PM16 — Proteus mirabilis бактериясын жуктуруп, аны лизиске учурата алган литикалык бактериофаг; бул изилдөө PM16, анын бактериялык кожоюну P. mirabilis жана сүт эмүүчүлөрдүн иммундук системасынын ортосундагы үч тараптуу байланышты эркек BALB/c чычкандарында изилдеген эксперименттик жаныбардык изилдөө болуп саналат. Изилдөөчүлөр PM16га каршы алдын ала түзүлгөн гуморалдык иммунитет кийинки P. mirabilis инфекциясында бактерияга каршы IgG жообун өзгөртөбү, пайда болгон anti-PM16 антителолору фагды нейтралдаштырабы жана бул антитело жооптору эксперименттик фаг терапиясынын модели менен кандайча өз ара аракеттенерин изилдешкен.

Бактериофаг же кыскача фаг — бактерияларды жуктуруучу вирус. PM16нын бута-бактериясы P. mirabilis; PM16 чычкандын клеткаларын жуктуруучу сүт эмүүчүлөрдүн вирусу катары изилденген эмес. Гуморалдык иммунитет болсо адаптивдүү иммунитеттин антителолор аркылуу иштеген бөлүгү. Бул изилдөөнүн негизги антитело өлчөөлөрүндө Immunoglobulin G (IgG) бааланган.

Жалпысынан 27 эки айлык эркек BALB/c чычканы адегенде үч негизги топко бөлүнгөн. Биринчи топ %0,9 NaCl, экинчи топ Freund адъювантын, үчүнчү топ болсо PM16 + Freund адъювантын алган. Биринчи иммунизация Gün 0дө complete Freund's adjuvant (CFA), кайталама иммунизация Gün 14тө incomplete Freund's adjuvant (IFA) колдонуу менен жүргүзүлгөн. Төрт жумадан кийин ар бир негизги топ үч кичи топко бөлүнгөн: mock инфекция, жалгыз P. mirabilis инфекциясы жана P. mirabilis инфекциясынан 1 саат өткөндөн кийин PM16 берилген моделдик фаг терапиясы. Ар бир Faz II кичи тобунда болгону үч чычкан болгон.

P. mirabilis дозасы ар бир чычканга \(10^8\) CFU, эксперименттик фаг терапиясынын дозасы болсо ар бир чычканга \(10^9\) PFU болгон. Бардык инъекциялар intraperitoneal жол менен берилген. Ошондуктан бул изилдөө клиникалык заара-жыныс жолунун инфекциясындагы табигый жугуу жолун туураган адамдагы дарылоо сыноосу эмес.

Негизги жыйынтык — PM16 бактериялык challengeдан кийин anti-P. mirabilis IgG жообун азайтпастан, тескерисинче эксперименттик шарттарда күчөткөн. Жалгыз бактериялык инфекция алган кичи топтордо орточо деңгээлдеги антибактериялык IgG пайда болсо, инфекциядан 1 саат кийин PM16 берилген тиешелүү кичи топтордо IgG байланышы жогору болгон. Инфекция + PM16 салыштырууларынын үч Faz-I фонунда тең mixed-effects анализиндеги Tukey-түзөтүлгөн \(p\) маанилери \(<0{,}001\).

PM16 + адъювант менен алдын ала иммунизацияланган жаныбарларда күчтүү anti-PM16 IgG жообу жана фагдын литикалык активдүүлүгүн азайта ала турган in vitro нейтралдашуу пайда болгон. Бирок алдын ала болгон бул anti-фаг иммунитет изилдөөдө өлчөнгөн anti-P. mirabilis гуморалдык жообун басаңдаткан эмес.

Изилдөөнүн күтүлбөгөн табылгасы — PM16га мурда кабылган эмес, бирок жалгыз P. mirabilis менен инфекцияланган айрым чычкандардын сывороткалары да PM16га байланып, фагдын функциясын жарым-жартылай бөгөттөй алган. Изилдөөчүлөр мунун эки башка жолун көрсөтүшөт: антибактериялык антителолор бактериянын бетиндеги PM16 адсорбция аймактарын жаап, фагдын кожоюн бактерияга байланышын тосушу мүмкүн; anti-PM16 антителолору болсо фаг бөлүкчөсүнө түз байланып, фагды нейтралдаштырышы мүмкүн.

Биоинформатикалык анализдер бул кайчылаш реактивдүүлүктүн дагы бир мүмкүн болгон түшүндүрмөсүн караган. PM16нын gp31, gp34, gp37, gp38 жана gp45 структуралык белоктору салыштырылган; айрыкча рецептор-байлоочу spike белогу gp45ке окшош тизмектер ар түрдүү P. mirabilis геномдорунда жана Proteus фагдарында табылганы, айрым аймактар потенциалдуу B-cell эпитопторун алып жүрүшү мүмкүн экени божомолдонгон. Бирок бул белоктор инфекция учурунда чындап экспрессияланганы бул изилдөөдө эксперименттик түрдө көрсөтүлгөн эмес. Ошондуктан бактерия кожоюндун иммундук системасын фагдарга каршы кыйыр пайдаланууга мүмкүнчүлүк берет деген “molecular mimicry” модели маанилүү, бирок бардык молекулалык баскычтары али ырастала элек механизмдик сунуш болуп саналат.

