Клеткасыз ДНК (cell-free DNA; cfDNA) — клеткалардан клеткадан тышкаркы чөйрөгө бөлүнүп чыккан ДНК фрагменттеринин жалпы аталышы; кан айлануудагы шишик ДНКсы (circulating tumor DNA; ctDNA) болсо кан айлануудагы cfDNAнын өзгөчө шишик клеткаларынан келип чыккан бөлүгү. Бул изилдөө химиотерапияга байланыштуу клетканын жабыркашы жана химиотерапияга туруктуулук рак клеткаларынан бөлүнүп чыккан cfDNAнын көлөмүнө, убакыт ичиндеги бөлүнүп чыгуу кинетикасына жана ДНК фрагменттеринин өлчөмдөрүнө кандай таасир этерин көзөмөлдөнгөн in vitro эксперименттер менен изилдеген. Адамдын өпкө аденокарциномасы A549 жана кызыл өңгөч аденокарциномасы FLO-1 жана OE19 клеткалары cisplatin жана 5-fluorourasil менен иштетилген; жалпы cfDNA Qubit флуорометриясы менен, шишик клеткасына мүнөздүү мутацияны алып жүргөн cfDNA болсо тамчылуу санариптик PCR (ddPCR) менен өлчөнгөн. Мындан тышкары, cisplatinге туруктуу OE19 модели түзүлүп, химиотерапияга сезгич жана туруктуу клеткалардын cfDNA бөлүнүп чыгуу кинетикасы түздөн-түз салыштырылган.

Клеткалардын саны көбөйгөн сайын клетка культурасынын чөйрөсүнө бөлүнүп чыккан cfDNAнын көлөмү A549, FLO-1 жана OE19 клеткаларынын баарында көбөйгөн. Qubit өлчөөлөрүндө клетка саны менен жалпы cfDNAнын ортосундагы Pearson корреляциялары A549 үчүн \(r=0.9357\), FLO-1 үчүн \(r=0.8599\) жана OE19 үчүн \(r=0.8767\) деп табылган. Мутацияга мүнөздүү ddPCR өлчөөлөрүндө корреляциялар тиешелүүлүгүнө жараша \(r=0.9864\), \(r=0.9863\) жана \(r=0.8511\). Бул жыйынтык клетка культурасы системасында cfDNAнын көлөмү тирүү шишик клеткаларынын саны менен күчтүү байланышта экенин көрсөтөт.

Химиотерапия колдонуу клетка санына нормалдаштырылган cfDNA бөлүнүп чыгышын үч клетка линиясында тең көбөйткөн. Эң маанилүү салыштырууда cisplatinге сезгич parental OE19 клеткалары беш күндүк cisplatin таасири учурунда туруктуу OE19 клеткаларына караганда көбүрөөк cfDNA бөлүп чыгарган. Туруктуу клеткаларда cisplatinге карата IC50 мааниси 24.40 µM болсо, parental клеткаларда 10.43 µM; болжол менен 2.34 эсе бул жогорулаш туруктуу фенотипти колдойт.

Cisplatin ошондой эле cfDNA фрагменттеринин бөлүштүрүлүшүн чоңураак ДНК фрагменттерине карай жылдырган. Болжол менен 167 bp жана анын эселенген өлчөмдөрүндө нуклеосомалык фрагменттер, болжол менен 50–100 bp майда фрагменттер жана 1000–15.000 bp аралыгында чоңураак клеткадан тышкаркы ДНК фрагменттери байкалган. Cisplatinден кийин 134–200 bp жана 50–700 bp аралыктарынын салыштырма үлүшү азайып, 1000–15.000 bp жана 1000 bpден жогору фрагменттердин салыштырма үлүшү көбөйгөн. Ошол эле мезгилде PI-оң жана Annexin V/PI кош-оң клетка популяцияларындагы өзгөрүүлөр мембрананын бүтүндүгүнүн жоголушу жана клетка өлүмүнүн кеч баскычтагы процесстери менен шайкеш болгон.

Изилдөөнүн клиникалык жактан эң маанилүү билдирүүсү — ctDNA/cfDNA деңгээлин шишик массасынын түздөн-түз көрсөткүчү катары гана чечмелөөгө болбой турганы. Химиотерапиядан кыска убакыт өткөндөн кийин пайда болгон убактылуу ДНК жогорулашы айрым учурларда шишиктин өрчүшүнөн эмес, дарылоого сезгич клеткалардын өлүшүнөн келип чыгышы мүмкүн. Бирок бул изилдөө бейтаптын канында жүргүзүлгөн эмес. Жыйынтыктар 2D клетка культураларынан алынган жана клиникалык үлгүлөрдө ДНКнын канга өтүшү, нуклеазалар менен ажыроосу, иммундук клеткалар жана бөйрөк аркылуу тазаланышы сыяктуу көптөгөн кошумча процесстер бар. Ошондуктан клиникалык үлгү алуу убактысына байланышкан жыйынтыктар гипотеза түзүүчү мүнөздө жана in vivo тастыктоону талап кылат.

cfDNA менен ctDNAнын Айырмасы Эмне?

cfDNA — клеткадан тышкаркы биологиялык суюктуктардагы бардык клеткасыз ДНК фрагменттерин камтыган жалпы термин; ctDNA болсо ушул cfDNA жыйындысынын рак клеткаларынан гана келип чыккан, шишикке мүнөздүү бөлүгү. Бул изилдөөнүн негизги эксперименттери клетка культурасынын чөйрөсүндө жүргүзүлгөндүктөн, изилдөөчүлөр түздөн-түз “кан айлануудагы” ДНКны эмес, культура чөйрөсүнө бөлүнүп чыккан cfDNAны өлчөшкөн; мутацияга мүнөздүү ddPCR болсо рак клеткасынан келип чыккан ДНКны тандалма түрдө аныктоочу ыкма катары колдонулган.

