ДНК-и озод аз ҳуҷайра (cell-free DNA; cfDNA) номи умумии фрагментҳои ДНК мебошад, ки аз ҳуҷайраҳо ба муҳити берун аз ҳуҷайра озод мешаванд; ДНК-и варами гардишкунанда (circulating tumor DNA; ctDNA) бошад қисми cfDNA-и дар гардиши хун мавҷудбудаест, ки махсусан аз ҳуҷайраҳои варам сарчашма мегирад. Ин таҳқиқот бо таҷрибаҳои назоратшавандаи in vitro омӯхтааст, ки осеби ҳуҷайравии вобаста ба химиотерапия ва муқовимат ба химиотерапия ба миқдори cfDNA-и аз ҳуҷайраҳои саратон озодшаванда, кинетикаи озодшавии он дар тӯли вақт ва андозаи фрагментҳои ДНК чӣ гуна таъсир мерасонанд. Ҳуҷайраҳои аденокарциномаи шуши инсон A549 ва аденокарциномаи сурхрӯда FLO-1 ва OE19 бо cisplatin ва 5-fluorourasil коркард шудаанд; cfDNA-и умумӣ бо флуорометрияи Qubit ва cfDNA-и дорои мутатсияи хоси ҳуҷайраи варам бо PCR-и рақамии қатрагӣ (ddPCR) чен карда шудааст. Ғайр аз ин, модели OE19-и ба cisplatin муқовим сохта шуда, кинетикаи озодшавии cfDNA дар ҳуҷайраҳои ба химиотерапия ҳассос ва муқовим мустақиман муқоиса карда шудааст.

Бо зиёд шудани шумораи ҳуҷайраҳо, миқдори cfDNA-и ба муҳити культураи ҳуҷайра озодшаванда дар ҳамаи ҳуҷайраҳои A549, FLO-1 ва OE19 афзудааст. Дар ченкуниҳои Qubit коррелятсияҳои Pearson байни шумораи ҳуҷайраҳо ва cfDNA-и умумӣ барои A549 \(r=0.9357\), барои FLO-1 \(r=0.8599\) ва барои OE19 \(r=0.8767\) муайян шудаанд. Дар ченкуниҳои ddPCR-и хоси мутатсия коррелятсияҳо мутаносибан \(r=0.9864\), \(r=0.9863\) ва \(r=0.8511\) буданд. Ин натиҷа нишон медиҳад, ки дар низоми культураи ҳуҷайра миқдори cfDNA бо фаровонии ҳуҷайраҳои зиндаи варам робитаи қавӣ дорад.

Истифодаи химиотерапия озодшавии cfDNA-ро, ки нисбат ба шумораи ҳуҷайраҳо нормализатсия шудааст, дар ҳар се хати ҳуҷайравӣ зиёд кардааст. Дар муқоисаи муҳимтарин, ҳуҷайраҳои parental OE19-и ба cisplatin ҳассос дар давоми панҷ рӯзи таъсири cisplatin нисбат ба ҳуҷайраҳои OE19-и муқовим cfDNA бештар озод кардаанд. Дар ҳуҷайраҳои муқовим қимати IC50 нисбат ба cisplatin 24.40 µM буд, дар ҳуҷайраҳои parental бошад 10.43 µM; ин афзоиши тақрибан 2.34 маротиба фенотипи муқовимро дастгирӣ мекунад.

Cisplatin инчунин тақсимоти фрагментҳои cfDNA-ро ба самти фрагментҳои калонтари ДНК гузаронидааст. Фрагментҳои нуклеосомалӣ дар тақрибан 167 bp ва зарбҳои он, фрагментҳои хурди тақрибан 50–100 bp ва фрагментҳои калонтари ДНК-и берун аз ҳуҷайра дар ҳудуди 1000–15.000 bp мушоҳида шудаанд. Пас аз cisplatin саҳми нисбии фосилаҳои 134–200 bp ва 50–700 bp кам шуда, саҳми нисбии фрагментҳои 1000–15.000 bp ва аз 1000 bp калон зиёд шудааст. Дар ҳамин давра тағйироти популятсияҳои ҳуҷайравии PI-мусбат ва Annexin V/PI дукарата-мусбат бо аз даст рафтани якпорчагии мембрана ва равандҳои марҳилаи дерини марги ҳуҷайра мувофиқ буданд.

Паёми аз ҷиҳати клиникӣ муҳимтарини таҳқиқот ин аст, ки сатҳи ctDNA/cfDNA набояд танҳо ҳамчун нишондиҳандаи мустақими массаи варам тафсир шавад. Афзоиши муваққатии ДНК, ки каме пас аз химиотерапия ба вуҷуд меояд, дар баъзе ҳолатҳо метавонад на аз пешрафти варам, балки аз марги ҳуҷайраҳои ба табобат ҳассос сарчашма гирад. Бо вуҷуди ин, ин таҳқиқот дар хуни бемор анҷом дода нашудааст. Натиҷаҳо аз культураҳои ҳуҷайравии 2D гирифта шудаанд ва дар намунаҳои клиникӣ равандҳои зиёди иловагӣ, аз ҷумла гузаштани ДНК ба хун, фрагментатсияи он тавассути нуклеазаҳо, тозашавӣ аз ҷониби ҳуҷайраҳои иммунӣ ва гурдаҳо, вуҷуд доранд. Аз ин рӯ, хулосаҳо дар бораи вақти гирифтани намунаҳои клиникӣ хусусияти гипотезаофар доранд ва тасдиқи in vivo талаб мекунанд.

