Kenevir tohumu protein hidrolizatı (hemp seed protein hydrolysates, HPH), kenevir tohumu proteinlerinin proteolitik enzimlerle daha küçük peptitlere parçalanmasıyla hazırlanan bir protein hidrolizatı materyalidir. Bu deneysel çalışma, flavourzyme ile hazırlanan HPH'nin erkek ve dişi Sprague-Dawley sıçanlarında tek doz ve 28 günlük tekrarlı oral uygulamadaki genel toksisitesini değerlendirmiştir. Tek dozda 2.000 ve 5.000 mg/kg, tekrarlı doz çalışmasında ise 500, 1.000 ve 2.000 mg/kg uygulanmıştır. Her iki çalışmada da ölüm gözlenmemiş; organ ağırlıkları, genel klinik durum ve temel biyokimyasal değerlendirmeler toksikolojik açıdan anlamlı bir olumsuzluk göstermemiştir. Tekrarlı doz çalışmasında karaciğer ve böbrek histolojisinde HPH'ye bağlanan patolojik lezyon saptanmamıştır.

Yazarların değerlendirmesine göre HPH için gözlenen olumsuz etki bulunmayan düzeyin (no-observed adverse effect level, NOAEL) tek uygulamada 5.000 mg/kg'ın, 28 günlük günlük uygulamada ise 2.000 mg/kg'ın üzerinde olduğu tahmin edilmiştir. Bununla birlikte çalışma bir sıçan toksisite deneyidir; sonuçlar insanlarda uzun dönem tüketim güvenliğini, allerjeniteyi veya sağlık fonksiyonel gıdası olarak klinik etkinliği kanıtlamaz. Kaynak özellikle 90 günlük tekrarlı doz ve genotoksisite çalışmalarının gelecekte yapılması gerektiğini belirtmektedir.

Araştırma problemi

Kenevir tohumu yaklaşık %25 protein içeren bir gıda hammaddesidir ve kenevir tohumu proteinlerinden enzimatik hidroliz yoluyla üretilen peptit karışımlarının antioksidan, antiinflamatuvar ve damar fonksiyonuyla ilişkili biyolojik etkileri önceki çalışmalarda araştırılmıştır. Ancak bir materyalin biyolojik aktivite göstermesi, oral kullanım için güvenli olduğunun otomatik kanıtı değildir. Protein kaynağı, kullanılan enzim, hidroliz derecesi, üretim koşulları ve oluşan peptit profili değiştikçe toksikolojik özelliklerin de ayrıca değerlendirilmesi gerekir.

Kaynak yazarların belirttiği literatür boşluğu, HPH için kemirgenlerde doğrudan tek doz ve tekrarlı doz genel toksisite verisinin bulunmamasıdır. Bu nedenle araştırma, belirli bir flavourzyme-temelli HPH preparatının sıçanlarda yüksek oral dozlara nasıl yanıt verdiğini incelemektedir.

Kenevir Tohumu Protein Hidrolizatı HPH Nedir?

Kenevir tohumu protein hidrolizatı (HPH), kenevir tohumu proteinlerinin enzimatik hidrolizle daha küçük peptit ve amino grupları içeren bir protein ürününe dönüştürülmesiyle hazırlanan materyaldir; bu çalışmadaki HPH, yağdan arındırılmış kenevir tohumu protein ekstraktının %2 flavourzyme ile 50°C'de 2 saat hidroliziyle hazırlanmıştır.

Çalışmadaki HPH nasıl üretildi?

