Уропатогендик Escherichia coli (uropathogenic Escherichia coli, UPEC) — заара чыгаруучу жолдордун инфекциялары менен байланышкан E. coli штаммдарын билдирген бактериялык топ. Бул кесилиштик изилдөө кайталануучу заара чыгаруучу жолдордун инфекциясынын тарыхын билдирген 80 катышуучуда семирүү менен байланышкан ээ организмдин сезгенүүсүн, IL6R rs2228145 генетикалык вариациясын жана заарадагы бактериялык өзгөчөлүктөрдү бир эле изилдөө алкагында баалаган. Кырк катышуучу семирүү тобунда, 40 катышуучу нормалдуу салмактагы салыштыруу тобунда болгон. Кан үлгүлөрүндө IL-6 жана эригич IL-6 рецептору (sIL-6R) ELISA менен өлчөнүп, IL6R rs2228145 TaqMan генотиптөөсү менен аныкталган; заара үлгүлөрүндө культура жана 16S rRNA, fimH жана papG бутага алынган qPCR жүргүзүлүп, тандалган эки UPEC изолятында бүтүндөй геномдук секвенирлөө аткарылган.
Семирүү тобунда 4PL калибрлөөсү менен бааланган орточо IL-6 деңгээли 28,04 ± 3,37 ng/L болсо, нормалдуу салмак тобунда 18,43 ± 1,41 ng/L болгон. Орточо айырма 9,61 ng/L болуп, %95 ишеним аралыгы 8,45–10,77 ng/L деп эсептелген. sIL-6R деңгээлдери да семирүү тобунда жогору болгон: 39,87 ± 9,15 ng/mLге каршы 33,69 ± 8,44 ng/mL. Бирок IL6R rs2228145 үчүн AA, AC жана CC генотиптеринин бөлүштүрүлүшү эки BMI тобунун ортосунда маанилүү айырма көрсөткөн эмес.
Генотип–биомаркер байланыштары чалгындоочу анализдер болуп саналат. BMI тобу моделге киргизилгенде ар бир кошумча C аллели үчүн болжолдонгон IL-6 деңгээлинде 1,06 эсе жана sIL-6R деңгээлинде 1,34 эсе өзгөрүү билдирилген. Бул көрсөткүчтөр тиешелүүлүгүнө жараша болжол менен %6 жана %34 көбөймө өсүүгө туура келет; бирок тиешелүү моделдер кошумча клиникалык ковариаттарды камтыган эмес жана бул чалгындоочу p маанилери көп жолу салыштыруу үчүн оңдолгон эмес. Жыйынтыктар генетикалык вариант биомаркер деңгээлдерине себеп болот деп өз алдынча далилдебейт.
Заара культураларында 37/80 үлгү UPEC катары классификацияланган. Башка культура жыйынтыктары 10 Klebsiella pneumoniae, 6 Proteus mirabilis, 4 Enterococcus faecalis, 3 Staphylococcus saprophyticus жана маанилүү бактериялык өсүү болбогон 20 үлгүдөн турган. UPEC-оң 37 үлгүдө fimH 33/37, papG 18/37 катышында qPCR менен табылган.
Бүтүндөй геномдук секвенирлөө тандалган эки UPEC изолятында гана жүргүзүлгөн. UPEC1 ST127/O6:H31, ал эми UPEC2 ST131/O25:H4 деп аныкталган. Эки геномдо тең fimH үчүн талапка жооп берген WGS дал келүүсү табылган, ал эми papG WGS босоголоруна UPEC2де гана жооп берген. Ошол эле учурда тандалган эки үлгү тең qPCRда papG-оң болгондуктан qPCR менен WGS ортосунда UPEC1 боюнча чечилбеген дал келбестик бар.
Изилдөөнүн негизги чечмелөө чеги маанилүү: бир эле катышуучуларда сезгенүү биомаркерлеринин, генотиптин жана бактериялык өзгөчөлүктөрдүн бирге өлчөнүшү бул элементтердин ортосунда түз себептик ээ организм–патоген механизмин далилдебейт. Мындан тышкары, “кайталануучу ЗЖИ” тарыхы билдирилгени менен мурдагы инфекциялардын даталары жана диагностикалык документтери жок болгондуктан изилдөөчүлөр бул тарых белгилүү бир стандарттык кайталануу аныктамасына жооп берер-бербесин ырастай алышкан эмес.
Изилдөө караган негизги маселе эмне?
Семирүү төмөн деңгээлдеги системалык сезгенүү менен байланышкан метаболизмдик абал. IL-6 сыяктуу цитокиндердин кан айлануудагы деңгээлдерине ушул сезгенүү чөйрөсү таасир этиши мүмкүн. Экинчи жагынан, заара чыгаруучу жолдордун инфекцияларында UPEC адгезия, темирди алуу, иммундук системадан качуу, токсин өндүрүү, клетка ичинде жашоо жана биофильм түзүү сыяктуу ар түрдүү өзгөчөлүктөр аркылуу заара чыгаруу системасында инфекцияны пайда кылышы же улантышы мүмкүн.
Бул изилдөө бир эле үлгүнүн ичинде эки башка биологиялык катмарды катар коёт: бир тарапта адам ээ организмдин IL-6/sIL-6R сезгенүү огу жана IL6R rs2228145 генотиби, экинчи тарапта заарадагы бактериялардын культурасы, адгезин генинин qPCRы жана тандалган геномдордун WGS профили бар.
Бул интеграцияланган мамиленин максаты бул катмарлардын кайсы бири экинчисинин себеби экенин көрсөтүү эмес; семирүү жана билдирилген кайталануучу ЗЖИ контекстинде алардын бирге кандай бөлүштүрүлгөнүн сүрөттөө.
Бул Изилдөө Семирүү менен Кайталануучу Заара Чыгаруучу Жолдордун Инфекциясынын Ортосунда Себептик Байланыш Түзөбү?
