Blastocystis spp., insanlarda ve çok sayıda hayvanda bağırsakta bulunabilen genetik olarak çeşitlilik gösteren anaerobik bir protisttir; bu çalışma, doğal olarak Blastocystis-pozitif olan ishalli yaklarda dışkı bakteri topluluğunun ve kısa zincirli yağ asidi profilinin Blastocystis-negatif ishalli yaklardan farklı olup olmadığını araştıran keşifsel, kesitsel bir gözlemsel çalışmadır. Lhasa'daki tek bir çiftlikten alınan 30 ishalli yak dışkı örneği taranmış; 11 örnek ilk moleküler taramada pozitif bulunmuş, altısında sekans doğrulaması başarılı olmuştur. Karşılaştırmalı analiz, altı Blastocystis-pozitif ve rastgele seçilmiş altı Blastocystis-negatif ishalli yak üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bakteri toplulukları 16S rRNA V3–V4 amplicon dizileme ile, yedi dışkı kısa zincirli yağ asidi ise GC–MS ile incelenmiştir.

Blastocystis-pozitif grupta asetik, propiyonik, bütirik, valerik, kaproik ve izobütirik asit konsantrasyonları daha düşük bulunmuş; izovalerik asit açısından anlamlı fark görülmemiştir. 16S analizinde pozitif grupta ACE, Chao1, Faith's phylogenetic diversity, gözlenen ASV sayısı ve Shannon çeşitliliği çalışmanın tanımladığı p<0,01 anlamlılık eşiğine göre daha düşük bulunmuştur. Bakteri topluluğunun genel kompozisyonu da gruplar arasında ayrılmıştır; ANOSIM sonucu R=0,9852 ve p=0,003'tür.

Taksonomik düzeyde Blastocystis-pozitif yaklarda Bacteroidota'nın göreli bolluğu daha düşük, Firmicutes_D'nin göreli bolluğu daha yüksek bulunmuştur. Karbonhidrat fermantasyonu veya kısa zincirli yağ asidi oluşumuyla daha önce ilişkilendirilmiş bazı bakteri cinsleri de pozitif grupta daha az temsil edilmiştir. PICRUSt2 analizi grupların tahmini mikrobiyal fonksiyonel potansiyelinde farklılıklar göstermiştir; ancak bu sonuçlar gerçek gen ekspresyonu, enzim aktivitesi veya metabolik akış ölçümü değildir.

Çalışmanın temel yorum sınırı nedenselliktir. Her iki grup da ishalli hayvanlardan oluştuğu, sağlıklı kontrol bulunmadığı, örneklem yalnız altı hayvan/grup olduğu ve diyet, yaş, ilaç kullanımı ve başka enterik enfeksiyonlar kapsamlı biçimde kontrol edilmediği için Blastocystis'in mikrobiyota değişikliklerine, SCFA azalmasına veya ishale neden olduğu sonucuna varılamaz.

Blastocystis spp. Pozitifliği Bu Çalışmada İshalin Nedeni Olarak Kanıtlandı mı?

Hayır. Çalışma yalnız ishalli yaklar içinde Blastocystis-pozitif ve Blastocystis-negatif hayvanları karşılaştırmıştır; sağlıklı kontrol grubu ve deneysel enfeksiyon tasarımı olmadığı için Blastocystis'in ishale veya gözlenen mikrobiyal ve metabolik değişikliklere neden olduğu gösterilemez. Bulgular Blastocystis pozitifliğiyle ilişkili örüntülerdir.

Yaklarda bağırsak mikrobiyotasının önemi

Yaklar, Qinghai–Tibet Platosu'nun kronik hipobarik hipoksi, düşük sıcaklık, güçlü ultraviyole ışınım ve mevsimsel yem kısıtlılığı gibi çevresel koşullarına uyum sağlamış ruminantlardır. Lif açısından zengin plato yemlerinin kullanılmasında gastrointestinal mikrobiyal fermantasyon önemli rol oynar.

Bağırsak mikrobiyotası yalnız bakterilerden oluşmaz. Arkea, mantar, virüs ve mikrobiyal ökaryotlar da bağırsak ekosisteminin bileşenidir. Buna rağmen bu çalışma özellikle dışkıdaki bakteriyel topluluklara odaklanmış ve 16S rRNA amplicon dizileme kullanmıştır; mantarlar, virüsler veya mutlak bakteri yükleri ölçülmemiştir.