Фарқи Байни cfDNA ва ctDNA Чист?

cfDNA истилоҳи умумиест, ки ҳамаи фрагментҳои ДНК-и озод аз ҳуҷайраро дар моеъҳои биологии берун аз ҳуҷайра фаро мегирад; ctDNA бошад қисми танҳо аз ҳуҷайраҳои саратон сарчашмагирандаи ин ҳавзи cfDNA ва ба варам хос мебошад. Азбаски таҷрибаҳои асосии ин таҳқиқот дар муҳити культураи ҳуҷайра гузаронида шудаанд, муҳаққиқон на ДНК-и мустақиман “гардишкунанда”, балки cfDNA-и ба муҳити культура озодшударо чен кардаанд; ddPCR-и хоси мутатсия бошад ҳамчун равише истифода шудааст, ки ДНК-и аз ҳуҷайраи саратон сарчашмагирандаро интихобан муайян мекунад.

Чаро ин фарқ муҳим аст?

cfDNA-и умумие, ки дар хуни бемор чен карда мешавад, танҳо аз ҳуҷайраҳои варам намеояд. Бофтаҳои муқаррарӣ, илтиҳоб, ҳуҷайраҳои иммунӣ ва дигар равандҳои ҳуҷайравӣ низ cfDNA тавлид мекунанд. Аз ин рӯ, дар намунаи клиникии плазма cfDNA-и умумӣ ва ctDNA-и ба варам хос як миқдор нестанд.

Низоми назоратшавандаи in vitro-и ин таҳқиқот бартарии муҳими экспериментӣ медиҳад: манбаи ДНК дар муҳити культура асосан бо ҳуҷайраҳои саратони таҳқиқшаванда ва ҷузъҳои культура маҳдуд аст. Аммо ин сохтори содакардашуда фаъолияти нуклеазаҳо, cfDNA-и заминавии аз бофтаҳо сарчашмагиранда ва механизмҳои физиологии тозашавиро, ки дар гардиши воқеии хуни инсон мавҷуданд, дар бар намегирад.

Масъалаи асосии таҳқиқот

ctDNA имрӯз биомаркери муҳими биопсияи моеъ мебошад, ки дар соҳаҳое чун ошкоркунии саратон, пайгирии ҷавоб ба табобат ва арзёбии бемории минималии боқимонда таҳқиқ мешавад. Аммо барои фаҳмидани маънои як қимати ctDNA бояд донист, ки ДНК аз ҳуҷайраи варам кай, дар натиҷаи кадом раванди ҳуҷайравӣ ва дар шакли фрагментҳои кадом андоза озод мешавад.

Масалан, баланд шудани сатҳи ctDNA-и плазма пас аз табобат дар назари аввал метавонад ҳамчун зиёд шудани бори варам тафсир шавад. Аммо агар химиотерапия шумораи зиёди ҳуҷайраҳои варамро нобуд кунад, дар ҳамин давра аз ҳуҷайраҳо миқдори зиёди ДНК озод шуданаш низ мумкин аст. Ин таҳқиқот ҳамин печидагии биологиро дар шароити назоратшавандаи культураи ҳуҷайра меомӯзад.

Моделҳои ҳуҷайравии истифодашуда дар таҳқиқот

Ба ҳар муҳити культура %10 fetal bovine serum, %1 пенисиллин-стрептомицин ва 2 mM GlutaGro илова шудааст. Санҷишҳои микоплазмаи ҳамаи хатҳои ҳуҷайравии истифодашуда дар таҳқиқот манфӣ буданд.

Шароити химиотерапия

Дар таҷрибаҳои озодшавии cfDNA консентратсияи cisplatin дар 0.002 mg/mL ва консентратсияи 5-fluorourasil (5-FU) дар 0.0032 mg/mL доимӣ нигоҳ дошта шудааст. Cisplatin дар %0.9 NaCl ва 5-FU дар диметилсулфоксид (DMSO) ҳал карда шудааст. Дар таҷрибаҳои cisplatin назорати saline-и аз ҷиҳати ҳаҷм мувофиқ ва дар таҷрибаҳои 5-FU назорати воситаи DMSO-и аз ҷиҳати ҳаҷм мувофиқ истифода шудааст.

Дар таҷрибаи Расми 2 таносуби ниҳоии saline дар муҳити культура %0.4 v/v ва таносуби DMSO %0.032 v/v буд. Бо ин роҳ ҷудо кардани таъсири дору аз таъсири ҳалкунанда ҳадаф қарор дода шудааст.

Азбаски муаллифон дар таҷрибаҳои пешакӣ мушоҳида кардаанд, ки ҳуҷайраҳо дар 24 соати аввали пас аз пасажкунӣ ва трипсинизатсия миқдори зиёди cfDNA озод мекунанд, дар ҳамаи таҷрибаҳои асосӣ ба ҳуҷайраҳо аввал 24 соат барои часпидан ва афзоиш иҷозат дода шудааст. Ин ҷузъиёти муҳим аст; дар акси ҳол, озодшавии cfDNA, ки худи коркарди ҳуҷайра ба вуҷуд меорад, метавонист бо таъсири химиотерапия омехта шавад.

Моеъи болоии культураи ҳуҷайра чӣ гуна омода карда шуд?

Дар анҷоми таҷриба моеъи болоии культураи ҳуҷайра аввал дар 300×g барои 5 дақиқа, сипас дар 1000×g барои 10 дақиқа центрифуга шуда, то изолятсияи cfDNA дар −20 °C нигоҳ дошта шудааст.

Азбаски муаллифон фикр мекарданд, ки ҳуҷайраҳои ҷудошудаи дар моеъи болоии культура мавҷудбуда низ метавонанд ба cfDNA саҳм гузоранд, ҳам ҳуҷайраҳои ба сатҳ часпида ва ҳам ҳуҷайраҳои ҷудошударо шумурда, барои нормализатсия шумораи умумии ҳуҷайраҳоро истифода кардаанд. Шумориши ҳуҷайраҳо бо ҳисобкунаки автоматии Countess 3 ва trypan blue анҷом дода шуда, ҳар намуна аз ҷиҳати техникӣ ду маротиба чен шудааст.

cfDNA-и умумӣ чӣ гуна чен карда шуд?

cfDNA бо кити QIAamp Circulating Nucleic Acid аз намунаи 3 mL ҷудо карда шудааст. Протоколи стандартӣ тағйир дода шуда, буфери лизиси бофтаи ATL истифода нашудааст ва элюсияи думарҳилагӣ анҷом дода шудааст: аввал 20 µL, сипас 10 µL буфери AVE. Ҳамин тавр ҳаҷми умумии элюсия 30 µL шудааст.