Жок. Изилдөө кесилиштик болгондуктан, мурдагы ЗЖИ эпизоддорунун даталары жана диагностикалык жазуулары ырасталбагандыктан жана сезгенүү, генотип менен бактериялык өзгөчөлүктөр бир эле убакыт алкагында байкоо иретинде өлчөнгөндүктөн, семирүү IL-6 аркылуу UPEC вируленттүүлүгүнө же кайталануучу ЗЖИге себеп болот деп көрсөтпөйт; авторлор жыйынтык бөлүмүндө да бул маалыматтар семирүү, ээ организмдин сезгенүүсү жана кайталануучу ЗЖИ ортосунда себептик байланыш түзбөй турганын ачык белгилешет.
Катышуучулардын топтору кантип түзүлгөн?
Жалпы 80 катышуучу 19–66 жаш аралыгында; 66сы аял, 14ү эркек. Семирүү тобу BMI ≥ 30 kg/m² болгон 40 адамдан, нормалдуу салмак тобу BMI 18,5–24,9 kg/m² болгон 40 адамдан турган.
Катталган ЗЖИ тарыхы экиден алты эпизодго чейин өзгөргөн. Бирок изилдөө бул эпизоддор кайсы убакыт аралыгында болгонун аныктай албайт. Эпизоддордун даталары жана диагностикалык документтери жок болгондуктан “кайталануучу ЗЖИ” тарыхы белгилүү бир клиникалык кайталануу аныктамасына жооп бергени ырасталган эмес.
IL-6 жана sIL-6R эмнени билдирет?
Интерлейкин-6 (IL-6) — сезгенүү жана иммундук жооптор менен байланышкан цитокин. Эригич IL-6 рецептору (soluble IL-6 receptor, sIL-6R) — IL-6нын мембранага байланышкан рецептордон тышкаркы транс-сигнал берүү жолунда роль ойной алган кан айлануучу рецептор формасы.
Изилдөө бул окту семирүү менен байланышкан сезгенүү чөйрөсүн сандык жактан мүнөздөө үчүн өлчөгөн. Бирок IL-6 же sIL-6Rдин жогору болушу өз алдынча заара чыгаруучу жолдордун инфекциясынын себеби, оордугу же кайталануу механизми катары чечмеленбейт.
IL6R rs2228145 деген эмне?
IL6R rs2228145 — IL-6 рецепторун коддогон IL6R генинин ичиндеги генетикалык вариант. Изилдөөдө аллелдер A жана C, ал эми генотиптер AA, AC жана CC катары классификацияланган.
Генотиптөө TaqMan ыкмасы менен жүргүзүлгөн. Ар бир 20 µL реакцияда 10 µL 2× TaqMan Genotyping Master Mix, 0,5 µL 20× assay working solution, 6,5 µL нуклеазасыз суу жана 3 µL DNA колдонулган. Термикалык профиль 95 °Cде 10 мүнөт; андан кийин 40 цикл бою 95 °Cде 15 секунд жана 60 °Cде 1 мүнөт болуп колдонулган.
AA, AC жана CC генотиптеринин бөлүштүрүлүшү эмнени көрсөттү?
| Генотип / аллел | Семирүү тобу | Нормалдуу салмак тобу | Odds ratio (%95 ИА) | p мааниси |
|---|---|---|---|---|
| AA | 15 (%37,5) | 16 (%40,0) | Референс | Референс |
| AC | 16 (%40,0) | 18 (%45,0) | 0,95 (0,36–2,51) | 1,000 |
| CC | 9 (%22,5) | 6 (%15,0) | 1,60 (0,46–5,59) | 0,539 |
| C аллели | 34/80 (%42,5) | 30/80 (%37,5) | 1,23 (0,65–2,32) | 0,628 |
Бул жыйынтыктар rs2228145 генотипинин же C аллелинин жыштыгы семирүү жана нормалдуу салмак топторунун ортосунда маанилүү айырмаланганын көрсөткөн эмес.
Hardy–Weinberg тең салмактуулугу эмне үчүн текшерилди?
Hardy–Weinberg equilibrium (HWE) — популяциядагы аллел жана генотип жыштыктарынын ортосундагы күтүлгөн байланышты баалаган генетикалык тең салмактуулук модели. Изилдөөдө HWE семирүү жана нормалдуу салмак топторунда өз-өзүнчө хи-квадрат тести менен бааланган.
| Топ | AA байкалган / күтүлгөн | AC байкалган / күтүлгөн | CC байкалган / күтүлгөн | χ² | p |
|---|---|---|---|---|---|
| Семирүү | 15 / 13,2 | 16 / 19,6 | 9 / 7,2 | 1,319 | 0,251 |
| Нормалдуу салмак | 16 / 15,6 | 18 / 18,8 | 6 / 5,6 | 0,064 | 0,800 |
Эки топто тең статистикалык жактан маанилүү HWE четтөөсү байкалган эмес. Бирок макалада да белгиленгендей, HWE тести өз алдынча генотиптөөнүн техникалык тууралыгын далилдебейт.
IL-6 Өлчөөсүндөгү 4PL Модели Эмне Үчүн Маанилүү?
IL-6 концентрациялары түзмөк түздөн-түз берген сандар эмес; 450 nmде өлчөнгөн оптикалык тыгыздык маанилери алты калибрлөө стандартына ылайыкташтырылган салмакталбаган төрт параметрлүү логистикалык ийри аркылуу концентрацияга айландырылган жана өзгөчө төмөн концентрация аймагында жыйынтыктар тандалган калибрлөө ыкмасына сезимтал болгондуктан 4PL өзгөртүүсүндөгү белгисиздик негизги жыйынтыктарды туура чечмелөө үчүн маанилүү.