Kısa zincirli yağ asitleri nedir?

Kısa zincirli yağ asitleri, bağırsak mikroorganizmalarının özellikle fermente edilebilir karbonhidratları işlemesi sonucunda oluşabilen küçük organik asitlerdir. Asetat, propiyonat ve bütirat bağırsak ekosisteminde en çok incelenen SCFA'lar arasındadır.

SCFA'lar epitel hücrelerinin enerji metabolizması, luminal pH, bariyer bütünlüğü ve immün düzenleme ile ilişkilidir. Ancak dışkıda ölçülen SCFA miktarı yalnız bakterilerin ne kadar SCFA ürettiğini yansıtmaz. Üretim, intestinal absorpsiyon, konak tarafından kullanım, transit süresi, dışkı su içeriği ve kullanılabilir substrat birlikte dışkı konsantrasyonunu belirler.

Blastocystis neden tek başına “patojen” olarak yorumlanmıyor?

Blastocystis birçok insan ve hayvan popülasyonunda saptanabilir ve konak–mikrobiyota ilişkisi çalışmadan çalışmaya değişebilir. Bazı insan çalışmalarında Blastocystis varlığı daha yüksek bakteriyel çeşitlilikle ilişkilendirilirken, bazı ishal olgularında belirli alt tipler düşük çeşitlilik ve farklı mikrobiyota örüntüleriyle ilişkilendirilmiştir.

Bu nedenle yalnız “Blastocystis pozitif” olmak tüm konaklarda aynı biyolojik sonucu ifade etmez. Alt tip, konak türü, klinik durum, diyet, arka plan mikrobiyotası ve çevre sonuçları değiştirebilir.

Bu çalışma neden plato yaklarına odaklanıyor?

Yüksek rakımda yaşayan yakların kronik hipoksi, soğuk, mevsimsel beslenme kısıtlılığı ve yüksek lifli otlatma düzeni, bağırsak fermentasyonu ve konak–mikrop etkileşimini düşük rakım hayvanlarından farklılaştırabilir.

Kaynak, bu çevresel bağlamın Blastocystis–mikrobiyota ilişkisini değiştirebileceğini bir bilimsel gerekçe olarak kullanmaktadır. Bununla birlikte çalışmada oksijenle ilişkili konak yanıtları, rakım gradyanı veya hipoksi göstergeleri ölçülmediği için “yüksek rakım Blastocystis etkisini artırdı” sonucu çıkarılamaz.

Çalışmanın araştırma sorusu

Ana soru, doğal Blastocystis pozitifliğinin ishalli yaklarda aşağıdaki dört özellik ile ilişkili olup olmadığıdır:

• dışkı bakteri topluluğunun değişmesi,
• bakteriyel zenginlik ve çeşitliliğin azalması,
• tahmini mikrobiyal metabolik potansiyelin değişmesi,
• dışkı SCFA konsantrasyonlarının düşmesi.

Sağlıklı kontrol grubunun olmaması neden önemlidir?

Negatif grup sağlıklı hayvanlardan oluşmamaktadır. Bu yaklar da ishallidir. Dolayısıyla iki grubun ortak paydası ishaldir; araştırma Blastocystis durumunun bu bozulmuş klinik bağlam içinde ek bir mikrobiyota/metabolit örüntüsüyle ilişkili olup olmadığını karşılaştırmaktadır.

Bu tasarım, Blastocystis-negatif ishalli yak ile Blastocystis-pozitif ishalli yak arasındaki farkı gösterebilir; ancak sağlıklı yak bağırsak ekosisteminin nasıl göründüğünü veya Blastocystis'in sağlıklı durumdan ishale geçişteki rolünü gösteremez.

Diğer karıştırıcı değişkenler

Yaş, cinsiyet, vücut kondisyonu, ayrıntılı yem tüketimi, aşı geçmişi, yakın dönem antimikrobiyal veya antiparaziter kullanım ve ishal şiddeti bireysel düzeyde sistematik olarak mevcut değildir.

Ayrıca bakteriyel, viral, protozoal ve helmint kaynaklı alternatif ishal nedenleri kapsamlı biçimde taranmamıştır. Bu nedenle gözlenen mikrobiyota ve SCFA farklarının bir bölümü Blastocystis dışındaki klinik veya çevresel değişkenlerle ilişkili olabilir.