Бул айырмалоо эмне үчүн маанилүү?

Бейтаптын канында өлчөнгөн жалпы cfDNA шишик клеткаларынан гана келбейт. Кадимки ткандар, сезгенүү, иммундук клеткалар жана башка клеткалык процесстер да cfDNA өндүрөт. Ошондуктан клиникалык плазма үлгүсүндө жалпы cfDNA менен шишикке мүнөздүү ctDNA бирдей чоңдук эмес.

Бул изилдөөнүн көзөмөлдөнгөн in vitro системасы маанилүү эксперименттик артыкчылык берет: культура чөйрөсүндөгү ДНКнын булагы негизинен изилденип жаткан рак клеткалары жана культура компоненттери менен чектелет. Бирок мындай жөнөкөйлөштүрүлгөн система чыныгы адамдын кан айлануусундагы нуклеаза активдүүлүгүн, ткандардан келип чыккан фондук cfDNAны жана физиологиялык тазалануу механизмдерин камтыбайт.

Изилдөөнүн негизги көйгөйү

ctDNA учурда ракты аныктоо, дарылоого жоопту көзөмөлдөө жана минималдуу калдык ооруну баалоо сыяктуу тармактарда изилденип жаткан маанилүү суюк биопсия биомаркери. Бирок ctDNA мааниси эмнени билдирерин түшүнүү үчүн ДНК шишик клеткасынан качан, кайсы клеткалык процесстин натыйжасында жана кандай өлчөмдөгү фрагменттер түрүндө бөлүнүп чыгарын билүү керек.

Мисалы, дарылоодон кийин плазмадагы ctDNA деңгээлинин жогорулашы биринчи караганда шишик жүгү көбөйдү деп чечмелениши мүмкүн. Бирок химиотерапия көп сандагы шишик клеткаларын өлтүрүп жатса, ошол эле мезгилде клеткалардан көп өлчөмдө ДНК бөлүнүп чыгышы да мүмкүн. Бул изилдөө ушул биологиялык аралашууну көзөмөлдөнгөн клетка культурасы шарттарында изилдейт.

Изилдөөдө колдонулган клетка моделдери

Ар бир культура чөйрөсүнө %10 fetal bovine serum, %1 пенициллин-стрептомицин жана 2 mM GlutaGro кошулган. Изилдөөдө колдонулган бардык клетка линияларынын микоплазма тесттери терс болгон.

Химиотерапия шарттары

cfDNA бөлүнүп чыгуу эксперименттеринде cisplatin концентрациясы 0.002 mg/mL, 5-fluorourasil (5-FU) концентрациясы болсо 0.0032 mg/mL деңгээлинде туруктуу кармалган. Cisplatin %0.9 NaCl ичинде, 5-FU болсо диметилсульфоксидде (DMSO) эритилген. Cisplatin эксперименттеринде көлөмү теңештирилген saline, 5-FU эксперименттеринде көлөмү теңештирилген DMSO ташуучу-контролу колдонулган.

2-сүрөт экспериментинде культура чөйрөсүндөгү акыркы saline үлүшү %0.4 v/v, DMSO үлүшү %0.032 v/v болгон. Муну менен дарынын таасирин эриткичтен келип чыккан таасирден ажыратуу көздөлгөн.

Авторлор алдын ала эксперименттерде пассаждоодон жана трипсинизациядан кийинки алгачкы 24 саатта клеткалар көп өлчөмдө cfDNA бөлүп чыгарарын байкашкандыктан, бардык негизги эксперименттерде клеткаларга алгач 24 саат жабышууга жана өсүүгө мүмкүнчүлүк беришкен. Бул деталь маанилүү; болбосо клеткаларды иштетүүнүн өзү жараткан cfDNA бөлүнүп чыгышы химиотерапиянын таасири менен аралашып кетмек.

Клетка культурасынын үстүңкү суюктугу кантип даярдалган?

Эксперименттин аягында клетка культурасынын үстүңкү суюктугу адегенде 300×gде 5 мүнөт, андан кийин 1000×gде 10 мүнөт центрифугаланып, cfDNA изоляциясына чейин −20 °C температурада сакталган.

Авторлор культуранын үстүңкү суюктугундагы ажырап калган клеткалар да cfDNAга салым кошушу мүмкүн деп эсептегендиктен, бетке жабышкан жана ажырап калган клеткаларды тең санап, нормалдаштыруу үчүн жалпы клетка санын колдонушкан. Клеткаларды эсептөө Countess 3 автоматтык клетка эсептегичи жана trypan blue менен жүргүзүлүп, ар бир үлгү техникалык жактан эки жолу өлчөнгөн.

