Bu çalışmada geliştirilen kronik yüksek tuzlu murin model, renal rezervi unilateral nefrektomiyle azaltılmış farelerde uzun süreli yüksek tuz alımının kemik dokusu ile bağışıklık sistemi üzerindeki zaman-bağımlı etkilerini birlikte inceleyen kontrollü bir hayvan deneyidir. Dişi ve erkek C57BL/6J ve Foxp3-GFP fareler unilateral nefrektomi sonrasında 30 gün iyileştirilmiş, ardından normal tuz diyeti (NSD; %0,2 NaCl) veya yüksek tuz diyeti (HSD; %4 NaCl) alacak şekilde rastgele gruplandırılmış ve 20, 60 veya 150 gün boyunca izlenmiştir. Çalışma insanlarda yapılmamış ve kullanılan %4 NaCl diyeti tipik insan tuz tüketimini doğrudan temsil etmemektedir.

Araştırmanın temel sonucu, kronik tuz yükünün kemik ile bağışıklık sisteminde aynı zaman desenini oluşturmamasıdır. Kemik tarafında hasar zaman ilerledikçe birikmektedir: 60 ve 150. günlerde femurun kırılma yükü ve ultimate yükü düşmekte, 150. günde stiffness, ultimate stress ve Young modülü de azalmaktadır. Tibianın kortikal kalsiyum ve fosfor içeriği 60 ve 150. günlerde azalırken, trabeküler kemik hacmi ve trabekül sayısı düşmekte, trabeküller arası mesafe artmakta ve 150. günde trabekül kalınlığı da azalmaktadır.

Bağışıklık yanıtı ise iki fazlıdır. HSD'nin 20. gününde dalak ve kemik iliğinde CD4+ ve CD8+ T hücrelerinin aktivasyonu yükselmiş, IL-17 üreten Th17 ve Tc17 hücreleri artmış ve Th17/Treg dengesi inflamatuvar yöne kaymıştır. Bu erken değişiklikler 60. günde büyük ölçüde normale dönmüş; 150. günde ise PD-1+ ve CD44+ efektör T hücrelerinin azalmasıyla T hücresi aktivasyonu ve efektör farklılaşmasının baskılandığı geç dönem profili ortaya çıkmıştır.

Fizyolojik olarak HSD farelerinde sistolik kan basıncı erken dönemde geçici biçimde yükselmiş fakat yaklaşık 45. günden itibaren başlangıç düzeyine dönmüştür. Buna karşılık su tüketimi ve idrar hacmi artmış; idrarla sodyum ve klor atılımı bütün ölçüm zamanlarında yüksek kalmıştır. İdrar kalsiyumu 60 ve 150. günlerde artmasına rağmen serum kalsiyumu, fosfor ve paratiroid hormonu değişmemiştir. Bu nedenle kemik bozulması sürekli hipertansiyon veya belirgin serum kalsiyum düşüşü olmadan da gelişmiştir.

Th17/Treg oranının bazı trabeküler kemik ve mineral parametreleriyle güçlü korelasyonları bulunmuştur. Bununla birlikte çalışma bu korelasyonların bağışıklık değişikliğinin kemik hasarına doğrudan neden olduğunu kanıtlamadığını açıkça belirtmektedir. Bulgular bağışıklık yeniden yapılanması ile iskelet bozulmasının kronik tuz maruziyeti sırasında birlikte geliştiğini desteklemekte; gerçek nedensel mekanizmanın belirlenmesi için osteoklast, osteoblast ve ilgili sinyal yollarını doğrudan değerlendiren ek deneyler gerekmektedir.

Araştırmanın temel problemi

Sodyum yaşam için gerekli bir elektrolittir; hücresel işlev, osmotik basınç, asit-baz dengesi ve vücut sıvılarının dağılımı gibi süreçlerde rol oynar. Bununla birlikte aşırı sodyum alımı özellikle hipertansiyonla ilişkilendirilir ve böbrek, damar, beyin ve bağışıklık sistemi üzerinde olumsuz etkiler oluşturabilir.

Araştırmanın daha özel problemi, fazla tuzun kemik dokusunu nasıl etkilediğinin yalnız kan basıncı veya idrarla kalsiyum kaybıyla açıklanamamasıdır. Kemik sürekli yenilenen canlı bir dokudur ve bağışıklık sistemi de kemik remodeling sürecinin düzenlenmesine katılır. Özellikle T hücrelerinden salgılanan çeşitli sitokinler osteoklast ve osteoblast davranışını etkileyebilir.

Önceki çalışmalar yüksek tuz alımının kemik mineral yoğunluğunu ve mikro-mimarisini bozabileceğini ve Th17/Treg dengesini değiştirebileceğini göstermiştir. Ancak önceki önemli modellerden bazıları yalnız erkek fare kullanmış, tek bir zaman noktasına odaklanmış veya sistemik bağışıklık, kemik kimyası, mikro-mimari ve biyomekaniği aynı çalışma içinde birlikte değerlendirmemiştir.

Bu çalışma bu boşluğu üç ayrı süreyi —20, 60 ve 150 gün— izleyerek ve iki cinsiyeti dahil ederek kapatmaya çalışmıştır.

Araştırmanın hipotezi

Araştırmacılar kronik yüksek tuz tüketiminin bağışıklık yanıtını zaman içinde dinamik biçimde yeniden şekillendireceğini ve bu değişimin kemik homeostazını farklı dönemlerde etkileyerek ilerleyici iskelet bozulmasına katkı sağlayacağını öne sürmüştür.

İkinci önerme, unilateral nefrektomiyle oluşturulan orta derecede azalmış renal rezervin tuza duyarlılığı yükselteceği ve böylece hem bağışıklık düzensizliğini hem kemik hasarını deneysel olarak görünür hale getireceğidir.