Blastocystis tür/alt tip doğrulaması

Yaklaşık 600 bp'lik small-subunit rRNA bölgesi PCR ile amplifiye edilmiştir. Kullanılan primerler Bs-RD5-F ve Bs-BhRDr-R'dir. PCR ürünleri agaroz jel elektroforeziyle kontrol edilmiş ve başarılı ürünler bidirectional Sanger dizilemeye gönderilmiştir.

Altı doğrulanmış dizi GenBank PP439446.1 ve OR117711.1 referanslarıyla %99,84 benzerlik göstermiştir. Diziler PX888047–PX888052 accession numaralarıyla GenBank'a yüklenmiştir.

Bu sonuç Blastocystis spp. tanımlamasını desteklemiştir; ancak belirli ST alt tipini güvenilir biçimde belirlememiştir. Bu nedenle çalışmanın mikrobiyota sonuçları belirli bir Blastocystis alt tipine atfedilemez.

Zoonotik aktarım hakkında ne söylenebilir?

Bu çalışma zoonotik aktarımı test etmemektedir. Yaklardan, insanlardan, diğer hayvanlardan ve ortak çevresel kaynaklardan eş zamanlı ve alt tip çözünürlüklü diziler toplanmadığı için insana veya insandan yaka geçiş gösterilemez.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Örnekleme tasarımı

Dışkı örneklerinin saklanması

Taze dışkı doğrudan rektumdan veya defekasyondan hemen sonra steril tek kullanımlık materyalle alınmış, kuru buz üzerinde taşınmış ve laboratuvarda −80 °C'de saklanmıştır.

Blastocystis PCR protokolü

Yaklaşık 200 mg dışkıdan Omega Fecal DNA Kit kullanılarak genomik DNA çıkarılmıştır. Blastocystis SSU rRNA bölgesi Bs-RD5-F ve Bs-BhRDr-R primerleriyle çoğaltılmıştır.

25 µL PCR karışımında 12,5 µL 2× Taq PCR Master Mix, her primerden 1,0 µL, yaklaşık 100 ng template DNA ve nuclease-free water kullanılmıştır. Termal döngü; 95 °C'de 5 dakika başlangıç denatürasyonu, 35 döngü boyunca 95 °C'de 15 saniye, 59 °C'de 15 saniye ve 72 °C'de 45 saniye, ardından 72 °C'de 10 dakika final extension şeklindedir.

16S rRNA amplicon dizileme

Bakteriyel analiz için 16S rRNA geninin V3–V4 hiperdeğişken bölgesi 338F ve 806R primerleriyle çoğaltılmıştır.

Amplifikasyon 95 °C'de 3 dakika başlangıç denatürasyonu; 30 döngü boyunca 95 °C'de 30 saniye, 55 °C'de 30 saniye, 72 °C'de 45 saniye; son olarak 72 °C'de 10 dakika biçiminde uygulanmıştır.

Extraction blank ve no-template PCR kontrollerinde amplicon saptanmamıştır. Kütüphaneler Illumina MiSeq üzerinde 2 × 300 bp paired-end olarak dizilenmiştir.

Dizileme kalite sonucu

Biyoinformatik işlem hattı

Demultiplex edilmiş diziler QIIME 2 v2023.9 ile işlenmiştir. Primer ve düşük kaliteli baz temizliğinin ardından denoising, paired-end birleştirme, dereplication, error correction ve chimera removal DADA2 ile yapılmıştır.

DADA2, benzerlik tabanlı OTU kümeleri yerine exact amplicon sequence variant üretmiştir. Taksonomik sınıflandırmada Genome Taxonomy Database release R214 ve q2-feature-classifier naïve Bayes classifier kullanılmıştır; confidence threshold 0,7'dir.

Kloroplast, mitokondri ve bakteri dışı diziler çıkarılmış; çeşitlilik analizinden önce örnekler minimum dizileme derinliğine rarefy edilmiştir.

Alfa çeşitlilik analizi

ACE ve Chao1 zenginlik tahminlerini; Faith's phylogenetic diversity filogenetik çeşitliliği; observed ASVs gözlenen varyant sayısını; Pielou evenness topluluğun eşit dağılımını; Shannon ve Simpson ise zenginlik ve dağılım yapısını farklı biçimlerde yansıtmaktadır.