Изилдөөнүн жыйынтыгы адамдардагы фаг терапиясынын натыйжалуулугун же коопсуздугун далилдебейт. Биологиялык кичи топтун көлөмү болгону \(n=3\); изилдөө бир гана фаг–бактерия жупту колдонот, инфекция модели non-lethal жана клиникалык жыйынтык ордуна негизинен антитело жооптору бааланган. Ошондуктан жыйынтыктар PM16–P. mirabilis системасы үчүн proof-of-concept деңгээлинде чечмеленүүгө тийиш.

PM16 менен Proteus mirabilis Ортосундагы Байланыш Кандай?

PM16 P. mirabilis бактериясын кожоюн катары пайдаланган литикалык подофаг; фаг бактерияга байланып, бактериянын бетиндеги рецепторлорду таанып, андан соң литикалык инфекцияны баштоого тийиш, ошондуктан фаг бөлүкчөсүнө каршы антителолор да, бактериянын фаг рецепторлорун жаап калган антибактериялык антителолор да PM16 активдүүлүгүнө ар башка механизмдер аркылуу таасир бере алат.

Proteus mirabilis эмнеге маанилүү?

Proteus mirabilis — Gram-терс, swarming motility көрсөтө алган жана уреаза өндүрө алган бактерия. Булак айрыкча анын цистит, pyelonefrit, bacteriuria, bacteremia, urosepsis, заара таштарынын пайда болушу жана катетерге байланышкан инфекциялар менен байланышын баса белгилейт.

Бактериянын катетерлерде biofilm түзө алышы да маанилүү. Biofilm жана кристаллдардын топтолушу катетердин бүтөлүшүнө жана инфекцияланган зааранын кайра агышына алып келиши мүмкүн. Мындан тышкары, ар түрдүү P. mirabilis штаммдарында көп антибиотикке туруктуулук билдирилгени альтернативдүү антибактериялык ыкмаларга кызыгууну күчөтөт.

Фаг терапиясында иммундук система эмнеге эки тараптуу көйгөй жаратат?

Фаг терапиясынын негизги максаты — фагдын бута-бактерияга жетиши, бактерияга адсорбцияланышы, көбөйүшү жана бактериянын лизисине салым кошуусу. Бирок сүт эмүүчүлөрдүн иммундук системасы да фаг бөлүкчөсүн бөтөн антиген катары таанышы мүмкүн.

Мындай учурда эки карама-каршы натыйжа болушу мүмкүн:

• Иммундук система фагды тазалап, анын кан айлануудагы жашоо мөөнөтүн жана бактерияга жетүүсүн азайтышы мүмкүн.
• Фаг бактерия менен иммундук системанын өз ара аракетин өзгөртүп, антибактериялык иммундук жоопту күчөтүшү мүмкүн.

Бул изилдөө дал ушул эки тараптуу мамиленин PM16 системасында кандай жүрөрүн изилдейт.

Алдын ала болгон anti-фаг иммунитет эмнени билдирет?

“Pre-existing humoral immunity” — фаг терапиясы колдонулганга чейин организмде фагга байланыша ала турган антителолордун болушу. Бул изилдөөдө мунун эксперименттик модели PM16ны Freund адъюванты менен эки жолу берүү аркылуу түзүлгөн.

Бирок дизайнда жалгыз PM16 алган өзүнчө алдын ала иммунизация тобу жок. Авторлор муну мурунку иштеринде PM16 өзү эле байкаларлык иммуноген эмес экенин көрсөтүшкөнү менен түшүндүрүшөт. Демек, бул эксперимент PM16 + адъювант иммунизациясын текшерет; PM16нын адъювантсыз алдын ала иммунизация таасирин бул эксперименттин ичинде кайра текшербейт.

Тогуз Кичи Топту Кантип Окуу Керек?

Тогуз кичи топ үч башка алдын ала иммунизация тарыхынын үч башка Faz-II challenge шарты менен айкалышынан түзүлөт; муну менен изилдөөчүлөр PM16га алдын ала кабылганды, жалгыз бактериялык инфекцияны жана инфекциядан кийин PM16 берүүнү бири-биринен ажыратууга аракет кылышкан.

PFU, CFU жана MOI деген эмне?

PFU (Plaque-Forming Unit) — бактерияны функционалдык түрдө жуктуруп, плак түзө алган фагдын санын билдирет. Ал физикалык фаг бөлүкчөлөрүнүн саны менен дайыма бирдей эмес; инфекциялык бирдиктерди гана көрсөтөт.

CFU (Colony-Forming Unit) — культурада колония түзө алган тирүү бактериялык бирдиктер.

MOI (Multiplicity of Infection) — баштапкы колдонулган инфекциялык фаг санынын бута-бактериялардын санына болжолдуу катышы. PM16 көбөйтүлгөндө булак \(OD_{600}=0{,}6\) деңгээлиндеги P. mirabilis культурасын \(MOI=0{,}1\) менен жуктурган.

