Hidrolizati ya protini ya kienzimu inayosaidiwa na ultrasound ni mchanganyiko wa peptidi ambamo kuvunjwa kwa protini za mimea kuwa peptidi ndogo kwa kutumia vimeng'enya kunasaidiwa na kavitesheni ya ultrasound. Utafiti huu wa in vitro ulichunguza jinsi kutumia ultrasound kwa protini za maharagwe na mbegu za maboga kabla au baada ya hidrolisisi ya kienzimu kunavyobadilisha kiwango cha hidrolisisi na uwezo wa kioksidanti; na iwapo sehemu za peptidi zilizopatikana hupunguza mwitikio wa uchochezi na oksidativi katika makrofaji RAW264.7 zilizochochewa kwa LPS na asidi ya palmitiki.

Matibabu ya awali ya ultrasound yalitoa kiwango cha juu zaidi cha hidrolisisi katika vyanzo vyote viwili vya protini za mimea. Katika hidrolizati ya maharagwe, kiwango cha hidrolisisi kiliongezeka kutoka %28,64 katika kundi la udhibiti hadi %34,06 katika kundi la ultrasound ya awali; na katika mbegu za maboga kutoka %63,06 hadi %70,87. Uwezo wa kioksidanti wa ABTS na ORAC katika hidrolizati ya maharagwe pia uliongezeka kwa kiasi kikubwa kwa matibabu ya awali. Katika mbegu za maboga, ORAC ya juu zaidi ilionekana katika kundi la ultrasound ya awali, huku makundi ya ultrasound ya awali na ya baadae hayakutofautiana kitakwimu kwa ABTS.

Hidrolizati zilizotengenezwa kwa matibabu ya awali ya ultrasound ziligawanywa katika sehemu mbili za uzito wa molekuli, 3–10 kDa na <3 kDa. Katika seli RAW264.7, sehemu zote zilionyesha uhai wa seli wa zaidi ya %95 katika safu ya 32,5–500 µg/mL na zilikandamiza uzalishaji wa NO unaosababishwa na LPS + asidi ya palmitiki kwa kutegemea dozi. Katika majaribio yaliyofuata, mkusanyiko wa 250 µg/mL ulitumika.

Katika majaribio yaliyolinganishwa utoaji wa peptidi kabla ya kichocheo cha uchochezi, wakati mmoja nacho, au baada ya kuanza kwake, sehemu zote zilipunguza uzalishaji wa NO na ROS ikilinganishwa na udhibiti chanya. Kwa ujumla, mwitikio wenye nguvu zaidi wa kupinga uchochezi ulionekana wakati wa utoaji wa pamoja, na CB3, sehemu ya maharagwe ya <3 kDa, ilijitokeza katika matokeo mengi. CB3 ilipunguza viwango vya mRNA vya Nos-2 na Cox-2 kwa zaidi ya %70, ilionyesha kupungua kwa takriban %75 katika uzalishaji wa TNF-α, na pia ilikuwa miongoni mwa zilizo na athari kubwa zaidi kwa IL-6 na MCP-1.

Hata hivyo, utafiti haukupima moja kwa moja njia za NF-κB/MAPK au NRF2. Ushiriki wa njia hizi unatolewa kama hitimisho kutoka kwa mabadiliko ya NO, ROS, Nos-2/Cox-2 na saitokini pamoja na fasihi ya awali. Mfuatano wa peptidi hai pia haukutambuliwa kwa LC-MS/MS. Kwa hiyo, matokeo ni ushahidi wa maabara kuhusu shughuli inayowezekana ya kibaolojia ya kupinga uchochezi ya peptidi zinazotokana na chakula; hayaonyeshi kuwa ufanisi uleule hutokea kwa binadamu baada ya matumizi ya mdomo.