1. Kabuğu alınmış Kanada kökenli kenevir tohumu kullanıldı.
2. Presleme yoluyla tohum yağı uzaklaştırıldı ve kalan küspe öğütüldü.
3. Defatted materyale ağırlığının 10 katı kadar distile su eklendi.
4. pH, 2 N NaOH ile 12,0'a ayarlandı.
5. Karışım 37°C'de 2 saat karıştırıldı.
6. 8.000×g, 4°C'de 30 dakika santrifüj edildi ve süpernatant alındı.
7. 2 N HCl ile pH 5,5'e ayarlanarak protein çöktürüldü ve yeniden santrifüj edildi.
8. Protein çökeltisi suda süspanse edilip pH 7,0'a getirildi ve liyofilize edildi.
9. Protein ekstraktı distile suyla 1:20 (w/v) oranında karıştırıldı.
10. 300 W ultrason ve 100°C ısıl işlem ayrı ayrı 15 dakika uygulandı.
11. Karışım 50°C'ye soğutuldu ve pH yeniden 7,0'a ayarlandı.
12. Substrat ağırlığının %2'si kadar flavourzyme eklenip 50°C'de 2 saat hidroliz yapıldı.
13. Enzim 90°C'de 20 dakika ısıtılarak inaktive edildi.
14. Ürün vakum filtrasyonu ve liyofilizasyon sonrasında deneylerde kullanıldı.

Kaynakta nihai HPH'nin protein içeriği yaklaşık %48,1 olarak bildirilmiştir. TNBS analiziyle raporlanan hidroliz ölçümü yaklaşık 40 μM leucine amino equivalent düzeyindedir; bu sonuç için ham veri makale içinde gösterilmemiştir.

Bu çalışma CBD veya THC toksisitesini mi inceliyor?

Hayır. Çalışmanın deney materyali kenevir tohumundan ekstrakte edilen ve enzimatik olarak hidrolize edilen protein fraksiyonudur. Araştırma CBD, THC veya başka bir saflaştırılmış cannabinoid preparatının toksisitesini değerlendirmemektedir. Kenevir bitkisiyle ilgili cannabinoid literatürü yalnız araştırmanın genel hammaddesel bağlamının bir parçasıdır.

Deney hayvanları ve bakım koşulları

Tek doz ve tekrarlı doz çalışmalarında dört haftalık erkek ve dişi Sprague-Dawley sıçanları kullanılmıştır. Hayvanlar deney başlamadan önce bir hafta ortama alıştırılmıştır.

5.000 mg/kg üst doz nasıl seçildi?

Ana tek doz deneyinden önce üç dişi SD sıçanına 5.000 mg/kg HPH verilmiş ve hayvanlar 14 gün izlenmiştir. Olağan dışı belirti veya ölüm görülmediği için araştırmacılar, OECD akut oral toksisite değerlendirmesinde kullanılan 2.000 mg/kg sınır dozunun üzerine çıkarak 5.000 mg/kg'ı ana tek doz çalışmasının en yüksek dozu olarak seçmiştir.

Tek doz çalışma tasarımı

28 günlük tekrarlı doz tasarımı

NOAEL Bu Çalışmada Ne Anlama Geliyor?

NOAEL, incelenen deney koşullarında test maddesine bağlanabilen olumsuz bir etkinin gözlenmediği en yüksek doz düzeyini ifade eder; bu çalışmada yazarlar tek dozda 5.000 mg/kg ve 28 günlük tekrarlı uygulamada 2.000 mg/kg düzeylerinde toksikolojik olarak olumsuz bir etki saptamadıkları için gerçek NOAEL'in test edilen bu üst dozların üzerinde olduğunu değerlendirmiştir.

“NOAEL >5.000 mg/kg” ifadesi 5.001 mg/kg'dan başlayarak bütün daha yüksek dozların güvenli olduğunun deneysel olarak kanıtlandığı anlamına gelmez. Çalışma yalnız 5.000 mg/kg'a kadar test etmiştir. Benzer biçimde 28 günlük çalışmada “NOAEL >2.000 mg/kg” ifadesinin deneysel dayanağı, 2.000 mg/kg'ın çalışmadaki en yüksek günlük doz olmasıdır.