Unilateral Nefrektomi Bu Fare Modelinde Neden Kullanıldı?

Unilateral nefrektomi (UNX), bir böbreğin cerrahi olarak çıkarılmasıyla renal rezervi azaltan ve farelerde normalde güçlü olmayabilen tuza duyarlı sistemik yanıtların kontrollü biçimde görünür hale gelmesini sağlayan deneysel işlemdir; araştırmacılar UNX'i yüksek tuzun etkisini hızlandırmak için kullanmış, ancak modelin insanlardaki tipik tuz duyarlılığını tam temsil etmediğini özellikle belirtmiştir.

Fareler tuza duyarlı hipertansiyon açısından bazı diğer kemirgen modelleri kadar belirgin yanıt göstermeyebilir. Araştırmacılar bu nedenle toplam böbrek fonksiyonunu tamamen ortadan kaldırmadan renal rezervi azaltmayı tercih etmiştir.

UNX sonrasında farelere hemen yüksek tuz verilmemiştir. Bütün hayvanlar 30 gün iyileştirilmiştir. Bu bekleme süresinin amacı ameliyatın akut hemodinamik, endokrin ve inflamatuvar etkilerinin geçmesini ve böbrek fonksiyonunun kompansasyonla kararlı hale gelmesini sağlamaktır.

Dolayısıyla daha sonra gözlenen HSD–NSD farklarının ameliyatın hemen oluşturduğu akut inflamasyondan kaynaklanma olasılığını azaltmak hedeflenmiştir.

Deney grupları nasıl oluşturuldu?

Yaşları 7–10 hafta olan dişi ve erkek fareler kullanılmıştır. Çalışmada iki fare hattı bulunmaktadır:

• C57BL/6J: standart wild-type deney faresi.
• Foxp3-GFP: düzenleyici T hücrelerinin Foxp3 ekspresyonunu GFP üzerinden izlemeye olanak veren reporter fare hattı.

Foxp3-GFP farelerde Foxp3 promotörü yeşil floresan proteini sürmektedir. Böylece Foxp3+ düzenleyici T hücreleri akış sitometrisinde doğrudan tanımlanabilir. C57BL/6J fareler akış sitometrisi dışındaki deneylerde kullanılmıştır.

Bu grup büyüklüklerinin toplamı 60 fareye karşılık gelmektedir. Bununla birlikte her ölçüm bütün hayvanlarda yapılmamıştır. Kaynak, belirli deneylerde rastgele seçilmiş alt grupların kullanıldığını ve gerçek analiz örneklem sayısının ilgili şekil açıklamasında verildiğini açıkça belirtmektedir.

Deney süresince diyet müdahalesine bağlı ölüm görülmemiştir.

%4 NaCl diyeti insanlardaki yüksek tuz tüketimiyle aynı mıdır?

Hayır. Kaynak, farelerde kullanılan %4 NaCl diyetinin insanlarda tipik olarak tüketilen tuz miktarından çok daha yüksek olduğunu açıkça belirtmektedir. Bu yüksek oran, deneysel sürede ölçülebilir fizyolojik ve doku değişiklikleri oluşturmak amacıyla kullanılan preklinik model koşuludur.

Bu nedenle “%4 NaCl fare diyeti insanlarda %4 tuz tüketilmesi gerektiğini veya insanların aynı miktara maruz kaldığını gösterir” biçiminde bir karşılaştırma yapılamaz.

Th17/Treg Dengesi Nedir ve Bu Çalışmada Neden Önemlidir?

Th17/Treg dengesi, proinflamatuvar IL-17 üreten yardımcı T hücreleri ile bağışıklık yanıtını sınırlayan düzenleyici T hücrelerinin göreli dengesini ifade eder; çalışmada yüksek tuzun 20. günde Th17 yönüne kaydırdığı bu denge daha kötü trabeküler mikro-mimari ve daha düşük kortikal mineral içeriğiyle ilişkili bulunmuştur.

Th17 hücreleri, IL-17 üretimiyle karakterize edilen ve inflamatuvar yanıtları destekleyebilen CD4+ T hücresi alt grubudur. IL-17, kemik biyolojisinde osteoblastlardan RANK-L üretimini destekleyebilir ve osteoklast öncüllerinin RANK-L'ye yanıtını artırabilir.

Treg hücreleri ise bağışıklık yanıtının aşırı aktivasyonunu sınırlandıran düzenleyici T hücreleridir. Foxp3, bu hücrelerin tanımlanmasında temel belirteçlerden biridir.

Bu nedenle yüksek bir Th17/Treg oranı, çalışmanın bağlamında düzenleyici yanıtlar karşısında proinflamatuvar yönün göreli olarak ağır bastığını gösteren bir immün denge göstergesidir. Bununla birlikte oran tek başına kemik kaybının nedenini kanıtlamaz.

Kemik–bağışıklık ekseni ne anlama geliyor?

Kemik dokusu ile bağışıklık sistemi birbirinden tamamen bağımsız değildir. T hücreleri, monositler, osteoklast öncüleri ve kemik hücreleri RANK-L, M-CSF, osteoprotegerin ve çeşitli inflamatuvar sitokinler üzerinden birbirleriyle etkileşebilir.

Bu alan genellikle osteoimmünoloji olarak adlandırılır. Çalışmanın özgün değeri, uzun süreli tuz maruziyetinde aynı deneysel model içinde kemik biyomekaniğini, mineral bileşimini, trabeküler mikro-mimariyi ve T hücresi fenotiplerini zaman içinde birlikte değerlendirmesidir.

Th17/Treg Korelasyonu Kemik Hasarının Nedenini Kanıtlıyor mu?