ДНК-и умумии дузанҷира бо кити Qubit dsDNA High Sensitivity чен карда шудааст. Дар ҳар ченкунӣ 1 µL ДНК истифода шуда, намунаҳо ҳамчун дубликати техникӣ таҳлил шудаанд.

Азбаски Qubit ҳамаи ДНК-и дузанҷираро чен мекунад, он ба ҳуҷайраи саратон хос нест. Аз ин рӯ, муҳаққиқон барои назорати заминае, ки муҳити культураи дорои FBS ё раванди экстраксия метавонад ба вуҷуд орад, контролҳои танҳо дорои муҳити культура ва blank-ҳои экстраксияи PBS-ро низ коркард кардаанд. Сигнали паст, вале ченшавандаи Qubit муайян шудааст. Бо вуҷуди ин, истифодаи якхелаи шароити муҳит ва коркард байни гурӯҳҳо ва тасдиқи робита бо шумораи ҳуҷайраҳо тавассути ddPCR-и хоси мутатсия робитаи асосии ҳуҷайра-шумораро дастгирӣ кардааст.

Чаро ddPCR Дар Ин Таҳқиқот Истифода Шуд?

PCR-и рақамии қатрагӣ (droplet digital PCR; ddPCR) барои ба таври интихобӣ миқдорӣ муайян кардани он истифода шудааст, ки ДНК-и муҳити культура аз хати дахлдори ҳуҷайраи саратон сарчашма мегирад; барои ин мутатсияҳои хоси KRAS ё TP53, ки дар ҳуҷайраҳои A549, FLO-1 ва OE19 мавҷуданд, ҳадаф қарор дода шудаанд. Бо ин роҳ ба сигнали умумии ДНК, ки Qubit чен мекунад, қабати дуюми ченкунии хоси мутатсия илова шудааст.

Мантиқи асосии ddPCR

ddPCR намунаро ба шумораи зиёди қатраҳои микроскопӣ ҷудо мекунад. Ҳар қатра метавонад пайдарпаии ҳадафии ДНК-ро дошта бошад ё надошта бошад. Пас аз PCR шумораи қатраҳои флуорессенсия-мусбат ва флуорессенсия-манфӣ арзёбӣ шуда, бо истифода аз омори Poisson консентратсияи ибтидоии ДНК-и ҳадаф ҳисоб карда мешавад.

Дар таҳқиқот барои ҷудо кардани пайдарпаии mutant ва wild-type зондҳои бо FAM ва HEX ишорашуда истифода шудаанд. Барои ҳар хати ҳуҷайравӣ ҳарорати annealing бо контролҳои синтетикии mutant ва wild-type gBlock ДНК оптимизатсия шудааст.

Маълумоти праймер ва зонд

Шароити реаксияи ddPCR

• 10 µL 2× ddPCR Supermix for Probes истифода шудааст.
• Ҳар кадоме аз праймерҳои Forward ва reverse 900 nM аст.
• Зондҳои FAM/HEX 250 nM мебошанд.
• Ба ҳар реаксия 2 µL ДНК илова шудааст.
• Барои тавлиди қатраҳо 70 µL Droplet Generation Oil истифода шудааст.
• Қатраҳо бо Bio-Rad QX200 Droplet Generator ҳосил шуда, бо QX200 Droplet Reader хонда шудаанд.
• Денатуратсияи ибтидоӣ дар 95 °C барои 10 дақиқа анҷом дода шудааст.
• Сипас 50 даври PCR иҷро шудааст: 30 сония дар 95 °C, 1 дақиқа дар ҳарорати annealing-и хоси хати ҳуҷайравӣ 54–62 °C ва 30 сония дар 72 °C.
• Марҳилаи охирин 5 дақиқа дар 98 °C мебошад.
• Суръати ramp 2 °C/s аст.
• Ҳамаи намунаҳо ҳамчун дубликати техникӣ таҳлил шудаанд.
• Намунаҳое, ки камтар аз 10.000 қатра ҳосил кардаанд, аз таҳлил хориҷ шудаанд.

Шумораи нусхаҳои ДНК-и mutant чӣ гуна ҳисоб карда шуд?

Дар манбаъ ҳисоб кардани шумораи умумии нусхаҳои mutant бо робитаи зерин дода шудааст:

\[ \text{Mutant kopya sayısı} = \left(\text{ortalama mutant hedef konsantrasyonu}\right) \times 20\,\mu L \times \frac{30\,\mu L}{2\,\mu L} \]

Зарбкунандаи аввал консентратсияи ҳадафи mutant мебошад, ки аз ҷониби QuantaSoft бо моделсозии Poisson ҳисоб карда шудааст. 20 µL ҳаҷми пурраи реаксияи PCR мебошад. Азбаски аз элюати умумии 30 µL ДНК танҳо 2 µL ба реаксия ворид шудааст, коэффисиенти миқёсбандии \(30/2=15\) барои аз aliquot-и таҳлилшуда ба тамоми намунаи ДНК-и экстраксияшуда баргардондани ҳисоб истифода мешавад.

Аз ин рӯ, формула на танҳо ДНК-и mutant-и дохили найчаи PCR, балки шумораи тахминии нусхаҳои mutant-ро дар элюати умумии 30 µL cfDNA медиҳад.