NOAEL ayrıca doğrudan insan tüketim dozu değildir. Türler arası farmakokinetik, vücut yüzey alanı, maruziyet süresi, ürün standardizasyonu, alerjenite ve insan klinik verileri ayrı güvenlik değerlendirmesi gerektirir.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Klinik gözlem ve takip

OECD TG420 ve TG407 çerçevesi temel alınmıştır. İlk uygulama gününde hayvanlar uygulamadan sonraki dört saat boyunca yakından izlenmiş; daha sonra ölüm, davranış, hareketlilik, görünüm ve genel toksisite işaretleri en az günlük olarak takip edilmiştir.

Tek doz çalışmasında vücut ağırlığı üç günde bir, 28 günlük çalışmada haftalık ölçülmüştür. Yem tüketimi ve kuyruk veninden glukometre ile kan glukozu haftalık olarak kaydedilmiştir.

Nekropsi ve organ ağırlıkları

Hayvanlar nekropsiden önce en az sekiz saat aç bırakılmış, avertin olarak da bilinen 2,2,2-tribromoethanol ile anestezi uygulanmış ve kardiyak kan alınmıştır. Karaciğer, kalp, böbrek, akciğer, dalak, mide ve cinsiyete özgü üreme organları makroskopik olarak incelenmiş ve tartılmıştır.

Kan biyokimyası

Plazma 4°C'de 15.000×g hızında 20 dakika santrifüj sonrasında elde edilmiş ve Indiko Plus otomatik biyokimya analizörü kullanılmıştır.

Histopatoloji

28 günlük tekrarlı doz çalışmasının sonunda karaciğer ve böbrek örnekleri %10 formalinde fikse edilmiş, standart doku işleme ve parafin gömme sonrasında kesitler hazırlanmış, Hematoxylin & Eosin (H&E) ile boyanmış ve ışık mikroskobunda değerlendirilmiştir. Kaynak Figure 3 temsilî görüntüleri ×200 büyütmede göstermektedir.

İstatistiksel analiz

Sonuçlar ortalama±standart hata olarak raporlanmıştır. Gruplar arası karşılaştırmada R 4.0.4 üzerinde one-way ANOVA ve ardından Tukey HSD post hoc testi kullanılmıştır. İstatistiksel anlamlılık sınırı P<0,05 olarak belirlenmiştir.

Tek doz çalışmasında ölüm ve klinik toksisite

Kontrol, 2.000 mg/kg ve 5.000 mg/kg gruplarında erkek ve dişi hayvanların hiçbirinde 14 günlük izlem sırasında ölüm görülmemiştir. Table 1 bütün gruplarda her haftada 0 klinik toksisite belirtisi / 0 ölüm / 6 incelenen hayvan biçiminde raporlanmıştır.

Tek dozda vücut ağırlığı, yem ve glukoz

Figure 1A'da erkek 2.000 mg/kg grubunda 14. gün vücut ağırlığı kontrol grubuna göre daha düşük bulunmuştur (P<0,01). Aynı düşüş 5.000 mg/kg grubunda görülmediğinden dozla artan düzenli bir örüntü oluşturmamıştır.

Figure 1B'de yem tüketiminde, Figure 1C'de kan glukozunda HPH gruplarıyla kontrol arasında anlamlı fark bildirilmemiştir.

Tek dozda organ ağırlıkları

Karaciğer, kalp, akciğer, dalak, mide, böbrek ve cinsiyete özgü üreme organlarının göreli ağırlıklarında HPH'ye bağlanan anlamlı değişiklik görülmemiştir. Makroskopik organ incelemesinde de HPH ile ilişkili belirgin patolojik bulgu bildirilmemiştir.

Tek doz biyokimyasındaki BUN değişikliği

BUN düşüşü istatistiksel olarak anlamlı olmakla birlikte kaynakta kullanılan referans aralığın içinde kalmıştır. AST, ALT, ALP, albumin, ürik asit, total kolesterol ve trigliseritte anlamlı grup farkı raporlanmamıştır. Yazarlar BUN bulgusunu toksikolojik olumsuzluk olarak değerlendirmemiştir.