Hayır. Çalışmada Th17/Treg oranı ile bazı kemik parametreleri arasında güçlü istatistiksel ilişkiler bulunmuştur; ancak korelasyon iki değişkenin birlikte değiştiğini gösterir ve bağışıklık dengesindeki değişimin kemik bozulmasına doğrudan neden olduğunu tek başına kanıtlamaz.

Örneğin kemik iliği Th17/Treg oranı ile BV/TV arasında r = −0,9921 ve p = 0,0079 bulunmuştur. Bu çok güçlü ters yönlü bir ilişkidir: oran arttıkça kemik hacim fraksiyonunun daha düşük olma eğilimi vardır. Ancak başka ortak süreçler —sodyumun doğrudan etkisi, renal mineral kaybı, hormonal değişiklikler veya farklı bağışıklık mekanizmaları— iki değişkeni aynı anda etkileyebilir.

Yazarların kendileri bu nedenle osteoklast ve osteoblast aktivitesinin doğrudan ölçülmesi, Th17/Treg polarizasyon yollarının daha ayrıntılı karakterizasyonu ve miyeloid hücre alt gruplarının incelenmesini gelecekteki mekanistik çalışmalar için gerekli görmektedir.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Hayvanların bakım koşulları

Fareler 12 saat aydınlık / 12 saat karanlık döngüsünde, 20–25 °C sıcaklıkta ve kontrollü nem koşullarında tutulmuştur. Yem ve suya serbest erişim sağlanmıştır. Aynı deney grubundaki hayvanlar kafes başına 3–6 fare olacak şekilde birlikte barındırılmıştır.

UNX sırasında ketamin 50 mg/kg ve ksilazin 20 mg/kg dozlarında intraperitoneal olarak uygulanmıştır.

Fizyolojik takip nasıl yapıldı?

Fareler başlangıçta ve diyetin 20., 60. ve 150. günlerinde 24 saatlik idrar toplamak ve su tüketimini ölçmek için ayrı metabolik kafeslere alınmıştır.

Vücut ağırlığı ve sistolik kan basıncı başlangıçta, daha sonra 15 günlük aralıklarla ve protokolün son gününde ölçülmüştür.

Kan basıncı anestezi olmadan CODA non-invaziv tail-cuff sistemiyle ölçülmüştür. Fareler ölçümden önce bir hafta boyunca aynı operatörle sisteme alıştırılmış, restrainer sıcaklığı 33–36 °C'de tutulmuştur. Nihai sistolik kan basıncı değeri on ölçümün ortalamasıdır.

Biyokimyasal ölçümler

Serum kalsiyum, fosfor ve kreatinin ile idrar kalsiyum ve kreatinini Biosystems A25 otoanalizörüyle spektrofotometrik olarak ölçülmüştür. PTH, MicroVue Mouse PTH 1-84 EIA ELISA yöntemiyle; idrar sodyum, klor ve potasyumu ise iyon-seçici elektrotlarla belirlenmiştir.

Kreatinin klirensi formülü

Kaynak kreatinin klirensini aşağıdaki biçimde vermektedir:

\[ \text{Kreatinin klirensi} = \frac{\text{idrar kreatinini (mg/24 h)}}{\text{serum kreatinini (mg/dL)}} \times \frac{\text{24 saatlik idrar hacmi (mL)}}{1440} \]

Formül neyi amaçlar? Böbreğin kreatinini kandan temizleme kapasitesini yaklaşık olarak ifade eden bir renal filtrasyon göstergesi üretmeyi amaçlar.

1440 neden vardır? Bir gün 1440 dakikadır; 24 saatlik idrar hacminin dakika başına akış biçimine dönüştürülmesinde bu zaman dönüşümü kullanılır.

Kaynak içi birim notu: Makale paydaki “urinary creatinine” değişkenini mg/24 h şeklinde etiketlemektedir. Verianla bu ifadeyi standart kreatinin klirensi formülüne göre sessizce “konsantrasyon” biçiminde düzeltmemektedir. Dolayısıyla burada formül kaynakta yazıldığı biçimde korunmuştur ve birim gösteriminde kaynak kaynaklı bir belirsizlik bulunduğu açık tutulmaktadır.

Üç Noktalı Eğme Testi Kemik Dayanımında Neyi Ölçer?

Üç noktalı eğme testi, femurun iki destek üzerinde tutulup orta noktadan kontrollü yük uygulanmasıyla kemiğin kırılmaya karşı taşıma kapasitesini, rijitliğini, enerji absorpsiyonunu ve geometrisi dikkate alındığında malzeme düzeyindeki stress–strain özelliklerini değerlendiren mekanik testtir.

Deney cihazı ve koşulları

Sağ femurlar −20 °C'de salinle nemlendirilmiş gazlı bez içinde saklanmış ve test öncesinde 37 °C'de çözündürülmüştür.

• Load cell kapasitesi: 200 N.
• Kuvvet çözünürlüğü: 0,01 N.
• Yer değiştirme doğruluğu: 10 µm.
• İki destek arasındaki açıklık: 8,5 mm.
• Yer değiştirme hızı: 0,01 mm/s.
• Örnekleme frekansı: 10 Hz.
• Yazılım: Biomedical Data Acquisition Suite 1.0.

Ultimate load, kemiğin ulaştığı en yüksek yük değeridir. Fracture load, kuvvetteki ilk belirgin düşüşten hemen önce kaydedilen yük olarak tanımlanmıştır.

Stiffness, yük–yer değiştirme eğrisinin doğrusal bölümünün eğimidir ve N/mm birimiyle verilmiştir.

Absorbed energy, kırılma noktasına kadar yük–yer değiştirme eğrisinin altında kalan alan olarak tanımlanmış ve mJ olarak raporlanmıştır.