Жалпы cfDNA кантип өлчөнгөн?

cfDNA QIAamp Circulating Nucleic Acid кити менен 3 mL үлгүдөн бөлүнүп алынган. Стандарттык протокол өзгөртүлүп, ATL ткань лизис буфери колдонулган эмес жана эки баскычтуу элюция жүргүзүлгөн: адегенде 20 µL, андан кийин 10 µL AVE буфери. Ошентип жалпы элюция көлөмү 30 µL болгон.

Жалпы кош чынжырлуу ДНК Qubit dsDNA High Sensitivity кити менен өлчөнгөн. Ар бир өлчөөгө 1 µL ДНК колдонулуп, үлгүлөр техникалык дубликат катары талданган.

Qubit бардык кош чынжырлуу ДНКны өлчөгөндүктөн, рак клеткасына мүнөздүү эмес. Ошондуктан изилдөөчүлөр FBS камтыган культура чөйрөсү же экстракция процесси жаратышы мүмкүн болгон фонду көзөмөлдөө үчүн культура чөйрөсү гана бар контролдорду жана PBS экстракция blank үлгүлөрүн да иштетишкен. Төмөн, бирок өлчөөгө мүмкүн болгон Qubit сигналы аныкталган. Ошого карабастан, бирдей чөйрө жана иштетүү шарттарынын топтор арасында колдонулушу жана клетка саны менен байланыштын мутацияга мүнөздүү ddPCR аркылуу да тастыкталышы негизги клетка-саны байланышын колдогон.

ddPCR Бул Изилдөөдө Эмне Үчүн Колдонулду?

Тамчылуу санариптик PCR (droplet digital PCR; ddPCR), A549, FLO-1 жана OE19 клеткаларында болгон өзгөчө KRAS же TP53 мутацияларын бутага алуу менен культура чөйрөсүндөгү ДНК тиешелүү рак клетка линиясынан келип чыкканын тандалма түрдө сандык баалоо үчүн колдонулган; муну менен Qubit өлчөгөн жалпы ДНК сигналына мутацияга мүнөздүү экинчи өлчөө катмары кошулган.

ddPCRдин негизги логикасы

ddPCR үлгүнү көп сандагы микроскопиялык тамчыларга бөлөт. Ар бир тамчы бута ДНК ырааттуулугун камтышы же камтыбашы мүмкүн. PCRден кийин флуоресценция-оң жана флуоресценция-терс тамчылардын саны бааланып, Poisson статистикасы менен баштапкы бута ДНК концентрациясы эсептелет.

Изилдөөдө mutant жана wild-type ырааттуулуктарын ажыратуу үчүн FAM жана HEX менен белгиленген зонддор колдонулган. Ар бир клетка линиясы үчүн синтетикалык mutant жана wild-type gBlock ДНК контролдору менен annealing температурасы оптималдаштырылган.

Праймер жана зонд маалыматы

ddPCR реакциясынын шарттары

• 10 µL 2× ddPCR Supermix for Probes колдонулган.
• Forward жана reverse праймерлердин ар бири 900 nM.
• FAM/HEX зонддору 250 nM.
• Ар бир реакцияга 2 µL ДНК кошулган.
• Тамчы түзүүдө 70 µL Droplet Generation Oil колдонулган.
• Тамчылар Bio-Rad QX200 Droplet Generator менен түзүлүп, QX200 Droplet Reader менен окулган.
• Баштапкы денатурация 95 °Cде 10 мүнөт.
• Андан кийин 50 PCR цикли жүргүзүлгөн: 95 °Cде 30 секунд, клетка линиясына мүнөздүү 54–62 °C annealing температурасында 1 мүнөт жана 72 °Cде 30 секунд.
• Акыркы баскыч 98 °Cде 5 мүнөт.
• Ramp ылдамдыгы 2 °C/s.
• Бардык үлгүлөр техникалык дубликат катары талданган.
• 10.000ден аз тамчы түзгөн үлгүлөр талдоодон чыгарылган.

Mutant ДНК көчүрмөлөрүнүн саны кантип эсептелди?

Булакта жалпы mutant көчүрмөлөрүнүн санын эсептөө төмөнкү байланыш менен берилген:

\[ \text{Mutant kopya sayısı} = \left(\text{ortalama mutant hedef konsantrasyonu}\right) \times 20\,\mu L \times \frac{30\,\mu L}{2\,\mu L} \]

Биринчи көбөйтүүчү — QuantaSoft тарабынан Poisson моделдөөсү менен бааланган mutant бута концентрациясы. 20 µL — толук PCR реакциясынын көлөмү. Реакцияга жалпы 30 µL ДНК элюатынын болгону 2 µL кошулгандыктан, \(30/2=15\) масштабдоо коэффициенти талданган aliquotтон толук экстракцияланган ДНК үлгүсүнө кайра эсептөө үчүн колдонулат.

Ошондуктан формула PCR түтүкчөсүндөгү mutant ДНКны гана эмес, 30 µL жалпы cfDNA элюатындагы болжолдуу mutant көчүрмөлөрүнүн санын берет.

Жалган-оң ddPCR сигналы кантип көзөмөлдөндү?

