Ultrason destekli enzimatik protein hidrolizatı, bitkisel proteinlerin enzimlerle daha küçük peptitlere parçalanmasının ultrasonik kavitasyonla desteklendiği bir peptit karışımıdır. Bu in vitro çalışma, fasulye ve kabak çekirdeği proteinlerine ultrasonun enzimatik hidrolizden önce veya sonra uygulanmasının hidroliz derecesini ve antioksidan kapasiteyi nasıl değiştirdiğini; elde edilen peptit fraksiyonlarının LPS ve palmitik asitle uyarılmış RAW264.7 makrofajlarında inflamatuvar ve oksidatif yanıtı azaltıp azaltmadığını araştırmıştır.

Ultrason ön işlemi, iki bitkisel protein kaynağında da hidroliz derecesinin en yüksek olduğu işlem olmuştur. Fasulye hidrolizatında hidroliz derecesi kontrol grubunda %28,64 iken ön ultrason grubunda %34,06'ya; kabak çekirdeğinde %63,06'dan %70,87'ye yükselmiştir. Fasulye hidrolizatında ABTS ve ORAC antioksidan kapasitesi de ön işlemle belirgin biçimde artmıştır. Kabak çekirdeğinde en yüksek ORAC ön ultrason grubunda görülürken, ABTS açısından ön ve son ultrason grupları birbirinden istatistiksel olarak ayrılmamıştır.

Ultrason ön işlemiyle oluşturulan hidrolizatlar 3–10 kDa ve <3 kDa olmak üzere iki moleküler ağırlık fraksiyonuna ayrılmıştır. RAW264.7 hücrelerinde bütün fraksiyonlar 32,5–500 µg/mL aralığında %95'in üzerinde hücre canlılığı göstermiş ve LPS + palmitik asit kaynaklı NO üretimini doza bağlı biçimde baskılamıştır. Sonraki deneylerde 250 µg/mL konsantrasyonu kullanılmıştır.

Peptitlerin inflamatuvar uyarandan önce, aynı anda veya başladıktan sonra uygulanmasını karşılaştıran deneylerde bütün fraksiyonlar pozitif kontrole göre NO ve ROS üretimini azaltmıştır. Genel olarak en güçlü antiinflamatuvar yanıt ortak uygulama sırasında görülmüş ve fasulyenin <3 kDa fraksiyonu olan CB3 birçok sonlanımda öne çıkmıştır. CB3, Nos-2 ve Cox-2 mRNA düzeylerini %70'in üzerinde azaltmış, TNF-α üretiminde yaklaşık %75 azalma göstermiş ve IL-6 ile MCP-1 üzerinde de en güçlü etkilerden birini oluşturmuştur.

Bununla birlikte çalışma NF-κB/MAPK veya NRF2 yollarını doğrudan ölçmemiştir. Bu yolakların katılımı NO, ROS, Nos-2/Cox-2 ve sitokin değişikliklerinden ve önceki literatürden çıkarılmaktadır. Aktif peptit dizileri de LC-MS/MS ile tanımlanmamıştır. Sonuçlar bu nedenle gıda kökenli peptitlerin potansiyel antiinflamatuvar biyolojik aktivitesine ilişkin laboratuvar kanıtıdır; insanlarda ağızdan tüketim sonrasında aynı etkinliğin oluştuğunu göstermez.

Araştırmanın temel problemi

Obeziteyle ilişkili kronik düşük dereceli inflamasyon, lipopolisakkaritler ve doymuş yağ asitleri gibi uyaranların immün hücrelerde inflamatuvar sinyal yollarını sürekli etkin tutabildiği karmaşık bir biyolojik durumdur. Makrofajlarda bu yanıt NO, ROS, proinflamatuvar enzimler ve sitokinlerin yükselmesiyle birlikte görülebilir.

Bitkisel proteinlerin enzimatik hidrolizi sırasında açığa çıkan kısa peptitlerin bazıları antioksidan veya antiinflamatuvar biyolojik aktivite gösterebilir. Ancak hidrolizin verimi; protein yapısının enzime ne kadar açık olduğu, protein agregasyonu ve enzim–substrat temasının yeterliliği gibi özelliklerden etkilenir.

Bu çalışmanın temel teknolojik sorusu, ultrasonik kavitasyonun protein yapısını hidrolizden önce açarak enzimlerin substrata erişimini artırıp artırmadığıdır. İkinci soru ise oluşan peptitlerin yalnız kimyasal antioksidan testlerde değil, inflamatuvar makrofaj modelinde de biyolojik yanıt oluşturup oluşturmadığıdır.

Ultrason neden enzimatik hidrolize yardımcı olabilir?

Ultrason uygulamasında sıvı ortamda büyüyüp çöken kavitasyon kabarcıkları oluşabilir. Kaynak, bu mikroçevrelerin protein–protein etkileşimlerini bozabileceğini, proteinlerin ikincil ve üçüncül yapısını açabileceğini, agregatları dağıtabileceğini ve enzimin erişebildiği yüzey alanını artırabileceğini açıklamaktadır.