Good's coverage açısından grup farkı saptanmamıştır. Rarefaction eğrilerinin plato yapması, mevcut örneklerde dizileme derinliğinin gözlenen bakteriyel çeşitliliği karakterize etmek açısından yeterli olduğuna işaret etmektedir; bu durum örneklem sayısının yeterli olduğu anlamına gelmez.

Beta çeşitlilik ve grup ayrımı

Beta çeşitlilik, örneklerin bakteri topluluk kompozisyonlarının birbirlerinden ne kadar farklı olduğunu değerlendirmektedir. Bray–Curtis dissimilarity üzerine PCoA ve NMDS uygulanmış, ayrıca PCA ve UPGMA kullanılmıştır.

ANOSIM'deki yüksek pozitif R değeri, incelenen 12 örnekte gruplar arası kompozisyon farklarının grup içi farklılıklardan daha güçlü olduğunu göstermektedir. Küçük örneklem nedeniyle sonuç dış popülasyonlara genellenmemelidir.

Filum düzeyindeki kompozisyon

Firmicutes/Bacteroidota benzeri oranların tek başına evrensel “dysbiosis göstergesi” olarak kullanılmaması gerekir. Taksonomik oranlar konak türü, diyet, gastrointestinal bölge, örnek hazırlama, dizileme yöntemi ve hastalık bağlamından etkilenir.

Cins düzeyindeki öne çıkan örüntüler

Blastocystis-pozitif grupta en bol cinsler arasında Arthrobacter_B (%10,20), Romboutsia_B (%8,94) ve Faecousia (%8,04) yer almıştır. Blastocystis-negatif grupta Faecousia (%16,17), Cryptobacteroides (%8,11) ve Paraprevotella (%3,58) öne çıkmıştır.

LEfSe analizi pozitif grupta Firmicutes_D, Actinobacteriota, Bacilli, Micrococcaceae, Planococcaceae, Bacillales_A, Peptostreptococcales ve Arthrobacter_B; negatif grupta ise Bacteroidota, Bacteroidia, Bacteroidales, Oscillospiraceae_88309, Spirochaetota, Verrucomicrobiota, Faecousia ve Alloprevotella gibi taksonları ayırt edici olarak göstermiştir.

Bu taksonlar “Blastocystis tanı biyobelirteci” olarak kabul edilmemelidir. Dış doğrulama ve tanısal performans analizi yapılmamıştır.

Mikrobiyal ortak-bulunma ağı

Ağ analizine yalnız örneklerin en az %50'sinde bulunan ve ortalama göreli bolluğu %0,1'den yüksek cinsler alınmıştır. Spearman korelasyonunun mutlak değeri en az 0,70 ve Benjamini–Hochberg düzeltilmiş q değeri <0,05 olduğunda bağlantı korunmuştur.

Örneğin Enterenecus; Phocaeicola_A_858004, Porcincola, Agathobacter_164119 ve Pygmaiobacter ile pozitif korelasyon göstermiştir. Faecousia UBA644, UBA5905 ve UBA6857 ile pozitif; Neoscardovia ise QALR01, UBA1732 ve UBA1259 ile negatif korelasyon göstermiştir.

Bu ağ istatistiksel ortak-değişim desenini gösterir. Bir bakterinin diğer bakteriyi doğrudan desteklediği veya baskıladığı sonucuna varılamaz.

Kısa zincirli yağ asitlerinin ölçümü

Yaklaşık 200 mg çözündürülmüş dışkı 1,8 mL %0,5 fosforik asit içinde homojenize edilmiş; 15.000×g'de 10 dakika, 4 °C'de santrifüj edilmiştir. Supernatant ethyl acetate ile ekstrakte edilmiş ve 0,22 µm PTFE filtreden geçirilmiştir.

İç standart olarak 1 mM 4-metilvalerik asit kullanılmıştır. Yedi noktalı kalibrasyon serisi hazırlanmış ve kabul için R² ≥0,99 koşulu uygulanmıştır.

GC–MS cihazı Agilent 7890B gaz kromatografı ile Agilent 5977B mass-selective detector kombinasyonudur. HP-FFAP kolon 30 m × 0,25 mm iç çap × 0,25 µm film kalınlığına sahiptir.

