DNA isiyo na seli (cell-free DNA; cfDNA) ni jina la jumla la vipande vya DNA vinavyotolewa kutoka kwenye seli kwenda kwenye mazingira ya nje ya seli; DNA ya uvimbe inayozunguka (circulating tumor DNA; ctDNA) ni sehemu ya cfDNA iliyo katika mzunguko wa damu ambayo hutokana hasa na seli za uvimbe. Utafiti huu umechunguza kwa majaribio yaliyodhibitiwa ya in vitro jinsi uharibifu wa seli unaohusiana na kemotherapi na usugu kwa kemotherapi unavyoathiri kiasi cha cfDNA kinachotolewa na seli za saratani, kinetiki ya kutolewa kwake kwa muda na ukubwa wa vipande vya DNA. Seli za adenokasinoma ya mapafu ya binadamu A549 na adenokasinoma ya umio FLO-1 na OE19 zilitibiwa kwa cisplatin na 5-fluorourasil; cfDNA ya jumla ilipimwa kwa fluorometri ya Qubit, huku cfDNA yenye mabadiliko ya kijenetiki mahususi kwa seli za uvimbe ikipimwa kwa PCR ya kidijitali ya matone (ddPCR). Zaidi ya hayo, modeli ya OE19 yenye usugu kwa cisplatin ilitengenezwa na kinetiki za kutolewa kwa cfDNA za seli nyeti na zenye usugu kwa kemotherapi zikalinganishwa moja kwa moja.

Idadi ya seli ilipoongezeka, kiasi cha cfDNA kilichotolewa kwenye mazingira ya utamaduni wa seli kiliongezeka katika seli zote za A549, FLO-1 na OE19. Katika vipimo vya Qubit, koralesheni za Pearson kati ya idadi ya seli na cfDNA ya jumla zilikuwa \(r=0.9357\) kwa A549, \(r=0.8599\) kwa FLO-1 na \(r=0.8767\) kwa OE19. Katika vipimo vya ddPCR mahususi kwa mabadiliko ya kijenetiki, koralesheni zilikuwa mtawalia \(r=0.9864\), \(r=0.9863\) na \(r=0.8511\). Matokeo haya yanaonyesha kuwa katika mfumo wa utamaduni wa seli, kiasi cha cfDNA kina uhusiano mkubwa na wingi wa seli hai za uvimbe.

Utumiaji wa kemotherapi uliongeza kutolewa kwa cfDNA kulikorekebishwa kwa idadi ya seli katika mistari yote mitatu ya seli. Katika ulinganisho muhimu zaidi, seli parental za OE19 zilizo nyeti kwa cisplatin zilitoa cfDNA zaidi kuliko seli za OE19 zenye usugu katika kipindi cha siku tano za kuathiriwa na cisplatin. Katika seli zenye usugu, thamani ya IC50 kwa cisplatin ilikuwa 24.40 µM, ilhali katika seli parental ilikuwa 10.43 µM; ongezeko hili la takriban mara 2.34 linaunga mkono fenotipu yenye usugu.

Cisplatin pia ilisogeza mgawanyo wa vipande vya cfDNA kuelekea vipande vikubwa zaidi vya DNA. Vipande vya nukleosomu vya takriban 167 bp na vizidisho vyake, vipande vidogo vya takriban 50–100 bp, na vipande vikubwa zaidi vya DNA ya nje ya seli katika masafa ya 1000–15.000 bp vilionekana. Baada ya cisplatin, sehemu ya jamaa ya masafa ya 134–200 bp na 50–700 bp ilipungua, huku sehemu ya jamaa ya vipande vya 1000–15.000 bp na vilivyo zaidi ya 1000 bp ikiongezeka. Katika kipindi hicho hicho, mabadiliko katika idadi za seli zenye PI-chanya na Annexin V/PI-chanya mara mbili yalilingana na kupotea kwa uadilifu wa utando na michakato ya hatua za mwisho za kifo cha seli.

Ujumbe muhimu zaidi wa kliniki wa utafiti ni kwamba kiwango cha ctDNA/cfDNA hakipaswi kutafsiriwa tu kama kiashiria cha moja kwa moja cha wingi wa uvimbe. Ongezeko la muda la DNA muda mfupi baada ya kemotherapi linaweza, katika baadhi ya hali, kusababishwa si na kuendelea kwa uvimbe bali na kufa kwa seli nyeti kwa matibabu. Hata hivyo, utafiti huu haukufanywa katika damu ya wagonjwa. Matokeo yalipatikana kutoka kwenye tamaduni za seli za 2D, na katika sampuli za kliniki kuna michakato mingi ya ziada kama kuingia kwa DNA kwenye damu, kuvunjwa na nukleasi, na kuondolewa na seli za kinga pamoja na figo. Kwa hiyo, hitimisho kuhusu muda wa uchukuaji wa sampuli za kliniki ni la kuzalisha nadharia tete na linahitaji uthibitisho wa in vivo.