PM16 кандай даярдалган?

P. mirabilis CEMTC 73 Lysogeny Broth ичинде өстүрүлгөн. PM16 бактериялык культурада көбөйтүлгөндөн кийин PEG 8000 + 2,5 M NaCl менен чөктүрүлүп, PBS pH 8,0 ичинде кайра суспензияланып, цезий хлоридинин градиентинде 22.000 rpm, 2 саат, 4 °C шартында центрифугалоо менен тазаланган.

Тазалоодон кийинки билдирилген фаг титри:

болгон.

LAL эндотоксин тестинде \(10^8\ \mathrm{PFU/mL}\) фаг концентрациясы 0,5 EU/mL эндотоксин деңгээлине туура келери билдирилген. Булак бул маанини парентералдык препараттар үчүн кабыл алынуучу диапазондо деп баалайт. Бул маалымат \(10^9\) PFU/чычкан колдонууда жалпы эндотоксин дозасын өз алдынча эсептөөгө жетишсиз; инъекция көлөмүнө таянып булакта берилбеген дозаны чыгарып алууга болбойт.

Гуморалдык Иммундук Жооп Кантип Өлчөндү?

Anti-P. mirabilis жообу бактерияларга байланышкан сыворотка IgGсинин конфокалдык микроскопиядагы флуоресценция интенсивдүүлүгү менен, anti-PM16 жообу болсо PM16 менен капталган ELISA пластиналарында сыворотка IgG байланышы менен бааланган; бул өлчөөлөр антитело байланышын көрсөтөт, бирок өз алдынча бактериянын өлтүрүлүшүн же клиникалык жакшырууну өлчөбөйт.

P. mirabilisке IgG байланышы тести

96-well микроскопия пластиналары %0,1 poly-L-lysine менен капталып, ар бир чуңкурчага \(10^8\) CFU P. mirabilis кошулган. Бактериялар 37 °Cде 30 мүнөт инкубацияланып, байланышпаган клеткалар жуулган.

Сывороткалар 1:500 суюлтууда бактериялар менен инкубацияланган; чычкан IgGсин көрүү үчүн Alexa Fluor 488-конъюгацияланган anti-mouse IgG жана бактериялык клеткаларды белгилөө үчүн Hoechst 33342 колдонулган.

Сүрөттөр Carl Zeiss LSM710 конфокалдык микроскопунда 1000× чоңойтууда жана бирдей микроскоп орнотуулары менен алынган; клетка сегментациясы жана Mean Fluorescence Intensity (MFI) өлчөөсү CellProfiler v4.2.4 менен жүргүзүлгөн.

MFI жогорулаган сайын эксперимент шарттарында бактерияга байланышкан IgG сигналы күчөдү деп чечмелөөгө болот. Бирок MFI түздөн-түз “канча бактерия өлтүрүлдү” дегенди билдирбейт.

PM16га каршы ELISA

Anti-PM16 IgG өлчөөсүндө 96-well пластиналары ар бир чуңкурчага \(10^8\) PFU PM16 менен капталган. Сывороткалар 1:100дөн башталган беш эселик сериялык суюлтууларда колдонулган.

Bound mouse IgG peroxidase-conjugated anti-mouse IgG жана TMB субстраты менен өлчөнгөн. Булак Figure 3тө \(OD_{450}\) сигналын сыворотка титрлөөсүнө карата көрсөтөт.

Графиктеги бардык чийки \(OD_{450}\) чекиттери булакта таблица түрүндө берилбегендиктен Verianla бул ийри сызыктардан так endpoint titer же аралык маанилерди чыгарбайт.

Anti-P. mirabilis IgG жыйынтыгы

Жалгыз бактериялык challenge алган 2, 5 жана 8-кичи топтордо өлчөнө турган антибактериялык IgG жообу түзүлгөн. Инфекциядан 1 саат кийин PM16 берилген 3, 6 жана 9-кичи топтордо болсо өздөрүнүн infection-only салыштырма топторуна караганда IgG байланышы өскөн.

Булак ошондой эле mouse-level aggregated MFI анализинде Kruskal–Wallis:

натыйжасын жана Dunn post-hoc салыштырууларында тиешелүү жогорку-байланыш топтору үчүн \(p<0{,}05\) маанилерин билдирет.

Кичи топ 9дун IgG деңгээли менен күчтүү adjuvant-background therapy тобу болгон кичи топ 6нын ортосундагы айырма:

болгондуктан колдонулган маанилүүлүк чегинде статистикалык жактан айырмаланган эмес. “Статистикалык жактан айырмаланган жок” деген сөз эки топ биологиялык жактан так бирдей дегенди билдирбейт.

PM16 Нейтралдашуусу Кантип Эсептелди?

PM16 нейтралдашуусу сыворотка менен инкубацияланган фаг үлгүлөрү түзгөн плактардын саны PBS контролундагы плактардын санына салыштырмалуу канчалык азайганы эсептелип аныкталган; жыйынтык пайыздык нейтралдашуу түрүндө берилген.