IL-6 үчүн колдонулган стандарттар
| IL-6 стандарты (ng/L) | Орточо чийки OD450 |
|---|---|
| 0 | 0,185 |
| 20 | 0,276 |
| 40 | 0,512 |
| 80 | 0,918 |
| 160 | 1,537 |
| 320 | 2,169 |
Төрт параметрлүү логистикалык теңдеме
Формула эмнени эсептейт? Бул теңдеме IL-6 концентрациясы менен ELISA оптикалык тыгыздыгынын ортосундагы сигмоидалдык калибрлөө байланышын сүрөттөйт.
Өзгөрмөлөр: OD — 450 nmдеги чийки абсорбанс/оптикалык тыгыздык мааниси. C — IL-6 концентрациясы жана ng/L бирдигинде берилет. a төмөнкү асимптотаны, d жогорку асимптотаны, b ийринин формасын аныктоочу параметрди, k болсо орто чекит концентрациясын билдирет.
Математикалык ролу: C өтө төмөн болгондо ийри төмөнкү асимптотага, C көбөйгөн сайын жогорку асимптотага жакындайт. k жана b өтүү аймагынын жайгашуусун жана тиктигин аныктайт.
Изилдөөдө үлгүнүн OD маанисинен концентрацияга өтүү үчүн теңдеме тескери түргө келтирилген:
Бул тескери теңдеме өлчөнгөн OD маанисинен болжолдуу IL-6 концентрациясын чыгарат. Булак алты стандарттын баарын салмактабастан fit кылган; стандарттарды жана үлгүлөрдү бир эле assay run ичинде өлчөгөн; кошумча blank subtraction колдонгон эмес. Репликат деңгээлиндеги дисперсиялар жок болгондуктан калибрлөөдө салмактоо жүргүзүлгөн эмес.
20 ng/L сызыгы эмне үчүн сандык аныктоо чеги эмес?
Булак графиктеринде 20 ng/L биринчи нөлдөн башка стандарт катары белгиленген. Бул маани изилдөөдө тастыкталган lower limit of quantification (LLOQ) катары аныкталган эмес.
4PL эсептөөсүндө нормалдуу салмак тобундагы 40 катышуучунун 34үнүн болжолдуу IL-6 мааниси 20 ng/Lден төмөн болгон. Бирок нормалдуу салмактагы алты үлгүнүн гана чийки OD мааниси 20 ng/L стандартынын өлчөнгөн OD мааниси болгон 0,276дан төмөн. Бул эки сандын айырмаланышы fitted 4PL ийри калибрлөө чекитинен так өтүүгө милдеттүү эместиги менен түшүндүрүлөт.
Альтернативдүү калибрлөө ыкмалары эмнени көрсөттү?
| Калибрлөө ыкмасы | Семирүү тобунун орточосу (ng/L) | Нормалдуу салмак тобунун орточосу (ng/L) |
|---|---|---|
| 4PL | 28,04 | 18,43 |
| Тескери кубдук | 27,01 | 16,56 |
| Жергиликтүү сызыктуу интерполяция | 28,63 | 20,87 |
Альтернативдүү өзгөртүүлөрдө да топтордун ортосунда айырма көрүнөт; бирок абсолюттук концентрациянын баалары өзгөрөт. Бул анализ өлчөөнүн тактыгын далилдебейт, болгону жыйынтыктардын калибрлөө моделине канчалык сезимтал экенин көрсөтөт.
sIL-6R үчүн колдонулган өзгөртүү
sIL-6R өлчөөсү Human Soluble Interleukin 6 Receptor ELISA E0226Hu комплекти менен жүргүзүлгөн. Булак комплект үчүн 0,5–150 ng/mL assay диапазонун, 0,24 ng/mL сезимталдыкты жана 0, 5, 10, 20, 40 жана 80 ng/mL жумушчу стандарттарды билдирет.
Бул үчүнчү даражадагы теңдеме OD450 маанисин sIL-6R концентрациясына айландыруу үчүн колдонулган. Коэффициенттер бул калибрлөө байланышынын эмпирикалык коэффициенттери; изилдөө бул теңдемени жаңы биологиялык механизм катары баалабайт.
Семирүү жана нормалдуу салмак топторундагы биомаркер жыйынтыктары
| Биомаркер | Семирүү | Нормалдуу салмак | Орточо айырма (%95 ИА) | Таасир өлчөмү | Көп тесттен кийинки p |
|---|---|---|---|---|---|
| IL-6, 4PL баасы | 28,04 ± 3,37 ng/L; медиана 28,42 | 18,43 ± 1,41 ng/L; медиана 18,44 | 9,61 ng/L (8,45–10,77) | Hedges g = 3,683 | 2,20 × 10−21 |
| sIL-6R | 39,87 ± 9,15 ng/mL; медиана 38,02 | 33,69 ± 8,44 ng/mL; медиана 33,66 | 6,18 ng/mL (2,26–10,10) | Hedges g = 0,695 | 0,011196 |
IL-6 үчүн чийки Welch p мааниси 1,57 × 10−22, sIL-6R үчүн 0,002399. Benjamini–Hochberg оңдоосунан кийин эки салыштыруу тең булакта статистикалык жактан маанилүү бойдон калган.
Hedges g эмнени билдирет?
Hedges g — эки топтун орточо маанилеринин айырмасын жалпы өзгөрмөлүүлүк шкаласында стандартташтырган жана үлгү көлөмү үчүн оңдоону камтыган таасир өлчөмү. Бул жерде IL-6 үчүн g = 3,683, sIL-6R үчүн g = 0,695 билдирилген. Бул маанилер p маанисинен башка суроого жооп берет: p мааниси байкалган айырманын статистикалык шайкештигин, Hedges g болсо айырманын стандартташтырылган чоңдугун билдирет.