Tofauti Kati ya cfDNA na ctDNA ni Nini?

cfDNA ni neno la jumla linalojumuisha vipande vyote vya DNA isiyo na seli vilivyo katika vimiminika vya kibayolojia vya nje ya seli; ctDNA ni sehemu ya hifadhi hiyo ya cfDNA inayotokana tu na seli za saratani na ni mahususi kwa uvimbe. Kwa kuwa majaribio makuu ya utafiti huu yalifanywa katika mazingira ya utamaduni wa seli, watafiti hawakupima moja kwa moja DNA “inayozunguka”, bali cfDNA iliyotolewa kwenye mazingira ya utamaduni; ddPCR mahususi kwa mabadiliko ya kijenetiki ilitumika kama mbinu ya kutambua kwa uteuzi zaidi DNA inayotokana na seli za saratani.

Kwa nini utofautishaji huu ni muhimu?

cfDNA ya jumla inayopimwa katika damu ya mgonjwa haitokani na seli za uvimbe pekee. Tishu za kawaida, uvimbe wa uchochezi, seli za kinga na michakato mingine ya seli pia huzalisha cfDNA. Kwa hiyo, katika sampuli ya kliniki ya plazma, cfDNA ya jumla na ctDNA mahususi kwa uvimbe si kiasi kilekile.

Mfumo wa in vitro uliodhibitiwa wa utafiti huu hutoa faida muhimu ya kimajaribio: chanzo cha DNA katika mazingira ya utamaduni kinawekewa mipaka kwa kiasi kikubwa na seli za saratani zinazochunguzwa pamoja na vipengele vya utamaduni. Hata hivyo, muundo huu uliorahisishwa haujumuishi shughuli ya nukleasi, cfDNA ya usuli inayotokana na tishu na mifumo ya kifiziolojia ya kuondoa DNA inayopatikana katika mzunguko halisi wa damu ya binadamu.

Tatizo kuu la utafiti

ctDNA kwa sasa ni biomarka muhimu ya biopsi ya kimiminika inayochunguzwa katika maeneo kama utambuzi wa saratani, ufuatiliaji wa mwitikio wa matibabu na tathmini ya ugonjwa mabaki wa kiwango cha chini. Hata hivyo, ili kuelewa thamani ya ctDNA ina maana gani, ni lazima kujua DNA hutolewa lini kutoka kwenye seli ya uvimbe, kutokana na mchakato gani wa seli, na katika vipande vya ukubwa gani.

Kwa mfano, kuongezeka kwa kiwango cha ctDNA katika plazma baada ya matibabu kunaweza kwa mtazamo wa kwanza kutafsiriwa kama kuongezeka kwa mzigo wa uvimbe. Lakini ikiwa kemotherapi inaua idadi kubwa ya seli za uvimbe, kiasi kikubwa cha DNA kinaweza pia kutolewa kutoka kwenye seli katika kipindi hicho hicho. Utafiti huu unachunguza mkanganyiko huu wa kibayolojia chini ya hali za utamaduni wa seli zilizodhibitiwa.

Modeli za seli zilizotumika katika utafiti

Kila mazingira ya utamaduni yaliongezewa %10 fetal bovine serum, %1 penicillin-streptomycin na 2 mM GlutaGro. Vipimo vya mycoplasma vya mistari yote ya seli iliyotumika katika utafiti vilikuwa hasi.

Hali za kemotherapi

Katika majaribio ya kutolewa kwa cfDNA, mkusanyiko wa cisplatin uliwekwa katika 0.002 mg/mL, na mkusanyiko wa 5-fluorourasil (5-FU) uliwekwa katika 0.0032 mg/mL. Cisplatin iliyeyushwa katika %0.9 NaCl, huku 5-FU ikiyeyushwa katika dimethyl sulfoxide (DMSO). Katika majaribio ya cisplatin, saline iliyolinganishwa kwa ujazo ilitumika kama udhibiti wa chombo; katika majaribio ya 5-FU, DMSO iliyolinganishwa kwa ujazo ilitumika kama udhibiti wa chombo.

Katika jaribio la Kielelezo 2, uwiano wa mwisho wa saline katika mazingira ya utamaduni ulikuwa %0.4 v/v, na uwiano wa DMSO ulikuwa %0.032 v/v. Hivyo, lengo lilikuwa kutenganisha athari ya dawa na athari inayotokana na kiyeyushi.

Kwa sababu waandishi waliona katika majaribio ya awali kwamba seli hutoa kiasi kikubwa cha cfDNA katika saa 24 za kwanza baada ya kupitishwa na trypsinization, katika majaribio yote makuu seli ziliruhusiwa kwanza kushikamana na kukua kwa saa 24. Maelezo haya ni muhimu; vinginevyo, kutolewa kwa cfDNA kunakosababishwa na kushughulikia seli kungeweza kuchanganyika na athari ya kemotherapi.

Kimiminika cha juu cha utamaduni wa seli kiliandaliwaje?

Mwishoni mwa jaribio, kimiminika cha juu cha utamaduni wa seli kilizungushwa kwa centrifuge kwanza kwa 300×g kwa dakika 5, kisha kwa 1000×g kwa dakika 10, na kuhifadhiwa katika −20 °C hadi cfDNA ilipotengwa.