Bu fiziksel değişiklikler yeni bir proteaz enzimi oluşturmaz. Temel etki, mevcut protein substratının pepsin ve pankreatin gibi enzimlere daha erişilebilir hale gelmesidir.

Ultrasonu Enzimatik Hidrolizden Önce Uygulamak Neden Daha Etkiliydi?

Kaynak sonuçlarına göre ön ultrason, henüz parçalanmamış protein yapısını ve agregatlarını enzimlerle temas etmeden önce değiştirdiği için enzim–substrat erişilebilirliğini artırmış; son ultrason ise enzimatik kesimlerin büyük bölümü zaten tamamlandıktan sonra uygulanmıştır ve bu nedenle hidroliz derecesine sağlayabileceği ek katkı daha sınırlı kalmıştır.

Protein kaynakları

Çalışmada organik Bayo çeşidi fasulye ve kabak çekirdeği kullanılmıştır. Materyaller Meksika'nın Tlaxcala bölgesindeki yerel üreticilerden sağlanmıştır.

Fasulye ve kabak çekirdeği öğütülerek 0,18 mm elekten geçirilmiştir. Kabak çekirdeği unu, lipitlerin uzaklaştırılması için 1:20 ağırlık/hacim oranında hekzanla 60 °C'de 1 saat işleme tabi tutulmuştur.

Protein ekstraksiyonunda unlar su içinde 1:10 ağırlık/hacim oranında süspanse edilmiştir. Fasulye için pH 8, kabak çekirdeği için pH 11'e ayarlanmış; süspansiyonlar 25 °C'de 1 saat karıştırılmıştır. İlk santrifüj 5000×g'de 15 dakika gerçekleştirilmiş, süpernatant pH 4,5'e getirilerek 10.000×g'de 15 dakika yeniden santrifüj edilmiştir. Protein çökeltileri −50 °C ve 0,1 mBar koşullarında 48 saat liyofilize edilmiştir.

Gastrointestinal enzimatik hidroliz

Fasulye ve kabak çekirdeği protein konsantreleri su içinde 1:20 ağırlık/hacim oranında dağıtılmış ve pH 1 M HCl ile 2'ye ayarlanmıştır.

Pepsin, enzim:substrat oranı 1:20 ağırlık/ağırlık olacak biçimde eklenmiş ve 37 °C'de 2 saat inkübe edilmiştir. Daha sonra pH 7,5'e çıkarılarak pepsin etkisizleştirilmiş, domuz kaynaklı pankreatin yine 1:20 enzim:substrat oranında eklenmiş ve 2 saat daha inkübasyon yapılmıştır.

Sindirim 75 °C'de 20 dakika ısıtılarak durdurulmuş, örnekler 16.000×g'de 10 dakika santrifüj edilmiş ve elde edilen süpernatantlar liyofilize edilmiştir.

Ultrason koşulları

Ön işlemde ultrason pepsin ve pankreatin eklenmeden önce doğal protein konsantresine uygulanmıştır. Son işlemde ise ultrason, pepsin–pankreatin sindirimi tamamlandıktan sonra elde edilen hidrolizata uygulanmıştır.

Fasulye ve kabak çekirdeği aynı şekilde hidrolize olmadı

SDS-PAGE sonuçlarında fasulye proteinindeki yaklaşık 35–48 kDa fazeolin alt birimleri hidroliz sonrasında belirgin biçimde kalmıştır. Kaynak fazeolinin fasulye toplam proteinlerinin önemli bir bölümünü oluşturduğunu ve gastrointestinal sindirime dirençli olduğunu belirtmektedir.

Buna karşılık kabak çekirdeği proteinlerinin ana 11S globulin ve 2S albumin bantları sindirim sonrasında büyük ölçüde ortadan kalkmıştır. Kabak çekirdeği hidrolizatının fasulyeye göre çok daha yüksek hidroliz derecesi göstermesi bu protein yapısı farkıyla uyumludur.

Tricine-SDS-PAGE her iki kaynakta da 10 kDa'nın altındaki peptitlerin oluştuğunu göstermiştir.

ABTS ve ORAC aynı şeyi mi ölçüyor?

Hayır. Kaynak, antioksidan kapasiteyi iki farklı kimyasal prensiple değerlendirmiştir. ABTS testi ağırlıklı olarak elektron transferine dayalı bir antioksidan kapasite ölçümünü, ORAC ise hidrojen atomu transferiyle ilişkili radikal süpürme kapasitesini temsil eder.

İki testin birlikte kullanılması, bir peptit karışımının antioksidan özelliğini yalnız tek reaksiyon türüne göre değerlendirmemeyi sağlar. Bununla birlikte ABTS veya ORAC değerinin yüksek olması insan vücudunda aynı büyüklükte klinik antioksidan etki oluşacağını göstermez.

Peptit fraksiyonları nasıl oluşturuldu?