Бул жерде:

• \(N\): фаг нейтралдашуусунун пайызы.
• \(V_0\): PBS менен инкубацияланган контролдук фаг үлгүсүнүн плак саны.
• \(V_n\): чычкан сывороткасы менен инкубацияланган фаг үлгүсүнүн плак саны.

Эгер сыворотка фагга таптакыр таасир этпесе, \(V_n\) болжол менен \(V_0\)га барабар болуп, \(N\) болжол менен %0 чыгат. Сыворотка фагдын плак түзүшүн азайтса, \(V_n\) төмөндөп, \(N\) өсөт.

PM16нын сериялык суюлтууларынан 20 µL тең көлөмдөгү pooled serum менен аралаштырылып, бөлмө температурасында 1 саат инкубацияланган. Андан кийин аралашма P. mirabilis камтыган top agar үстүнө колдонулуп, 37 °Cде түн бою инкубацияланган.

Маанилүү үлгү чектөөсү: бул нейтралдаштыруу экспериментинде бир эле кичи топтогу сывороткалар бириктирилген. Ошондуктан техникалык кайталануулар болгону менен ар бир чычкандын өзүнчө нейтралдашуу жообун көрсөтүүчү mouse-level биологиялык бөлүштүрүү алынган эмес.

Нейтралдаштыруу экспериментинде эмне табылды?

Кичи топ 1ге салыштырганда кичи топтор 2–4тө маанилүү нейтралдашуу аныкталган эмес. Кичи топ 5 үчүн \(p=0{,}0007\), кичи топ 6 үчүн \(p<0{,}0001\) менен күчөгөн нейтралдашуу билдирилген.

Айрыкча жалгыз P. mirabilis алган кичи топ 5тин сывороткасында тиешелүү mock/adjuvant топ 4кө салыштырганда нейтралдаштыруучу активдүүлүк байкалганы көңүл бурууга татыктуу:

Кичи топ 6 үчүн кичи топ 4кө салыштырганда:

билдирилген.

PM16 + адъювант менен алдын ала иммунизацияланган 7–9-кичи топтордо эң күчтүү нейтралдашуу байкалып, кичи топ 1ге каршы \(p<0{,}0001\) алынган.

Булак берген ачык болжолдуу пайыздык мисалдардын бири — эң жогорку текшерилген PM16 концентрациясында \(10^5\ \mathrm{PFU/\mu L}\) үчүн кичи топ 6дагы нейтралдашуу болжол менен %80 болгон. Авторлор муну assay saturation жок экенин көрсөтүүчү контролдук аргумент катары колдонушат.

Антителолор Фагды Эки Башка Жол Менен Кантип Тосо Алат?

Изилдөөнүн маалыматтары PM16 бир жагынан фаг бөлүкчөсүнө байланышуучу anti-PM16 антителолору менен түздөн-түз нейтралдаштырылышы мүмкүн экенин, экинчи жагынан бактериялык беттик антигендерге байланышкан антибактериялык антителолор PM16 колдончу адсорбция аймактарын жаап калгандыктан анын бактерияга байланышы кыйыр түрдө бөгөттөлүшү мүмкүн экенин көрсөтөт.

PM16 байланыш тести кантип жүргүзүлгөн?

PM16 Alexa Fluor 488 NHS ester менен флуоресценттик белгиленген. NHS ester капсид белокторундагы primary amine топтору менен коваленттик amide bond түзөт.

Булак \(10^{10}\ \mathrm{PFU/mL}\) PM16ны 1, 10 же 100 µM AF488 менен тең көлөмдө аралаштырып; 4 °Cде 24 саат инкубациялап, эркин боёкту Sephadex G-50 size-exclusion chromatography менен алып салган.

Fluorescent labelingден кийин фагдын infectivityси олуттуу бузулбаганы plaque assay менен текшерилген.

Адсорбция экспериментинде иммобилизацияланган P. mirabilis клеткалары чычкан сывороткалары менен 37 °Cде 2 саат опсонизацияланган. Жуугандан кийин plate бетине фаг байланышын алдын алуу үчүн %5 bovine serum albumin менен blocking жүргүзүлүп, ар бир чуңкурчага \(10^9\) PFU флуоресценттик PM16 кошулган.

“Опсонизация” бул жерде эмнени билдирет?

Опсонизация — антителолордун бактериянын бетине байланышы. Бул экспериментте максат фагоцитозду өлчөө эмес; сыворотка антителолору бактериянын бетин жапкандан кийин PM16нын ошол эле бактерияга байланышын өзгөртүп-өзгөртпөгөнү изилденет.

Байланыштын азайышы канчалык чоң болгон?

Cell-level mixed-effects моделинде experimental condition overall таасири маанилүү болгон:

Non-opsonized controlга салыштырганда бардык immune кичи топтордо PM16 флуоресценциялык байланышы баштапкы шкалада болжол менен %2,7–%4,9 азайганы билдирилген.

Cell-level модель көп сандагы бактериялык клетка өлчөөлөрүн пайдаланат; булак ар бир техникалык кайталоо үчүн болжол менен 1000 клетка талданганын билдирет. Бирок бул клеткалар көз карандысыз чычкандар эмес. Биологиялык үлгү көлөмү ар бир кичи топ үчүн кайра эле \(n=3\).