Kwa kuwa waandishi walidhani kwamba seli zilizojitenga zilizopo katika kimiminika cha juu cha utamaduni pia zingeweza kuchangia cfDNA, walihesabu seli zilizoshikamana na uso pamoja na seli zilizojitenga, na walitumia jumla ya idadi ya seli kwa urekebishaji. Uhesabuji wa seli ulifanywa kwa Countess 3 automatic cell counter na trypan blue; kila sampuli ilipimwa mara mbili kiufundi.

cfDNA ya jumla ilipimwaje?

cfDNA ilitengwa kutoka sampuli ya 3 mL kwa kutumia QIAamp Circulating Nucleic Acid kit. Itifaki ya kawaida ilibadilishwa kwa kutoitumia ATL tissue lysis buffer na kwa kutumia elution ya hatua mbili: kwanza 20 µL, kisha 10 µL AVE buffer. Hivyo jumla ya ujazo wa elution ulikuwa 30 µL.

DNA yote ya nyuzi mbili ilipimwa kwa kutumia Qubit dsDNA High Sensitivity kit. Katika kila kipimo, 1 µL DNA ilitumika na sampuli zikachambuliwa kama duplikati za kiufundi.

Kwa kuwa Qubit hupima DNA yote ya nyuzi mbili, si mahususi kwa seli za saratani. Kwa hiyo, ili kudhibiti usuli unaoweza kutokea kutokana na mazingira ya utamaduni yenye FBS au mchakato wa uchimbaji, watafiti walichakata pia vidhibiti vilivyo na mazingira ya utamaduni pekee na blanki za uchimbaji wa PBS. Ishara ya Qubit ya chini lakini inayoweza kupimwa iligunduliwa. Hata hivyo, matumizi ya mazingira na hali zilezile za uchakataji kati ya makundi, pamoja na kuthibitishwa kwa uhusiano na idadi ya seli kwa ddPCR mahususi kwa mabadiliko ya kijenetiki, yaliunga mkono uhusiano mkuu wa idadi ya seli.

Kwa Nini ddPCR Ilitumika Katika Utafiti Huu?

PCR ya kidijitali ya matone (droplet digital PCR; ddPCR) ilitumika kulenga mabadiliko mahususi ya KRAS au TP53 yaliyopo katika seli za A549, FLO-1 na OE19 ili kupima kwa uteuzi DNA katika mazingira ya utamaduni iliyotokana na mstari husika wa seli za saratani; hivyo ikaongeza safu ya pili ya kipimo mahususi cha mabadiliko kwenye ishara ya jumla ya DNA iliyopimwa na Qubit.

Mantiki ya msingi ya ddPCR

ddPCR hugawanya sampuli katika idadi kubwa ya matone madogo sana. Kila tone linaweza kuwa na au lisiwe na mfuatano lengwa wa DNA. Baada ya PCR, idadi ya matone chanya kwa floresensi na hasi kwa floresensi hutathminiwa, na mkusanyiko wa awali wa DNA lengwa hukadiriwa kwa kutumia takwimu za Poisson.

Katika utafiti, vichunguzi vilivyowekwa alama za FAM na HEX vilitumika kutenganisha mfuatano mutant na wild-type. Kwa kila mstari wa seli, joto la annealing liliboreshwa kwa kutumia vidhibiti vya DNA vya gBlock vya sintetiki vya mutant na wild-type.

Taarifa za primer na probe

Masharti ya mmenyuko wa ddPCR

• 10 µL ya 2× ddPCR Supermix for Probes ilitumika.
• Kila moja ya forward na reverse primer ilikuwa 900 nM.
• Probe za FAM/HEX zilikuwa 250 nM.
• 2 µL ya DNA iliongezwa katika kila mmenyuko.
• 70 µL ya Droplet Generation Oil ilitumika katika utengenezaji wa matone.
• Matone yaliundwa kwa Bio-Rad QX200 Droplet Generator na kusomwa kwa QX200 Droplet Reader.
• Denaturation ya awali ilikuwa dakika 10 katika 95 °C.
• Kisha mizunguko 50 ya PCR ilifanywa: sekunde 30 katika 95 °C, dakika 1 katika joto la annealing la 54–62 °C mahususi kwa mstari wa seli, na sekunde 30 katika 72 °C.
• Hatua ya mwisho ilikuwa dakika 5 katika 98 °C.
• Kasi ya ramp ilikuwa 2 °C/s.
• Sampuli zote zilichanganuliwa kama nakala mbili za kiufundi.
• Sampuli zilizozalisha matone chini ya 10.000 ziliondolewa kwenye uchanganuzi.

Idadi ya nakala za DNA mutant ilihesabiwaje?

Katika chanzo, hesabu ya jumla ya idadi ya nakala mutant imetolewa kwa uhusiano ufuatao:

\[ \text{Mutant kopya sayısı} = \left(\text{ortalama mutant hedef konsantrasyonu}\right) \times 20\,\mu L \times \frac{30\,\mu L}{2\,\mu L} \]

Kizidishi cha kwanza ni mkusanyiko wa lengo mutant uliokadiriwa na QuantaSoft kwa modeli ya Poisson. 20 µL ni ujazo kamili wa mmenyuko wa PCR. Kwa kuwa ni 2 µL pekee ya jumla ya 30 µL ya eluate ya DNA iliyowekwa katika mmenyuko, mgawo wa kuongeza kiwango wa \(30/2=15\) hutumika kufanya hesabu ya kurudi kutoka aliquot iliyochanganuliwa hadi sampuli nzima ya DNA iliyotolewa.

Kwa hiyo, fomula haitoi tu DNA mutant iliyo katika bomba la PCR, bali idadi inayokadiriwa ya nakala mutant katika jumla ya 30 µL ya eluate ya cfDNA.