Bir µL örnek splitless modda 250 °C inlet sıcaklığında enjekte edilmiş, helyum 1,0 mL/dakika sabit akışta taşıyıcı gaz olarak kullanılmıştır. Oven programı 50 °C'de 1 dakika; 10 °C/dakika ile 180 °C'ye; ardından 20 °C/dakika ile 240 °C'ye çıkış ve 240 °C'de 5 dakika bekleme şeklindedir.

Electron ionization 70 eV'de gerçekleştirilmiş ve selected-ion-monitoring modu kullanılmıştır.

GC–MS yöntem doğrulaması

SCFA sonuçları

Dışkıdaki SCFA Azalması Mikrobiyal SCFA Üretiminin Azaldığını Doğrudan Kanıtlar mı?

Hayır. Dışkı SCFA konsantrasyonu mikrobiyal üretimin yanında intestinal absorpsiyon, konak kullanımı, gastrointestinal transit, dışkı su içeriği ve kullanılabilir substrattan etkilenir; bu nedenle çalışmada ölçülen düşük dışkı SCFA değerleri azalmış mikrobiyal üretimle uyumlu olabilir fakat üretim hızının doğrudan ölçümü değildir.

SCFA ile bakteri kompozisyonunun birlikte yorumlanması

Pozitif grupta Bacteroidota ve Alloprevotella, Faecalibacterium, Caproiciproducens, Intestinimonas, Angelakisella ve Roseburia gibi karbonhidrat fermantasyonu veya SCFA üretimiyle daha önce ilişkilendirilmiş bazı taksonların daha az temsil edilmesi, SCFA sonuçlarıyla aynı yönde bir örüntüdür.

Bununla birlikte işlev tür ve hatta suş düzeyinde değişebilir. 16S V3–V4 amplicon verisi bakterinin gerçekten hangi metabolitleri hangi hızda ürettiğini ölçmez.

PICRUSt2 Sonuçları Gerçek Metabolik Aktiviteyi Ölçüyor mu?

Hayır. PICRUSt2, 16S rRNA taksonomik profilleri ile referans genom bilgilerini kullanarak topluluğun olası genetik ve metabolik fonksiyon kapasitesini hesaplayan bir tahmin yöntemidir; gerçek gen miktarı, transkripsiyon, protein, enzim aktivitesi, metabolik akış veya SCFA üretimi doğrudan ölçülmemiştir.

MetaCyc tabanlı tahminler

Blastocystis-pozitif grupta glikoliz, TCA/glioksilat bypassı ve metiyonin/homoserin metabolizmasıyla ilişkili bazı tahmini yolların daha yüksek temsil edildiği bildirilmiştir.

Negatif grupta ASPASN-PWY ve hücre zarfı/glikan biyosenteziyle ilişkili COLANSYN-PWY ve NAGLIPASYN-PWY gibi yollar daha fazla tahmin edilmiştir.

KEGG tabanlı tahminler

Pozitif grupta keton cismi sentez/yıkımı, yağ asidi metabolizması, dallı zincirli amino asit yıkımı, ABC transporters, phosphotransferase system ve tryptophan metabolism ile ilişkili yolların tahmini temsili daha yüksek bulunmuştur.

Negatif grupta dallı zincirli amino asit biyosentezi, folate one-carbon pool, glycosaminoglycan degradation, biotin metabolism ve lipopolysaccharide biosynthesis gibi yolların daha fazla temsil edildiği tahmin edilmiştir.

Bu görünürdeki fonksiyon farklarının doğrulanması shotgun metagenomics, metatranscriptomics veya metabolomics gibi doğrudan moleküler ölçümler gerektirir.

İstatistiksel analiz

İstatistikler SPSS 27.0 ile gerçekleştirilmiştir. Her yak bağımsız deneysel birim kabul edilmiş; teknik tekrar varsa hayvan başına tek değer oluşturmak üzere ortalaması alınmıştır.

Normalite Shapiro–Wilk, varyans homojenliği Levene testiyle değerlendirilmiştir. Normal ve eşit varyanslı veriler independent-samples Student's t-test; normal fakat eşit olmayan varyanslı veriler Welch's t-test; normal dağılmayan veriler Mann–Whitney U ile karşılaştırılmıştır.