Ар бир мутацияга мүнөздүү тест үчүн 10 көз карандысыз экспериментте 10 no-template control реакциясы бааланган. Кайсы бир NTC реакциясында эң көп дегенде бир mutant-оң тамчы байкалган. Изилдөөчүлөр ушул фондук деңгээлди эске алып, эки же андан аз mutant-оң тамчы камтыган эксперименттик үлгүлөрдү консервативдүү түрдө терс деп кабыл алышкан.

Клетка саны менен cfDNAнын ортосундагы байланыш

Бардык корреляция коэффициенттеринин оң жана жогору болушу клеткалар көп болгон культураларда cfDNA да көбүрөөк экенин көрсөтөт. Pearson корреляциясы сызыктуу байланыштын күчүн өлчөйт; \(r=1\)ге жакындаган маанилер күчтүү оң сызыктуу байланышка туура келет. Бирок корреляция өз алдынча биологиялык себептүүлүк механизмин далилдебейт.

Химиотерапиядан кийин бир клеткага туура келген cfDNA

A549, FLO-1 жана OE19 клеткалары химиотерапия эксперименттеринде тиешелүүлүгүнө жараша 50.000, 125.000 жана 500.000 клетка болуп себилген. Бул баштапкы сандар ар башка көбөйүү ылдамдыктарына карабастан үстүңкү суюктук алынганда болжол менен %80 конфлюенцияга жетүү үчүн тандалган.

72 сааттык cisplatin же 5-FU колдонулгандан кийин cfDNA маанилери, дарылоолор клетканын көбөйүшүн жана жалпы клетка санын өзгөрткөндүктөн, үлгү алынган учурдагы жалпы клетка санына нормалдаштырылган. Ошентип изилдөө “культурада жалпы канча ДНК бар?” деген суроодон көрө “бир клеткага салыштырмалуу ДНК бөлүнүп чыгышына дарылоо кандай таасир берет?” деген суроону баалаган.

Үч клетка линиясында тең химиотерапиядан кийин бир клеткага туура келген cfDNA бөлүнүп чыгышы көбөйгөн. Булак муну химиотерапияга байланыштуу цитотоксикалуулук cfDNA бөлүнүп чыгышын көбөйтөт деп чечмелейт.

Химиотерапиядан Кийинки cfDNA Көбөйүшүн Кантип Чечмелөө Керек?

Бул изилдөөгө ылайык, химиотерапиядан кийин эрте мезгилде көбөйгөн cfDNA шишик клеткаларынын саны көбөйгөнүн гана билдирбеши мүмкүн; цитотоксикалык дарылоого сезгич рак клеткаларынын өлүшү жана ДНКны клеткадан тышкаркы чөйрөгө бөлүп чыгарышы да cfDNA деңгээлин убактылуу жогорулатышы мүмкүн. Бирок бул жыйынтык in vitro моделге негизделет жана бейтапта дарылоонун ийгилигинин түз көрсөткүчү катары колдонулардан мурда убакыт, ДНКнын тазаланышы жана клиникалык шишик жүгү сыяктуу өзгөрмөлөр менен тастыкталышы керек.

Cisplatinге туруктуу OE19 модели кантип түзүлдү?

Parental OE19 клеткалары 5 µmol/L cisplatinге 72 саат дуушар кылынган, андан кийин химиотерапиясыз чөйрөдө калыбына келүүсүнө мүмкүнчүлүк берилген. Клеткалар %70–80 конфлюенцияга жеткенде пассаждалып, 24 сааттан кийин ошол эле процесс кайталанган.

Бул цикл 3 ай улантылган. Туруктуу фенотип андан кийин ар үч пассажда бир cisplatin колдонуу менен сакталган. Негизги эксперименттердин алдында туруктуу клеткалар кеминде бир толук пассаж бою cisplatinсиз чөйрөдө өстүрүлгөн.

CCK-8 менен туруктуулукту ырастоо

CCK-8 экспериментинде ар бир чуңкурчага 4000 клетка кошулуп, эксперименттер трипликат жүргүзүлгөн. Клеткалар 24 сааттан кийин 1, 2, 4, 8, 16, 32 же 64 µg/mL cisplatin менен 48 саат иштетилген. Андан кийин CCK-8 реагенти кошулуп, 450 nm абсорбанс өлчөнгөн.

CCK-8 клеткалардын метаболизмдик активдүүлүгүнө байланышкан түс өзгөрүүсүн колдонуп салыштырмалуу клетка жашоо жөндөмдүүлүгүн баалоочу тест. Доза көбөйгөн сайын жашоо жөндөмдүүлүгү канчалык төмөндөгөнү өлчөнүп, дарыга сезгичтик ийри сызыгы алынат.

IC50 деген эмне?

IC50 — белгилүү эксперименттик шарттарда клетканын жашоо жөндөмдүүлүгүн же өлчөнгөн биологиялык таасирди жарым-максималдуу деңгээлге төмөндөтүү үчүн талап кылынган дары концентрациясы. Ошол эле эксперименттик системада жогорураак IC50 клеткалар ошол эле басаңдатуучу таасирди жаратуу үчүн жогорураак дары концентрациясын талап кыларын жана демек, туруктуураак экенин көрсөтөт.