Tatizo kuu la utafiti

Uchochezi sugu wa kiwango cha chini unaohusishwa na unene kupita kiasi ni hali changamano ya kibaolojia ambamo vichocheo kama lipopolisakaridi na asidi za mafuta zilizoshiba vinaweza kuweka njia za uashiriaji wa uchochezi katika seli za kinga zikiwa hai kwa muda mrefu. Katika makrofaji, mwitikio huu unaweza kuonekana pamoja na ongezeko la NO, ROS, vimeng'enya vya pro-uchochezi na saitokini.

Baadhi ya peptidi fupi zinazotolewa wakati wa hidrolisisi ya kienzimu ya protini za mimea zinaweza kuonyesha shughuli ya kibaolojia ya kioksidanti au ya kupinga uchochezi. Hata hivyo, ufanisi wa hidrolisisi huathiriwa na sifa kama kiwango ambacho muundo wa protini umefunguka kwa kimeng'enya, mkusanyiko wa protini, na utoshelevu wa mgusano kati ya kimeng'enya na substrati.

Swali kuu la kiteknolojia la utafiti huu ni iwapo kavitesheni ya ultrasound huongeza ufikivu wa vimeng'enya kwenye substrati kwa kufungua muundo wa protini kabla ya hidrolisisi. Swali la pili ni iwapo peptidi zinazotengenezwa huleta mwitikio wa kibaolojia si tu katika vipimo vya kemikali vya kioksidanti bali pia katika modeli ya makrofaji yenye uchochezi.

Kwa nini ultrasound inaweza kusaidia hidrolisisi ya kienzimu?

Katika matumizi ya ultrasound, viputo vya kavitesheni vinaweza kuundwa katika kimiminika, kukua na kisha kuporomoka. Chanzo kinaeleza kuwa mazingira haya madogo yanaweza kuvuruga mwingiliano wa protini–protini, kufungua miundo ya pili na ya tatu ya protini, kutawanya mikusanyiko na kuongeza eneo la uso linaloweza kufikiwa na kimeng'enya.

Mabadiliko haya ya kimwili hayaundi kimeng'enya kipya cha protease. Athari kuu ni kufanya substrati iliyopo ya protini ipatikane kwa urahisi zaidi kwa vimeng'enya kama pepsin na pancreatin.

Kwa Nini Kutumia Ultrasound Kabla ya Hidrolisisi ya Kienzimu Kulikuwa na Ufanisi Zaidi?

Kulingana na matokeo ya chanzo, ultrasound ya awali iliongeza ufikivu wa kimeng'enya–substrati kwa kubadilisha muundo wa protini ambao haujakatwa na mikusanyiko yake kabla ya kukutana na vimeng'enya; ultrasound ya baadae ilitumika baada ya sehemu kubwa ya ukataji wa kienzimu kuwa tayari umekamilika, hivyo mchango wake wa ziada katika kiwango cha hidrolisisi ukabaki kuwa mdogo zaidi.

Vyanzo vya protini

Utafiti ulitumia maharagwe ya kikaboni aina ya Bayo na mbegu za maboga. Nyenzo zilipatikana kutoka kwa wazalishaji wa ndani katika eneo la Tlaxcala, Mexico.

Maharagwe na mbegu za maboga zilisagwa na kupitishwa kwenye ungo wa 0,18 mm. Unga wa mbegu za maboga ulitibiwa kwa hexane kwa uwiano wa uzito/kiasi wa 1:20 kwa 60 °C kwa 1 saa ili kuondoa lipidi.

Katika uchimbaji wa protini, unga ulisimamishwa kwenye maji kwa uwiano wa uzito/kiasi wa 1:10. pH iliwekwa 8 kwa maharagwe na 11 kwa mbegu za maboga; suspensheni zilichanganywa kwa 25 °C kwa 1 saa. Sentrifugesheni ya kwanza ilifanywa kwa 5000×g kwa 15 dakika, kisha supernatanti iliwekwa kwenye pH 4,5 na kusentrifugwa tena kwa 10.000×g kwa 15 dakika. Mashapo ya protini yalikaushwa kwa kufungia kwa −50 °C na 0,1 mBar kwa 48 saa.