Stress hesabı

Kaynak klasik beam theory kullanarak aşağıdaki stress ilişkisini vermektedir:

\[ \sigma= \frac{F\,L\,r}{4I} \]

• \(\sigma\): hesaplanan stress.
• \(F\): uygulanan yük.
• \(L\): iki destek çubuğu arasındaki mesafe.
• \(r\): kemiğin dış yarıçapı.
• \(I\): CSMI — cross-sectional moment of inertia.

CSMI, kesitin eğilmeye karşı geometrik direncini temsil eder. Aynı yük altında kemiğin dış geometrisi değişirse oluşan stress de değişebilir; bu nedenle yalnız kırılma kuvvetine bakmak ile malzeme düzeyindeki ultimate stress'i değerlendirmek aynı şey değildir.

Strain hesabı

Kaynak strain ilişkisini aşağıdaki biçimde vermektedir:

\[ \varepsilon= \frac{12\,r\,\delta\,10^{6}}{L^{2}} \]

• \(\varepsilon\): strain.
• \(r\): dış yarıçap.
• \(\delta\): yer değiştirme.
• \(L\): destekler arası mesafe.

Strain, şekil değişiminin başlangıç boyutuna göre göreli büyüklüğünü temsil eder. Kaynak denklem metninde strain birimini ayrıca etiketlememektedir; \(10^6\) ölçek çarpanı korunarak formül aynen aktarılmıştır.

Young modülü, stress–strain eğrisinin doğrusal bölümünden belirlenmiştir. Yüksek Young modülü daha rijit malzemeyi, düşük Young modülü aynı stress altında daha fazla elastik deformasyona yatkın malzemeyi temsil eder.

Micro-CT kemik yapısını nasıl ölçtü?

Sol tibia SkyScan 1173 micro-computed tomography sistemiyle görüntülenmiştir.

• Kaynakta bildirilen voxel size: 6 µm³.
• Gerilim: 60 kV.
• Akım: 133 µA.
• Integration time: 500 ms.
• Rotation step: 0,2°.
• Toplam projeksiyon: 360° boyunca 1800.
• Reconstruction: NRecon 1.7.3.2.
• Analiz: Fiji 2.16.0/1.54p + BoneJ 7.0.20.

Volume of interest, proksimal büyüme kıkırdağından 20 kesit uzaklıkta başlatılmış ve toplam tibia uzunluğunun %5'ine karşılık gelen yükseklikte tanımlanmıştır.

Görüntülere Gaussian filter uygulanmış (\(\sigma=0,8\)), Otsu thresholding ile segmentasyon yapılmış ve trabeküler bölge ROI'leri manuel olarak çizilmiştir.

Temel micro-CT parametreleri:

• BV/TV (%): incelenen hacim içindeki trabeküler kemik hacmi oranı.
• Tb.N (1/mm): trabekül sayısı.
• Tb.Th (µm): trabekül kalınlığı.
• Tb.Sp (µm): trabeküller arasındaki mesafe.

Genel olarak aynı anatomik bölgede BV/TV ve Tb.N'nin azalması, Tb.Sp'nin artması trabeküler ağın seyrekleştiğini gösterir. Bu çalışmada bu yönlü değişiklikler 60 ve 150 günlük HSD maruziyetinde belirginleşmiştir.

SEM-EDS neyi ölçtü?

Sağ tibialar metakrilata gömülmüş ve enine kesitler hazırlanmıştır. Kortikal bölgenin element bileşimi Sigma scanning electron microscope ile energy-dispersive spectroscopy kullanılarak değerlendirilmiştir.

Bu yöntem özellikle kortikal kemikte kalsiyum ve fosfor miktarını, Ca/P oranını ve diğer seçilmiş elementleri değerlendirmek amacıyla kullanılmıştır.

Akış sitometrisi nasıl yapıldı?

Dalaktan mekanik ayrıştırmayla tek hücre süspansiyonu hazırlanmıştır. Kemik iliği hücreleri femur epifizleri çıkarıldıktan sonra 8000×g'de 5 saniyelik kısa santrifüjle elde edilmiştir.

Eritrositler ACK lysing buffer ile 3 dakika parçalanmış ve lökosit sayımı Turk çözeltisi ile Neubauer kamarasında yapılmıştır.

Yüzey boyaması için 2 × 10⁶ hücre, PBS içinde %2 FBS ortamında 20 dakika 4 °C'de boyanmıştır. CD4, CD8, NK1.1, CD25, CD39, PD-1, CD44, CD45, IL-17 ve Foxp3 dahil çeşitli belirteçler kullanılmıştır.

Hücre içi sitokin analizi için 2 × 10⁶ hücre/kuyu, 200 µL RPMI 1640 içinde 5 saat 37 °C'de PMA 50 ng/mL ve ionomycin 1 µg/mL ile uyarılmış; Brefeldin A ve Monensin kullanılmıştır.

Veriler LSRFortessa flow cytometer ile toplanmış ve FlowJo X.0.7 ile analiz edilmiştir.

İstatistiksel analiz

Sonuçlar aksi belirtilmedikçe ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir.

• Normallik: Shapiro–Wilk testi.
• Cinsiyet × diyet ana fizyolojik etkileri: iki yönlü ANOVA.
• Cinsiyet × diyet × zaman temel kemik sonuçları: üç yönlü ANOVA.
• Aynı zaman noktasındaki iki grup: normalse t-testi, değilse Mann–Whitney.
• Tekrarlı vücut ağırlığı ve sistolik kan basıncı: repeated-measures ANOVA + uygun post hoc testler.
• Kemik–bağışıklık ilişkileri: pairwise correlation.
• Outlier gerektiğinde: ROUT yöntemi.
• Yazılım: Stata 17.0 ve GraphPad Prism 9.0.