Туруктуу клеткаларда IC50 болжол менен 2.34 эсе жогорулаган. Эки-жолдуу ANOVA cisplatin концентрациясы, клетка линиясы жана алардын өз ара таасири үчүн \(p<0.0001\) деп билдирген.

Доза-жооп ийри сызыктары төрт параметрлүү, өзгөрмө ылдыйлыгы бар ингибитордук доза-жооп модели менен ылайыкталган. Моделдин жогорку чеги %100 нормалдаштырылган жашоо жөндөмдүүлүгүнө бекитилип, төмөнкү чеги 0дөн чоң болушу менен чектелген; IC50 жана Hill ылдыйлыгы эркин калтырылган. Булак бул моделдин ачык алгебралык формуласын бербегендиктен, Verianla булакка таандык эмес теңдемени кошпойт.

Химиорезистенттүүлүк cfDNA Бөлүнүп Чыгуу Кинетикасына Кантип Таасир Этти?

Cisplatinге сезгич parental OE19 клеткалары жана cisplatinге туруктуу OE19 клеткалары беш күн бою күн сайын cisplatin алганда эки топто тең бир клеткага туура келген cfDNA көбөйгөн, бирок сезгич клеткалар көптөгөн убакыт чекиттеринде туруктуу клеткаларга караганда олуттуу көбүрөөк cfDNA бөлүп чыгарган; ошондуктан булак cfDNA бөлүнүп чыгышынын көлөмү химиотерапия жараткан цитотоксикалуулуктун даражасы менен байланышта деп баалаган.

Беш күндүк кинетика эксперименти

Parental жана туруктуу OE19 клеткаларына беш күн бою күн сайын cisplatin колдонулуп, культуранын үстүңкү суюктугу ар 24 саат сайын чогултулган. Жалпы cfDNA Qubit менен, мутацияга мүнөздүү cfDNA ddPCR менен өлчөнгөн.

Бардык маанилер ар бир үлгү алынган учурдагы жалпы клетка санына нормалдаштырылган. Эки-жолдуу ANOVAда убакыт, эксперименттик шарт жана убакыт × шарт өз ара таасиринин баары үчүн \(p<0.0001\) билдирилген.

Сезгич parental OE19 клеткаларында cisplatinге байланыштуу cfDNA бөлүнүп чыгышы туруктуу клеткаларга караганда жогору болгон жана Sidak түзөтүүсү менен салыштырууларда бир нече убакыт чекитинде \(p<0.05\) деңгээлинде айырма болгон.

Бул табылга “туруктуу клетка эч кандай cfDNA бөлүп чыгарбайт” дегенди билдирбейт. Туруктуу клеткаларда да cisplatin астында бөлүнүп чыгуу көбөйөт; негизги айырма — бөлүнүп чыгуунун көлөмү жана убакыт ичиндеги жүрүм-туруму.

cfDNA Фрагментинин Өлчөмүндөгү Өзгөрүү Эмнени Көрсөтөт?

Cisplatinден кийин сезгич да, туруктуу да OE19 культураларында cfDNA бөлүштүрүлүшүнүн чоңураак ДНК фрагменттерине карай жылышы химиотерапия бөлүнүп чыккан ДНКнын көлөмүнө гана эмес, ДНК кайсы клетка өлүмү жана клеткадан тышкаркы иштетүү процесстеринен өтөрүнө да таасир этиши мүмкүн экенин көрсөтөт; бирок Annexin V/PI жана фрагмент өлчөмү өз алдынча белгилүү бир өлүм жолун так аныктай албайт.

ДНК фрагментинин өлчөмү кантип өлчөндү?

ДНК өлчөмү Agilent 4150 TapeStation автоматташтырылган электрофорез системасы менен бааланган. Эки башка ScreenTape системасы бири-бирин толуктоочу максатта колдонулган:

• Genomic DNA ScreenTape: 150–50.000 bp аралыгындагы жалпы фрагмент бөлүштүрүлүшү жана орточо фрагмент өлчөмү.
• Cell-free DNA ScreenTape: 50–700 bp аралыгындагы кыска ДНК фрагменттеринин үлүшү.

Фрагмент талдоосу cisplatin дарылоосунун 3. күнүндө жүргүзүлгөн. Ошол эле күнү Annexin V/PI агымдык цитометриясы жүргүзүлүп, ДНК өлчөмү менен клетка өлүмүнүн профили ошол эле эксперименттик убакыт чекитинде бааланган.

Кандай фрагмент өлчөмдөрү байкалды?

Cisplatin менен дарылоо parental да, туруктуу да OE19 клеткаларында орточо ДНК фрагментинин өлчөмүн көбөйткөн. 134–200 bp жана 50–700 bp аралыгындагы ДНКнын жалпы cfDNAдагы үлүшү азайып, 1000–15.000 bp жана 1000 bpден жогору фрагменттердин үлүшү көбөйгөн.

Annexin V жана propidium iodide эмнени көрсөтөт?

Annexin V клетка мембранасында фосфатидилсериндин сырткы бетке өтүшүн аныктоо үчүн колдонулат жана апоптоз менен байланышкан көрсөткүч. Propidium iodide (PI) бүтүн клетка мембранасынан оңой өтө албагандыктан, PI-оңдук мембрананын бүтүндүгү жоголгонун көрсөтөт.