Генотип менен биомаркер деңгээлдеринин ортосунда эмне табылды?
| Анализ | Сүрөттөөчү жыйынтык | Таасир баасы | Статистикалык чечмелөө |
|---|---|---|---|
| IL-6 жана генотип | AA: 19,70 [18,10–26,06]; AC: 20,76 [18,62–27,99]; CC: 28,73 [19,07–31,68] ng/L | Ар бир кошумча C аллели үчүн 1,06 эсе (%95 ИА 1,03–1,09) | Kruskal–Wallis p = 0,051; BMIге ылайыкташтырылган доза модели p < 0,001; чалгындоочу |
| sIL-6R жана генотип | AA: 28,43 ± 4,13; AC: 37,89 ± 4,47; CC: 51,51 ± 3,56 ng/mL | Ар бир кошумча C аллели үчүн 1,34 эсе (%95 ИА 1,30–1,38) | Kruskal–Wallis p < 0,001; BMIге ылайыкташтырылган доза модели p < 0,001; чалгындоочу |
| IL-6 менен sIL-6R | 80 жупташкан өлчөө | Spearman ρ = 0,512 | p < 0,001; оң корреляция, себептик таасир эмес |
IL-6 үчүн бардык генотиптерди бирге салыштырган Kruskal–Wallis тести p = 0,051 менен 0,05 деңгээлинде маанилүү эмес. Бирок BMI тобу менен C аллелинин дозасын бир эле лог-сызыктуу моделге киргизген анализ оң байланыш тапкан. Бул эки тест ар башка суроолорду жана ар башка моделдик божомолдорду баалагандыктан жыйынтыктарды “бири экинчисин жокко чыгарат” деп чечмелөө туура эмес.
Булакта генотип–биомаркер анализдери чалгындоочу деп аныкталган. Бул p маанилери көп жолу салыштыруу үчүн оңдолгон эмес жана лог-сызыктуу модель BMI тобунан башка кошумча клиникалык ковариаттарды камтыбайт.
Benjamini–Hochberg оңдоосу эмне үчүн колдонулган?
Изилдөөдө көп сандагы гипотеза тесттери жүргүзүлгөндө кокустуктан улам төмөн p маанилерин көрүү ыктымалдыгы жогорулайт. Benjamini–Hochberg ыкмасы көп тесттердин ичинде жалган ачылыш үлүшүн көзөмөлдөөгө багытталган оңдоо.
Булак бул оңдоону алдын ала белгиленген 14 тестке колдонгон: төрт BMI топ салыштыруусу, генотип жана аллел бөлүштүрүү тесттери, үч UPEC абалынын салыштыруусу, жаш–эпизод корреляциясы жана WGS тандоосуна байланыштуу төрт салыштыруу. HWE, pairwise Fisher жана генотип–биомаркер анализдери болсо чалгындоочу бойдон калтырылып, бул 14 тесттик оңдоо үй-бүлөсүнө киргизилген эмес.
UPEC культурасынын жыйынтыктары
| Культура классы | n | Үлүш |
|---|---|---|
| UPEC / E. coli | 37 | %46,2 |
| Маанилүү бактериялык өсүү жок | 20 | %25,0 |
| Klebsiella pneumoniae | 10 | %12,5 |
| Proteus mirabilis | 6 | %7,5 |
| Enterococcus faecalis | 4 | %5,0 |
| Staphylococcus saprophyticus | 3 | %3,8 |
UPEC-оң топтун жаш курак бөлүштүрүлүшү жашыраак болгон. UPEC-оң катышуучулардын жашы 37,16 ± 11,70 жыл болсо, башка организм же маанилүү өсүү болбогон топтун медианалык жашы 46,00 [35,50–58,50] жыл. Жашты салыштырууда чийки p = 0,004, Benjamini–Hochberg менен оңдолгон p = 0,013 жана Cliff delta = −0,379 билдирилген.
Жыныстын бөлүштүрүлүшү жана билдирилген кайталануучу ЗЖИ эпизоддорунун саны боюнча булакта көп тесттен кийин маанилүү айырма табылган эмес. Эпизод саны үчүн оңдолгон p = 0,734; жыныс бөлүштүрүлүшү үчүн 0,839.
fimH жана papG эмнени билдирет?
fimH жана papG — UPECтин адгезия менен байланышкан түзүлүштөрүн мүнөздөө үчүн бутага алынган гендер. Изилдөөдө бул DNA буталарынын qPCR менен табылышы тиешелүү бута тизмеги үлгүдө амплификацияланганын көрсөтөт.
Мунун маанилүү чеги мындай: ген тизмегинин табылышы тиешелүү адгезин белогу чындап экспрессияланганын же бактерия белгилүү бир адгезия функциясын аткарганын түздөн-түз далилдебейт.
| Профиль | n | UPEC ичиндеги үлүш |
|---|---|---|
| fimH+ / papG− | 18 | %48,6 |
| fimH+ / papG+ | 15 | %40,5 |
| fimH− / papG+ | 3 | %8,1 |
| fimH− / papG− | 1 | %2,7 |
Жалпысынан fimH 33/37, papG 18/37 UPEC үлгүсүндө qPCR менен табылган.
qPCRдагы Ct мааниси эмнени билдирет?
Ct — реалдуу убакыттагы PCRда флуоресценция сигналы белгиленген босогодон өткөн циклдердин санын билдирет. Бирдей assay шарттарында жана бир эле бута ичинде Ct маанилери амплификация сигналы канчалык эрте пайда болгонун сүрөттөө үчүн колдонулушу мүмкүн.
Бирок бул изилдөө 16S, fimH жана papG Ct маанилерин ген экспрессиясына, гендин абсолюттук көчүрмө санына же бактериялык жүккө айландырган эмес. Ар башка буталардын Ct маанилеринин ортосундагы айырмалар да бактериялык жүк же экспрессия айырмасы катары чечмеленген эмес. Мындан тышкары, “ND” qPCRда амплификация табылбаганын билдирет; биологиялык жактан ген такыр жок экенин далилдебейт.
qPCR менен WGSтеги papG Жыйынтыктары Эмне Үчүн Бирдей Болгон Эмес?