Ishara chanya ya uongo ya ddPCR ilidhibitiwaje?

Kwa kila kipimo mahususi cha mabadiliko, miitikio 10 ya no-template control ilitathminiwa katika majaribio 10 huru. Katika mmenyuko wowote mmoja wa NTC, tone moja tu la mutant-chanya lilionekana kwa kiwango cha juu zaidi. Kwa kuzingatia kiwango hiki cha usuli, watafiti walichukulia kwa tahadhari sampuli za majaribio zenye matone mawili au machache ya mutant-chanya kuwa hasi.

Uhusiano kati ya idadi ya seli na cfDNA

Ukweli kwamba migawo yote ya uhusiano ni chanya na ya juu unaonyesha kuwa cfDNA zaidi hupatikana katika tamaduni zenye seli nyingi zaidi. Uhusiano wa Pearson hupima nguvu ya uhusiano wa mstari; thamani zinazokaribia \(r=1\) zinawakilisha uhusiano thabiti chanya wa mstari. Hata hivyo, uhusiano pekee hauthibitishi utaratibu wa usababishaji wa kibayolojia.

cfDNA kwa kila seli baada ya kemotherapi

Seli za A549, FLO-1 na OE19 zilipandikizwa katika majaribio ya kemotherapi kwa idadi ya seli 50.000, 125.000 na 500.000, mtawalia. Idadi hizi za mwanzo zilichaguliwa ili kupata takriban %80 confluence wakati wa kukusanya supernatant licha ya viwango tofauti vya kuongezeka kwa seli.

Baada ya matumizi ya cisplatin au 5-FU kwa saa 72, thamani za cfDNA zilinormalishwa kwa jumla ya idadi ya seli wakati wa ukusanyaji wa sampuli kwa sababu matibabu yalibadilisha kuongezeka kwa seli na jumla ya idadi ya seli. Hivyo utafiti ulitathmini, badala ya swali “kuna jumla ya DNA kiasi gani katika utamaduni?”, swali “kutolewa kwa DNA kwa jamaa kwa kila seli kunaathiriwaje na matibabu?”.

Katika mistari yote mitatu ya seli, ongezeko la kutolewa kwa cfDNA kwa kila seli lilionekana baada ya kemotherapi. Chanzo kinatafsiri hili kuwa sitotoksisiti inayohusiana na kemotherapi huongeza kutolewa kwa cfDNA.

Ongezeko la cfDNA Baada ya Kemotherapi Linapaswa Kutafsiriwaje?

Kulingana na utafiti huu, ongezeko la cfDNA katika kipindi cha mapema baada ya kemotherapi huenda lisionyeshe tu kwamba idadi ya seli za uvimbe imeongezeka; kufa kwa seli za saratani zilizo nyeti kwa matibabu ya sitotoksiki na kuachia DNA katika mazingira ya nje ya seli kunaweza pia kuongeza kwa muda kiwango cha cfDNA. Hata hivyo, matokeo haya yanategemea modeli ya in vitro na yanapaswa kuthibitishwa kwa vigezo kama muda wa sampuli, uondoaji wa DNA na mzigo wa uvimbe wa kliniki kabla ya kutumiwa kama kiashiria cha moja kwa moja cha mafanikio ya matibabu kwa mgonjwa.

Modeli ya OE19 yenye usugu kwa cisplatin iliundwaje?

Seli parental za OE19 ziliwekwa kwenye 5 µmol/L cisplatin kwa saa 72, kisha ziliruhusiwa kupona katika mazingira yasiyo na kemotherapi. Seli zilipofikia %70–80 confluence zilipitishwa, na mchakato huo huo ulirudiwa baada ya saa 24.

Mzunguko huu uliendelezwa kwa miezi 3. Fenotipu sugu baadaye ilidumishwa kwa matumizi ya cisplatin mara moja kila pasi tatu. Kabla ya majaribio makuu, seli sugu zilikuzwa katika mazingira yasiyo na cisplatin kwa angalau pasi moja kamili.

Uthibitishaji wa usugu kwa CCK-8

Katika jaribio la CCK-8, seli 4000 ziliwekwa katika kila kisima na majaribio yalifanywa kwa triplicate. Baada ya saa 24, seli zilitibiwa kwa cisplatin ya 1, 2, 4, 8, 16, 32 au 64 µg/mL kwa saa 48. Kisha kitendanishi cha CCK-8 kiliongezwa na absorbance ya 450 nm ikapimwa.

CCK-8 ni kipimo kinachotathmini uhai wa seli kwa kulinganisha kwa kutumia mabadiliko ya rangi yanayohusishwa na shughuli za kimetaboliki za seli. Kwa kupima kiasi ambacho uhai hupungua kadiri dozi inavyoongezeka, hupatikana mkunjo wa unyeti kwa dawa.

IC50 ni nini?

IC50 ni mkusanyiko wa dawa unaohitajika kupunguza uhai wa seli au athari ya kibayolojia inayopimwa hadi kiwango cha nusu ya kiwango cha juu chini ya masharti maalumu ya jaribio. Katika mfumo ule ule wa majaribio, IC50 ya juu inaonyesha kuwa seli zinahitaji mkusanyiko mkubwa zaidi wa dawa ili kutoa athari ile ile ya kuzuia na, kwa hiyo, zina usugu zaidi.