Жалпы чечмелөөдө Annexin V-терс / PI-терс клеткалар тирүү популяцияга; Annexin V-оң / PI-терс клеткалар эрте апоптоздук процесске; кош-оңдук болсо кеч апоптозго, экинчилик некрозго же мембрана өткөрүмдүүлүгү жоголгон башка кеч стадиядагы өлүм абалдарына шайкеш келет.

Бул изилдөө үчүн өзгөчө маанилүү чектөө — Annexin V/PI талдоосу кеч апоптозду, экинчилик некрозду, некроптозду же башка жөнгө салынган клетка өлүмүнүн жолдорун так ажырата албайт.

Агымдык цитометрия шарттары

Болжол менен 20.000 клетка/үлгү BD FACS-CANTO II менен болжол менен 500 клетка/секунд ылдамдыкта талданган. Адегенде FSC-A/SSC-A менен debris чыгарылып, андан кийин singlet клеткалар тандалып, Annexin V/PI quadrant gating колдонулган. Талдоо FlowJo V11 менен жүргүзүлгөн.

Cisplatin parental OE19 клеткаларындагы Annexin V/PI кош-терс тирүү фракцияны олуттуу азайткан:

\[ p_{\text{Sidak}}=0.0120 \]

Туруктуу OE19 клеткаларындагы азайыш кичирээк жана статистикалык жактан маанилүү эмес:

\[ p_{\text{Sidak}}=0.2908 \]

Эки клетка тобунда тең PI-оң жана Annexin V/PI кош-оң популяциялардын көбөйүшү мембрана өткөрүмдүүлүгүнүн бузулушу жана клетка өлүмүнүн кеч баскычтагы процесстеринин көбөйүшү менен шайкеш.

Бул схеманын негизги билдирүүсү

Булактын бардык эксперименттери чогуу каралганда cfDNA бир өлчөмдүү “шишик көлөмүнүн эсептегичи” эмес экени көрүнөт. Бир эле cfDNA өлчөөсүнө төрт өзүнчө биологиялык компонент таасир этиши мүмкүн: клетка саны, дарылоого байланыштуу цитотоксикалуулук, дарыга сезгичтик/туруктуулук жана ДНКнын кайсы клетка өлүмү же клеткадан тышкаркы иштетүү механизми аркылуу бөлүнүп чыгышы.

Изилдөөнүн Ыкмасы жана Жыйынтыктары

Эксперименттик дизайндын кадам-кадам жыйынтыгы

Статистикалык талдоо

Статистикалык талдоо GraphPad Prism 10, версия 10.6.1 менен жүргүзүлгөн. Маалыматтар көз карандысыз биологиялык кайталоолордун орточо ± стандарттык четтөөсү катары берилген.

• Клетка саны менен cfDNAнын ортосундагы сызыктуу байланыш үчүн Pearson корреляция коэффициенти колдонулган.
• Эки топту салыштырууда эки тараптуу көз карандысыз үлгүлөрдүн t-тести колдонулган.
• Бир нече топ же эксперименттик фактор болгон эксперименттерде эки-жолдуу ANOVA колдонулган.
• Жуптар аралык салыштыруулар Sidak көп жолку салыштыруу тести менен оңдолгон.
• CCK-8 доза-жооп ийри сызыктары төрт параметрлүү өзгөрмө ылдыйлыгы бар nonlinear регрессия менен моделденген.
• IC50 үчүн %95 profile-likelihood ишеним аралыгы билдирилген.
• Статистикалык маанилүүлүк чеги \(p<0.05\).

Көз карандысыз биологиялык кайталоо менен техникалык кайталоонун айырмасы

Биологиялык кайталоо — экспериментти көз карандысыз культура/үлгү шарттарында кайра жүргүзүү жана ал биологиялык өзгөрмөлүүлүктү чагылдырат. Техникалык кайталоо — ошол эле биологиялык үлгүнүн өлчөө процессин бир нече жолу жүргүзүү жана аппараттан же өлчөөдөн келип чыккан өзгөрмөлүүлүктү көзөмөлдөөгө жардам берет.

Изилдөөнүн негизги эксперименттеринин көбү n=3 көз карандысыз биологиялык кайталоо менен жүргүзүлгөн. Qubit, TapeStation жана ddPCR сыяктуу көптөгөн өлчөөлөр кошумча техникалык дубликат катары аткарылган. Авторлор n=3 өзгөчө статистикалык маанилүү эмес жыйынтыктарды чечмелөөдө статистикалык күчтү чектеши мүмкүн экенин ачык белгилешет.