28 günlük çalışmada ölüm ve genel durum

500, 1.000 ve 2.000 mg/kg HPH'nin 28 gün boyunca günlük oral verilmesi sonucunda erkek veya dişi hayvanlarda ölüm görülmemiştir. Table 4 bütün gruplarda dört hafta boyunca 0/0/6 bildirmektedir.

28 günlük çalışmada vücut ağırlığı, yem ve glukoz

Figure 2A'da erkek ve dişi hayvanların vücut ağırlıkları arasında HPH'ye bağlanan anlamlı fark görülmemiştir. Figure 2B'de erkek HPH gruplarında dördüncü haftada yem tüketiminin kontrol grubuna göre düştüğü bildirilmiştir. Dişilerde aynı örüntü raporlanmamıştır.

Kan glukozu Figure 2C'de dört haftalık uygulama boyunca erkek ve dişi gruplar arasında anlamlı biçimde farklılaşmamıştır.

28 günlük çalışmada organ ağırlıkları

Table 5'te karaciğer, kalp, akciğer, dalak, mide, böbrek, adrenal bezler ve cinsiyete özgü üreme organlarının göreli ağırlıkları karşılaştırılmıştır. HPH gruplarıyla kontrol arasında toksikolojik olarak anlamlı organ ağırlığı değişimi raporlanmamıştır.

28 günlük biyokimyada ALP

ALP 500 ve 2.000 mg/kg gruplarında anlamlı biçimde düşük olmasına rağmen 1.000 mg/kg grubunda aynı farkın bulunmaması monoton bir doz-yanıt ilişkisi göstermemektedir. Kaynak, ALP değerlerinin erkek ve dişilerde kullanılan normal aralıklar içinde olduğunu belirtmektedir.

Tekrarlı doz çalışmasında AST, ALT, BUN, albumin, ürik asit, total kolesterol ve trigliserit açısından HPH'ye bağlanan anlamlı değişiklik bildirilmemiştir. Total kolesterolün HPH gruplarında bir miktar yükselme eğilimi göstermesine rağmen fark istatistiksel olarak anlamlı değildir.

İstatistiksel Olarak Anlamlı Bir Fark Her Zaman Toksisite Anlamına Gelir mi?

Hayır. Toksikolojik yorum yalnız P değerine dayanmaz; değişikliğin yönü, büyüklüğü, doz-yanıt ilişkisi, biyolojik referans aralığı, başka organ veya biyokimya göstergeleriyle tutarlılığı ve histopatolojik karşılığı birlikte değerlendirilir. Bu çalışmada tek doz erkek BUN düşüşü ile tekrarlı doz dişi ALP düşüşleri istatistiksel olarak anlamlı olsa da yazarlar normal aralık içinde kalmaları, tutarlı doz-yanıt göstermemeleri ve eşlik eden organ/histoloji toksisitesi bulunmaması nedeniyle bunları advers toksikolojik bulgu olarak değerlendirmemiştir.

Figure 3 histopatolojisi ne gösterdi?

Karaciğer ve böbreğin H&E kesitlerinde erkek ve dişi kontrol, 500, 1.000 ve 2.000 mg/kg grupları karşılaştırılmıştır. Kaynak; yağ dejenerasyonu, inflamasyon veya hücre nekrozu dahil HPH'ye bağlanabilecek patolojik lezyon bildirmemiştir.

Histopatoloji yalnız 28 günlük tekrarlı doz çalışmasındaki karaciğer ve böbrekle sınırlıdır. Bu nedenle “bütün dokularda mikroskobik değişiklik yoktur” biçiminde daha geniş bir sonuç çıkarılamaz.