Тандалган эки UPEC үлгүсү qPCRда fimH жана papG боюнча тең оң болгон учурда, WGS негизиндеги гомологдук скрининг fimHти эки геномдо, papGни болсо UPEC2де гана босогодон жогору дал келүү катары тапкан; булак UPEC1деги бул дал келбестикти чечилген ката катары чечмелебейт жана assay өзгөчөлүгү, тизмек вариациясы, аралаш template же assembly чектөөсүн мүмкүн болгон түшүндүрмөлөр катары гана санайт.
“No qualifying hit” эмне үчүн “ген жок” дегенди билдирбейт?
WGS вируленттүүлүк скринингинде ABRicate дал келүүсү талапка жооп берет деп эсептелиши үчүн кеминде %80 нуклеотиддик окшоштук жана кеминде %80 референс камтуу талап кылынган. Бул босогодон төмөн жыйынтык “no qualifying hit” катары классификацияланган.
Бул сөз айкашы белгилүү скрининг критерийи аткарылбаганын көрсөтөт. Ген биологиялык жактан такыр жок дегенди билдирбейт. Булак 8-сүрөттөгү боз “NH” уячаларын да нөл пайыздык окшоштук катары эмес, талапка жооп берген дал келүү табылбаган скрининг категориясы катары аныктайт.
Изилдөөнүн Ыкмасы жана Жыйынтыктары
Изилдөө дизайнынын интеграцияланган түзүлүшү
Кан үлгүлөрүн иштетүү
Ар бир катышуучудан асептикалык перифериялык веналык кан алынган. 200 µL толук кан EDTA камтыган түтүккө бөлүнүп, геномдук DNA экстракциясы жана IL6R rs2228145 генотиптөөсү үчүн колдонулган. Калган кан центрифугаланган, бөлүнгөн плазма белгиленген микротүтүктөргө алынган жана IL-6 менен sIL-6R өлчөөгө чейин тоңдурулган шарттарда сакталган.
Заара культурасы
Ошол эле барууда стерилдүү жана белгиленген оозу кең идиштерге заара үлгүлөрү алынган. Үлгүлөр Al-Arabi Hospital микробиология лабораториясына тез жеткирилип, ылайыктуу бактериологиялык азык чөйрөлөрүнө себилген жана 37 °Cде аэробдук шартта 18–24 саат инкубацияланган. Өскөн организмдер стандарттык микробиологиялык жана биохимиялык ыкмалар менен аныкталган.
Бактериялык qPCR ыкмасы
Бактериялык геномдук DNA ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit менен экстракцияланган. ZR BashingBead лизис түтүктөрү менен механикалык майдалоо жүргүзүлүп; андан соң колонкага негизделген DNA тазалоо жана ингибиторлорду алып салуу колдонулган.
DNA концентрациясы Qubit dsDNA HS Assay Kit, ал эми тазалыгы Nabi спектрофотометри менен бааланган.
16S rRNA, fimH жана papG үчүн реалдуу убакыттагы PCR колдонулган. Ар бир 20 µL реакция 10 µL KAPA SYBR Green FAST qPCR Universal mix, 0,4 µL forward primer, 0,4 µL reverse primer, 3 µL экстракцияланган DNA жана 6,2 µL нуклеазасыз суудан турган.
Кайра өндүрүлүүчүлүк эскертүүсү: Булак бактериялык qPCR реакция аралашмасын жана праймер булактарын билдирет; бирок негизги текстте бул qPCR үчүн өзүнчө термикалык cycling профили берилбейт. Verianla жетишпеген термикалык профилди божомолдоп толуктабайт.
WGS лабораториялык жана биоинформатикалык линиясы
Тандалган эки UPEC изолятынын китепканалары MGIEasy Fast FS Library Prep Set V2.0 менен даярдалган. DNA ферментативдик түрдө майдаланып, end-repair жана A-tailing колдонулган, dual-barcode адаптерлери байланыштырылган жана PCR enrichment жүргүзүлгөн.
Фрагмент өлчөмү Qsep1 fragment analyzer менен, китепкана концентрациясы Qubit dsDNA HS менен бааланган. Бириктирилген китепканалардан DNBSEQ OneStep DNB Make Reagent Kit колдонулуп, тегерек бир чынжырлуу DNA templateтери жана DNA nanoballдор түзүлгөн.
Секвенирлөө DNBSEQ-G99 платформасында G99 FCL PE150 reagent set менен жүргүзүлүп, paired-end 150 bp окуулар алынган.
| Кадам | Программа / ыкма | Версия / шарт |
|---|---|---|
| Окуунун сапатын көзөмөлдөө | FastQC | v0.12.1 |
| Жалпы сапат жыйынтыгы | MultiQC | v1.33 |
| Окууларды тазалоо | fastp | v1.1.0 |
| Genome assembly | SPAdes | v4.2.0, isolate mode |
| MLST типтөө | mlst | v2.19.0 |
| Вируленттүүлүк/гомология скрининги | ABRicate | v1.2.0; ecoh, ecoli_vf, VFDB |
| Read mapping | minimap2 | v2.30-r1287 |
| Coverage жыйынтыгы | samtools | v1.20 |
| Талапка жооп берген вируленттүүлүк дал келүүсү | ABRicate hit | ≥ %80 нуклеотиддик окшоштук жана ≥ %80 референс камтуу |
Тандалган эки геномдун жыйынтыктары
| Өзгөчөлүк | UPEC1 | UPEC2 |
|---|---|---|
| MLST / серотип | ST127/O6:H31 | ST131/O25:H4 |
| Q30 | %98,89 | %98,90 |
| Орточо mapping depth | 256,7× | 212,5× |
| Assembly N50 | 197.534 bp | 159.148 bp |
| fimH | Табылды | Табылды |
| papG | Талапка жооп берген WGS дал келүүсү жок | Табылды |
| 1-тип fimbria системасы | 8/8 ген | 8/8 ген |
| p fimbria системасы | 0/12 талапка жооп берген ген дал келүүсү | 12/12 ген |
| Heme темир системасы | 8/8 ген | 8/8 ген |
| Yersiniabactin системасы | 11/11 ген | 11/11 ген |
Бул таблица эки геномду гана сүрөттөйт. UPEC1 жана UPEC2де табылган вируленттүүлүк гендери бардык 37 UPEC үлгүсүндө бул гендердин таралышын көрсөтпөйт жана гендер экспрессияланганын же функционалдык активдүү экенин далилдебейт.