Сигнали бардурӯғ-мусбати ddPCR чӣ гуна назорат карда шуд?

Барои ҳар санҷиши хоси мутатсия дар 10 таҷрибаи мустақил 10 реаксияи no-template control арзёбӣ шудааст. Дар ягон реаксияи алоҳидаи NTC на бештар аз як қатраи mutant-мусбат дида шудааст. Муҳаққиқон ин сатҳи заминаро ба назар гирифта, намунаҳои экспериментиро, ки ду ё камтар қатраи mutant-мусбат доштанд, ба таври консервативӣ манфӣ ҳисоб кардаанд.

Робитаи байни шумораи ҳуҷайраҳо ва cfDNA

Мусбат ва баланд будани ҳамаи коэффисиентҳои коррелятсия нишон медиҳад, ки дар культураҳое, ки ҳуҷайра бештар аст, cfDNA низ бештар мебошад. Коррелятсияи Pearson қувваи робитаи хаттиро чен мекунад; қиматҳое, ки ба \(r=1\) наздик мешаванд, ба робитаи қавии мусбати хаттӣ мувофиқанд. Бо вуҷуди ин, коррелятсия худ аз худ механизми сабабияти биологиро исбот намекунад.

cfDNA ба ҳар ҳуҷайра пас аз химиотерапия

Ҳуҷайраҳои A549, FLO-1 ва OE19 дар таҷрибаҳои химиотерапия мутаносибан ба миқдори 50.000, 125.000 ва 500.000 ҳуҷайра кишт карда шудаанд. Ин шумораҳои ибтидоӣ барои ба даст овардани тақрибан %80 конфлюэнсия ҳангоми ҷамъоварии моеъи болоӣ, сарфи назар аз суръатҳои гуногуни афзоиш, интихоб шудаанд.

Пас аз 72 соати истифодаи cisplatin ё 5-FU, қиматҳои cfDNA ба шумораи умумии ҳуҷайраҳо дар лаҳзаи ҷамъоварии намуна нормализатсия шуданд, зеро табобат афзоиши ҳуҷайраҳо ва шумораи умумии онҳоро тағйир медод. Ҳамин тавр, таҳқиқот бештар аз саволи “дар культура дар маҷмӯъ чӣ қадар ДНК ҳаст?” саволи “озодшавии нисбии ДНК ба ҳар ҳуҷайра аз табобат чӣ гуна таъсир мегирад?”-ро арзёбӣ кардааст.

Дар ҳар се хати ҳуҷайравӣ пас аз химиотерапия озодшавии cfDNA ба ҳар ҳуҷайра афзудааст. Манбаъ инро чунин тафсир мекунад, ки ситотоксикияти вобаста ба химиотерапия озодшавии cfDNA-ро зиёд мекунад.

Афзоиши cfDNA Пас аз Химиотерапия Чӣ Гуна Бояд Тафсир Шавад?

Мувофиқи ин таҳқиқот, афзоиши cfDNA дар давраи барвақти пас аз химиотерапия метавонад танҳо зиёд шудани шумораи ҳуҷайраҳои варамро нишон надиҳад; марги ҳуҷайраҳои саратони ба табобати ситотоксикӣ ҳассос ва озод кардани ДНК ба муҳити берун аз ҳуҷайра низ метавонад сатҳи cfDNA-ро муваққатан баланд кунад. Аммо ин натиҷа ба модели in vitro асос ёфтааст ва пеш аз истифода шудан ҳамчун нишондиҳандаи мустақими муваффақияти табобат дар бемор бояд бо тағйирёбандаҳое чун вақт, тозашавии ДНК ва бори клиникии варам тасдиқ шавад.

Модели OE19-и ба cisplatin муқовим чӣ гуна сохта шуд?

Ҳуҷайраҳои parental OE19 ба 5 µmol/L cisplatin барои 72 соат дучор карда шуда, сипас иҷозат дода шуд, ки дар муҳити бидуни химиотерапия барқарор шаванд. Вақте ҳуҷайраҳо ба %70–80 конфлюэнсия расиданд, пасаж карда шуданд ва пас аз 24 соат ҳамон раванд такрор шуд.

Ин давр 3 моҳ идома дода шуд. Баъдан фенотипи муқовим бо истифодаи cisplatin пас аз ҳар се пасаж нигоҳ дошта шуд. Пеш аз таҷрибаҳои асосӣ ҳуҷайраҳои муқовим ҳадди ақал як пасажи пурра дар муҳити бе cisplatin парвариш карда шуданд.

Тасдиқи муқовимат бо CCK-8

Дар таҷрибаи CCK-8 ба ҳар чоҳча 4000 ҳуҷайра илова шуда, таҷрибаҳо дар трипликат гузаронида шуданд. Пас аз 24 соат ҳуҷайраҳо бо 1, 2, 4, 8, 16, 32 ё 64 µg/mL cisplatin барои 48 соат коркард шуданд. Баъдан реагенти CCK-8 илова шуда, абсорбанс дар 450 nm чен карда шуд.

CCK-8 санҷишест, ки бо истифода аз тағйирёбии ранг вобаста ба фаъолияти метаболикии ҳуҷайраҳо қобилияти нисбии зиндамонии ҳуҷайраҳоро арзёбӣ мекунад. Бо чен кардани он ки зиндамонӣ бо зиёд шудани доза то чӣ андоза коҳиш меёбад, каҷи ҳассосият ба дору ба даст оварда мешавад.

IC50 чист?

IC50 консентратсияи доруест, ки дар шароити муайяни таҷрибавӣ барои то сатҳи ниммаксималӣ коҳиш додани зиндамонии ҳуҷайра ё таъсири биологии ченшуда лозим аст. Дар як низоми таҷрибавӣ IC50-и баландтар нишон медиҳад, ки ҳуҷайраҳо барои ба вуҷуд овардани ҳамон таъсири боздоранда консентратсияи баландтари доруро талаб мекунанд ва бинобар ин муқовимтаранд.