İstatistiksel anlamlılık eşiği p < 0,05'tir. Kaynak 0,05–0,10 arasındaki p değerlerini “trend” olarak yorumlamaktadır. Trend, istatistiksel anlamlılıkla aynı şey değildir.

Kaynak n = 6 için, \(\alpha=0,05\) düzeyinde Cohen's d = 2,02 kadar büyük bir etkiyi saptamak için post hoc güç değerini 0,88 olarak vermektedir. Küçük örneklemler nedeniyle bu güç ifadesi daha küçük etkilerin güvenilir biçimde tespit edildiği anlamına gelmez.

Fizyolojik sonuçlar

Vücut ağırlığı artışı HSD ve NSD arasında benzer ilerlemiştir. Dişiler erkeklerden daha düşük vücut ağırlığına sahip olmakla birlikte diyetin ağırlık artışına etkisi iki cinsiyet için benzer bulunmuştur.

Sistolik kan basıncı HSD grubunda 15. ve 30. günlerde yükselmiş, yaklaşık 45. günde başlangıç düzeyine dönmüş ve daha sonra kararlı kalmıştır. Yazarlar 150 günlük protokol boyunca değerlerin normotansif aralık içinde kaldığını belirtmektedir.

HSD grubunda 20., 60. ve 150. günlerde su tüketimi ve 24 saatlik idrar hacmi daha yüksektir.

İki yönlü ANOVA bazı parametrelerde cinsiyet ana etkileri göstermiştir; ancak anlamlı sex × diet interaction bulunmamıştır. Bu, kadın ve erkek farelerin bütün mutlak değerlerinin aynı olduğu anlamına gelmez; yüksek tuz diyetinin etkisinin cinsiyetler arasında belirgin biçimde farklılaşmadığı anlamına gelir. Bu nedenle sonraki sonuçların büyük bölümü cinsiyetler birleştirilerek gösterilmiştir.

Renal ve mineral metabolizması

HSD grubunda 24 saatlik idrar sodyum ve klor atılımı bütün incelenen zaman noktalarında yükselmiştir. İdrar potasyum, kalsiyum ve kreatinin atılımı özellikle 60 ve 150. günlerde artmıştır.

Buna rağmen serum kalsiyum, fosfor ve PTH değerlerinde belirgin HSD–NSD farkı görülmemiştir.

* p < 0,05; ** p < 0,01. HSD grubundaki kreatinin klirensi 60 ve 150. günlerde daha yüksektir. Araştırmacılar bunu UNX sonrasında gelişen kompansatuvar glomerüler hiperfiltrasyonla uyumlu bir bulgu olarak yorumlamaktadır.

Kemik biyomekaniği

20. günde femur mekanik özelliklerinde belirgin HSD–NSD farkı saptanmamıştır. 60. günde kırılma yükü ve ultimate yük düşmüş; 150. günde bu iki fark devam ederken stiffness, ultimate stress ve Young modülü de belirgin biçimde azalmıştır.

* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001.

Bu sonuçlar yalnız kemiğin “daha kolay kırılması” anlamına gelmez. 150 günlük HSD grubunda stiffness ve Young modülündeki düşüş, kemiğin hem yapısal hem malzeme düzeyindeki mekanik kalitesinin bozulduğunu desteklemektedir.

Kortikal mineral bileşimi

SEM-EDS analizi HSD'nin tibia kortikal kemiğindeki kalsiyum ve fosfor içeriğini 60 ve 150. günlerde azalttığını göstermiştir. Ca/P oranı 150. günde düşmüştür. Kortikal sodyum ve magnezyum içeriği ise incelenen zamanlarda değişmemiştir.

Bu mineral kaybı, biyomekanik bozulmayla aynı kronik zaman aralığında ortaya çıkmaktadır; ancak çalışmanın tasarımı mineral kaybının mekanik zayıflığın tek nedeni olduğunu doğrudan kanıtlamamaktadır.

Trabeküler mikro-mimari

Micro-CT bulguları yüksek tuz grubunda zamanla ilerleyen trabeküler bozulma göstermiştir:

• BV/TV 60 ve 150. günlerde azalmıştır.
• Tb.N 60 ve 150. günlerde azalmıştır.
• Tb.Sp 60 ve 150. günlerde artmıştır.
• Tb.Th 150. günde azalmıştır.

Bu yönlerin birlikte görülmesi trabeküler ağın hacimce azalması, seyrekleşmesi ve kronik dönemde daha ince trabeküller oluşmasıyla uyumludur.

20 günlük erken bağışıklık yanıtı

20. günde dalakta ana bağışıklık hücresi alt gruplarının genel frekansları büyük ölçüde korunmasına rağmen T hücrelerinin aktivasyon durumu değişmiştir.

Foxp3− CD4+ konvansiyonel T hücrelerinde ve CD8+ T hücrelerinde CD25, CD39 ve/veya PD-1 ekspresyonu yükselmiştir.

IL-17 üreten:

• Th17 hücreleri,
• Tc17 hücreleri

artmıştır. Splenik Treg frekansında azalma yönünde eğilim bulunmuş ve Th17/Treg oranı anlamlı biçimde yükselmiştir.

Kemik iliğinde de CD4+ ve CD8+ T hücresi aktivasyonu artmış; Th17 ve NK17 frekansları yükselmiştir. Kemik iliği Treg frekansı korunmuş, Th17/Treg oranında yükselme eğilimi görülmüştür.

60 günlük ara dönem

20. günde görülen erken inflamatuvar T hücresi değişiklikleri 60. günde artık belirgin değildir.