Katika seli sugu, IC50 iliongezeka kwa takriban mara 2.34. ANOVA ya njia mbili iliripoti \(p<0.0001\) kwa mkusanyiko wa cisplatin, mstari wa seli na mwingiliano wao wote.

Mikunjo ya dozi–mwitikio ililinganishwa na modeli ya dozi–mwitikio zuizi yenye vigezo vinne na mteremko unaobadilika. Kikomo cha juu cha modeli kilifungwa kwenye uhai ulionormalishwa wa %100, kikomo cha chini kiliwekewa sharti kuwa kikubwa kuliko 0; IC50 na mteremko wa Hill viliachwa huru. Kwa kuwa chanzo hakitoi fomula wazi ya kialjebra ya modeli hii, Verianla haiongezi mlinganyo usiotokana na chanzo.

Usugu kwa Kemotherapi Uliathirije Kinetiki ya Kutolewa kwa cfDNA?

Seli parental za OE19 zilizo nyeti kwa cisplatin na seli za OE19 zenye usugu kwa cisplatin zilipopokea cisplatin kila siku kwa siku tano, cfDNA kwa kila seli iliongezeka katika makundi yote mawili, lakini seli nyeti zilitoa cfDNA kwa kiasi kikubwa zaidi kuliko seli sugu katika nyakati nyingi; kwa hiyo, chanzo kilitathmini kwamba ukubwa wa kutolewa kwa cfDNA unahusiana na kiwango cha sitotoksisiti kinachosababishwa na kemotherapi.

Jaribio la kinetiki la siku tano

Seli parental na sugu za OE19 zilitibiwa kwa cisplatin kila siku kwa siku tano, na supernatant ya utamaduni ilikusanywa kila baada ya saa 24. Jumla ya cfDNA ilipimwa kwa Qubit, na cfDNA mahususi ya mabadiliko ilipimwa kwa ddPCR.

Thamani zote zilinormalishwa kwa jumla ya idadi ya seli katika kila wakati wa ukusanyaji wa sampuli. Katika ANOVA ya njia mbili, \(p<0.0001\) iliripotiwa kwa muda, hali ya jaribio na mwingiliano wa muda × hali.

Katika seli parental za OE19 zilizo nyeti, kutolewa kwa cfDNA kunakohusiana na cisplatin kulikuwa juu zaidi kuliko katika seli sugu, na katika ulinganisho uliorekebishwa kwa Sidak kulikuwa na tofauti katika kiwango cha \(p<0.05\) katika nyakati nyingi.

Ugunduzi huu haumaanishi kwamba “seli sugu hazitoi cfDNA kabisa”. Kutolewa pia huongezeka katika seli sugu chini ya cisplatin; tofauti kuu ni ukubwa wa kutolewa na mwenendo wake kwa muda.

Mabadiliko ya Ukubwa wa Vipande vya cfDNA Yanaonyesha Nini?

Baada ya cisplatin, kusogea kwa mgawanyo wa cfDNA kuelekea vipande vikubwa zaidi vya DNA katika tamaduni za OE19 zilizo nyeti na sugu kunadokeza kwamba kemotherapi inaweza kuathiri si tu kiasi cha DNA inayotolewa bali pia michakato ya kifo cha seli na uchakataji wa nje ya seli ambayo DNA hupitia; hata hivyo, Annexin V/PI na ukubwa wa vipande pekee haviwezi kubainisha kwa uhakika njia mahususi ya kifo.

Ukubwa wa vipande vya DNA ulipimwaje?

Ukubwa wa DNA ulitathminiwa kwa mfumo wa elektroforesisi otomatiki wa Agilent 4150 TapeStation. Mifumo miwili tofauti ya ScreenTape ilitumika kwa madhumuni yanayokamilishana:

• Genomic DNA ScreenTape: mgawanyo wa jumla wa vipande katika masafa ya 150–50.000 bp na wastani wa ukubwa wa vipande.
• Cell-free DNA ScreenTape: uwiano wa vipande vifupi vya DNA kati ya 50–700 bp.

Uchanganuzi wa vipande ulifanywa katika siku ya 3 ya matibabu ya cisplatin. Siku hiyo hiyo, saitometri ya mtiririko ya Annexin V/PI ilifanywa, hivyo ukubwa wa DNA na wasifu wa kifo cha seli uliweza kutathminiwa katika wakati ule ule wa jaribio.

Ni ukubwa gani wa vipande ulioonekana?

Matibabu ya cisplatin yaliongeza wastani wa ukubwa wa vipande vya DNA katika seli parental na sugu za OE19. Wakati uwiano wa DNA katika masafa ya 134–200 bp na 50–700 bp ndani ya jumla ya cfDNA ulipungua, uwiano wa vipande vya 1000–15.000 bp na vipande vilivyo zaidi ya 1000 bp uliongezeka.

Annexin V na propidium iodide vinaonyesha nini?

Annexin V hutumika kutambua kuhamia kwa phosphatidylserine kwenye uso wa nje wa utando wa seli na ni kiashiria kinachohusishwa na apoptosis. Kwa kuwa Propidium iodide (PI) haiwezi kupenya kwa urahisi utando wa seli ulio salama, kuwa PI-chanya huonyesha kupotea kwa uadilifu wa utando.