Çalışmanın desteklediği sonuçlar

• İncelenen HPH preparatı tek dozda 5.000 mg/kg'a kadar ölüm oluşturmamıştır.
• İncelenen HPH preparatı 500, 1.000 ve 2.000 mg/kg dozlarda 28 günlük günlük oral uygulamada ölüm oluşturmamıştır.
• Organ ağırlıklarında HPH'ye bağlanan anlamlı değişim bildirilmemiştir.
• Tek dozda erkek 5.000 mg/kg grubunda BUN düşüşü görülmüş, ancak kaynak bunu toksikolojik adverse effect olarak yorumlamamıştır.
• 28 günlük çalışmada dişi 500 ve 2.000 mg/kg gruplarında ALP düşmüştür; değişim dozla monoton değildir ve normal aralık içinde değerlendirilmiştir.
• 28 günlük çalışmada karaciğer ve böbrek histolojisinde HPH'ye bağlanan patolojik lezyon görülmemiştir.
• Yazarların değerlendirmesine göre NOAEL tek dozda 5.000 mg/kg'ın, 28 günlük tekrarlı uygulamada 2.000 mg/kg'ın üzerindedir.

Çalışmanın desteklemediği sonuçlar

• HPH'nin insanlarda güvenli olduğu bu deneyle kanıtlanmamıştır.
• HPH'nin uzun dönem veya yaşam boyu tüketim güvenliği gösterilmemiştir.
• 90 günlük subkronik toksisite değerlendirilmemiştir.
• Genotoksisite değerlendirilmemiştir.
• Bu çalışma allerjenite testi değildir.
• HPH'nin sağlık fonksiyonel gıdası olarak klinik etkinliği test edilmemiştir.
• Çalışma CBD veya THC güvenliğini değerlendirmemektedir.
• NOAEL değerleri doğrudan insan tüketim dozu olarak kullanılamaz.

Bu Sonuçlar HPH'nin İnsanlarda Güvenli Olduğunu Kanıtlıyor mu?

Hayır. Bu çalışma belirli üretim koşullarında hazırlanmış HPH'nin Sprague-Dawley sıçanlarında 14 günlük tek doz ve 28 günlük tekrarlı oral maruziyet altındaki genel toksisite profilini değerlendirir; insanlarda kronik tüketim, allerjenite, uzun dönem toksisite veya klinik güvenlik için ayrı çalışmalar gerekir.

Çalışmanın yöntemsel sınırları

Birinci sınır maruziyet süresidir. Tek doz çalışmasının izlem süresi 14 gün, tekrarlı doz çalışmasının süresi 28 gündür. Kaynak yazarları daha uzun dönem güvenlik için 90 günlük tekrarlı doz toksisite araştırmasını gerekli görmektedir.

İkinci sınır toksisite kapsamıdır. Araştırma genel klinik gözlem, vücut ağırlığı, yem tüketimi, glukoz, organ ağırlıkları, sınırlı biyokimya paneli ve karaciğer/böbrek histolojisine odaklanmıştır. Genotoksisite bu çalışmada test edilmemiştir.

Üçüncü sınır türler arası genellemedir. SD sıçanında tolerans gösterilen bir mg/kg dozun insandaki eşdeğeri doğrudan aynı sayı değildir. İnsan güvenlik değerlendirmesi için ayrıca maruziyet, ürün standardizasyonu, sindirim, metabolizma ve klinik veriler gerekir.

Dördüncü sınır preparat özgüllüğüdür. Çalışmanın sonuçları; bu araştırmada kullanılan kenevir tohumu, ekstraksiyon süreci, flavourzyme oranı, hidroliz süresi ve ürün bileşimine bağlı HPH preparatına aittir. Farklı üretim süreçleriyle hazırlanan bütün kenevir protein hidrolizatlarının özdeş toksisite profiline sahip olduğu varsayılamaz.

Gelecek araştırma gereksinimi

Kaynak yazarlar 90 günlük tekrarlı doz toksisitesi ve genotoksisite testlerini sonraki güvenlik adımları arasında göstermektedir. Ayrıca HPH'nin farklı üretim koşulları altında standardizasyonu, biyolojik aktivitesi ve güvenliğinin birlikte doğrulanması gerektiğini vurgulamaktadır.