Булак мунун үчүн mouse жана mouse ичиндеги slide деңгээлдерин nested random effects катары камтыган linear mixed-effects model колдонгон. Бул ыкма миңдеген клетка өлчөөлөрүн жаңылыш түрдө миңдеген көз карандысыз жаныбарлар катары баалабоо үчүн маанилүү.

PM16нын infection-only топко кошулушу cell-level моделинде кичине, бирок маанилүү кошумча азайууларды жараткан. Ал эми mouse-level aggregated анализде кичи топ 5 vs. 6 үчүн:

жана кичи топ 8 vs. 9 үчүн:

табылган. Кичи топ 6 жана 9 арасындагы binding inhibition да:

менен айырмаланган эмес.

Бул айырма cell-level жана mouse-level анализдер ар башка статистикалык маалымат алып жүрөрүн көрсөтөт. Өтө көп клетка саны өтө кичине effectтерди статистикалык жактан сезгич кармай алат; бирок биологиялык жалпылоо көз карандысыз чычкандардын саны менен эле чектелет.

Бактериялык Инфекция Эмне Үчүн PM16га Каршы Антитело Жараткан Болушу Мүмкүн?

Булак жалгыз P. mirabilis менен жолуккан чычкандарда байкалган PM16 кайчылаш реактивдүүлүгүн түшүндүрүү үчүн бактериялык геномдордогу профагдан келип чыккан же фаг белокторуна окшош тизмектер жалпы B-cell эпитопторун түзүшү мүмкүн деп сунуштайт; sequence similarity жана epitope prediction бул гипотезаны колдойт, бирок тиешелүү белоктор инфекция учурунда чындап экспрессияланганын түз далилдебейт.

Кайсы PM16 белоктору изилденген?

Референстик фаг геному GenBank:

деп берилген.

PSI-BLAST жана Clustal Omega эмне кылган?

PSI-BLAST алыстагы protein sequence similarityлерди издөө үчүн колдонулган. Булак E-value cutoff:

колдонгон.

Натыйжалар Proteus тукумуна тиешелүү же phage-related тизмектерди сактоо үчүн чыпкаланып, андан кийин Clustal Omega v1.2.4 менен multiple-sequence alignment жүргүзүлгөн.

Shannon энтропиясы эмнени өлчөйт?

Булак ар бир alignment позициясындагы amino-acid ар түрдүүлүгүн:

менен эсептейт.

\(p(X,i)\) — \(i\)-alignment позициясында amino acid \(X\) кездешүү жыштыгы.

Эгер бир позицияда бардык гомолог белоктор бир эле аминокислотаны алып жүрсө, бөлүштүрүү өтө тартиптүү болуп, энтропия төмөн болот. Amino-acid ар түрдүүлүгү өскөн сайын энтропия да өсөт.

Булак normalize conservation scoreду:

түрүндө берет. \(C(i)\) мааниси 1ге жакындаган сайын тиешелүү amino-acid позициясы гомологдор арасында жакшыраак сакталган деп чечмеленет.

B-cell эпитопу деген эмне?

B-cell эпитопу — антитело же B-cell receptor тааный ала турган антиген аймагы. Булакта B-cell эпитоптору эксперименттик binding assay менен бирден ырасталган эмес; BepiPred-3.0 колдонулуп эсептөө жолу менен божомолдонгон.

Метод тексти BepiPred-3.0 combined CNN + LSTM моделин жана recommended threshold:

маанисин билдирет.

Бирок булак Figure 6 түшүндүрмөсүндө threshold:

деп жазган. Бул эки мааниси бири-бирине шайкеш эмес. Булак чыныгы анализде кайсы босого колдонулганын бул тексттин ичинде так чечпейт; ошондуктан Verianla эки маанинин бирин унчукпай “туура” деп жарыялабайт.

gp45 эмне үчүн өзгөчө бөлүнүп чыкты?

Булакка ылайык gp31, gp37 жана gp45 көп потенциалдуу B-cell epitope candidate камтыса, gp34 жана gp38 азыраак талапкер аймактарды көрсөткөн.

gp31 жана gp37 P. mirabilis фаг белоктору менен жогорку conservation көрсөтсө, өзгөчө gp45 P. mirabilis фагдарында да, ар түрдүү P. mirabilis штаммдарынын геномдорунда коддолгон көп сандагы окшош белоктор менен да тегизделген.

Булак бул гендердин бир бөлүгү PM16га тиешеси жок prophage sequences ичинде, бир бөлүгү болсо бактериялык геномдорго интеграцияланган абалда экенин билдирет.

Бул жагдай геномдук деңгээлде жалпы антигендик түзүлүштөр болушу мүмкүн экенин колдойт. Бирок DNA/protein-coding sequence геномдо бар болушу инфекция учурунда белок сөзсүз экспрессияланат дегенди билдирбейт.

HHPred жана AlphaFold эмне кошту?

gp45 үчүн HHPred analysis жүргүзүлүп, multiple-sequence alignment түзүүдө Hhblits → UniRef30, үч iteration жана:

колдонулган.