Hücresel deneyler için ultrason ön işlemi uygulanmış fasulye ve kabak çekirdeği hidrolizatları ultrafiltrasyonla moleküler ağırlıklarına göre ayrılmıştır:

• CB10: fasulye 3–10 kDa fraksiyonu
• CB3: fasulye <3 kDa fraksiyonu
• PS10: kabak çekirdeği 3–10 kDa fraksiyonu
• PS3: kabak çekirdeği <3 kDa fraksiyonu

Daha Küçük Peptitler Her Zaman Daha Güçlü Antiinflamatuvar Etki mi Gösterdi?

Hayır. Fasulyede <3 kDa CB3 fraksiyonu birçok hücresel sonlanımda en güçlü fraksiyon olurken, kabak çekirdeğinde NO baskılanması açısından 3–10 kDa PS10 fraksiyonu PS3'ten daha güçlüydü; bu sonuç biyolojik etkinliğin yalnız moleküler ağırlığa değil peptit dizisine, amino asit bileşimine ve yapısal özelliklere de bağlı olduğunu göstermektedir.

RAW264.7 makrofaj modeli

RAW264.7 fare makrofaj hücreleri DMEM/F12 ortamında %10 FBS ve %1 penisilin–streptomisinle, 37 °C, %5 CO₂ ve %95 nemli hava koşullarında kültüre edilmiştir. Bütün hücresel deneylerde pasaj 10 kullanılmıştır.

İnflamatuvar modelde hücreler 100 ng/mL LPS ve 100 µM palmitik asitle uyarılmıştır. Bu iki uyaranın birlikte kullanılması, obeziteyle ilişkili endotoksin ve doymuş yağ asidi stresini makrofaj düzeyinde taklit etmeyi amaçlamaktadır.

İlk doz taraması

Hidrolizat fraksiyonları 32,5–500 µg/mL aralığında test edilmiştir. Bütün fraksiyonlarda hücre canlılığı %95'in üzerinde kalmıştır.

LPS + palmitik asit pozitif kontrolü NO üretimini negatif kontrole göre yaklaşık dört kat artırmıştır. Dört peptit fraksiyonunun tamamı NO üretimini dozla birlikte azaltmıştır.

CB10, CB3 ve PS10 için 250 µg/mL'den 500 µg/mL'ye çıkıldığında ek anlamlı azalma görülmediği için ana zamanlama deneylerinde 250 µg/mL kullanılmıştır.

Pre-, co- ve post-treatment ne anlama geliyor?

NO sonuçları

Üç zamanlama düzeninde de peptit fraksiyonları LPS + PA pozitif kontrolüne göre NO üretimini anlamlı biçimde azaltmıştır.

Pre-treatment düzeninde CB3 ve PS10 en güçlü NO baskılamasını göstermiştir. Bu bulgu fasulye ve kabak çekirdeği için aynı moleküler ağırlık fraksiyonunun en iyi olmadığına işaret eder.

Co-treatment sırasında bütün fraksiyonlar güçlü baskılama göstermiş ve CB3 en belirgin yanıtı oluşturmuştur.

Post-treatment düzeninde PS3 dışındaki fraksiyonlar NO düzeyini negatif kontrol düzeylerine kadar düşürmüştür. Bu sonuç peptitlerin yalnız inflamatuvar uyaran öncesinde değil, yanıt başladıktan sonra da in vitro etkili olabildiğini göstermektedir.

ROS sonuçları

DCFH-DA floresansı hücre içi oksidan yük için kullanılan dolaylı bir göstergedir. LPS + PA bütün zamanlama düzenlerinde ROS sinyalini artırmıştır.

Bütün peptit fraksiyonları pozitif kontrole göre ROS üretimini anlamlı biçimde baskılamıştır. Pre-treatment sırasında fraksiyonların ROS üzerindeki etkileri arasında belirgin ayrım görülmemiştir.

Co-treatment sırasında CB3 en güçlü ROS baskılanmasını gösteren fraksiyonlardan biri olmuştur. Kaynak ayrıca CB3 ve PS3 gibi daha küçük peptit fraksiyonlarının hücre içi ROS baskılamasında daha büyük fraksiyonlardan güçlü olabildiğini tartışmaktadır.

Post-treatment sırasında dört fraksiyon da ROS düzeyini pozitif kontrolün ve kaynak anlatımına göre negatif kontrolün altına indirmiştir.

NO ile ROS aynı biyolojik sonlanım değildir

NO, bu modelde NOS-2 aktivitesiyle ilişkili inflamatuvar azot türü üretimini; DCFH-DA floresansı ise hücre içindeki oksidatif yükle ilişkili sinyali temsil eder. Bir peptit fraksiyonunun NO üzerinde güçlü olması, ROS üzerinde aynı sıralamada etkili olması gerektiği anlamına gelmez.

Nitekim kabak çekirdeği PS10 fraksiyonunun NO baskılamasında öne çıkmasına karşılık daha küçük PS3 fraksiyonunun bazı ROS karşılaştırmalarında güçlü olması, peptit büyüklüğüne göre mekanizma farklılaşması olabileceğini düşündürmektedir.