Katika tafsiri ya jumla, seli Annexin V-hasi / PI-hasi zinaendana na idadi hai; seli Annexin V-chanya / PI-hasi zinaendana na mchakato wa mapema wa apoptosis; na kuwa chanya mara mbili kunaendana na apoptosis ya hatua ya mwisho, nekrosisi ya sekondari au hali nyingine za kifo cha hatua za mwisho ambako upenyezaji wa utando umepotea.

Kizuizi muhimu hasa kwa utafiti huu ni kwamba uchanganuzi wa Annexin V/PI hauwezi kutofautisha kwa uhakika apoptosis ya hatua ya mwisho, nekrosisi ya sekondari, necroptosis au njia nyingine zilizodhibitiwa za kifo cha seli.

Masharti ya saitometri ya mtiririko

Takriban seli 20.000/sampuli zilichanganuliwa kwa BD FACS-CANTO II kwa kasi ya takriban seli 500/sekunde. Kwanza debris iliondolewa kwa FSC-A/SSC-A, kisha seli singlet zilichaguliwa na Annexin V/PI quadrant gating ikatumika. Uchanganuzi ulifanywa kwa FlowJo V11.

Cisplatin ilipunguza kwa kiasi kikubwa sehemu hai ya Annexin V/PI hasi mara mbili katika seli parental za OE19:

\[ p_{\text{Sidak}}=0.0120 \]

Upungufu katika seli sugu za OE19 ulikuwa mdogo zaidi na haukuwa na umuhimu wa kitakwimu:

\[ p_{\text{Sidak}}=0.2908 \]

Katika makundi yote mawili ya seli, kuongezeka kwa idadi za PI-chanya na Annexin V/PI-chanya mara mbili kunaendana na kuharibika kwa upenyezaji wa utando na kuongezeka kwa michakato ya kifo cha seli ya hatua ya mwisho.

Ujumbe mkuu wa mchoro huu

Majaribio yote ya chanzo yanaposomwa pamoja, inaonekana kwamba cfDNA si “kihesabu cha kiasi cha uvimbe” chenye kipimo kimoja. Kipimo kile kile cha cfDNA kinaweza kuathiriwa na vipengele vinne tofauti vya kibayolojia: idadi ya seli, sitotoksisiti inayohusiana na matibabu, unyeti/usugu kwa dawa, na utaratibu wa kifo cha seli au uchakataji wa nje ya seli ambao DNA hutolewa kupitia huo.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Muhtasari wa hatua kwa hatua wa muundo wa majaribio

Uchanganuzi wa kitakwimu

Takwimu zilifanywa kwa GraphPad Prism 10, toleo 10.6.1. Data zimewasilishwa kama wastani ± mkengeuko sanifu wa marudio huru ya kibayolojia.

• Mgawo wa uhusiano wa Pearson ulitumika kwa uhusiano wa mstari kati ya idadi ya seli na cfDNA.
• Katika ulinganisho wa makundi mawili, t-test ya sampuli huru yenye pande mbili ilitumika.
• Katika majaribio yenye zaidi ya kundi moja au kipengele cha majaribio, ANOVA ya njia mbili ilitumika.
• Ulinganisho wa jozi ulirekebishwa kwa kipimo cha ulinganisho mwingi cha Sidak.
• Mikunjo ya dozi–mwitikio ya CCK-8 ilimodeliwa kwa regresheni isiyo ya mstari yenye vigezo vinne na mteremko unaobadilika.
• Kwa IC50, muda wa kujiamini wa %95 wa profile-likelihood uliripotiwa.
• Kiwango cha umuhimu wa kitakwimu kilikuwa \(p<0.05\).

Tofauti kati ya marudio huru ya kibayolojia na marudio ya kiufundi

Rudio la kibayolojia ni kurudia jaribio katika hali huru za utamaduni/sampuli na huwakilisha utofauti wa kibayolojia. Rudio la kiufundi ni kufanya mchakato wa kipimo cha sampuli ile ile ya kibayolojia zaidi ya mara moja na husaidia kudhibiti utofauti unaotokana na kifaa au kipimo.

Majaribio mengi makuu ya utafiti yalifanywa kwa n=3 marudio huru ya kibayolojia. Vipimo vingi kama Qubit, TapeStation na ddPCR pia vilifanywa kama nakala mbili za kiufundi. Waandishi wanaeleza wazi kwamba n=3 inaweza kupunguza nguvu ya kitakwimu, hasa katika kutafsiri matokeo yasiyo na umuhimu.

Matokeo ya moja kwa moja yenye nguvu zaidi ya utafiti

Hitimisho ambazo utafiti hauungi mkono

• Haiwezi kuhitimishwa kwamba ongezeko la ctDNA baada ya kemotherapi katika plazma ya mgonjwa linaonyesha kwa uhakika mafanikio ya matibabu.
• Utafiti huu haukutengeneza kizingiti cha kliniki cha utambuzi au algoriti ya kubadilisha matibabu kwa ctDNA.
• Kutokana na ukubwa wa vipande vya cfDNA pekee, haiwezi kusemwa kwa uhakika kwamba seli ilikufa kwa apoptosis, nekrosisi, necroptosis au utaratibu mwingine wa kifo.
• Mchango wa cisplatin kwenye ukubwa wa vipande na mchango wa utaratibu wa kifo cha seli haukutenganishwa kikamilifu.
• Matokeo katika mistari mitatu ya seli hayawezi kujumlishwa kwa aina zote za saratani.
• Kinetiki ya cfDNA katika utamaduni wa seli wa vipimo viwili si sawa moja kwa moja na kinetiki ya ctDNA katika mzunguko wa damu wa binadamu.
• Utafiti huu haukuonyesha kwamba mifumo hiyo hiyo ya mgawanyiko wa vipande hutokea katika immunotherapy, tiba lengwa au madarasa mengine ya dawa.
• Uhusiano wa dozi–mwitikio wa dozi tofauti za kemotherapi kwenye kutolewa kwa cfDNA na mgawanyiko wa vipande haukujaribiwa kwa utaratibu.