Bu nedenle mevcut çalışma sağlık fonksiyonel gıda geliştirme zincirinde nihai insan güvenlik belgesi değil, hayvan toksikolojisine ilişkin bir başlangıç güvenlik veri katmanı olarak değerlendirilmelidir.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün çalışma: Single- and Repeated-Dose Toxicity Study of Hemp Seed Protein Hydrolysates

Korece özgün başlık: Hemp Seed 단백가수분해물의 단회 및 반복투여 독성 평가

Yazarlar: Junho Nam; Jae Jung Lee; Yoon Jeong Lee; Ju Hee Kim; Jun Ho Kim.

Sorumlu yazar: Jun Ho Kim.

Kurumlar: Department of Food Science and Biotechnology, Gyeongkuk National University; Milepost Co., Ltd.

Dergi: Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition / 한국식품영양과학회지.

Yayımlayan kuruluş: The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Cilt / sayı / sayfalar: 55(1), 49–56.

Yıl: 2026.

DOI: 10.3746/jkfn.2026.55.1.49.

Received: 16 Ekim 2025.

Revised: 11 Kasım 2025.

Accepted: 14 Kasım 2025.

Kaynak türü: Deneysel in vivo hayvan toksisite araştırması.

Lisans: Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 (CC BY-NC 4.0).

Ana test maddesi: Hemp seed protein hydrolysates (HPH).

HPH enzimi: Flavourzyme; substrat ağırlığının %2'si.

Hidroliz koşulu: 50°C, 2 saat, pH 7,0.

HPH protein içeriği: Yaklaşık %48,1.

Hayvan modeli: Erkek ve dişi Sprague-Dawley sıçanları.

Tek doz: 2.000 ve 5.000 mg/kg; tek oral uygulama; 14 günlük izlem.

Tekrarlı doz: 500, 1.000 ve 2.000 mg/kg; günlük oral uygulama; 28 gün.

Grup büyüklüğü: Ana deneylerde her cinsiyet ve doz grubu için n=6.

Ön doz çalışması: 5.000 mg/kg; dişi sıçanlarda n=3; 14 gün.

Klinik takip: Genel durum, toksisite belirtisi, hareketlilik, görünüm ve ölüm.

Ek takip: Vücut ağırlığı, yem tüketimi ve kan glukozu.

Biyokimya: AST, ALT, ALP, BUN, albumin, ürik asit, total kolesterol ve trigliserit.

Histopatoloji: 28 günlük çalışmada karaciğer ve böbrek; H&E; ×200 temsilî görüntüler.

İstatistik: R 4.0.4; one-way ANOVA; Tukey HSD; P<0,05.

Etik kurul: Gyeongkuk National University Animal Experiment Ethics Committee; onay no. 2025-2-0527-02-01.

Tek doz ana sonuç: Ölüm veya toksikolojik olarak anlamlı genel olumsuz etki görülmemiştir; yazarların değerlendirmesine göre NOAEL >5.000 mg/kg.

28 günlük ana sonuç: Ölüm, organ ağırlığı toksisitesi veya karaciğer/böbrek histopatolojik lezyonu görülmemiştir; yazarların değerlendirmesine göre NOAEL >2.000 mg/kg.

Finansman: 2025 Ministry of Education ve Gyeongsangbuk-do kaynaklarıyla Gyeongbuk RISE Center, Regional Innovation System & Education; B0080529001944.

Veri erişilebilirliği: Kaynak PDF'de ayrı bir Data Availability Statement bulunmamaktadır.

Çıkar çatışması: Kaynak PDF'de ayrı bir Conflict of Interest beyanı bulunmamaktadır; yokluğu varsayılmamıştır.

Yazar katkıları: Kaynak PDF'de ayrı bir CRediT/yazar katkısı bölümü bulunmamaktadır.

Temel yorum sınırı: Sonuçlar belirli bir HPH preparatının sıçanlardaki kısa süreli ve 28 günlük genel toksisite değerlendirmesine aittir; insan tüketim güvenliği veya uzun dönem güvenlik kanıtı değildir.