Nos-2 ve Cox-2 neden ölçüldü?

Nos-2, indüklenebilir nitrik oksit sentazı kodlar ve inflamatuvar koşullarda yüksek NO üretiminin temel kaynaklarından biridir. Cox-2 ise inflamasyonla ilişkili prostaglandin sentezinde görev yapan indüklenebilir siklooksijenazı kodlar.

LPS + PA uyarımı Nos-2 mRNA'sını uyarılmamış hücrelere göre 10,5 kat, Cox-2 mRNA'sını yaklaşık 7 kat artırmıştır.

CB3 bu iki genin ekspresyonunu %70'in üzerinde azaltmıştır. CB10, PS10 ve PS3 de iki geni %35'in üzerinde baskılamıştır.

Bu sonuç NO azalmasının yalnız kimyasal NO temizlenmesinden ibaret olmadığını ve inflamatuvar enzimlerin transkripsiyon düzeyinde de değiştiğini göstermektedir.

NF-κB/MAPK ve NRF2 Yolakları Bu Çalışmada Doğrudan Kanıtlandı mı?

Hayır. Nos-2, Cox-2, NO, ROS ve sitokinlerdeki değişiklikler NF-κB/MAPK baskılanması ve NRF2 ilişkili antioksidan yanıtla uyumludur, ancak çalışma fosforile yolak proteinleri, NF-κB reporter aktivitesi veya NRF2 nükleer translokasyonunu doğrudan ölçmediği için bu mekanizmalar doğrulanmış moleküler yol olarak değil, desteklenen hipotez olarak değerlendirilmelidir.

TNF-α

TNF-α, kronik inflamasyon sırasında çok sayıda metabolik ve immün yanıtı etkileyen proinflamatuvar bir sitokindir. Bütün peptit fraksiyonları LPS + PA pozitif kontrolüne göre TNF-α üretimini anlamlı biçimde azaltmıştır.

En güçlü sonuç CB3 fraksiyonunda görülmüş ve kaynak yaklaşık %75 azalma bildirmiştir.

IL-6

IL-6 bağlama göre hem proinflamatuvar hem de düzenleyici işlev gösterebilen pleiotropik bir sitokindir. Bu hücre modelinde LPS + PA ile güçlü biçimde yükselmiştir.

Dört hidrolizat fraksiyonunun tamamı IL-6 düzeyini beş kattan fazla azaltmış, en güçlü yanıt yine CB3'te görülmüştür.

MCP-1

Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1), monositlerin inflamasyon bölgelerine göçünü yönlendiren bir kemokindir. Kronik metabolik inflamasyonda aşırı MCP-1 üretimi dokuya immün hücre infiltrasyonunu sürdürebilir.

Bütün fraksiyonlar MCP-1 üretimini azaltmış; CB3 yaklaşık iki katlık düşüş göstermiştir.

Üç sitokinin birlikte azalması ne anlatıyor?

TNF-α, IL-6 ve MCP-1'in aynı deney düzeninde eş zamanlı olarak azalması, yalnız tek bir sitokinin doğrudan nötralizasyonundan daha geniş bir transkripsiyonel inflamasyon yanıtının baskılanmasıyla uyumludur.

Yazarlar bu deseni NF-κB ekseninin olası katılımıyla yorumlamıştır. Fakat yolak düzeyindeki nedensel bağlantı deneysel olarak doğrudan gösterilmemiştir.

Aktif peptitlerin kimliği biliniyor mu?

Hayır. Ultrafiltrasyon yalnız moleküler ağırlık aralıklarını ayırmıştır. CB3'ün <3 kDa olması, içindeki hangi özgül peptit dizisinin aktiviteden sorumlu olduğunu söylemez.

Peptitlerin amino asit dizileri, elektrik yükleri, N- ve C-terminal özellikleri veya TLR4 ile doğrudan bağlanma afiniteleri bu çalışmada ölçülmemiştir.

Kaynak gelecekte LC-MS/MS peptit dizilemesi, moleküler docking ve deneysel yolak doğrulamasını önermektedir.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Deneysel işlem zinciri

1. Fasulye ve kabak çekirdeği materyalinin öğütülmesi ve protein konsantresinin hazırlanması.
2. Kabak çekirdeği ununun hekzanla yağsızlaştırılması.
3. Proteinlerin alkali ortamda ekstraksiyonu ve pH 4,5'te çöktürülmesi.
4. Protein konsantrelerinin liyofilizasyonu.
5. Ultrason ön işlem grubunda proteine 20 kHz, %70 amplitüd, 10 dakika ultrason uygulanması.
6. Pepsinle 2 saat ve pankreatinle 2 saat in vitro gastrointestinal hidroliz.
7. Son ultrason grubunda enzimatik hidroliz bittikten sonra aynı ultrason koşulunun uygulanması.
8. Hidroliz derecesinin OPA yöntemiyle belirlenmesi.
9. SDS-PAGE ve Tricine-SDS-PAGE ile protein/peptit profillerinin değerlendirilmesi.
10. ABTS ve ORAC ile kimyasal antioksidan kapasitenin ölçülmesi.
11. En etkili ön-ultrason hidrolizatlarının 3–10 kDa ve <3 kDa fraksiyonlarına ayrılması.
12. RAW264.7 makrofajlarında canlılık ve NO doz taraması.
13. 250 µg/mL ile pre-, co- ve post-treatment deneyleri.
14. NO, ROS, Nos-2, Cox-2, TNF-α, IL-6 ve MCP-1 ölçümleri.