Изилдөөнүн эң күчтүү түз табылгалары

Изилдөө колдобогон жыйынтыктар

• Бейтап плазмасында химиотерапиядан кийинки ctDNA көбөйүшү сөзсүз дарылоонун ийгилигин көрсөтөт деген жыйынтык чыгарууга болбойт.
• Бул изилдөө ctDNA үчүн клиникалык диагностикалык чек же дарылоону өзгөртүү алгоритмин иштеп чыккан эмес.
• cfDNA фрагментинин өлчөмүнө гана карап клетка так апоптоз, некроз, некроптоз же башка өлүм механизми менен өлгөн деп айтууга болбойт.
• Cisplatinдин фрагмент өлчөмүнө кошкон салымы менен клетка өлүмү механизминин салымы бири-биринен толук ажыратылган эмес.
• Үч клетка линиясындагы жыйынтыктарды бардык рак түрлөрүнө жалпылоого болбойт.
• Эки өлчөмдүү клетка культурасынын cfDNA кинетикасы адамдын кан айлануусундагы ctDNA кинетикасына бирдей эмес.
• Иммунотерапияда, бутага багытталган дарылоодо же башка дары класстарында ошол эле фрагментация үлгүлөрү пайда болору бул изилдөө тарабынан көрсөтүлгөн эмес.
• Ар кандай химиотерапия дозаларынын cfDNA бөлүнүп чыгышына жана фрагментациясына доза-жооп байланышы системалуу түрдө текшерилген эмес.

In vitro менен клиникалык чөйрөнүн негизги айырмалары

Клетка культураларында бөлүнүп чыккан cfDNA түздөн-түз айланадагы культура чөйрөсүндө топтолот. Адамдын организминде болсо шишик ДНКсы ткань аралык мейкиндиктен канга же башка биологиялык суюктуктарга өтүшү керек. Клиникалык үлгүдөгү өлчөөгө мүмкүн болгон ctDNA деңгээлине төмөнкү процесстер да таасир берет:

• Шишиктин анатомиялык жайгашуусу жана кан айланууга жакындыгы.
• Кадимки ткандардан келген чоң cfDNA фону.
• ДНКнын нуклеазалар менен ажыроосу.
• Иммундук клеткалар тарабынан тазалануу.
• Бөйрөк фильтрациясы.
• ДНКнын кан же башка биологиялык суюктуктарда ташылышы.

Изилдөөдөгү in vitro системада физиологиялык нуклеазалар жок болгондуктан, байкалган фрагмент профилдери негизинен алгач бөлүнүп чыккан ДНКнын касиеттерин чагылдырат. Бейтап плазмасындагы ДНК болсо бөлүнүп чыккандан кийин кошумча иштетүүгө жана тазаланууга дуушар болот.

Фрагментация жыйынтыгын чектеген техникалык факторлор

Авторлор ДНК фрагменттеринин бөлүштүрүлүшүн клетка өлүмү гана аныктабай турганын өзгөчө белгилешет. Cisplatin ДНК кайчылаш байланыштарын жана кош чынжырлуу үзүлүүлөрдү жаратып, фрагмент өлчөмүнө түздөн-түз таасир этиши мүмкүн. ДНК изоляция ыкмасы ар башка өлчөмдөгү фрагменттерди ар башка эффективдүүлүк менен кайра алышы да өлчөнгөн бөлүштүрүлүштү өзгөртүшү мүмкүн.

Мындан тышкары, үстүңкү суюктук 300×g жана 1000×g центрифугалоодон өткөрүлсө да, бардык клеткалык debris толугу менен алынып салынганы кепилденбейт. Калган debris өзгөчө чоң ДНК фрагменттеринин бир бөлүгүнө салым кошушу мүмкүн.

Үлгү алуу убактысы клиникалык жактан эмне үчүн маанилүү болушу мүмкүн?

Булак талкуулаган убакытка көз каранды моделге ылайык, цитотоксикалык дарылоодон дароо кийин көп сандагы сезгич шишик клеткаларынын өлүшү ctDNAнын убактылуу жогорулашына алып келиши мүмкүн. Дарылоо натыйжалуу улана берген сайын сезгич шишик клеткалары азайып, кийинки өлчөөлөрдө ctDNA төмөндөшү күтүлүшү мүмкүн. Тескерисинче, дарылоонун кийинки жүрүшүндө ctDNA тазаланбай калышы же жогору бойдон турушу туруктуу оорунун улануусу менен байланыштуу болушу мүмкүн.

Бул модель ушул макаланын клетка культурасы табылгалары менен авторлор талкуулаган мурунку клиникалык изилдөөлөрдү бирге чечмелөөгө негизделет. Изилдөө өзү бул убакыт катарын бейтаптарда сынаган эмес. Ошондуктан клиникалык практикада ылайыктуу кан алуу убактысын аныктоо үчүн жогорку жыштыктагы longitudinal бейтап үлгүлөрү керек.

Преклиникалык дары скринингиндеги мүмкүн болгон мааниси

Авторлор cfDNA генетикалык мутацияларды гана эмес, дарылоого байланыштуу клетка өлүмүн жана фрагментация жүрүм-турумун да чагылдырышы мүмкүн деп эсептегендиктен, cfDNA профилин преклиникалык дары скринингинде кошумча функционалдык биомаркер катары баалашат.

Бул колдонуу азырынча тастыкталган клиникалык тест эмес. Изилдөө 2D клетка культурасына негизделет. Бейтаптан алынган органоиддер жана organ-on-chip системалары сыяктуу физиологияга жакыныраак моделдер ошол эле механизмдерди келечекте тастыктоого мүмкүн болгон эксперименттик платформалар катары сунушталат.

