzwa kwa B-RAF V600E, TOP2B, cyclin D1 na GSK3β. Hata hivyo, hesabu hazionyeshi mwingiliano wa moja kwa moja na shabaha au utaratibu wa athari. Hitimisho la chanzo lenyewe pia ni kwamba majaribio ya kina zaidi ya mkusanyiko-mwitikio, majaribio ya moja kwa moja ya biokemia, tafiti za mwingiliano wa shabaha katika seli na uchunguzi mpana zaidi wa kimekanisti vinahitajika.

Dokezo la Chanzo na Mbinu

Kichwa asili: Cycloalkane-Fused 5H-Pyrido[3,2-b]indol-4-amines: Synthesis, Characterization, Molecular Docking, and In Vitro Cell-Viability Evaluation

Waandishi: Lo’ay A. Al-Momani; Panayiotis A. Koutentis; Stavros Panagiotou; Mohammad K. Abu-Sini; Fadi G. Saqallah; Samir A. Ross.

Mwandishi wa mawasiliano: Lo’ay A. Al-Momani — Department of Chemistry, Faculty of Science, The Hashemite University, Zarqa, Jordan.

Mchango sawa: Hakuna taarifa ya mchango sawa/uandishi mwenza wa kwanza iliyoelezwa katika makala chanzo.

Taasisi: Department of Chemistry, Faculty of Science, The Hashemite University, Zarqa, Jordan; Department of Chemistry, University of Cyprus, Nicosia, Cyprus; Department of Pharmacy, Faculty of Pharmacy, Al-Zaytoonah University of Jordan, Amman, Jordan; National Center for Natural Products Research, School of Pharmacy, The University of Mississippi, Oxford, Mississippi, USA; Division of Pharmacognosy, Department of Biomolecular Sciences, School of Pharmacy, The University of Mississippi, Oxford, Mississippi, USA.

Jarida: Chemistry.

Mchapishaji: MDPI, Basel, Switzerland.

Rekodi ya bibliografia: Chemistry 2026, 8(10), 132.

DOI: 10.3390/chemistry8100132

Kiungo rasmi: https://doi.org/10.3390/chemistry8100132

Kupokelewa / kurekebishwa / kukubaliwa / kuchapishwa: Received 22 Agosti 2026; Revised 17 Septemba 2026; Accepted 21 Septemba 2026; Published 24 Septemba 2026.

Aina ya chanzo na mapitio ya wenzao: Ni makala ya utafiti iliyochapishwa katika jarida Chemistry. Chemistry ni jarida la kemia la ufikiaji wazi linalopitiwa na wenzao na kuchapishwa na MDPI.

Leseni: Leseni ya ufikiaji wazi ya Creative Commons Attribution (CC BY); masharti ya ufikiaji wazi ya jarida yanaonyesha leseni ya CC BY 4.0.

Hali ya preprint: Hakuna toleo la preprint au kitambulisho cha preprint kilichoelezwa katika makala chanzo.

Aina ya utafiti: Usanisi na utambuzi wa sifa wa kemia ya kikaboni/kidawa ya majaribio + tathmini ya in vitro ya uhai wa seli kwa MTT + docking ya molekuli ya kiuchunguzi ya in silico.

Ufadhili: Utafiti uliungwa mkono na Fulbright Foundation, Tafila Technical University (TTU), Hashemite University Research Grant No. 113/2022 na University of Mississippi National Center for Natural Products Research (NCNPR). Chanzo kinasema kuwa wafadhili hawakuwa na jukumu katika muundo wa utafiti, ukusanyaji wa data, uchanganuzi/tafsiri, maandalizi ya makala au uamuzi wa kuchapisha.

Upatikanaji wa data: Imeelezwa kwamba data zilizowasilishwa katika utafiti zinapatikana ndani ya makala na Supplementary Materials.

Nyenzo za ziada: Ndani ya Supplementary Materials kuna Figures S1–S36 kwa spectra za FTIR; Figures S37–S164 kwa data za ¹H na ¹³C NMR, DEPT, HMBC na HMQC; Figures S165–S200 kwa HRMS na Table S1 yenye uchanganuzi wa mwingiliano wa kufungamana wa misombo.

Mgongano wa maslahi: Waandishi wametangaza kwamba hakuna mgongano wa maslahi.

Kamati ya maadili / ridhaa yenye taarifa: Hakuna Institutional Review Board au Informed Consent Statement tofauti iliyoripotiwa katika taarifa za mwisho za makala chanzo. Sehemu ya kibayolojia ya utafiti ilifanywa kwenye mistari thabiti ya seli.

Michango ya waandishi: Uundaji wa dhana: Panayiotis A. Koutentis, Lo’ay A. Al-Momani na Samir A. Ross. Mbinu: Panayiotis A. Koutentis, Stavros Panagiotou, Lo’ay A. Al-Momani, Mohammad K. Abu-Sini na Fadi G. Saqallah. Programu: Fadi G. Saqallah. Uchanganuzi rasmi: Lo’ay A. Al-Momani, Stavros Panagiotou na Panayiotis A. Koutentis. Rasilimali: Samir A. Ross na Lo’ay A. Al-Momani. Usimamizi wa data: Lo’ay A. Al-Momani, Mohammad K. Abu-Sini na Fadi G. Saqallah. Rasimu ya kwanza: Lo’ay A. Al-Momani. Mapitio na uhariri: Panayiotis A. Koutentis na Samir A. Ross. Usimamizi wa kisayansi: Samir A. Ross na Panayiotis A. Koutentis. Usimamizi wa mradi: Lo’ay A. Al-Momani, Samir A. Ross na Panayiotis A. Koutentis. Upatikanaji wa ufadhili: Samir A. Ross na Lo’ay A. Al-Momani.

Shukrani: Waandishi wanamshukuru Amar Chittiboyina kwa kutoa vifaa vya maabara kwa tafiti za usanisi, Shabana Khan kwa kufanya vipimo vya MTT katika University of Mississippi, na Charles Cantrell (USDA-ARS) pamoja na Naba Hikma Labs kwa msaada wao katika vipimo vya spectrometri ya molekuli yenye azimio la juu.

Kikomo kikuu cha kimethodolojia: Jaribio la seli linategemea viwango vitatu tu vya kiambatani na baadhi ya thamani za IC₅₀ zilibaki nje ya kiwango cha majaribio. Matokeo ya MTT ni kiashirio cha shughuli ya kimetaboliki/uhai wa seli; si ushahidi wa moja kwa moja wa utaratibu dhidi ya saratani. Hesabu za docking ya molekuli hazithibitishi kwa majaribio kufungamana na shabaha au utaratibu. DNA iliondolewa katika modeli ya TOP2B na udhibiti wa mkao wa nomilin uliotumika kwa cyclin D1 si uthibitishaji wa kioo bali ni kurudiwa kwa mkao kati ya hesabu. Hakuna uthibitishaji wa in vivo au wa kliniki uliofanywa katika utafiti.