Тандалган эки WGS үлгүсү башка UPEC үлгүлөрүн өкүлчүлүк кылабы?
Жок. Эки WGS изоляты тең qPCRда fimH+/papG+ болгон учурда, башка 35 UPEC үлгүсүнүн 13ү кош оң. Fisher exact тестинде чийки p = 0,158 жана оңдолгон p = 0,441 табылган. Эки үлгүдөн турган WGS кичи топтому бүт UPEC тобунун өкүлчүлүгүн далилдей албайт.
| Өлчөө | WGS үчүн тандалган эки үлгү | Башка UPEC үлгүлөрү | Оңдолгон p |
|---|---|---|---|
| 16S Ct | 22,65 ± 0,35; медиана 22,65 | 22,88 ± 0,60; медиана 22,90 | 0,781 |
| fimH Ct | 22,20 ± 0,14; медиана 22,20 | 22,64 ± 0,84; медиана 22,70 | 0,734 |
| papG Ct | 22,90 ± 0,85; медиана 22,90 | 22,85 ± 0,70; медиана 22,75 | 0,888 |
Булак бул Ct салыштырууларын абсолюттук бактериялык жүк салыштыруусу катары чечмелебейт.
Статистикалык анализ кантип жүргүзүлдү?
Кайра каралган макаланын статистикасы Python 3.12.14 менен кайра өндүрүлгөн. pandas 2.2.3, NumPy 2.3.5, SciPy 1.18.1 жана statsmodels 0.15.0 колдонулган; сүрөттөр Matplotlib 3.10.9 жана 3.11.2 менен даярдалган.
Үзгүлтүксүз өзгөрмөлөр mean ± SD же median [IQR], категориялык өзгөрмөлөр сан жана пайыз катары жыйынтыкталган. Биомаркер анализдеринин баары 80 катышуучуну камтыган, ал эми башка анализдерде жеткиликтүү байкоолор колдонулуп, жетишпеген маанилерге имputation жүргүзүлгөн эмес.
- Бөлүштүрүү жана дисперсияны баалоо: Shapiro–Wilk жана Brown–Forsythe/Levene.
- Үзгүлтүксүз өзгөрмөлөрдү салыштыруу: Welch t-тести же Mann–Whitney U.
- Категориялык салыштыруулар: хи-квадрат же Fisher exact.
- Генотиптер боюнча биомаркер: Kruskal–Wallis.
- Hardy–Weinberg тең салмактуулугу: ар бир BMI тобунда 1 эркиндик даражасы бар хи-квадрат.
- Таасир өлчөмдөрү: Hedges g, Cliff delta, odds ratio же Cramer V.
- Корреляция: Spearman rho.
- Көп тестти көзөмөлдөө: алдын ала белгиленген 14 тест үчүн Benjamini–Hochberg.
- Генотип–биомаркер модели: лог-өзгөртүлгөн концентрацияда BMI тобу менен C аллелинин дозасын камтыган ordinary least squares model.
Лог-сызыктуу генотип моделдеринде коэффициенттер экспоненциалдык формага айландырылып, ар бир кошумча C аллели үчүн fold-change катары билдирилген. Бул моделдер кошумча клиникалык ковариаттарды камтыган эмес.
IL-6 ишеним аралыктары жана p маанилери калибрлөө ийрисиндеги белгисиздикти моделге өзүнчө кошкон эмес. Бул жагдай өзгөчө төмөн IL-6 аймагындагы өлчөөнү чечмелөөдө маанилүү.
Изилдөө колдогон жана колдобогон жыйынтыктар
| Изилдөө колдойт | Изилдөө колдобойт |
|---|---|
| Семирүү тобунда IL-6 баалары жана sIL-6R концентрациялары нормалдуу салмак тобуна караганда жогору. | Семирүү IL-6 жогорулашы аркылуу кайталануучу ЗЖИге себеп болот. |
| IL6R rs2228145 генотип жыштыктары эки BMI тобунда маанилүү айырма көрсөткөн эмес. | rs2228145 семирүүнү же ЗЖИни түздөн-түз аныктайт. |
| C аллелинин дозасы менен sIL-6R жана алсызыраак түрдө IL-6 ортосунда чалгындоочу байланыш байкалган. | Бул генотип–биомаркер байланыштары себептик. |
| 37/80 культура UPEC катары классификацияланган. | 80 катышуучунун баарында активдүү UPEC инфекциясы бар. |
| fimH жана papG бута DNAлары көптөгөн UPEC үлгүлөрүндө qPCR менен табылган. | Бул гендер бардык үлгүлөрдө экспрессияланган же функционалдык адгезия түзгөн. |
| Тандалган эки геном ST127/O6:H31 жана ST131/O25:H4. | Бул эки тукумдун 37 UPEC ичиндеги таралышы же үстөмдүгү аныкталган. |
| WGS эки изоляттын вируленттүүлүк менен байланышкан ген курамын сүрөттөйт. | Бул гендердин транскрипциясы, белок деңгээли же функционалдык активдүүлүгү өлчөнгөн. |
| UPEC-оң топтун жаш курак бөлүштүрүлүшү башка топко караганда жашыраак. | Жаш курак UPEC үчүн себептик тобокелдик фактору экенин бул изилдөө көрсөткөн. |
Изилдөөнүн күчтүү жактары
- Ошол эле 80 катышуучуда ээ организм жана микробиологиялык өлчөөлөрдүн бирге жүргүзүлүшү.