Булакка ылайык gp45тин узун N-terminal аймагы carbohydrate-specific enzymatic functions камтыган functionally annotated spike proteins менен окшоштук көрсөтөт. Predicted epitopesтин айрымдары bacterial-cell-wall binding жана depolymerase/saccharidase активдүүлүгү менен байланышкан функционалдык аймактарга дал келиши мүмкүн.

gp45тин 3D модели AlphaFold менен болжолдонгон; булак predicted models үчүн 0,85 overall-score threshold колдонгонун билдирет. Structure Bio.PDB менен иштетилип, эпитоп аймактары py3Dmol менен картага түшүрүлгөн.

Бул 3D модель чыныгы cryo-EM же X-ray crystallography түзүлүшү эмес; эсептөөчү structure prediction.

Molecular mimicry далилдендиби?

Жок, бүт чынжыр түздөн-түз эксперименттик жактан далилденген эмес. Изилдөөнүн маалыматтары төмөнкү баскычтарды колдойт:

1. Жалгыз бактериялык инфекция алган айрым чычкандардын сывороткасында PM16га кайчылаш байланыш/нейтралдашуу байкалышы мүмкүн.
2. Бактерияга байланышкан сыворотка антителолору PM16нын бактерияга адсорбциясын азайтышы мүмкүн.
3. P. mirabilis геномдорунда айрым PM16 структуралык белокторуна, айрыкча gp45ке окшош тизмектер болушу мүмкүн.
4. Бул окшош белоктордо эсептөө жолу менен потенциалдуу B-cell эпитоптору болжолдонот.

Бирок бул gp45-like белоктор P. mirabilis инфекциясы учурунда чындап экспрессияланганын, чычкандын иммундук системасына көрсөтүлгөнүн жана пайда болгон антителолор белгилүү gp45 эпитопуна түз байланышканын эксперименттик түрдө көрсөтүлгөн эмес.

Ошондуктан “бактерия кожоюн өзүнүн adaptive immune systemи аркылуу фагга каршы эмдейт” деген идея авторлор маалыматтардан иштеп чыккан механизмдик гипотеза; толук молекулалык себептик чынжыр эмес.

Изилдөөнүн Ыкмасы жана Жыйынтыктары

Жаныбарлар жана этика

Изилдөөдө эки айлык эркек BALB/c чычкандары колдонулган. Жаныбарлар VECTOR, Novosibirskтеги animal-care facilityден алынган. Normal light–dark cycle шартында кармалып; суу жана тоют ad libitum берилген.

Булак жаныбардык изилдөөлөр EU Directive 2010/63/EU алкагына ылайык жүргүзүлүп, Inter-institutional Bioethics Committee of the Institute of Cytology and Genetics, SB RAS тарабынан жактырылганын билдирет.

Этикалык протокол номери:

жана жактырылган күнү 21 Январь 2020.

Статистикалык анализ

Cell-level fluorescence маалыматтары үчүн булак:

өзгөртүүсүн колдонгон. \(+1\) мүчөсү нөл маанилеринде logarithm көйгөйүн болтурбоого жардам берет; logarithmic transformation болсо оңго кыйшайган fluorescence бөлүштүрүүлөрүн талдоону жеңилдетиши мүмкүн.

Linear mixed-effects моделинде experimental group fixed effect катары, mouse жана mouse ичиндеги slide nested random intercepts катары аныкталган.

Pairwise comparisons estimated marginal means аркылуу Tukey's Honestly Significant Difference (HSD) менен жүргүзүлүп, family-wise error rate:

чегинде көзөмөлдөнгөн.

Mouse-level aggregated data үчүн non-parametric Kruskal–Wallis тести, андан кийин Dunn's pairwise test жана Bonferroni correction колдонулган. Бардык тесттер two-sided жана significance threshold \(p<0{,}05\).

p мааниси эмнени айтат, эмнени айтпайт?

Бир \(p\) мааниси топтор биологиялык жактан канчалык айырмаланарын түз өлчөбөйт. Айрыкча көп cell-level observation бар mixed-effects анализдеринде өтө кичине effect статистикалык жактан өтө кичине \(p\) маанисин жаратышы мүмкүн.

Ошондуктан Table 2де cell-level comparisons \(p<0{,}001\) болсо да, авторлор ошол эле айырмалар mouse-level aggregated анализде айрым салыштырууларда маанилүү эмес болуп калганын көрсөтүшү маанилүү.

Anti-PM16 сыворотка жообу

NaCl pre-immunization тарыхы бар чычкандарда да жалгыз P. mirabilis инфекциясынан кийин PM16-binding antibodies байкалган. Адъювант тарыхында окшош, бирок күчтүүрөөк таасир билдирилген.

PM16 + адъювант менен алдын ала иммунизацияланган жаныбарларда mock абалында да жогорку anti-PM16 IgG болгон; бактериялык challenge жана challenge + PM16 колдонгондон кийин жооп дагы өскөн.

Бул табылга бактериялык инфекциянын өзү PM16 менен кайчылаш реакция кыла ала турган antibody repertoireга салым кошушу мүмкүн деген гипотезаны жараткан.