Hidrolisisi ya kienzimu ya njia ya chakula

Mikolezo ya protini ya maharagwe na mbegu za maboga ilitawanywa kwenye maji kwa uwiano wa uzito/kiasi wa 1:20 na pH ikawekwa 2 kwa 1 M HCl.

Pepsin iliongezwa kwa uwiano wa kimeng'enya:substrati wa 1:20 uzito/uzito na kuingizwa kwa 37 °C kwa 2 saa. Kisha pH iliongezwa hadi 7,5 ili kuzima pepsin, pancreatin ya asili ya nguruwe ikaongezwa tena kwa uwiano wa kimeng'enya:substrati wa 1:20 na kuingizwa kwa 2 saa zaidi.

Usagaji ulisimamishwa kwa kupashwa joto kwa 75 °C kwa 20 dakika, sampuli zikasentrifugwa kwa 16.000×g kwa 10 dakika na supernatanti zilizopatikana zikakaushwa kwa kufungia.

Masharti ya ultrasound

Katika matibabu ya awali, ultrasound ilitumika kwa mkolezo wa protini asilia kabla ya kuongezwa pepsin na pancreatin. Katika matibabu ya baadae, ultrasound ilitumika kwa hidrolizati iliyopatikana baada ya usagaji wa pepsin–pancreatin kukamilika.

Maharagwe na mbegu za maboga hazikuhidrolishwa kwa njia sawa

Katika matokeo ya SDS-PAGE, vitengo vidogo vya phaseolin vya takriban 35–48 kDa katika protini ya maharagwe vilibaki dhahiri baada ya hidrolisisi. Chanzo kinaeleza kuwa phaseolin huunda sehemu muhimu ya jumla ya protini za maharagwe na ni sugu kwa usagaji wa njia ya chakula.

Kinyume chake, bendi kuu za 11S globulin na 2S albumin za protini za mbegu za maboga zilitoweka kwa kiasi kikubwa baada ya usagaji. Kiwango cha hidrolisisi cha hidrolizati ya mbegu za maboga kuwa kikubwa zaidi kuliko cha maharagwe kinaendana na tofauti hii ya muundo wa protini.

Tricine-SDS-PAGE ilionyesha kuwa peptidi zilizo chini ya 10 kDa ziliundwa katika vyanzo vyote viwili.

Je, ABTS na ORAC hupima kitu kilekile?

Hapana. Chanzo kilitathmini uwezo wa kioksidanti kwa kanuni mbili tofauti za kemikali. Kipimo cha ABTS kinawakilisha hasa kipimo cha uwezo wa kioksidanti unaotegemea uhamishaji wa elektroni, huku ORAC ikiwakilisha uwezo wa kufagia radikali unaohusiana na uhamishaji wa atomi ya hidrojeni.

Kutumia vipimo hivi viwili pamoja husaidia kuepuka kutathmini sifa ya kioksidanti ya mchanganyiko wa peptidi kwa aina moja tu ya mmenyuko. Hata hivyo, thamani kubwa ya ABTS au ORAC haionyeshi kuwa athari ya kliniki ya kioksidanti ya ukubwa huohuo itatokea katika mwili wa binadamu.

Sehemu za peptidi zilitengenezwa vipi?

Kwa majaribio ya seli, hidrolizati za maharagwe na mbegu za maboga zilizotibiwa kwa ultrasound kabla ziligawanywa kwa uzito wa molekuli kwa ultrafiltrations:

• CB10: sehemu ya maharagwe ya 3–10 kDa
• CB3: sehemu ya maharagwe ya <3 kDa
• PS10: sehemu ya mbegu za maboga ya 3–10 kDa
• PS3: sehemu ya mbegu za maboga ya <3 kDa

Je, Peptidi Ndogo Daima Zilionyesha Athari Kubwa Zaidi ya Kupinga Uchochezi?