- IL-6 жана sIL-6R менен катар IL6R rs2228145 генотиптөөсүнүн бааланышы.
- Культура жыйынтыктарынын бутага багытталган qPCR менен колдоого алынышы.
- Тандалган изоляттарда WGS аркылуу тукум жана вируленттүүлүк профилдөөсүнүн жүргүзүлүшү.
- WGS дал келүүлөрү үчүн так ≥%80 окшоштук жана ≥%80 камтуу босогосунун көрсөтүлүшү.
- 14 тесттен турган көп салыштыруу үй-бүлөсү үчүн Benjamini–Hochberg оңдоосунун колдонулушу.
- IL-6 үчүн альтернативдүү калибрлөө ыкмалары сезимталдык анализи катары көрсөтүлүшү.
- Авторлор Ct, WGS hit жана чалгындоочу генотип байланыштары үчүн чечмелөө чектерин ачык көрсөтүшү.
Изилдөөнүн негизги чектөөлөрү
- Кесилиштик дизайн себептүүлүктү жана убакыттык тартипти түзө албайт.
- Мурдагы ЗЖИ эпизоддорунун даталары жана диагностикалык жазуулары жок болгондуктан стандарттык кайталануу аныктамасы ырасталган эмес.
- IL-6нын төмөн концентрация аймагындагы абсолюттук тактыгы белгисиз.
- IL-6 ишеним аралыктары жана p маанилери калибрлөө белгисиздигин камтыбайт.
- 4PL fitте репликат деңгээлиндеги дисперсия жок болгондуктан салмактоо жүргүзүлгөн эмес.
- Генотип–биомаркер анализдери чалгындоочу жана көп салыштыруу оңдоосу колдонулган эмес.
- Лог-сызыктуу генотип моделдери BMI тобунан башка кошумча клиникалык ковариаттарды камтыбайт.
- Рецептордун функциясы өлчөнгөн эмес.
- qPCR бута DNAны аныктайт; адгезин функциясын же ген экспрессиясын өлчөбөйт.
- WGS тандалган эки UPEC изолятында гана жүргүзүлгөн.
- Эки геном бардык UPEC үлгүлөрүн өкүлчүлүк кыла албайт.
- qPCR менен WGS ортосундагы UPEC1 papG дал келбестиги чечилген эмес.
- “No qualifying hit” биологиялык ген жок дегенди билдирбейт.
- WGS менен гендин болушу, ген экспрессиясы же функционалдык вируленттүүлүк көрсөтүлгөн эмес.
- Эки геномдун чийки SRA accession номерлери жарыяланган күнү коомчулукка али ачык эмес.
Изилдөөнүн негизги илимий билдирүүсү
Бул изилдөөнүн негизги жыйынтыгы “семирүү UPECтен келип чыккан кайталануучу ЗЖИге себеп болот” деген эмес. Изилдөө кайталануучу ЗЖИ тарыхын билдирген бул 80 адамдык үлгүдө семирүү тобунун жогору IL-6 бааларына жана sIL-6R концентрацияларына ээ экенин; IL6R rs2228145 генотиптеринин бөлүштүрүлүшү BMI топторунун ортосунда маанилүү айырма көрсөткөн эместигин; C аллелинин дозасы менен өзгөчө sIL-6R ортосунда чалгындоочу байланыш табылганын жана заара культурасы/qPCR/WGS анализдери UPEC тобунда ар кандай адгезин жана вируленттүүлүк өзгөчөлүктөрүн сүрөттөгөнүн көрсөтөт.
Ээ организмдин сезгенүүсү, генетикалык вариация жана бактериялык өзгөчөлүктөрдүн бир изилдөөдө чогуу өлчөнүшү илимий жактан баалуу; бирок азыркы дизайн алардын бир себептик механизмдин үстүндө бири-бирине байланышканын көрсөтпөйт.
Булак жана Ыкма Жөнүндө Эскертүү
Түпнуска аталышы: Integrated Host IL-6 Axis, IL6R rs2228145, and Uropathogenic Escherichia coli Virulence Profiling in Obesity and Recurrent Urinary Tract Infection
Авторлор: Zahra K. Saeed; Hibbat Al-Rahman R. Rickad; Basil A. Abbas.
Жооптуу автор: Basil A. Abbas.
Тең салым: Булакта тең биринчи авторлук же тең салым жөнүндө билдирүү көрсөтүлгөн эмес.
Мекеме 1: College of Dentistry, University of Basrah, Basrah 61001, Iraq.
Мекеме 2: College of Medical and Health Technology, Al-Kunooze University, Basrah 61001, Iraq.
Журнал: Acta Microbiologica Hellenica.
Басмакана: MDPI, Hellenic Society for Microbiology атынан.
Булак түрү: Article; кесилиштик байкоочу адам изилдөөсү.
Библиографиялык жазуу: Acta Microbiologica Hellenica, 2026, том 71, макала 45.
DOI: 10.3390/amh71040045
Жарыялоо убакыт сызыгы: Received: 14 Сентябрь 2026; Revised: 16 Октябрь 2026; Accepted: 22 Октябрь 2026; Published: 27 Октябрь 2026.
Рецензия абалы: Жарыяланган изилдөө макаласы; Acta Microbiologica Hellenica эл аралык рецензияланган ачык жеткиликтүү медициналык микробиология журналы.
Лицензия: Creative Commons Attribution (CC BY).