Tofauti kuu kati ya in vitro na mazingira ya kliniki

cfDNA inayotolewa katika utamaduni wa seli hukusanyika moja kwa moja katika mazingira ya utamaduni yanayoizunguka. Katika mwili wa binadamu, DNA ya uvimbe lazima ipite kutoka nafasi ya tishu hadi kwenye damu au vimiminika vingine vya kibayolojia. Kiwango kinachoweza kupimwa cha ctDNA katika sampuli ya kliniki pia huathiriwa na michakato ifuatayo:

• Mahali uvimbe ulipo kianatomia na ukaribu wake na mzunguko wa damu.
• Usuli mkubwa wa cfDNA unaotoka kwenye tishu za kawaida.
• Kuvunjwa kwa DNA na nukleasi.
• Kuondolewa na seli za kinga.
• Uchujaji wa figo.
• Usafirishaji wa DNA katika damu au vimiminika vingine vya kibayolojia.

Kwa kuwa nukleasi za kifiziolojia hazipo katika mfumo wa in vitro wa utafiti, wasifu wa vipande unaoonekana kwa kiasi kikubwa huwakilisha sifa za DNA iliyotolewa mwanzoni. DNA katika plazma ya mgonjwa, kwa upande mwingine, hupitia uchakataji na uondoaji wa ziada baada ya kutolewa.

Sababu za kiufundi zinazoweka mipaka kwa matokeo ya mgawanyiko wa vipande

Waandishi wanasisitiza kwamba mgawanyo wa vipande vya DNA hauamuliwi na kifo cha seli pekee. Cisplatin inaweza kuathiri moja kwa moja ukubwa wa vipande kwa kuunda viunganishi vya msalaba vya DNA na mipasuko ya nyuzi mbili. Njia ya kutenga DNA pia inaweza kubadilisha mgawanyo unaopimwa kwa kurejesha vipande vya ukubwa tofauti kwa ufanisi tofauti.

Zaidi ya hayo, ingawa supernatant ilipitia centrifugation ya 300×g na 1000×g, haiwezi kuhakikishwa kwamba debris yote ya seli iliondolewa kikamilifu. Debris iliyobaki inaweza kuwa imechangia sehemu ya vipande vikubwa vya DNA hasa.

Kwa nini muda wa kuchukua sampuli unaweza kuwa muhimu kliniki?

Kulingana na modeli inayotegemea muda inayojadiliwa na chanzo, kufa kwa idadi kubwa ya seli za uvimbe zilizo nyeti mara tu baada ya matibabu ya sitotoksiki kunaweza kusababisha ongezeko la muda la ctDNA. Kadiri matibabu yanavyoendelea kuwa na ufanisi, kupungua kwa seli za uvimbe zilizo nyeti kunaweza kutarajiwa kufuatiwa na kupungua kwa ctDNA katika vipimo vya baadaye. Kwa upande mwingine, kutosafishwa kwa ctDNA au kuendelea kwake kuwa juu katika mchakato unaoendelea wa matibabu kunaweza kuhusishwa na kuendelea kwa ugonjwa sugu.

Modeli hii inategemea tafsiri ya pamoja ya matokeo ya utamaduni wa seli ya makala hii na tafiti za kliniki za awali zilizojadiliwa na waandishi. Utafiti wenyewe haukujaribu mfululizo huu wa muda kwa wagonjwa. Kwa hiyo, ili kubainisha nyakati zinazofaa za kuchukua damu katika matumizi ya kliniki, sampuli za wagonjwa za longitudinal zenye marudio ya juu zinahitajika.

Maana inayowezekana katika uchunguzi wa dawa wa kabla ya kliniki

Kwa sababu waandishi wanaona kwamba cfDNA inaweza kuakisi si tu mabadiliko ya kijeni bali pia kifo cha seli kinachohusiana na matibabu na mwenendo wa mgawanyiko wa vipande, wanatathmini wasifu wa cfDNA kama biomarker ya kiutendaji ya ziada katika uchunguzi wa dawa wa kabla ya kliniki.

Matumizi haya bado si kipimo cha kliniki kilichothibitishwa. Utafiti unategemea utamaduni wa seli wa 2D. Modeli zilizo karibu zaidi na fiziolojia, kama organoid zinazotokana na wagonjwa na mifumo ya organ-on-chip, zinapendekezwa kama majukwaa ya majaribio ambayo taratibu hizo hizo zinaweza kuthibitishwa baadaye.