Дар ҳуҷайраҳои муқовим IC50 тақрибан 2.34 маротиба афзудааст. ANOVA-и дуҷониба барои консентратсияи cisplatin, хати ҳуҷайравӣ ва таъсири мутақобилаи онҳо \(p<0.0001\) гузориш кардааст.

Каҷҳои доза-ҷавоб бо модели боздорандаи доза-ҷавоби чорпараметрӣ ва нишебии тағйирёбанда мутобиқ карда шудаанд. Ҳадди болоии модел ба %100 зиндамонии нормализатсияшуда собит шуда, ҳадди поёнӣ ба бузургтар аз 0 будан маҳдуд карда шудааст; IC50 ва нишебии Hill озод мондаанд. Азбаски манбаъ формулаи алгебравии ошкори ин моделро надодааст, Verianla муодилаи ба манбаъ тааллуқнадоштаро илова намекунад.

Химиорезистентӣ Ба Кинетикаи Озодшавии cfDNA Чӣ Гуна Таъсир Кард?

Вақте ҳуҷайраҳои parental OE19-и ба cisplatin ҳассос ва ҳуҷайраҳои OE19-и ба cisplatin муқовим дар тӯли панҷ рӯз ҳар рӯз cisplatin гирифтанд, cfDNA ба ҳар ҳуҷайра дар ҳар ду гурӯҳ зиёд шуд, аммо ҳуҷайраҳои ҳассос дар бисёр нуқтаҳои вақт нисбат ба ҳуҷайраҳои муқовим ба таври назаррас бештар cfDNA озод карданд; бинобар ин манбаъ арзёбӣ кардааст, ки бузургии озодшавии cfDNA бо дараҷаи ситотоксикияти ба вуҷудовардаи химиотерапия робита дорад.

Таҷрибаи кинетикии панҷрӯза

Ба ҳуҷайраҳои parental ва муқовими OE19 дар тӯли панҷ рӯз ҳар рӯз cisplatin дода шуда, моеъи болоии культура ҳар 24 соат ҷамъоварӣ шудааст. cfDNA-и умумӣ бо Qubit ва cfDNA-и хоси мутатсия бо ddPCR чен карда шудааст.

Ҳамаи қиматҳо ба шумораи умумии ҳуҷайраҳо дар вақти ҳар ҷамъоварии намуна нормализатсия шудаанд. Дар ANOVA-и дуҷониба барои вақт, шароити таҷрибавӣ ва таъсири мутақобилаи вақт × шароит \(p<0.0001\) гузориш шудааст.

Дар ҳуҷайраҳои parental OE19-и ҳассос озодшавии cfDNA вобаста ба cisplatin нисбат ба ҳуҷайраҳои муқовим баландтар буд ва дар муқоисаҳои бо Sidak ислоҳшуда дар чанд нуқтаи вақт фарқият дар сатҳи \(p<0.05\) вуҷуд дошт.

Ин бозёфт маънои онро надорад, ки “ҳуҷайраи муқовим умуман cfDNA озод намекунад”. Дар ҳуҷайраҳои муқовим низ зери таъсири cisplatin озодшавӣ зиёд мешавад; фарқи асосӣ дар бузургии озодшавӣ ва рафтори он дар тӯли вақт аст.

Тағйироти Андозаи Фрагментҳои cfDNA Чиро Нишон Медиҳад?

Пас аз cisplatin, гузариши тақсимоти cfDNA ба фрагментҳои калонтари ДНК ҳам дар культураҳои ҳассос ва ҳам муқовими OE19 нишон медиҳад, ки химиотерапия метавонад на танҳо ба миқдори ДНК-и озодшуда, балки ба он низ таъсир расонад, ки ДНК аз кадом равандҳои марги ҳуҷайра ва коркарди берун аз ҳуҷайра мегузарад; аммо Annexin V/PI ва андозаи фрагмент худ аз худ роҳи муайяни маргро ба таври қатъӣ муайян карда наметавонанд.

Андозаи фрагментҳои ДНК чӣ гуна чен карда шуд?

Андозаи ДНК бо низоми автоматикунонидашудаи электрофорези Agilent 4150 TapeStation арзёбӣ шудааст. Ду низоми гуногуни ScreenTape барои мақсадҳои якдигарро пуркунанда истифода шуданд:

• Genomic DNA ScreenTape: тақсимоти умумии фрагментҳо дар ҳудуди 150–50.000 bp ва андозаи миёнаи фрагмент.
• Cell-free DNA ScreenTape: ҳиссаи фрагментҳои кӯтоҳи ДНК дар ҳудуди 50–700 bp.

Таҳлили фрагментҳо дар рӯзи 3-юми табобат бо cisplatin анҷом дода шудааст. Дар ҳамон рӯз ситометрияи ҷараёнии Annexin V/PI гузаронида шуд, то андозаи ДНК ва профили марги ҳуҷайра дар як нуқтаи вақти таҷрибавӣ арзёбӣ шаванд.

Кадом андозаҳои фрагмент мушоҳида шуданд?

Табобат бо cisplatin андозаи миёнаи фрагментҳои ДНК-ро ҳам дар ҳуҷайраҳои parental ва ҳам дар ҳуҷайраҳои муқовими OE19 зиёд кардааст. Дар ҳоле ки ҳиссаи ДНК-и 134–200 bp ва 50–700 bp дар cfDNA-и умумӣ коҳиш ёфт, ҳиссаи фрагментҳои 1000–15.000 bp ва аз 1000 bp калон афзуд.

Annexin V ва propidium iodide чиро нишон медиҳанд?