Preprint абалы: Каралган булак жарыяланган журнал версиясы; булакта өзүнчө preprint идентификатору көрсөтүлгөн эмес.
Изилдөө жери жана убактысы: Ирактагы бир нече оорукана; Декабрь 2025–Февраль 2026.
Үлгү: 19–66 жаштагы 80 катышуучу; 66 аял жана 14 эркек. Семирүү n = 40, нормалдуу салмак n = 40.
BMI аныктамалары: Семирүү BMI ≥ 30 kg/m²; нормалдуу салмак BMI 18,5–24,9 kg/m².
ЗЖИ тарыхынын чеги: Экиден алты эпизодго чейин билдирилген; эпизоддордун даталары жана диагностикалык документтер жок болгондуктан стандарттык кайталануу аныктамасы ырасталган эмес.
Ээ организм өлчөөлөрү: IL-6 ELISA, sIL-6R ELISA, IL6R rs2228145 TaqMan генотиптөө.
Микробиологиялык өлчөөлөр: Заара культурасы, 16S rRNA/fimH/papG бутага алынган qPCR жана тандалган эки UPEC изолятында WGS.
IL-6 ыкмасы: Human IL-6 kit E0090Hu; 450 nm; алты стандартка салмакталбаган 4PL fit; концентрация тескери ийри менен эсептелген.
IL-6 өлчөө чеги: 20 ng/L биринчи нөлдөн башка стандарт; тастыкталган LLOQ эмес. Төмөн диапазондогу тактык белгисиз.
sIL-6R ыкмасы: Human Soluble Interleukin 6 Receptor kit E0226Hu; булакта assay диапазону 0,5–150 ng/mL жана сезимталдык 0,24 ng/mL деп берилген.
Бактериялык qPCR кайра өндүрүлүүчүлүк чеги: Реакция аралашмасы билдирилген; негизги текст өзүнчө термикалык cycling профилин бербейт.
WGS платформасы: DNBSEQ-G99; paired-end 150 bp.
WGS сапат/скрининг программалары: FastQC v0.12.1, MultiQC v1.33, fastp v1.1.0, SPAdes v4.2.0, mlst v2.19.0, ABRicate v1.2.0, minimap2 v2.30-r1287 жана samtools v1.20.
WGS hit босогосу: ≥%80 нуклеотиддик окшоштук жана ≥%80 референс камтуу.
Статистикалык программа: Python 3.12.14; pandas 2.2.3; NumPy 2.3.5; SciPy 1.18.1; statsmodels 0.15.0; Matplotlib 3.10.9/3.11.2.
Көп тест оңдоосу: Алдын ала белгиленген 14 тест үчүн Benjamini–Hochberg.
Чалгындоочу анализдер: HWE, pairwise Fisher жана генотип–биомаркер анализдери булакта чалгындоочу жана көп салыштыруу үчүн оңдолбогон.
Негизги биомаркер жыйынтыгы: Семирүү тобунда IL-6 28,04 ± 3,37 ng/L, нормалдуу салмакта 18,43 ± 1,41 ng/L; sIL-6R 39,87 ± 9,15ке каршы 33,69 ± 8,44 ng/mL.
Негизги генетикалык жыйынтык: IL6R rs2228145 генотип жыштыктары BMI топторунун ортосунда маанилүү айырма көрсөткөн эмес.
Чалгындоочу аллел жыйынтыгы: BMIге ылайыкташтырылган моделде ар бир кошумча C аллели үчүн fold-change IL-6 үчүн 1,06 жана sIL-6R үчүн 1,34.
Культура жыйынтыгы: UPEC 37/80; маанилүү өсүү жок 20/80; K. pneumoniae 10/80; P. mirabilis 6/80; E. faecalis 4/80; S. saprophyticus 3/80.
qPCR жыйынтыгы: UPEC үлгүлөрүндө fimH 33/37, papG 18/37.
WGS жыйынтыгы: UPEC1 ST127/O6:H31; UPEC2 ST131/O25:H4.
qPCR–WGS дал келбестиги: Тандалган эки үлгү тең papG qPCR-оң болгону менен papG үчүн талапка жооп берген WGS дал келүүсү UPEC2де гана табылган; себеби так аныкталган эмес.
Этика комитети: University of Basrah Review Board Ethics Committee; UOB-ETH-2025-13; Ноябрь 2025.
Маалымдалган макулдук: Бардык жеке катышуучулардан алынган жана үлгү чогултулганга чейин жазуу жүзүндөгү документтер архивделген.
Каржылоо: Тышкы каржылоо алынган эмес.
Кызыкчылыктардын кагылышы: Авторлор кызыкчылыктардын кагылышын билдирген эмес.
Маалыматтардын жеткиликтүүлүгү: Макаланын түпнуска салымдары макаланын ичинде берилген. Тандалган эки изоляттын чийки paired-end окууларын NCBI SRAга жайгаштыруу пландалган; макала жарыяланган учурда BioProject, BioSample жана SRA run accession номерлери али жок болчу.
Авторлордун салымы: Conceptualization, methodology, investigation, data curation, formal analysis, visualization, writing—original draft, writing—review and editing, supervision жана project administration Zahra K. Saeed менен Hibbat Al-Rahman R. Rickad тарабынан билдирилген. Basil A. Abbasтын булакта көрсөтүлгөн салымы журнал менен correspondence.
Негизги чечмелөө чеги: Жыйынтыктар семирүү тобунда жогору IL-6 бааларын жана sIL-6R концентрацияларын, ошондой эле эки UPEC геномунун деталдуу мүнөздөлүшүн көрсөтөт; бирок семирүү, ээ организмдин сезгенүүсү, UPEC вируленттүүлүгү жана кайталануучу ЗЖИ ортосунда себептик механизмди далилдебейт.
Пикир калтырыңыз
E-mail дарегиңиз жарыяланбайт. Милдеттүү талаалар * менен белгиленген