Vikwazo vikuu vya utafiti

• Majaribio yote yalifanywa in vitro.
• Michakato ya uondoaji wa DNA katika mwili wa binadamu haipo katika modeli.
• Nukleasi za kifiziolojia hazipo.
• Annexin V/PI haiwezi kutofautisha kwa uhakika njia mahususi za kifo cha seli.
• Cisplatin inaweza kuathiri moja kwa moja mgawanyiko wa kimwili wa DNA.
• Njia ya uchimbaji wa DNA inaweza kuonyesha ufanisi tofauti wa urejeshaji kulingana na ukubwa wa vipande.
• Debris ya seli iliyobaki baada ya centrifugation haikuweza kuondolewa kikamilifu.
• Utafiti ulilenga tu kemotherapi ya sitotoksiki na modeli za seli za uvimbe imara.
• Dozi ya kemotherapi haikuchunguzwa kama mfululizo wa dozi wa kimfumo kwa upande wa kutolewa kwa cfDNA.
• Katika majaribio mengi makuu kuna marudio matatu tu huru ya kibayolojia.
• Modeli zaidi za seli, aina za matibabu na uthibitishaji wa in vivo vinahitajika.

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Kichwa asili: Cell-Free DNA Release Kinetics and Fragmentation Reflect Treatment Response and Resistance In Vitro

Waandishi: Alexandra Bartolomucci; Laura Kienzle; Sarah Tadhg Ferrier; Benjamin Forgie; Thupten Tsering; Kyle Dickinson; Lorenzo Ferri; Jonathan Cools-Lartigue; Julia V. Burnier.

Mpangilio wa waandishi: Mpangilio katika chanzo umehifadhiwa.

Mwandishi wa mawasiliano: Julia V. Burnier.

Mchango sawa: Hakuna taarifa ya mchango sawa / uandishi mwenza wa kwanza katika chanzo.

Taasisi: Cancer Research Program, Research Institute of the McGill University Health Centre; Department of Pathology, McGill University; Division of Thoracic Surgery, McGill University Health Centre; Gerald Bronfman Department of Oncology, McGill University; Goodman Cancer Institute, McGill University; Montreal, Kanada.

Jarida: Cells.

Mchapishaji: MDPI.

Mwaka: 2026.

Juzuu / toleo / nambari ya makala: 15(17), 1561.

DOI: 10.3390/cells15171561.

Tarehe ya kupokelewa: 26 Juni 2026.

Marekebisho: 22 Agosti 2026.

Kukubaliwa: 26 Agosti 2026.

Kuchapishwa: 28 Agosti 2026.

Aina ya chanzo: Makala asili ya utafiti.

Hali ya mapitio ya kitaalamu: Utafiti uliopitiwa na wataalamu, uliochapishwa katika jarida na kupitia mchakato wa kukubaliwa/marekebisho.

Leseni: Creative Commons Attribution, CC BY.

Maneno muhimu: ctDNA; cfDNA; biomarker; chemotherapy resistance; treatment response; esophageal adenocarcinoma.

Ufadhili: Msaada kutoka Canadian Cancer Society Emerging Scholar Award #707153 na Fonds de Recherche du Québec en Santé; chanzo kinaripoti nambari #312831 kwa J.V.B. na #330312 kwa A.B.

Bodi ya maadili: Institutional Review Board Statement: haitumiki.

Ridhaa iliyoarifiwa: Haitumiki.

Upatikanaji wa data: Inaelezwa kuwa data ghafi zinazounga mkono matokeo ya makala zitatolewa na waandishi kwa ombi.

Mgongano wa maslahi: Waandishi wanatangaza kwamba hakuna mgongano wa maslahi.

Michango ya waandishi: Uundaji wa dhana J.V.B.; mbinu A.B. na J.V.B.; uthibitishaji A.B.; uchanganuzi rasmi A.B., S.T.F., B.F., T.T. na K.D.; uchunguzi A.B., L.K., S.T.F., B.F., T.T. na K.D.; rasilimali L.F. na J.V.B.; rasimu ya kwanza A.B.; mapitio na uhariri A.B., L.K., S.T.F., T.T., K.D., L.F., J.C.-L. na J.V.B.; uonyeshaji A.B.; usimamizi J.V.B.; upatikanaji wa ufadhili J.C.-L. na J.V.B.

Mbinu kuu: Florometri ya Qubit; ddPCR mahususi ya mabadiliko; uchanganuzi wa dozi–mwitikio wa CCK-8; uchanganuzi wa vipande kwa Agilent 4150 TapeStation; saitometri ya mtiririko ya Annexin V/PI; uhusiano wa Pearson; t-test ya sampuli huru yenye pande mbili; ANOVA ya njia mbili; ulinganisho mwingi wa Sidak; regresheni isiyo ya mstari ya dozi–mwitikio yenye vigezo vinne.

Kikomo kikuu cha majaribio: Utafiti ulifanywa katika tamaduni za seli za saratani za 2D. Plazma ya wagonjwa, uondoaji wa ctDNA wa in vivo na maamuzi halisi ya matibabu ya kliniki hayakujaribiwa moja kwa moja.

Kikomo kikuu cha tafsiri: Chanzo kinatoa msaada wa kimekanika kwamba ongezeko la ctDNA/cfDNA baada ya matibabu ya mapema linaweza kutokana na kifo cha seli cha sitotoksiki; hata hivyo, hakitoi kizingiti cha kliniki kinachobainisha jinsi kipimo kimoja cha ctDNA kinachoongezeka kinapaswa kuainishwa kwa mgonjwa kama mafanikio ya matibabu au kuendelea kwa ugonjwa.