Hapana. Katika maharagwe, sehemu ya CB3 ya <3 kDa ilikuwa sehemu yenye nguvu zaidi katika matokeo mengi ya seli, ilhali katika mbegu za maboga sehemu ya 3–10 kDa PS10 ilikuwa na nguvu zaidi kuliko PS3 katika ukandamizaji wa NO; matokeo haya yanaonyesha kuwa ufanisi wa kibaolojia hautegemei uzito wa molekuli pekee bali pia mfuatano wa peptidi, muundo wa aminoasidi na sifa za kimuundo.

Modeli ya makrofaji RAW264.7

Seli za makrofaji za panya RAW264.7 zilikuzwa katika mazingira ya DMEM/F12 yenye %10 FBS na %1 penicillin–streptomycin, katika 37 °C, %5 CO₂ na %95 hewa yenye unyevunyevu. Passage 10 ilitumika katika majaribio yote ya seli.

Katika modeli ya uchochezi, seli zilichochewa kwa 100 ng/mL LPS na 100 µM asidi ya palmitiki. Kutumia vichocheo hivi viwili pamoja kunalenga kuiga msongo wa endotoksini na asidi ya mafuta iliyojaa unaohusishwa na unene kupita kiasi katika kiwango cha makrofaji.

Uchunguzi wa awali wa dozi

Sehemu za hidrolizati zilijaribiwa katika safu ya 32,5–500 µg/mL. Uhai wa seli ulibaki juu ya %95 katika sehemu zote.

Udhibiti chanya wa LPS + asidi ya palmitiki uliongeza uzalishaji wa NO kwa takriban mara nne ikilinganishwa na udhibiti hasi. Sehemu zote nne za peptidi zilipunguza uzalishaji wa NO kadiri dozi ilivyoongezeka.

Kwa kuwa hakukuwa na upungufu mwingine wenye umuhimu wakati wa kuongeza kutoka 250 µg/mL hadi 500 µg/mL kwa CB10, CB3 na PS10, 250 µg/mL ilitumika katika majaribio makuu ya muda.

Pre-, co- na post-treatment zinamaanisha nini?

Matokeo ya NO

Katika mipangilio yote mitatu ya muda, sehemu za peptidi zilipunguza uzalishaji wa NO kwa kiasi kikubwa ikilinganishwa na udhibiti chanya wa LPS + PA.

Katika mpangilio wa pre-treatment, CB3 na PS10 zilionyesha ukandamizaji mkubwa zaidi wa NO. Ugunduzi huu unaonyesha kuwa sehemu ya uzito wa molekuli ileile haikuwa bora kwa maharagwe na mbegu za maboga.

Wakati wa co-treatment, sehemu zote zilionyesha ukandamizaji mkubwa na CB3 ilitoa mwitikio ulio wazi zaidi.

Katika mpangilio wa post-treatment, sehemu zote isipokuwa PS3 zilipunguza kiwango cha NO hadi viwango vya udhibiti hasi. Matokeo haya yanaonyesha kuwa peptidi zinaweza kuwa na ufanisi in vitro si tu kabla ya kichocheo cha uchochezi bali pia baada ya mwitikio kuanza.

Matokeo ya ROS

Floresensi ya DCFH-DA ni kiashirio kisicho cha moja kwa moja kinachotumika kwa mzigo wa vioksidishaji ndani ya seli. LPS + PA iliongeza ishara ya ROS katika mipangilio yote ya muda.

Sehemu zote za peptidi zilikandamiza uzalishaji wa ROS kwa kiasi kikubwa ikilinganishwa na udhibiti chanya. Wakati wa pre-treatment, hakukuwa na tofauti iliyo wazi kati ya athari za sehemu kwa ROS.

Wakati wa co-treatment, CB3 ilikuwa mojawapo ya sehemu zilizoonyesha ukandamizaji mkubwa zaidi wa ROS. Chanzo pia kinajadili kuwa sehemu ndogo za peptidi kama CB3 na PS3 zinaweza kuwa na nguvu zaidi kuliko sehemu kubwa katika kukandamiza ROS ndani ya seli.