Ana iki taraflı anlamlılık eşiği p<0,01'dir. Çoklu taksonomik ve tahmini fonksiyon karşılaştırmalarında Benjamini–Hochberg false-discovery-rate düzeltmesi uygulanmış ve q<0,01 anlamlı kabul edilmiştir. Düzeltmeden sonra anlamlılığını korumayan sonuçlar keşifsel olarak değerlendirilmiştir.

LEfSe için ayrıca Kruskal–Wallis ve pairwise Wilcoxon testlerinde p<0,05 ve LDA score ≥2,0 seçim kriteri kullanılmıştır.

Kaynak içindeki p-eşiği yorumuna dikkat

Kaynağın abstract'ında Pielou evenness p=0,011 ve Simpson p=0,037 değerleri pozitif grupta daha düşük olarak raporlanmıştır. Ancak yöntem bölümünde çalışmanın ana iki taraflı istatistiksel anlamlılık eşiği p<0,01 olarak belirlenmiştir.

Bu nedenle bu iki alfa çeşitlilik metriği yön olarak daha düşük olsa da ana eşiğe göre istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmemelidir. ACE, Chao1, Faith's PD, observed ASVs ve Shannon ise p<0,01 koşulunu karşılamaktadır.

Çalışmanın önerdiği hipotetik biyolojik yol

Yazarların tartıştığı mekanizma doğrudan doğrulanmış bir nedensel zincir değil, mevcut sonuçları birleştiren hipotezdir:

1. Blastocystis pozitifliği belirli bir bakteri topluluğu yapısıyla birlikte görülür.
2. SCFA oluşumuyla ilişkilendirilmiş bazı taksonların göreli temsili azalır.
3. Dışkıda birkaç SCFA'nın konsantrasyonu daha düşük ölçülür.
4. Düşük SCFA erişilebilirliğinin epitel ve immün homeostazı etkileyebileceği varsayılır.

Son basamak bu çalışmada doğrudan ölçülmemiştir. Intestinal permeability, tight-junction proteins, GPR43 expression, cytokines ve histopathology değerlendirilmemiştir.

Veterinerlik açısından yorum

Blastocystis PCR testi, yaklarda ishalin geniş kapsamlı tanısal araştırmasının bir parçası olabilir. Ancak tek başına pozitif PCR sonucu ishalin nedenini belirlemez ve belirli bir tedavi seçimini doğrulamaz.

Klinik incelemede diyet, hidrasyon, ilaç geçmişi, ishal şiddeti ve bakteriyel, viral, protozoal veya helmint kaynaklı diğer enfeksiyonlar da değerlendirilmelidir.

Kaynak, uygun dışkı yönetimi ve yem/suyun fekal kontaminasyondan korunması gibi genel biyogüvenlik önlemlerinin fekal–oral maruziyeti azaltabileceğini belirtmektedir.

Probiotik, prebiyotik, SCFA takviyesi veya bitkisel formülasyonların Blastocystis ile ilişkili yak hastalığında etkinliği bu çalışma tarafından doğrulanmamıştır; bunlar kanıtlanmış tedavi olarak sunulmamalıdır.

Çalışmanın desteklediği sonuçlar

Blastocystis-pozitif ishalli yakların dışkısında altı SCFA'nın konsantrasyonu Blastocystis-negatif ishalli yaklardan daha düşüktür.

Pozitif ve negatif ishalli yak gruplarının bakteri topluluğu kompozisyonları incelenen örneklemde belirgin biçimde ayrılmıştır.

ACE, Chao1, Faith's PD, observed ASVs ve Shannon çeşitliliği, çalışmanın p<0,01 ana anlamlılık eşiği altında pozitif grupta daha düşüktür.

Bacteroidota ve bazı fermentasyon/SCFA ile ilişkilendirilmiş taksonlar pozitif grupta daha düşük göreli bolluk göstermiştir.

PICRUSt2, grupların tahmini fonksiyonel potansiyellerinde farklılıklar olduğunu göstermiştir.

Çalışmanın desteklemediği sonuçlar

Blastocystis'in ishale neden olduğu gösterilmemiştir.

Blastocystis'in gözlenen bakteri değişikliklerine doğrudan neden olduğu gösterilmemiştir.