Негизги жыйынтыктардын булак-чектөөлөрү менен кыскача мазмуну

Изилдөө колдогон жыйынтыктар

PM16 эксперименттик чычкан моделинде P. mirabilisке каршы өлчөнгөн IgG жообун басаңдатпаганы жана PM16 берилгенден кийин антибактериялык IgG байланышы жогорулаганы колдоого алынат.

PM16 + Freund адъюванты менен алдын ала иммунизация күчтүү anti-PM16 IgG жана in vitro phage-neutralizing activity түзө алары колдоого алынат.

Бактериялык инфекциянын өзү PM16 менен кайчылаш реакция кыла ала турган сыворотка antibody activity жаратышы мүмкүн экени эксперименттик түрдө колдоого алынат.

Бактерияга байланышкан антителолор PM16 adsorptionын азайта алары жана бул receptor blockade менен шайкеш экени колдоого алынат.

PM16 gp45ке окшош тизмектер айрым P. mirabilis геномдорунда жана Proteus фагдарында болушу жана потенциалдуу B-cell эпитопторун алып жүрүшү мүмкүн экени эсептөөчү анализдер менен колдоого алынат.

Изилдөө колдобогон жыйынтыктар

Изилдөө PM16 адамдарда P. mirabilis инфекциясын дарылай турганын көрсөтпөйт.

Изилдөө PM16нын клиникалык заара-жыныс жолунун инфекцияларындагы натыйжалуулугун текшербейт.

Изилдөө in vitro phage-neutralizing antibodies адамдарда же башка жаныбар моделдеринде дарылоонун натыйжалуулугуна сөзсүз таасир этпей турганын көрсөтпөйт.

Изилдөө anti-P. mirabilis IgG көбөйүшү түз bacterial clearance, жашап калуу же клиникалык жакшыруу менен барабар экенин көрсөтпөйт.

Изилдөө бардык бактериофаг–бактерия жуптарында бирдей cross-reactivity механизми бар экенин көрсөтпөйт.

Изилдөө gp45-like bacterial genes инфекция учурунда белок катары чындап экспрессияланарын түз көрсөтпөйт.

Изилдөө predicted B-cell эпитопторунун баары чыныгы immunodominant эпитоптор экенин эксперименттик түрдө ырастабайт.

Негизги чектөөлөр

Бир фаг–бактерия жуп: PM16 жана P. mirabilis CEMTC 73 изилденген. Натыйжаларды башка фаг morphotypes же бактерияларга автоматтык түрдө жалпылоого болбойт.

Кичине биологиялык үлгү: Faz II ар бир кичи топто болгону үч чычкан бар.

Бир жыныс жана бир чычкан strainи: Эки айлык эркек BALB/c чычкандары колдонулган.

Intraperitoneal модель: Табигый заара-жыныс жолунун инфекциясы же адамдагы clinical administration route эмес.

Non-lethal модель: Bacterial burden, mortality же ачык disease severity негизги endpoint катары колдонулган эмес; humoral immunity параметрлери effectiveness өлчөмү катары бааланган.

Pooled neutralization sera: Фаг neutralization assay mouse-level биологиялык вариацияны сактабайт.

PM16-only immunization arm жок: Алдын ала иммунизация PM16 + Freund адъюванты түрүндө.

Genomic mechanism түз толукталган эмес: gp45-like proteins инфекция учурунда expression кылары эксперименттик түрдө ырасталган эмес.

Computational epitope prediction: BepiPred prediction чыныгы antibody-binding assayдын ордун баспайт.

Булак ичиндеги методдук шайкешсиздиктер: BepiPred threshold үчүн метод \(0{,}15\), Figure 6 caption болсо \(1{,}56\) берет; MFI методунда “mean” жана “median” терминдери да бир эле абзацта шайкешсиз колдонулган.

Булак жана Ыкма Жөнүндө Эскертүү

Түпнуска аталыш: The Podophage PM16 Enhances the Humoral Immune Response Against Proteus mirabilis

Авторлор: Lina Al Allaf, Anton V. Chechushkov, Vera V. Morozova, Yulia N. Kozlova, Tatiana A. Ushakova, Nina V. Tikunova.

Тең салым: Lina Al Allaf жана Anton V. Chechushkov тең салым кошконун билдиришкен.

Corresponding authors: Lina Al Allaf, Anton V. Chechushkov жана Nina V. Tikunova.

Correspondence: allaflina@gmail.com; achechushkov@gmail.com; tikunova@1bio.ru

Мекеме: Laboratory of Molecular Microbiology, Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, 630090 Novosibirsk, Russia.

Журнал: Viruses.

Басма: MDPI, Basel, Switzerland.

Жыл: 2026.

Том: 18.

Сан: 6.

Макала номери: 669.

DOI: 10.3390/v18060669.

Received: 13 Апрель 2026.

Revised: 9 Июнь 2026.

Accepted: 10 Июнь 2026.

Published: 12 Июнь 2026.

Булак түрү: Рецензияланган түпнуска изилдөө макаласы.

Рецензия статусу: Рецензияланган журналдык басылма.