Dalakta aktive CD4+ ve CD8+ T hücreleri başlangıç düzeyine dönmüş; CD44+ efektör hücreler, Th17, Tc17 ve Th17/Treg oranı gruplar arasında benzer hale gelmiştir.

Kemik iliğinde de ana T hücresi aktivasyon ve IL-17 üreten alt grup farkları kaybolmuştur.

Bu normalleşme kemik hasarının da düzeldiği anlamına gelmemektedir. Tam tersine aynı 60 günlük zaman noktasında kırılma yükü, ultimate yük, kortikal mineral içeriği ve trabeküler mikro-mimari açısından bozulmalar belirginleşmektedir.

150 günlük geç bağışıklık yanıtı

150. günde dalak lökosit sayısı ve ana T hücresi popülasyonlarının genel frekansları tekrar benzerdir. Ancak aktivasyon/farklılaşma belirteçlerinde yön değişmiştir.

PD-1+ Tconv ve CD8+ T hücrelerinin frekansı azalmış; CD44+ efektör Tconv hücreleri düşmüştür. Kemik iliğinde de CD44+ efektör Tconv ve CD8+ T hücreleri azalmıştır.

Yazarlar bu sonucu kronik HSD altında T hücresi aktivasyonunun ve efektör farklılaşmasının baskılanmasına doğru geç dönem kayması olarak yorumlamaktadır.

Kaynak içi örneklem notu: Deney tasarımında 150 günlük NSD grubu 4 dişi + 4 erkek olarak verilmiştir. Buna karşılık kaynak Şekil 6 açıklamasında NSD için yalnız “n = 4 male” yazılmıştır; görsel lejantta dişi NSD sembolleri de bulunmaktadır. Bu nedenle Şekil 6'nın NSD örneklem açıklaması kaynak içinde eksik veya tutarsız görünmektedir. Verianla bu noktayı tahminle düzeltmemektedir.

Kemik–bağışıklık korelasyonları

Özellikle kemik iliği Th17/Treg oranı; BV/TV, Tb.Th ve Tb.N ile güçlü negatif, Tb.Sp ile güçlü pozitif korelasyon göstermiştir. Hem dalak hem kemik iliği Th17/Treg oranı kortikal kalsiyum ve fosfor içeriğiyle anlamlı negatif ilişkilidir.

Dalak BV/TV ve Tb.Th ilişkilerindeki korelasyon katsayıları çok yüksek negatif olmasına rağmen p değerleri 0,05'in üzerindedir. Kaynak 0,05–0,10 aralığını “trend” olarak tanımladığı için dalak BV/TV p = 0,0905 bu kategoriye girerken Tb.Th p = 0,1135 bu eşik dışında kalmaktadır.

Kan basıncı normale dönerken kemik neden bozulmaya devam etmiş olabilir?

Çalışmanın önemli gözlemlerinden biri, kronik kemik ve bağışıklık değişikliklerinin kalıcı hipertansiyon gerektirmemesidir. HSD grubunda erken sistolik basınç artışı geçici olmuş ve devam eden tuz maruziyetine rağmen daha sonra normale dönmüştür.

Buna karşılık calciuria, renal elektrolit değişiklikleri, kortikal mineral kaybı ve trabeküler bozulma devam etmiştir. Yazarlar sodyum-kalsiyum renal işlenmesi, doğrudan sodyum etkileri, hormonal adaptasyonlar ve bağışıklık mekanizmaları dahil birden fazla olası yol tartışmaktadır.

Ancak çalışma bu mekanizmalardan hangisinin kemik hasarına ne kadar katkı sağladığını ayrı ayrı deneysel olarak çözmemiştir.

Çalışmanın desteklediği sonuçlar

• UNX sonrasında kronik %4 NaCl diyeti farelerde zaman-bağımlı fizyolojik, kemik ve bağışıklık değişiklikleri oluşturmuştur.
• Sistolik kan basıncı erken dönemde geçici olarak yükselmiş, daha sonra normale dönmüştür.
• HSD boyunca su tüketimi ve idrar hacmi artmıştır.
• İdrar sodyum ve klor atılımı sürekli yüksek; kalsiyum, potasyum ve kreatinin atılımı özellikle 60 ve 150. günlerde daha yüksek bulunmuştur.
• Serum kalsiyum, fosfor ve PTH düzeyleri HSD ile belirgin biçimde değişmemiştir.
• Femur mekanik dayanımı kronik maruziyetle ilerleyici biçimde bozulmuştur.
• Kortikal kalsiyum ve fosfor içeriği 60 ve 150. günlerde azalmıştır.
• Tibial trabeküler mikro-mimari zamanla bozulmuştur.
• 20. günde proinflamatuvar T hücresi aktivasyonu ve Th17/Treg dengesizliği gelişmiştir.
• 60. günde erken T hücresi değişiklikleri büyük ölçüde normalleşmiştir.
• 150. günde efektör T hücresi aktivasyonu ve farklılaşması baskılanmış profile kaymıştır.
• Kemik iliği Th17/Treg oranı çeşitli trabeküler kemik parametreleriyle güçlü korelasyon göstermiştir.
• Diyet etkilerinde anlamlı sex × diet interaction saptanmaması, incelenen ana yanıtların iki cinsiyette genel olarak benzer yönde olduğunu desteklemektedir.