Annexin V барои муайян кардани интиқоли фосфатидилсерин ба сатҳи берунии мембранаи ҳуҷайра истифода мешавад ва нишондиҳандаи вобаста ба апоптоз мебошад. Propidium iodide (PI) аз мембранаи солими ҳуҷайра ба осонӣ гузашта наметавонад, бинобар ин PI-мусбат будан аз даст рафтани якпорчагии мембранаро нишон медиҳад.

Дар тафсири умумӣ ҳуҷайраҳои Annexin V-манфӣ / PI-манфӣ бо популятсияи зинда; ҳуҷайраҳои Annexin V-мусбат / PI-манфӣ бо раванди барвақти апоптозӣ; дукарата-мусбат будан бошад бо апоптози марҳилаи дер, некрози дуюмдараҷа ё дигар ҳолатҳои дерини марг, ки дар онҳо гузаронандагии мембрана гум шудааст, мувофиқ аст.

Маҳдудияти махсусан муҳим барои ин таҳқиқот он аст, ки таҳлили Annexin V/PI апоптози дер, некрози дуюмдараҷа, некроптоз ё дигар роҳҳои танзимшавандаи марги ҳуҷайраро ба таври қатъӣ аз ҳам ҷудо карда наметавонад.

Шароити ситометрияи ҷараёнӣ

Тақрибан 20.000 ҳуҷайра/намуна бо BD FACS-CANTO II бо суръати тақрибан 500 ҳуҷайра/сония таҳлил шудааст. Аввал debris бо FSC-A/SSC-A хориҷ карда шуд, сипас ҳуҷайраҳои singlet интихоб шуда, Annexin V/PI quadrant gating татбиқ гардид. Таҳлил бо FlowJo V11 анҷом дода шуд.

Cisplatin фраксияи зиндаи Annexin V/PI дукарата-манфиро дар ҳуҷайраҳои parental OE19 ба таври назаррас коҳиш дод:

\[ p_{\text{Sidak}}=0.0120 \]

Коҳиш дар ҳуҷайраҳои муқовими OE19 хурдтар буд ва аз ҷиҳати оморӣ аҳамиятнок набуд:

\[ p_{\text{Sidak}}=0.2908 \]

Афзоиши популятсияҳои PI-мусбат ва Annexin V/PI дукарата-мусбат дар ҳар ду гурӯҳи ҳуҷайра бо халалдор шудани гузаронандагии мембрана ва зиёд шудани равандҳои марҳилаи дерини марги ҳуҷайра мувофиқ аст.

Паёми асосии ин схема

Ҳангоми якҷоя хондани ҳамаи таҷрибаҳои манбаъ дида мешавад, ки cfDNA як “ҳисобкунаки миқдори варам”-и якченака нест. Ба ҳамон ченкунии cfDNA чор ҷузъи алоҳидаи биологӣ таъсир расонида метавонанд: шумораи ҳуҷайраҳо, ситотоксикияти вобаста ба табобат, ҳассосият/муқовимат ба дору ва он ки ДНК тавассути кадом механизми марги ҳуҷайра ё коркарди берун аз ҳуҷайра озод мешавад.

Усул ва Натиҷаҳои Таҳқиқот

Хулосаи қадам ба қадами тарҳи таҷриба

Таҳлили оморӣ

Омор бо GraphPad Prism 10, версияи 10.6.1 анҷом дода шудааст. Маълумот ҳамчун миёна ± инҳирофи стандартии такрорҳои мустақили биологӣ пешниҳод шудааст.

• Барои робитаи хаттии байни шумораи ҳуҷайраҳо ва cfDNA коэффисиенти коррелятсияи Pearson истифода шудааст.
• Дар муқоисаи ду гурӯҳ t-тести дуҷонибаи намунаҳои мустақил истифода шудааст.
• Дар таҷрибаҳое, ки чанд гурӯҳ ё омилҳои таҷрибавӣ доштанд, ANOVA-и дуҷониба татбиқ шудааст.
• Муқоисаҳои байни ҷуфтҳо бо санҷиши бисёрмуқоисавии Sidak ислоҳ шудаанд.
• Каҷҳои доза-ҷавоби CCK-8 бо регрессияи nonlinear-и чорпараметрӣ ва нишебии тағйирёбанда моделсозӣ шудаанд.
• Барои IC50 фосилаи эътимоди %95 profile-likelihood гузориш шудааст.
• Ҳадди аҳамиятнокии оморӣ \(p<0.05\) аст.

Фарқи такрори мустақили биологӣ аз такрори техникӣ

Такрори биологӣ аз нав гузаронидани таҷриба дар шароити мустақили культура/намуна мебошад ва тағйирёбии биологиро инъикос мекунад. Такрори техникӣ чанд маротиба анҷом додани раванди ченкунии ҳамон намунаи биологӣ мебошад ва ба назорати тағйирёбии аз дастгоҳ ё ченкунӣ сарчашмагиранда кӯмак мекунад.

Аксари таҷрибаҳои асосии таҳқиқот бо n=3 такрори мустақили биологӣ гузаронида шудаанд. Бисёр ченкуниҳо, аз ҷумла Qubit, TapeStation ва ddPCR, инчунин ҳамчун дубликати техникӣ иҷро шудаанд. Муаллифон ошкоро қайд мекунанд, ки n=3 метавонад қувваи омориро махсусан ҳангоми тафсири натиҷаҳои ғайриаҳамиятнок маҳдуд созад.