Hidroliz derecesi nasıl ölçüldü?

Hidroliz derecesi Nielsen ve çalışma arkadaşlarının o-phthaldialdehyde (OPA) yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. DH, protein zincirlerindeki peptit bağlarının enzimatik parçalanma derecesini temsil eder.

Daha yüksek DH genellikle daha fazla peptit bağının kırıldığını ve daha küçük peptitlerin oluştuğunu gösterir; ancak daha yüksek DH'nin her biyolojik aktivitede otomatik olarak daha yüksek etkinlik anlamına gelmediği kabak çekirdeği fraksiyon sonuçlarında açıkça görülmektedir.

ABTS ve ORAC ölçümü

ABTS ve ORAC için Trolox standart eğrileri hazırlanmış ve R² değerleri 0,98'in üzerinde tutulmuştur.

ABTS standart aralığı 25–200 µmol/L, ORAC aralığı 6,25–200 µmol/L'dir. Sonuçlar µmol Trolox equivalents/g protein biçiminde raporlanmıştır.

Hücresel ROS analizi

ROS üretimi 10 µM DCFH-DA kullanılarak değerlendirilmiştir. Hücreler probla 37 °C'de 30 dakika inkübe edilmiş; floresans 485 nm eksitasyon ve 530 nm emisyon dalga boylarında Cytation 5 okuyucuyla ölçülmüştür.

Sonuçlar negatif kontrol %100 kabul edilerek göreli ROS yüzdesi biçiminde verilmiştir.

NO analizi

Hücre kültürü süpernatantındaki NO, Griess Reagent System ile dolaylı olarak nitrit üzerinden ölçülmüştür. 1,56–100 µM sodyum nitrit standart eğrisi kullanılmış ve sonuçlar µM nitrit olarak raporlanmıştır.

qPCR

Co-treatment deneylerinden sonra total RNA izole edilmiş ve cDNA'ya dönüştürülmüştür. Nos-2 ve Cox-2 genleri QuantStudio 3 cihazında qPCR ile ölçülmüş, Ppib endojen kontrol olarak kullanılmıştır.

Göreli mRNA ekspresyonu \(2^{-\Delta\Delta C_T}\) yöntemiyle hesaplanmıştır.

Bu yöntem hedef genin Ct değerini önce referans genle normalize eder ve ardından deney grubunu referans koşulla karşılaştırarak göreli ekspresyon değişimini verir. Sonuç mutlak mRNA molekül sayısı değil, referansa göre kat değişimidir.

Sitokin analizi

TNF-α, IL-6 ve MCP-1 hücre kültürü süpernatantlarında ELISA kitleriyle ölçülmüştür. Bu deneyler yalnız co-treatment düzeninde ve 250 µg/mL peptit fraksiyonu kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Tekrar yapısı ve istatistik

DH, ABTS ve ORAC analizlerinde üç bağımsız enzimatik hidroliz prosedürü biyolojik tekrar olarak kullanılmış ve her biyolojik tekrar teknik olarak üç kez ölçülmüştür.

Hücresel deneyler farklı günlerde yürütülen üç bağımsız RAW264.7 hücre kültürüyle biyolojik triplikat olarak gerçekleştirilmiş; her biyolojik tekrarda her koşul için teknik üçlü kuyucuk kullanılmıştır.

Normal dağılım Shapiro–Wilk testi, varyans homojenliği Levene testiyle α=0,05 düzeyinde değerlendirilmiştir. Kaynak bütün veri setlerinin bu parametrik varsayımları karşıladığını belirtmektedir.

Gruplar tek yönlü ANOVA ve Tukey çoklu karşılaştırma testiyle analiz edilmiş, p<0,05 anlamlı kabul edilmiştir. Analizlerde GraphPad Prism 10.6.1 ve Minitab 22.4.0.0 kullanılmıştır.

Figure 1'in bilimsel rolü

Figure 1, peptitlerin inflamatuvar uyarana göre zamanlamasını gösterir. Pre-treatment modeli peptidin uyaran öncesi etkisini, co-treatment eş zamanlı başlangıç etkisini, post-treatment ise inflamatuvar yanıt başladıktan sonraki etkisini araştırır.