Düşük dışkı SCFA düzeylerinin doğrudan daha düşük mikrobiyal SCFA üretim hızını temsil ettiği gösterilmemiştir.

Sağlıklı yakların mikrobiyota profili bu araştırmadan çıkarılamaz.

PICRUSt2 sonuçları gerçek gen ekspresyonu veya metabolik akış ölçümü değildir.

Co-occurrence ağındaki korelasyonlar doğrudan mikrobiyal etkileşim değildir.

Taksonomik farklılıklar tanısal biyobelirteç olarak doğrulanmamıştır.

Belirli Blastocystis alt tipine ait patojenik özellik çıkarılamaz.

Yak–insan zoonotik aktarımı gösterilmemiştir.

Probiotik, prebiyotik, SCFA veya bitkisel ürünlerin Blastocystis tedavisi olduğu gösterilmemiştir.

Temel sınırlılıklar

Gelecek çalışmalar

Sonuçların doğrulanması için daha büyük, longitudinal ve birden fazla çiftliği kapsayan çalışmalar gereklidir. Sağlıklı ve ishalli yakların birlikte değerlendirilmesi, eksik kalan referans durumunu sağlayabilir.

Ayrıntılı yaş, cinsiyet, vücut kondisyonu, diyet, ilaç geçmişi ve klinik şiddet bilgileri toplanmalı; bakteriyel, viral, protozoal ve helmint eş enfeksiyonlar kapsamlı biçimde taranmalıdır.

Blastocystis için subtype-resolved analiz yapılmalı; mikrobiyal fonksiyon shotgun metagenomics, metatranscriptomics veya metabolomics ile doğrudan test edilmelidir.

Konak düzeyindeki biyolojik mekanizmayı değerlendirmek için intestinal bariyer bütünlüğü, tight-junction proteinleri, SCFA reseptörleri, sitokinler, histopatoloji, sindirilebilirlik ve üretim performansı gibi sonuçlara ihtiyaç vardır.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün başlık: Blastocystis spp. Positivity Is Associated with Altered Fecal Bacterial Communities and Reduced Short-Chain Fatty Acid Concentrations in Diarrheic Yaks.

Yazarlar: Qiang Zhang; Ziye Zhu; Ziyi Xu; Muhammad Safdar; Wentong Liu; Kun Li.

Corresponding authors: Wentong Liu; Kun Li.

Kurumlar: Agriculture, Rural Affairs, Water Resources and Science & Technology Bureau of Lixian County; College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University; School of Basic Medicine, Hubei University of Arts and Science; Department of Breeding & Genetics, Cholistan University of Veterinary and Animal Sciences; Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology-Hellas.

Dergi: Veterinary Sciences.

Yayınevi: MDPI, Basel, Switzerland.

Yayın bilgisi: Veterinary Sciences 2026, 13(9), 910.

DOI: 10.3390/vetsci13090910.

Makale geçmişi: Alındı 13 Temmuz 2026; revize edildi 31 Ağustos 2026; kabul edildi 1 Eylül 2026; yayımlandı 4 Eylül 2026.

Kaynak türü: Özgün araştırma makalesi; keşifsel, kesitsel ve gözlemsel hayvan çalışması.

Hakemlik: Veterinary Sciences hakemli bir açık erişim dergisidir.

Lisans: Creative Commons Attribution (CC BY).

Ana örneklem: Lhasa'daki tek çiftlikten 2025 yılında elde edilmiş ishalli yak dışkı örnekleri.

Nihai karşılaştırma: 6 Blastocystis-pozitif ve 6 Blastocystis-negatif ishalli yak.

Sağlıklı kontrol: Yok.

Blastocystis tanımlama yöntemi: SSU rRNA PCR + bidirectional Sanger sequencing.

Blastocystis dizileri: GenBank PX888047–PX888052.

Alt tip: Güvenilir biçimde atanamamıştır.

Bakteriyel profil yöntemi: 16S rRNA V3–V4 amplicon sequencing; Illumina MiSeq 2 × 300 bp.

Biyoinformatik: QIIME 2 v2023.9; DADA2; GTDB release R214; q2-feature-classifier.

Ham dizileme: 2.751.028 read.

Kalite sonrası dizileme: 2.620.949 read; %95,27 retention.