Wakati wa post-treatment, sehemu zote nne zilipunguza kiwango cha ROS chini ya udhibiti chanya na, kulingana na maelezo ya chanzo, chini ya udhibiti hasi.

NO na ROS si matokeo yale yale ya kibaolojia

Katika modeli hii, NO inawakilisha uzalishaji wa spishi za nitrojeni za uchochezi unaohusishwa na shughuli ya NOS-2; floresensi ya DCFH-DA inawakilisha ishara inayohusiana na mzigo wa oksidativi ndani ya seli. Sehemu ya peptidi kuwa na nguvu kwa NO haimaanishi lazima iwe na kiwango kilekile cha nguvu kwa ROS.

Kwa kweli, PS10 ya mbegu za maboga ilijitokeza katika ukandamizaji wa NO, ilhali sehemu ndogo ya PS3 ilikuwa na nguvu katika baadhi ya ulinganisho wa ROS; hili linaashiria kuwa kunaweza kuwa na tofauti za mekanizimu kulingana na ukubwa wa peptidi.

Kwa nini Nos-2 na Cox-2 zilipimwa?

Nos-2 husimba sintetasi ya oksidi nitriki inayochochewa na ni mojawapo ya vyanzo vikuu vya uzalishaji mkubwa wa NO katika hali za uchochezi. Cox-2 husimba siklooksijenasi inayochochewa ambayo hushiriki katika usanisi wa prostaglandini unaohusiana na uchochezi.

Uchocheaji wa LPS + PA uliongeza mRNA ya Nos-2 kwa mara 10,5 na mRNA ya Cox-2 kwa takriban mara 7 ikilinganishwa na seli zisizochochewa.

CB3 ilipunguza uelezaji wa jeni hizi mbili kwa zaidi ya %70. CB10, PS10 na PS3 pia zilikandamiza jeni zote mbili kwa zaidi ya %35.

Matokeo haya yanaonyesha kuwa kupungua kwa NO hakukutokana tu na kuondolewa kwa NO kwa kemikali, na kwamba vimeng'enya vya uchochezi pia vilibadilika katika kiwango cha unukuzi.

Je, Njia za NF-κB/MAPK na NRF2 Zilithibitishwa Moja kwa Moja Katika Utafiti Huu?

Hapana. Mabadiliko katika Nos-2, Cox-2, NO, ROS na saitokini yanaendana na ukandamizaji wa NF-κB/MAPK na mwitikio wa kioksidanti unaohusiana na NRF2, lakini kwa kuwa utafiti haukupima moja kwa moja protini za njia zilizofosforilishwa, shughuli ya NF-κB reporter au uhamaji wa NRF2 kwenda kwenye kiini, mekanizimu hizi zinapaswa kutathminiwa kama nadharia inayoungwa mkono badala ya njia ya molekuli iliyothibitishwa.

TNF-α

TNF-α ni saitokini ya pro-uchochezi inayoathiri majibu mengi ya kimetaboliki na kinga wakati wa uchochezi sugu. Sehemu zote za peptidi zilipunguza kwa kiasi kikubwa uzalishaji wa TNF-α ikilinganishwa na udhibiti chanya wa LPS + PA.

Matokeo yenye nguvu zaidi yalionekana katika sehemu ya CB3 na chanzo kiliripoti upungufu wa takriban %75.

IL-6

IL-6 ni saitokini yenye kazi nyingi ambayo inaweza kuwa na jukumu la pro-uchochezi au la udhibiti kutegemea muktadha. Katika modeli hii ya seli, iliongezeka kwa nguvu kwa LPS + PA.

Sehemu zote nne za hidrolizati zilipunguza kiwango cha IL-6 kwa zaidi ya mara tano, huku mwitikio mkubwa zaidi ukionekana tena kwa CB3.