Қавитарин бозёфтҳои мустақими таҳқиқот

Натиҷаҳое, ки таҳқиқот дастгирӣ намекунад

• Наметавон хулоса кард, ки афзоиши ctDNA пас аз химиотерапия дар плазмаи бемор ҳатман муваффақияти табобатро нишон медиҳад.
• Ин таҳқиқот барои ctDNA ҳадди клиникии ташхисӣ ё алгоритми тағйири табобат таҳия накардааст.
• Танҳо аз рӯйи андозаи фрагментҳои cfDNA наметавон гуфт, ки ҳуҷайра маҳз тавассути апоптоз, некроз, некроптоз ё механизми дигари марг нобуд шудааст.
• Саҳми cisplatin ба андозаи фрагмент ва саҳми механизми марги ҳуҷайра аз ҳам пурра ҷудо карда нашудаанд.
• Натиҷаҳои се хати ҳуҷайравиро ба ҳамаи намудҳои саратон умумӣ кардан мумкин нест.
• Кинетикаи cfDNA дар культураи ҳуҷайравии дуандоза бо кинетикаи ctDNA дар гардиши хуни инсон айнан баробар нест.
• Ин таҳқиқот нишон надодааст, ки дар иммунотерапия, табобати ҳадафнок ё синфҳои дигари дору ҳамон намунаҳои фрагментатсия ба вуҷуд меоянд.
• Робитаи доза-ҷавоби вояҳои гуногуни химиотерапия бо озодшавӣ ва фрагментатсияи cfDNA ба таври систематикӣ санҷида нашудааст.

Фарқҳои асосии байни in vitro ва муҳити клиникӣ

cfDNA-и дар культураи ҳуҷайра озодшуда мустақиман дар муҳити культураи атроф ҷамъ мешавад. Дар организми инсон бошад, ДНК-и варам бояд аз фосилаи бофта ба хун ё дигар моеъҳои биологӣ гузарад. Ба сатҳи ченшавандаи ctDNA дар намунаи клиникӣ равандҳои зерин низ таъсир мекунанд:

• Ҷойгиршавии анатомии варам ва наздикии он ба гардиши хун.
• Заминаи калони cfDNA аз бофтаҳои муқаррарӣ.
• Фрагментатсияи ДНК тавассути нуклеазаҳо.
• Тозашавӣ аз ҷониби ҳуҷайраҳои иммунӣ.
• Филтратсияи гурда.
• Интиқоли ДНК дар хун ё дигар моеъҳои биологӣ.

Азбаски дар низоми in vitro-и таҳқиқот нуклеазаҳои физиологӣ вуҷуд надоранд, профилҳои фрагментҳои мушоҳидашуда асосан хусусиятҳои ДНК-и аввал озодшударо инъикос мекунанд. ДНК-и плазмаи бемор бошад пас аз озодшавӣ ба коркарди иловагӣ ва тозашавӣ дучор мешавад.

Омилҳои техникӣ, ки натиҷаи фрагментатсияро маҳдуд мекунанд

Муаллифон махсусан таъкид мекунанд, ки тақсимоти фрагментҳои ДНК танҳо бо марги ҳуҷайра муайян намешавад. Cisplatin метавонад бо эҷоди пайвандҳои салибии ДНК ва шикастҳои дузанҷира ба андозаи фрагмент мустақиман таъсир расонад. Усули изолятсияи ДНК метавонад фрагментҳои андозаашон гуногунро бо самаранокии гуногун бозёбӣ кунад ва ҳамин ҳам тақсимоти ченшударо тағйир дода метавонад.

Илова бар ин, ҳарчанд моеъи болоӣ аз центрифугакунии 300×g ва 1000×g гузаронда шудааст, кафолат дода намешавад, ки тамоми debris-и ҳуҷайравӣ пурра хориҷ шудааст. Debris-и боқимонда метавонад махсусан ба як қисми фрагментҳои калони ДНК саҳм гузошта бошад.

Чаро вақти намунагирӣ метавонад аз ҷиҳати клиникӣ муҳим бошад?

Мувофиқи модели вобаста ба вақт, ки манбаъ муҳокима мекунад, марги шумораи зиёди ҳуҷайраҳои варами ҳассос фавран пас аз табобати ситотоксикӣ метавонад боиси болоравии муваққатии ctDNA шавад. Агар табобат самаранок идома ёбад, бо коҳиш ёфтани ҳуҷайраҳои ҳассоси варам дар ченкуниҳои баъдӣ паст шудани ctDNA интизор шудан мумкин аст. Баръакс, дар рафти минбаъдаи табобат тоза нашудани ctDNA ё баланд мондани он метавонад бо идомаи бемории муқовим алоқаманд бошад.

Ин модел ба тафсири якҷояи бозёфтҳои культураи ҳуҷайраи ин мақола ва таҳқиқоти клиникии қаблие, ки муаллифон муҳокима мекунанд, асос ёфтааст. Худи таҳқиқот ин пайдарпаии вақтро дар беморон санҷида нашудааст. Аз ин рӯ, барои муайян кардани вақтҳои мувофиқи гирифтани хун дар амалияи клиникӣ намунагирии longitudinal-и беморон бо басомади баланд лозим аст.

Аҳамияти эҳтимолӣ дар скрининги пешклиникии дору

Азбаски муаллифон бар ин назаранд, ки cfDNA метавонад на танҳо мутатсияҳои генетикӣ, балки марги ҳуҷайра ва рафтори фрагментатсияи вобаста ба табобатро низ инъикос кунад, онҳо профили cfDNA-ро ҳамчун биомаркери функсионалии иловагӣ дар скрининги пешклиникии дору арзёбӣ мекунанд.

Ин истифода ҳанӯз санҷиши клиникии тасдиқшуда нест. Таҳқиқот ба культураи ҳуҷайраи 2D асос ёфтааст. Моделҳои физиологитар, аз қабили органоидҳои аз бемор гирифташуда ва низомҳои organ-on-chip, ҳамчун платформаҳои таҷрибавие пешниҳод шудаанд, ки ҳамин механизмҳоро дар оянда дар онҳо тасдиқ кардан мумкин аст.