Изилдөөнүн негизги чектөөлөрү

• Бардык эксперименттер in vitro жүргүзүлгөн.
• Адам организминдеги ДНК тазалануу процесстери моделде жок.
• Физиологиялык нуклеазалар жок.
• Annexin V/PI белгилүү клетка өлүмүнүн жолдорун так ажырата албайт.
• Cisplatin ДНКнын физикалык фрагментациясына түздөн-түз таасир этиши мүмкүн.
• ДНК экстракция ыкмасы фрагмент өлчөмүнө жараша ар башка кайра алуу эффективдүүлүгүн көрсөтүшү мүмкүн.
• Центрифугалоодон кийин калган клеткалык debris толугу менен четтетилген эмес.
• Изилдөө цитотоксикалык химиотерапияга жана solid шишик клетка моделдерине гана багытталган.
• Химиотерапия дозасы cfDNA бөлүнүп чыгышы жагынан системалуу доза сериясы түрүндө изилденген эмес.
• Негизги эксперименттердин көбүндө болгону үч көз карандысыз биологиялык кайталоо бар.
• Көбүрөөк клетка модели, дарылоо түрү жана in vivo тастыктоо талап кылынат.

Булак жана Ыкма Жөнүндө Эскертүү

Түпнуска аталышы: Cell-Free DNA Release Kinetics and Fragmentation Reflect Treatment Response and Resistance In Vitro

Авторлор: Alexandra Bartolomucci; Laura Kienzle; Sarah Tadhg Ferrier; Benjamin Forgie; Thupten Tsering; Kyle Dickinson; Lorenzo Ferri; Jonathan Cools-Lartigue; Julia V. Burnier.

Авторлордун тартиби: Булактагы тартип сакталган.

Жооптуу автор: Julia V. Burnier.

Тең салым: Булакта тең салым / биргелешкен биринчи авторлук жөнүндө билдирүү жок.

Мекемелер: Cancer Research Program, Research Institute of the McGill University Health Centre; Department of Pathology, McGill University; Division of Thoracic Surgery, McGill University Health Centre; Gerald Bronfman Department of Oncology, McGill University; Goodman Cancer Institute, McGill University; Montreal, Канада.

Журнал: Cells.

Басмакана: MDPI.

Жыл: 2026.

Том / сан / макала номери: 15(17), 1561.

DOI: 10.3390/cells15171561.

Келип түшкөн дата: 26 Июнь 2026.

Ревизия: 22 Август 2026.

Кабыл алуу: 26 Август 2026.

Жарыялоо: 28 Август 2026.

Булак түрү: Түпнуска изилдөө макаласы.

Рецензия статусу: Журналда жарыяланган жана кабыл алуу/ревизия процессинен өткөн рецензияланган изилдөө.

Лицензия: Creative Commons Attribution, CC BY.

Негизги сөздөр: ctDNA; cfDNA; biomarker; chemotherapy resistance; treatment response; esophageal adenocarcinoma.

Каржылоо: Canadian Cancer Society Emerging Scholar Award #707153 жана Fonds de Recherche du Québec en Santé колдоолору; булак J.V.B. үчүн #312831 жана A.B. үчүн #330312 номерлерин билдирет.

Этика кеңеши: Institutional Review Board Statement: колдонулбайт.

Маалымдалган макулдук: Колдонулбайт.

Маалыматтардын жеткиликтүүлүгү: Макаланын жыйынтыктарын колдогон чийки маалыматтар авторлордон суроо-талап боюнча берилери көрсөтүлгөн.

Кызыкчылыктардын кагылышы: Авторлор кызыкчылыктардын кагылышы жок экенин билдиришет.

Авторлордун салымдары: Концептуалдаштыруу J.V.B.; ыкма A.B. жана J.V.B.; валидация A.B.; формалдуу талдоо A.B., S.T.F., B.F., T.T. жана K.D.; изилдөө A.B., L.K., S.T.F., B.F., T.T. жана K.D.; ресурстар L.F. жана J.V.B.; алгачкы долбоор A.B.; карап чыгуу жана редакциялоо A.B., L.K., S.T.F., T.T., K.D., L.F., J.C.-L. жана J.V.B.; визуалдаштыруу A.B.; супервизия J.V.B.; каржылоону алуу J.C.-L. жана J.V.B.

Негизги ыкмалар: Qubit флуорометриясы; мутацияга мүнөздүү ddPCR; CCK-8 доза-жооп талдоосу; Agilent 4150 TapeStation фрагмент талдоосу; Annexin V/PI агымдык цитометриясы; Pearson корреляциясы; эки тараптуу көз карандысыз t-тести; эки-жолдуу ANOVA; Sidak көп жолку салыштыруусу; төрт параметрлүү nonlinear доза-жооп регрессиясы.

Негизги эксперименттик чек: Изилдөө 2D рак клетка культураларында жүргүзүлгөн. Бейтап плазмасы, in vivo ctDNA тазаланышы жана чыныгы клиникалык дарылоо чечимдери түздөн-түз текшерилген эмес.

Негизги чечмелөө чеги: Булак эрте дарылоодон кийинки ctDNA/cfDNA көбөйүшү цитотоксикалык клетка өлүмүнөн келип чыгышы мүмкүн экенине механисттик колдоо берет; бирок бир эле жогорулаган ctDNA өлчөөсүн бейтапта дарылоонун ийгилиги же оорунун өрчүшү катары кантип классификациялоо керектигин аныктаган клиникалык чек сунуштабайт.