MCP-1

Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) ni kemokini inayoelekeza uhamaji wa monocytes kwenda kwenye maeneo ya uchochezi. Katika uchochezi sugu wa kimetaboliki, uzalishaji kupita kiasi wa MCP-1 unaweza kuendeleza uingiaji wa seli za kinga kwenye tishu.

Sehemu zote zilipunguza uzalishaji wa MCP-1; CB3 ilionyesha upungufu wa takriban mara mbili.

Kupungua kwa saitokini tatu pamoja kuna maana gani?

Kupungua kwa wakati mmoja kwa TNF-α, IL-6 na MCP-1 katika mpangilio uleule wa jaribio kunaendana na ukandamizaji mpana wa mwitikio wa uchochezi wa unukuzi kuliko uondoaji wa moja kwa moja wa saitokini moja tu.

Waandishi walitafsiri muundo huu kwa ushiriki unaowezekana wa mhimili wa NF-κB. Hata hivyo, uhusiano wa kisababishi katika kiwango cha njia haukuonyeshwa moja kwa moja kwa majaribio.

Je, utambulisho wa peptidi hai unajulikana?

Hapana. Ultrafiltrations ilitenganisha tu safu za uzito wa molekuli. Ukweli kwamba CB3 ni <3 kDa hauonyeshi ni mfuatano gani maalum wa peptidi ndani yake unaowajibika kwa shughuli.

Mfuatano wa aminoasidi, chaji za umeme, sifa za N- na C-terminal au afiniti ya kufunga moja kwa moja kwa TLR4 hazikupimwa katika utafiti huu.

Chanzo kinapendekeza kwa siku zijazo upangaji wa peptidi kwa LC-MS/MS, molecular docking na uthibitishaji wa njia kwa majaribio.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Mlolongo wa hatua za majaribio

1. Kusaga nyenzo za maharagwe na mbegu za maboga na kuandaa mkolezo wa protini.
2. Kuondoa mafuta kwenye unga wa mbegu za maboga kwa hexane.
3. Kuchimba protini katika mazingira ya alkali na kuzitia mashapo katika pH 4,5.
4. Kukausha kwa kufungia mikolezo ya protini.
5. Katika kundi la matibabu ya awali ya ultrasound, kutumia ultrasound ya 20 kHz, amplitudo %70, kwa 10 dakika kwenye protini.
6. Hidrolisisi ya gastrointestinal ya in vitro kwa pepsin kwa 2 saa na pancreatin kwa 2 saa.
7. Katika kundi la ultrasound ya baadae, kutumia hali ileile ya ultrasound baada ya hidrolisisi ya kienzimu kukamilika.
8. Kuamua kiwango cha hidrolisisi kwa mbinu ya OPA.
9. Kutathmini profaili za protini/peptidi kwa SDS-PAGE na Tricine-SDS-PAGE.
10. Kupima uwezo wa kioksidanti wa kemikali kwa ABTS na ORAC.
11. Kugawa hidrolizati bora zaidi za ultrasound ya awali katika sehemu za 3–10 kDa na <3 kDa.
12. Uchunguzi wa dozi wa uhai wa seli na NO katika makrofaji RAW264.7.
13. Majaribio ya pre-, co- na post-treatment kwa 250 µg/mL.
14. Vipimo vya NO, ROS, Nos-2, Cox-2, TNF-α, IL-6 na MCP-1.

Kiwango cha hidrolisisi kilipimwaje?

Kiwango cha hidrolisisi kiliamuliwa kwa kutumia mbinu ya o-phthaldialdehyde (OPA) ya Nielsen na wenzake. DH inawakilisha kiwango cha kuvunjika kwa kienzimu kwa vifungo vya peptidi katika minyororo ya protini.

DH ya juu kwa kawaida inaonyesha kuwa vifungo vingi zaidi vya peptidi vimevunjwa na peptidi ndogo zaidi zimeundwa; hata hivyo, matokeo ya sehemu za mbegu za maboga yanaonyesha wazi kuwa DH ya juu haimaanishi moja kwa moja shughuli kubwa zaidi katika kila athari ya kibaolojia.