Маҳдудиятҳои асосии таҳқиқот

• Ҳамаи таҷрибаҳо in vitro гузаронида шудаанд.
• Равандҳои тозашавии ДНК дар организми инсон дар модел вуҷуд надоранд.
• Нуклеазаҳои физиологӣ вуҷуд надоранд.
• Annexin V/PI роҳҳои мушаххаси марги ҳуҷайраро ба таври қатъӣ ҷудо карда наметавонад.
• Cisplatin метавонад ба фрагментатсияи физикии ДНК мустақиман таъсир расонад.
• Усули экстраксияи ДНК метавонад вобаста ба андозаи фрагмент самаранокии гуногуни бозёбӣ дошта бошад.
• Пас аз центрифугакунӣ debris-и боқимондаи ҳуҷайравӣ пурра хориҷ карда нашудааст.
• Таҳқиқот танҳо ба химиотерапияи ситотоксикӣ ва моделҳои ҳуҷайравии варамҳои сахт тамаркуз кардааст.
• Вояи химиотерапия аз нуқтаи назари озодшавии cfDNA ҳамчун силсилаи систематикии дозаҳо омӯхта нашудааст.
• Дар аксари таҷрибаҳои асосӣ танҳо се такрори мустақили биологӣ мавҷуд аст.
• Моделҳои бештари ҳуҷайравӣ, намудҳои табобат ва тасдиқи in vivo лозим аст.

Ёддошт оид ба Манбаъ ва Усул

Унвони аслӣ: Cell-Free DNA Release Kinetics and Fragmentation Reflect Treatment Response and Resistance In Vitro

Муаллифон: Alexandra Bartolomucci; Laura Kienzle; Sarah Tadhg Ferrier; Benjamin Forgie; Thupten Tsering; Kyle Dickinson; Lorenzo Ferri; Jonathan Cools-Lartigue; Julia V. Burnier.

Тартиби муаллифон: Тартиби манбаъ нигоҳ дошта шудааст.

Муаллифи масъул: Julia V. Burnier.

Саҳми баробар: Дар манбаъ изҳороти саҳми баробар / ҳаммуаллифии аввал мавҷуд нест.

Муассисаҳо: Cancer Research Program, Research Institute of the McGill University Health Centre; Department of Pathology, McGill University; Division of Thoracic Surgery, McGill University Health Centre; Gerald Bronfman Department of Oncology, McGill University; Goodman Cancer Institute, McGill University; Montreal, Канада.

Маҷалла: Cells.

Ношир: MDPI.

Сол: 2026.

Ҷилд / шумора / рақами мақола: 15(17), 1561.

DOI: 10.3390/cells15171561.

Санаи дарёфт: 26 июни 2026.

Бознигарӣ: 22 августи 2026.

Қабул: 26 августи 2026.

Нашр: 28 августи 2026.

Навъи манбаъ: Мақолаи аслии таҳқиқотӣ.

Вазъи тақриз: Таҳқиқоти аз тақриз гузашта, ки дар маҷалла нашр шуда ва раванди қабул/бознигариро гузаштааст.

Литсензия: Creative Commons Attribution, CC BY.

Калидвожаҳо: ctDNA; cfDNA; biomarker; chemotherapy resistance; treatment response; esophageal adenocarcinoma.

Маблағгузорӣ: Дастгирии Canadian Cancer Society Emerging Scholar Award #707153 ва Fonds de Recherche du Québec en Santé; манбаъ барои J.V.B. рақами #312831 ва барои A.B. рақами #330312-ро гузориш мекунад.

Кумитаи ахлоқ: Institutional Review Board Statement: татбиқ намешавад.

Ризоияти огоҳона: Татбиқ намешавад.

Дастрасии маълумот: Зикр шудааст, ки маълумоти хоме, ки натиҷаҳои мақоларо дастгирӣ мекунанд, аз муаллифон бо дархост дастрас карда мешаванд.

Бархӯрди манфиатҳо: Муаллифон изҳор мекунанд, ки бархӯрди манфиатҳо вуҷуд надорад.

Саҳми муаллифон: Консептуализатсия J.V.B.; усул A.B. ва J.V.B.; валидатсия A.B.; таҳлили формалӣ A.B., S.T.F., B.F., T.T. ва K.D.; таҳқиқот A.B., L.K., S.T.F., B.F., T.T. ва K.D.; захираҳо L.F. ва J.V.B.; тарҳи аввал A.B.; бозбинӣ ва таҳрир A.B., L.K., S.T.F., T.T., K.D., L.F., J.C.-L. ва J.V.B.; визуализатсия A.B.; назорат J.V.B.; дарёфти маблағгузорӣ J.C.-L. ва J.V.B.

Усулҳои асосӣ: Флуорометрияи Qubit; ddPCR-и хоси мутатсия; таҳлили доза-ҷавоби CCK-8; таҳлили фрагмент бо Agilent 4150 TapeStation; ситометрияи ҷараёнии Annexin V/PI; коррелятсияи Pearson; t-тести дуҷонибаи мустақил; ANOVA-и дуҷониба; муқоисаи бисёркаратаи Sidak; регрессияи nonlinear-и доза-ҷавоби чорпараметрӣ.

Ҳадди асосии таҷрибавӣ: Таҳқиқот дар культураҳои 2D-и ҳуҷайраҳои саратон анҷом дода шудааст. Плазмаи бемор, тозашавии in vivo-и ctDNA ва қарорҳои воқеии клиникии табобат мустақиман санҷида нашудаанд.

Ҳадди асосии тафсир: Манбаъ дастгирии механистӣ медиҳад, ки афзоиши ctDNA/cfDNA пас аз табобати барвақт метавонад аз марги ситотоксикии ҳуҷайра сарчашма гирад; аммо ҳадди клиникиеро пешниҳод намекунад, ки муайян кунад як ченкунии баландшудаи ctDNA дар бемор бояд ҳамчун муваффақияти табобат ё пешрафти беморӣ чӣ гуна тасниф шавад.