Kaynak şeklinin görünür etiketlerinde 125 ve 250 µg/mL bulunmasına karşın yöntem metni ana üç-zamanlama deneylerinin bir konsantrasyonla, 250 µg/mL'de yürütüldüğünü ve Figure 4–7 açıklamaları da 250 µg/mL kullandığını bildirmektedir. Bu kaynak içi sunum farkı yorumda korunmalıdır.

Figure 2'nin bilimsel rolü

SDS-PAGE ile büyük proteinlerin, Tricine-SDS-PAGE ile daha küçük peptitlerin dağılımı görülmektedir. Fasulyede fazeolin bantlarının dirençli kalması, kabak çekirdeğinde ise büyük depolama proteini bantlarının daha güçlü kaybolması iki hammaddenin sindirilebilirlik farkını açıklar.

Figure 2 açıklamasında PSP ve PSH'nin “common bean protein” ve “common bean hydrolysate” olarak açılması metinle tutarsızdır; deney bağlamı PSP/PSH'nin kabak çekirdeği protein/hidrolizatını temsil ettiğini göstermektedir.

Figure 3'ün bilimsel rolü

Figure 3 dört peptit fraksiyonunun 32,5–500 µg/mL aralığındaki NO doz–yanıtını karşılaştırır. Fasulyede CB3, kabak çekirdeğinde ise PS10 daha güçlü profillerden birini göstermektedir.

Grafik aynı zamanda 250 µg/mL'nin sonraki deneyler için seçilmesinin deneysel temelini oluşturur.

Figure 4 ve Figure 5 birlikte nasıl okunmalıdır?

Figure 4 NO, Figure 5 ROS yanıtını üç farklı zamanlamada gösterir. Her iki sonlanım genel olarak peptit tedavisiyle azalmakla birlikte fraksiyon sıralaması aynı değildir.

Bu nedenle antiinflamatuvar aktiviteyi yalnız NO veya yalnız ROS üzerinden tanımlamak eksik olacaktır. Kaynak bu iki ölçümü tamamlayıcı biyolojik sonlanımlar olarak kullanmıştır.

Figure 6 ne gösteriyor?

Figure 6, co-treatment sırasında Nos-2 ve Cox-2 mRNA düzeylerini karşılaştırmaktadır. LPS + PA iki geni de güçlü biçimde artırırken bütün peptit fraksiyonları ekspresyonu azaltmıştır.

CB3 her iki gende de %70'in üzerinde baskılama göstermiştir. Bu sonuç hücresel NO değişikliğinin en azından kısmen gen ekspresyonu düzeyindeki değişimle birlikte gerçekleştiğini desteklemektedir.

Figure 7 ne gösteriyor?

Figure 7 TNF-α, IL-6 ve MCP-1 protein düzeylerini ELISA ile karşılaştırır. Üç proinflamatuvar mediyatörün de bütün peptit fraksiyonlarında azalması, geniş kapsamlı bir inflamatuvar yanıt baskılanmasıyla uyumludur.

CB3 üç sitokinde de en tutarlı güçlü profili göstermiştir.

Çalışmanın güçlü yönleri

• Ultrason ön ve son uygulamaları aynı bitkisel protein kaynaklarında doğrudan karşılaştırılmıştır.
• Fasulye ve kabak çekirdeğinin farklı protein yapıları aynı deneysel çerçevede değerlendirilmiştir.
• Kimyasal antioksidan kapasite ABTS ve ORAC olmak üzere iki farklı prensiple ölçülmüştür.
• Hidrolizatlar moleküler ağırlığa göre fraksiyonlanmış ve biyolojik aktivite fraksiyon düzeyinde incelenmiştir.
• Hücresel yanıt yalnız NO ile değil ROS, mRNA ve üç farklı sitokinle birlikte değerlendirilmiştir.
• Peptitlerin inflamatuvar uyarana göre zamanlaması üç ayrı modelde incelenmiştir.
• Biyolojik tekrarlar bağımsız günlerde yürütülmüş ve teknik tekrarlarla desteklenmiştir.

Çalışmanın temel sınırlılıkları

• Çalışma yalnız in vitro hücre modelidir; insanlarda veya hayvanlarda terapötik etkinlik göstermez.
• Aktif peptitlerin amino asit dizileri LC-MS/MS ile tanımlanmamıştır.
• Peptitlerin elektrik yükü ve gerçek yapı–aktivite ilişkisi belirlenmemiştir.
• TLR4'e doğrudan bağlanma veya LPS nötralizasyonu deneysel olarak ölçülmemiştir.
• NF-κB/MAPK fosforilasyonu Western blot ile doğrulanmamıştır.
• NF-κB reporter assay yapılmamıştır.
• NRF2 nükleer translokasyonu doğrudan değerlendirilmemiştir.
• 250 µg/mL in vitro konsantrasyonunun normal beslenmeyle bağırsak veya dolaşımda elde edilip edilemeyeceği bilinmemektedir.
• Peptitlerin gastrointestinal stabilitesi ve bağırsak geçirgenliği değerlendirilmemiştir.
• Plazma stabilitesi ve farmakokinetik veri bulunmamaktadır.
• Endüstriyel ölçek büyütme ve ekonomik uygulanabilirlik test edilmemiştir.
• Ultrason frekansı, amplitüdü ve süresinin geniş optimizasyon haritası çıkarılmamıştır.