Çalışmanın desteklemediği sonuçlar

• Bu çalışma insanlarda yüksek tuz tüketiminin aynı etkileri oluşturduğunu kanıtlamaz.
• %4 NaCl fare diyeti tipik insan diyetindeki tuz düzeyine doğrudan eşitlenemez.
• UNX uygulanmış fare sonucu sağlıklı böbreklere sahip insanlara doğrudan genellenemez.
• Th17/Treg oranının kemik kaybının doğrudan nedeni olduğu kanıtlanmamıştır.
• SGK1, bağırsak mikrobiyotası veya glukokortikoid mekanizmaları bu deneyde doğrudan mekanistik neden olarak gösterilmemiştir.
• Kemik hasarının yalnız idrar kalsiyum kaybından kaynaklandığı gösterilmemiştir.
• Kalıcı hipertansiyon kemik bozulması için gerekli bulunmamıştır; ancak çalışma hipertansiyonun başka modellerdeki rolünü dışlamaz.
• Osteoklast ve osteoblast aktivitesi doğrudan ölçülmemiştir.
• Bu çalışma bir tedavi geliştirme veya insanlarda tuz azaltmanın kemik kırığı riskini ne kadar düşüreceğini ölçme çalışması değildir.

Güçlü yönler

Araştırmanın önemli güçlü yönü tek bir zaman noktasına dayanmamasıdır. 20, 60 ve 150 günlük zaman ekseni, erken inflamatuvar aktivasyonun geç dönemde aynı yönde devam etmediğini ortaya çıkarmıştır.

İkinci güçlü yön, kemik sağlığının yalnız tek ölçümle değerlendirilmemesidir. Çalışma aynı deneysel sistem içinde:

• biyokimyasal parametreleri,
• üç noktalı eğme biyomekaniğini,
• SEM-EDS mineral bileşimini,
• micro-CT trabeküler mikro-mimariyi,
• dalak ve kemik iliği bağışıklık fenotiplemesini

bir araya getirmiştir.

Üçüncü güçlü yön hem dişi hem erkek farelerin dahil edilmesi ve diyet etkisinin cinsiyetle etkileşiminin istatistiksel olarak kontrol edilmesidir.

Temel sınırlılıklar

Hayvan modeli: Bulgular murin modeline aittir ve klinik insan verisi değildir.

UNX modeli: Renal rezervin cerrahi olarak azaltılması insanlarda en sık görülen tuz duyarlılığı durumlarını tam yansıtmayabilir.

Yüksek deneysel tuz konsantrasyonu: %4 NaCl diyeti tipik insan tüketiminden çok yüksektir.

Küçük deney grupları: Çoğu özel analizde n yaklaşık 4–6/grup düzeyindedir ve tüm parametreler bütün farelerde ölçülmemiştir.

Korelasyon nedensellik değildir: Bağışıklık yeniden yapılanması ile kemik bozulmasının zaman içinde birlikte görülmesi, birinin diğerini doğrudan oluşturduğunu kanıtlamaz.

Osteoklast/osteoblast ölçümü eksik: Kemik remodeling hücrelerinin aktivitesi doğrudan değerlendirilmemiştir.

Mekanistik yollar tam test edilmemiştir: SGK1, microbiota–immune etkileşimleri, myeloid hücre alt grupları ve diğer olası yollar tartışılmış ancak doğrudan deneysel mekanizma zinciri kurulmamıştır.

Kaynak içi raporlama belirsizlikleri: Kreatinin klirensi formülündeki idrar kreatinini birim etiketi ve Şekil 6 NSD örneklem açıklaması sessizce düzeltilmeyecek kaynak-içi belirsizliklerdir.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün başlık: A Longitudinal Murine Model Reveals Biphasic T Cell Remodeling and Progressive Skeletal Deterioration Under Chronic High-Salt Exposure

Yazarlar: Constanza Quiroga; Santiago Boccardo; Camila M. S. Giménez; Daniela J. Porta; Mercedes Lombarte; Lucas R. Brun; Germán Tirao; Eva V. Acosta Rodríguez; María Angélica Rivoira.

Yazar sırası: Kaynakta yukarıdaki sırayla verilmiştir.

Eş katkı: Eva V. Acosta Rodríguez ve María Angélica Rivoira eşit katkıda bulunan yazarlar olarak işaretlenmiştir.

Sorumlu yazar: María Angélica Rivoira.

Sorumlu yazar e-posta: maria.angelica.rivoira@unc.edu.ar

Kurum 1: Instituto de Investigación en Ciencias de la Salud (INICSA), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, Universidad Nacional de Córdoba (CONICET-UNC), Córdoba, Argentina.

Kurum 2: Cátedra de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba, Córdoba, Argentina.

Kurum 3: Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI), CONICET-UNC, Córdoba, Argentina.

Kurum 4: Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba, Córdoba, Argentina.

Kurum 5: Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.

Kurum 6: Laboratorio de Biología Ósea, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Rosario, Rosario, Argentina.

Kurum 7: Instituto de Física Enrique Gaviola (IFEG), CONICET-UNC, Córdoba, Argentina.

Kurum 8: Facultad de Matemática, Astronomía, Física y Computación (FAMAF), Universidad Nacional de Córdoba, Córdoba, Argentina.

Dergi: Cells.

Yayınevi: MDPI.

Cilt / sayı / makale numarası: 15(9), 825.

DOI: 10.3390/cells15090825.

Gönderim: 2 Mart 2026.

Revizyon: 20 Nisan 2026.

Kabul: 24 Nisan 2026.

Yayın: 1 Mayıs 2026.

Academic Editor: Kin Hing William Lau.

Kaynak türü: Özgün araştırma makalesi; kontrollü preklinik hayvan deneyi.

Hakemlik: Cells hakemli bir dergidir; derginin güncel resmî politikası single-anonymized peer review sistemini ve hakemli aşamaya geçen çalışmalar için en az iki hakem raporunu belirtmektedir.

Lisans: Creative Commons Attribution 4.0 — CC BY 4.0.

Resmî yayın bağlantısı: MDPI Cells makale kaydı; DOI üzerinden erişilebilir.