Расмий шилтеме: https://www.mdpi.com/1999-4915/18/6/669

DOI шилтемеси: https://doi.org/10.3390/v18060669

Лицензия: Creative Commons Attribution (CC BY).

Академиялык редактор: Mikael Skurnik.

Изилдөө түрү: Контролдолгон чычкан эксперименти + in vitro серология/фаг нейтралдашуусу + конфокалдык adsorption assay + protein-sequence/epitope биоинформатикасы.

Жаныбар модели: Эки айлык эркек BALB/c чычкандары.

Жалпы чычкан саны: 27.

Негизги топ көлөмү: Faz I үчүн \(n=9\).

Faz-II кичи топ көлөмү: \(n=3\).

Колдонуу жолу: Intraperitoneal.

PM16 алдын ала иммунизация дозасы: Ар бир чычканга \(10^9\) PFU + CFA; booster баскычында PM16 + IFA.

P. mirabilis challenge: Ар бир чычканга \(10^8\) CFU.

Моделдик фаг терапиясы: Бактериялык challengeдан 1 саат кийин ар бир чычканга \(10^9\) PFU PM16.

Сыворотка алуу: Faz II башталгандан эки жума өткөн соң.

Anti-P. mirabilis өлчөөсү: Confocal fluorescence IgG-binding assay, LSM710, 1000×, CellProfiler v4.2.4.

Anti-PM16 өлчөөсү: PM16-coated ELISA; сыворотка суюлтуусу 1:100дөн башталган беш эселик сериялык суюлтуу.

Фаг neutralization: Serum–PM16 incubation + plaque assay; кичи топ сывороткалары pooled колдонулган.

PM16 fluorescent labeling: Alexa Fluor 488 NHS ester, 1/10/100 µM; 4 °C, 24 саат; Sephadex G-50 purification.

Адсорбция assay: \(10^9\) PFU/well AF488-labeled PM16; болжол менен 1000 bacterial cell/technical replicate.

Cell-level statistics: \(\log(MFI+1)\) linear mixed-effects model; experimental group fixed effect; mouse жана slide-within-mouse nested random intercepts; Python statsmodels; Tukey HSD.

Mouse-level statistics: Kruskal–Wallis + Dunn post-hoc + Bonferroni correction.

Маанилүүлүк чеги: Эки тараптуу \(p<0{,}05\).

Белок издөө: PSI-BLAST, NCBI nr, \(E<1\times10^{-9}\).

Multiple-sequence alignment: Clustal Omega v1.2.4.

Epitope prediction: BepiPred-3.0 combined CNN + LSTM.

Булак ичиндеги BepiPred шайкешсиздиги: Метод бөлүмү recommended threshold 0,15 деп берсе, Figure 6 түшүндүрмөсү 1,56 деп берет. Чыныгы анализде кайсы мааниси колдонулганын бул PDFден так аныктоо мүмкүн эмес.

Functional similarity: HHPred; Hhblits → UniRef30, \(E<1\times10^{-3}\), үч iteration.

3D structure: AlphaFold prediction; Bio.PDB parsing; py3Dmol visualization.

Булак ичиндеги жетүү датасынын аномалиясы: py3Dmol үчүн PDFде “accessed on 23 December 2026” деп жазылган. Бул дата макаланын 12 Июнь 2026 publication dateинен кийин; булакта ишенимдүү түзөтүү маалыматы жок болгондуктан өзгөртүлгөн жок.

Supplementary Material: Figure S1 жана File S1 — IgG binding validation titration.

Каржылоо: Russian Scientific Foundation, research project No. 25-64-00030. CEMTC коллекциясы ошондой эле Ministry of Education and Science Project No. 125012300671-8 тарабынан колдоого алынат.

Этикалык жактыруу: Inter-institutional Bioethics Committee of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; protocol No. 70, 21 Январь 2020.

Data Availability: Изилдөөнүн түпнуска салымдары article жана Supplementary Material ичинде берилген; кошумча суроолор corresponding authorsга жөнөтүлүшү мүмкүн.

Conflicts of Interest: Авторлор изилдөөгө таасир бериши мүмкүн болгон белгилүү competing financial interests же personal relationships жок экенин билдиришкен.

Author Contributions: Conceptualization: L.A.A., A.V.C., N.V.T.; Investigation: L.A.A., A.V.C., V.V.M., Y.N.K., T.A.U.; Data Curation: V.V.M., Y.N.K.; Visualization: L.A.A., A.V.C.; Formal Analysis: L.A.A., A.V.C.; Project Administration: A.V.C., N.V.T.; Writing—Original Draft: L.A.A., A.V.C.; Writing—Review and Editing: L.A.A., A.V.C., N.V.T.; Supervision: N.V.T.

Негизги чечмелөө чеги: Натыйжалар PM16–P. mirabilis жубунун кичине үлгүлүү эркек BALB/c чычкан моделине жана тиешелүү in vitro/биоинформатикалык анализдерге таандык. Адамдардагы клиникалык фаг терапиясынын натыйжалуулугу, бардык бактериофагдарда бирдей механизм же gp45-like белоктор инфекция учурунда чындап экспрессияланары бул изилдөө менен көрсөтүлгөн эмес.