Çalışmanın desteklediği sonuçlar

Ultrasonun enzimatik hidrolizden önce uygulanması, kullanılan deney koşullarında fasulye ve kabak çekirdeği proteinlerinin hidroliz derecesini artırmıştır.

Ultrason ön ve son uygulaması hidrolizatların ABTS ve ORAC ile ölçülen antioksidan kapasitesini genel olarak artırmıştır; ön uygulama özellikle fasulye ve kabak çekirdeği ORAC sonuçlarında daha güçlüdür.

Ultrason ön işleminden elde edilen peptit fraksiyonları RAW264.7 hücrelerinde LPS + palmitik asit kaynaklı NO ve ROS üretimini azaltmıştır.

Peptit fraksiyonları Nos-2 ve Cox-2 mRNA'sını ve TNF-α, IL-6 ve MCP-1 üretimini azaltmıştır.

CB3 fraksiyonu hücresel antiinflamatuvar sonlanımların çoğunda en güçlü ve en tutarlı fraksiyonlardan biri olmuştur.

Peptit büyüklüğü ile biyolojik aktivite arasındaki ilişki protein kaynağına ve ölçülen sonlanıma bağlıdır.

Çalışmanın desteklemediği sonuçlar

Çalışma fasulye veya kabak çekirdeği peptitlerinin insanlarda obeziteyi, diyabeti veya yağlı karaciğer hastalığını tedavi ettiğini göstermez.

250 µg/mL hücre kültürü konsantrasyonunun normal beslenmeyle insan dokularında elde edilebildiği gösterilmemiştir.

CB3 veya diğer fraksiyonların NF-κB, MAPK, NRF2 veya TLR4 üzerindeki doğrudan moleküler etkileşimi kanıtlanmamıştır.

Hangi özgül peptit dizilerinin antioksidan veya antiinflamatuvar aktiviteden sorumlu olduğu bilinmemektedir.

Daha küçük moleküler ağırlığın her durumda daha yüksek biyolojik aktivite sağladığı gösterilmemiştir.

Ultrason ön işleminin endüstriyel ölçekte ekonomik veya teknik olarak en iyi proses olduğu gösterilmemiştir.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün çalışma: Ultrasound-Assisted Enzymatic Hydrolysates from Common Bean and Pumpkin Seed Proteins: Antioxidant and Anti-Inflammatory Properties

Yazarlar: Erick Huerta-Rodriguez; Omar Sanchez-Jimenez; Cristina Chuck-Hernández; Margarita L. Martinez-Fierro; Idalia Garza-Veloz; Diana L. Cárdenas-Chávez; Cesar A. Ponce-Ponce de Leon; Maria del Refugio Rocha-Pizaña.

Sorumlu yazar: Maria del Refugio Rocha-Pizaña.

Kurumlar: Escuela de Ingenieria y Ciencias, Tecnologico de Monterrey, Monterrey, Mexico; Molecular Medicine Laboratory, Unidad Academica de Medicina Humana y C.S, Universidad Autonoma de Zacatecas, Zacatecas, Mexico.

Dergi: Antioxidants.

Yayınevi: MDPI, Basel, Switzerland.

Yayın bilgisi: 2026; cilt 15; sayı 5; makale 578. Yayın tarihi: 3 Mayıs 2026.

DOI: 10.3390/antiox15050578

Kaynak türü: Hakemli, açık erişimli özgün deneysel araştırma makalesi; gıda protein teknolojisi ve in vitro makrofaj modeli.

Lisans: Creative Commons Attribution (CC BY).

Bitkisel materyal: Organik Bayo fasulyesi ve kabak çekirdeği; Tlaxcala, Mexico.

Protein hidrolizi: Pepsin ve pankreatin; her aşamada enzim:substrat 1:20 ağırlık/ağırlık; pepsin pH 2 ve 37 °C'de 2 saat; ardından pH 7,5 ve pankreatinle 2 saat; 75 °C'de 20 dakika enzim inaktivasyonu.

Ultrason: Branson 450S-Digital Sonifier; 20 kHz; %70 amplitüd; 10 dakika; 25 saniye açık/25 saniye kapalı; buz banyosu.

Peptit fraksiyonları: Fasulye CB10 (3–10 kDa), CB3 (<3 kDa); kabak çekirdeği PS10 (3–10 kDa), PS3 (<3 kDa).

Antioksidan analiz: ABTS ve ORAC; sonuçlar µmol Trolox equivalents/g protein olarak raporlanmıştır.

Hücre modeli: RAW264.7 fare makrofajları, pasaj 10.

İnflamatuvar uyaran: LPS 100 ng/mL + palmitik asit 100 µM.

Ana hücresel peptit konsantrasyonu: 250 µg/mL.