Ham 16S veri erişimi: NCBI Sequence Read Archive BioProject PRJNA1414128.

Alfa çeşitlilik: ACE, Chao1, Faith's phylogenetic diversity, observed ASVs, Pielou's evenness, Shannon, Simpson ve Good's coverage.

Beta çeşitlilik: Bray–Curtis; PCA; PCoA; NMDS; UPGMA; ANOSIM 999 permutations.

Diferansiyel takson analizi: LEfSe; LDA ≥2,0.

Co-occurrence ağı: Genus düzeyi Spearman korelasyonu; ≥%50 örnekte bulunma; ortalama relative abundance >%0,1; |ρ| ≥0,70; BH q<0,05.

Fonksiyonel tahmin: PICRUSt2; MetaCyc ve KEGG. Doğrudan fonksiyon ölçümü değildir.

SCFA yöntemi: Gas chromatography–mass spectrometry.

GC–MS: Agilent 7890B + 5977B mass-selective detector; HP-FFAP column.

Ölçülen SCFA'lar: Acetic, propionic, butyric, isobutyric, valeric, isovaleric ve caproic acids.

İstatistik: SPSS v27.0; Shapiro–Wilk; Levene; Student's t-test; Welch's t-test; Mann–Whitney U; Benjamini–Hochberg FDR.

Ana anlamlılık eşiği: İki taraflı p<0,01; çoklu takson/fonksiyon karşılaştırmalarında q<0,01. LEfSe kendi seçim protokolünde p<0,05 kullanmıştır.

İstatistiksel raporlama notu: Abstract'ta Pielou's evenness p=0,011 ve Simpson p=0,037 ile daha düşük raporlanmıştır; bu iki değer yöntem bölümünde belirtilen p<0,01 ana anlamlılık eşiğini karşılamamaktadır.

Ana SCFA sonucu: Pozitif grupta asetik, propiyonik, bütirik, valerik, kaproik ve izobütirik asit daha düşüktür; izovalerik asitte anlamlı fark yoktur.

ANOSIM: R=0,9852; p=0,003.

Etik kurul: Ethics Committee of Nanjing Agricultural University; NJAU.No20240910164; onay tarihi 10 Eylül 2024.

Bilgilendirilmiş onam: Uygulanamaz.

Finansman: Key R&D and Transformation Projects of the Xizang Autonomous Region, XZ202601ZY0138; National Natural Science Foundation of China, 32102692.

Veri erişilebilirliği: 16S ham verileri PRJNA1414128; Blastocystis SSU rRNA dizileri PX888047–PX888052.

Çıkar çatışması: Yazarlar çıkar çatışması bildirmemiştir.

Yazar katkıları: Kavramsallaştırma Kun Li; metodoloji, yazılım, biçimsel analiz, araştırma ve veri kürasyonu Qiang Zhang, Ziye Zhu ve Ziyi Xu; doğrulama Kun Li ve Wentong Liu; kaynaklar, görselleştirme, danışmanlık, proje yönetimi ve finansman edinimi Kun Li; özgün taslak Kun Li ve Wentong Liu; inceleme/düzenleme Kun Li ve Muhammad Safdar olarak bildirilmiştir.

Temel yöntemsel sınır: Küçük örneklemli kesitsel tasarım, sağlıklı kontrol eksikliği, tek çiftlik, eksik host/diyet metadata, diğer enterik patojenlerin sistematik dışlanmaması ve Blastocystis alt tipinin belirlenmemesi nedeniyle nedensellik kurulamaz.

Fonksiyonel yorum sınırı: 16S göreli bolluk verisi mutlak bakteri sayısını; PICRUSt2 gerçek gen veya metabolik aktiviteyi; dışkı SCFA konsantrasyonu ise doğrudan intestinal mikrobiyal üretim hızını ölçmez.

Veterinerlik uygulama sınırı: Blastocystis PCR pozitifliği ishalin nedenini tek başına belirlemez ve spesifik tedavi için yeterli değildir.

Görsel kullanım notu: Kaynak CC BY lisanslıdır. Verianla kapak görselinde kaynak grafiklerinin birebir yeniden üretimi yerine yak, Blastocystis, bakteriyel topluluk değişimi ve azalan SCFA ilişkisini bilimsel olarak doğru, bağımsız ve şematik biçimde göstermek tercih edilmelidir.