Preprint: Bu bibliyografik doğrulamada aynı başlık için ayrı bir preprint kaydı tespit edilmemiştir.

Anahtar kelimeler: high-salt diet; bone deterioration; T cell activation; Th17/Treg balance; bone–immune crosstalk; mouse; unilateral nephrectomy.

Fareler: 7–10 haftalık dişi ve erkek C57BL/6J ve Foxp3-GFP.

Deneysel müdahale: Unilateral nefrektomi ardından 30 günlük iyileşme; daha sonra NSD (%0,2 NaCl) veya HSD (%4 NaCl).

Deney sonlanımları: 20, 60 ve 150 gün post-diet.

Toplam tasarım büyüklüğü: Kaynakta verilen altı grubun toplamı 60 fareye karşılık gelmektedir; ancak her deneysel analizde bütün hayvanlar kullanılmamıştır.

Mortalite: Diyet müdahalesi boyunca ölüm gözlenmemiştir.

Kan basıncı: CODA Noninvasive Blood Pressure System; ölçüm başına on kaydın ortalaması.

Biyokimya: Biosystems A25 spektrofotometrik otoanalizör; PTH için MicroVue Mouse PTH 1-84 EIA; idrar elektrolitleri için iyon-seçici elektrotlar.

Kemik biyomekaniği: Sağ femurda üç noktalı eğme; 200 N load cell; 8,5 mm support span; 0,01 mm/s displacement; 10 Hz acquisition.

Micro-CT: SkyScan 1173; kaynakta bildirilen voxel size 6 µm³; 60 kV; 133 µA; 500 ms integration; 0,2° rotation step; 1800 projection / 360°.

Micro-CT yazılımı: NRecon 1.7.3.2; Fiji 2.16.0/1.54p; BoneJ 7.0.20.

Mineral bileşimi: Tibial kortikal bölgede SEM-EDS; Sigma cihazı, Carl Zeiss.

Akış sitometrisi: LSRFortessa; analiz FlowJo X.0.7.

İstatistik: Shapiro–Wilk, two-way ANOVA, three-way ANOVA, repeated-measures ANOVA, t-testi, Mann–Whitney, pairwise correlation ve gerektiğinde ROUT outlier yöntemi.

Anlamlılık: p < 0,05; 0,05–0,10 kaynak tarafından trend olarak yorumlanmıştır.

İstatistik yazılımları: Stata 17.0 ve GraphPad Prism 9.0.

Güç analizi: Kaynağa göre n = 6, α = 0,05 altında Cohen's d = 2,02 büyüklüğündeki etki için 0,88 post hoc power sağlamıştır.

Temel bilimsel sonuç: Kronik HSD, ilerleyici kemik mineral, mikro-mimari ve biyomekanik bozulmayla birlikte erken proinflamatuvar ve geç baskılanmış T hücresi yanıtından oluşan iki fazlı bağışıklık yeniden yapılanması oluşturmuştur.

Nedensellik sınırı: Th17/Treg–kemik korelasyonları nedensel mekanizma kanıtı değildir.

İnsanlara aktarım sınırı: UNX uygulanmış fareler ve %4 NaCl diyeti insanlardaki tipik tuz tüketimini ve yaygın tuz duyarlılığı tablolarını doğrudan temsil etmez.

Etik kurul: Hayvan protokolü V-25/2022; CICUAL, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba; onay tarihi 1 Eylül 2022.

Finansman: Secretaría de Ciencia y Tecnología (SECyT)-Universidad Nacional de Córdoba, grant 33620230100180CB; ayrıca National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH, Award R01AI169482.

Veri erişilebilirliği: Veriler makul talep üzerine sorumlu yazardan temin edilebilir.

Çıkar çatışması: Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmektedir.

Yazar katkıları: Conceptualization: E.V.A.R., M.A.R.; data curation: C.Q., S.B., C.M.S.G., D.J.P., M.L.; formal analysis: C.Q., S.B., C.M.S.G., D.J.P.; funding acquisition: E.V.A.R., M.A.R.; investigation: C.Q., S.B., C.M.S.G., D.J.P., M.L., L.R.B., G.T., M.A.R.; methodology: S.B., L.R.B., G.T., E.V.A.R., M.A.R.; project administration: C.Q., E.V.A.R., M.A.R.; resources: L.R.B., G.T., E.V.A.R., M.A.R.; software: M.L.; supervision: E.V.A.R., M.A.R.; visualization: C.Q., S.B., C.M.S.G.; original draft: C.Q., S.B., E.V.A.R., M.A.R.; review/editing: C.Q., E.V.A.R., M.A.R.

Yapay zekâ kullanım bildirimi: Yazarlar ChatGPT v5.3'ün yalnız dilbilgisi, yazım ve İngilizce kullanımına yardımcı olmak için kullanıldığını; tüm önerilerin yazarlar tarafından açıklık, doğruluk ve yorum uygunluğu açısından eleştirel biçimde gözden geçirildiğini bildirmektedir.

Supplementary Materials: Deney tasarımı; 20 günlük dalak ve kemik iliği flow-cytometry gating/analizleri; 60 günlük bağışıklık sonuçları; 150 günlük dalak ve kemik iliği flow-cytometry analizleri; diet × sex ve time × diet × sex ANOVA tabloları.

Kaynak içi formül notu: Kreatinin klirensi formülünde idrar kreatinini “mg/24 h” olarak etiketlenmiştir. Bu ifade sessizce yeniden yorumlanmamıştır.

Kaynak içi şekil notu: Şekil 6 açıklamasındaki NSD örneklem ifadesi genel 150 günlük grup tanımı ve görsel sembollerle tam uyumlu görünmemektedir; kaynakta bulunmayan düzeltilmiş örneklem sayısı üretilmemiştir.