Hücresel sonlanımlar: Hücre canlılığı, nitrit/NO, DCFH-DA ROS, Nos-2 ve Cox-2 mRNA, TNF-α, IL-6 ve MCP-1.

qPCR: \(2^{-\Delta\Delta C_T}\) yöntemi; Ppib endojen kontrol.

İstatistik: Shapiro–Wilk normalite testi; Levene varyans homojenliği testi; tek yönlü ANOVA ve Tukey post hoc; p<0,05.

Tekrar yapısı: Üç bağımsız biyolojik tekrar; her biyolojik tekrarda teknik triplikatlar.

Yazılım: GraphPad Prism 10.6.1 ve Minitab 22.4.0.0.

Supplementary materyal: Figure S1, dört peptit fraksiyonunun RAW264.7 hücre canlılığı üzerindeki etkisini göstermektedir.

Finansman: Kaynağın Funding bölümü dış finansman alınmadığını bildirmektedir.

Destek ve teşekkür: Tecnologico de Monterrey laboratuvar materyali desteği; organik fasulye ve kabak çekirdeği sağlayan yerel üretici/kuruluşlar; SECIHTI araştırma bursu No. 1049616.

Etik kurul: Uygulanabilir değil.

Bilgilendirilmiş onam: Uygulanabilir değil.

Veri erişilebilirliği: Özgün katkılar makale ve ek materyalde sunulmuştur; ek sorular sorumlu yazara yöneltilebilir.

Çıkar çatışması: Yazarlar çıkar çatışması bildirmemiştir.

Yazar katkıları: Kavramsallaştırma Maria del Refugio Rocha-Pizaña, Cristina Chuck-Hernández, Margarita L. Martinez-Fierro ve Idalia Garza-Veloz; metodoloji Erick Huerta-Rodriguez ve Maria del Refugio Rocha-Pizaña; validasyon ve formal analiz Erick Huerta-Rodriguez; araştırma Erick Huerta-Rodriguez ve Omar Sanchez-Jimenez; ilk taslak Erick Huerta-Rodriguez; süpervizyon, proje yönetimi ve finansman edinimi Maria del Refugio Rocha-Pizaña tarafından yürütülmüştür.

Kaynak içi isimlendirme notu: Kabak tür adı abstract'ta “Cucurbita argyoesperma”, giriş ve yöntemde “Cucurbita argyosperma” olarak geçmektedir. Verianla bu farkı kaynak içi yazım tutarsızlığı olarak korur.

Kaynak Figure 2 notu: Figure 2 açıklamasında PSP ve PSH yanlışlıkla “common bean” olarak açılmış görünmektedir; deney metni bunların kabak çekirdeği proteini ve hidrolizatı olduğunu açıkça göstermektedir.

Figure 1 yöntem notu: Görsel üzerinde 125 ve 250 µg/mL etiketleri bulunmasına karşın Bölüm 2.8.3 ve Figure 4–7 ana deneylerde 250 µg/mL kullanıldığını belirtmektedir. Verianla ana hücresel sonuçlarda 250 µg/mL değerini esas alır ve görseldeki farkı gizlemez.

Temel mekanistik sınırlılık: NF-κB/MAPK ve NRF2 yolaklarının katılımı aşağı akım sonuçlardan çıkarılmaktadır; doğrudan pathway aktivasyon deneyleri yapılmamıştır.

Peptit kimliği sınırı: Fraksiyonlar yalnız moleküler ağırlığa göre tanımlanmıştır. Biyoaktif diziler, amino asit bileşimi ve reseptör bağlanma mekanizmaları doğrudan belirlenmemiştir.

Translasyon sınırı: Gastrointestinal stabilite, Caco-2 benzeri intestinal transport, plazma stabilitesi, farmakokinetik ve ağızdan alınan peptitlerin 250 µg/mL eşdeğeri doku maruziyetine ulaşıp ulaşamayacağı test edilmemiştir.

Endüstriyel sınır: Ultrason ön işlemi laboratuvar düzeyinde avantaj göstermiştir; frekans, amplitüd, süre ve ölçek büyütmenin ekonomik optimizasyonu tamamlanmamıştır.

Verianla anlatım yöntemi: Bu içerik yalnız abstract veya conclusion çevirisi değildir. Protein ekstraksiyonu, gastrointestinal hidroliz, ultrason ön/son uygulaması, moleküler ağırlık fraksiyonlaması, SDS-PAGE/Tricine-SDS-PAGE, DH, ABTS, ORAC, hücre canlılığı, NO, ROS, üç zamanlama düzeni, qPCR, sitokin ELISA'sı, istatistik ve mekanistik sınırlılıklar ayrı bilimsel katmanlar halinde yeniden yapılandırılmıştır.

Sağlık yorumu sınırı: Sonuçlar laboratuvar koşullarındaki bitkisel protein hidrolizatlarına aittir ve fasulye veya kabak çekirdeği tüketiminin insanlarda belirli inflamatuvar hastalıkları tedavi ettiğini göstermez.