Kipimo cha ABTS na ORAC

Mikunjo ya kiwango cha Trolox iliandaliwa kwa ABTS na ORAC na thamani za R² ziliwekwa juu ya 0,98.

Safu ya kiwango cha ABTS ilikuwa 25–200 µmol/L, na ya ORAC 6,25–200 µmol/L. Matokeo yaliripotiwa kama µmol Trolox equivalents/g protein.

Uchambuzi wa ROS wa seli

Uzalishaji wa ROS ulitathminiwa kwa kutumia 10 µM DCFH-DA. Seli ziliingizwa na probu kwa 37 °C kwa 30 dakika; floresensi ilipimwa kwa msisimko wa 485 nm na utoaji wa 530 nm kwa kisomaji Cytation 5.

Matokeo yalitolewa kama asilimia ya ROS ya kulinganisha, huku udhibiti hasi ukichukuliwa kuwa %100.

Uchambuzi wa NO

NO katika supernatanti ya utamaduni wa seli ilipimwa kwa njia isiyo ya moja kwa moja kupitia nitriti kwa Griess Reagent System. Mkunjo wa kiwango wa sodium nitrite wa 1,56–100 µM ulitumika na matokeo yakaripotiwa kama µM nitriti.

qPCR

Baada ya majaribio ya co-treatment, total RNA ilitengwa na kubadilishwa kuwa cDNA. Jeni za Nos-2 na Cox-2 zilipimwa kwa qPCR kwenye kifaa cha QuantStudio 3, huku Ppib ikitumika kama udhibiti wa ndani.

Uelezaji wa mRNA wa kulinganisha ulihesabiwa kwa mbinu ya \(2^{-\Delta\Delta C_T}\).

Mbinu hii kwanza husawazisha thamani ya Ct ya jeni lengwa kwa jeni rejea na kisha kulinganisha kundi la majaribio na hali rejea ili kutoa mabadiliko ya uelezaji wa kulinganisha. Matokeo si idadi kamili ya molekuli za mRNA, bali ni mabadiliko ya mara ikilinganishwa na rejea.

Uchambuzi wa saitokini

TNF-α, IL-6 na MCP-1 zilipimwa katika supernatanti za utamaduni wa seli kwa kutumia vifaa vya ELISA. Majaribio haya yalifanywa tu katika mpangilio wa co-treatment na kwa kutumia sehemu ya peptidi ya 250 µg/mL.

Muundo wa marudio na takwimu

Katika uchambuzi wa DH, ABTS na ORAC, taratibu tatu huru za hidrolisisi ya kienzimu zilitumika kama marudio ya kibaolojia na kila marudio ya kibaolojia yalipimwa mara tatu kitaalamu.

Majaribio ya seli yalifanywa kama triplikati za kibaolojia kwa kutumia tamaduni tatu huru za seli RAW264.7 zilizofanywa katika siku tofauti; katika kila marudio ya kibaolojia, visima vitatu vya kiufundi vilitumika kwa kila hali.

Usambazaji wa kawaida ulitathminiwa kwa Shapiro–Wilk test, na usawa wa variansi kwa Levene test katika kiwango cha α=0,05. Chanzo kinaeleza kuwa seti zote za data zilikidhi dhana hizi za kiparametriki.

Makundi yalichambuliwa kwa one-way ANOVA na Tukey multiple comparison test, na p<0,05 ikachukuliwa kuwa yenye umuhimu. GraphPad Prism 10.6.1 na Minitab 22.4.0.0 zilitumika katika uchambuzi.

Jukumu la kisayansi la Figure 1

Figure 1 inaonyesha muda wa utoaji wa peptidi kulingana na kichocheo cha uchochezi. Modeli ya pre-treatment huchunguza athari ya peptidi kabla ya kichocheo, co-treatment athari ya mwanzo wa wakati mmoja, na post-treatment athari baada ya mwitikio wa uchochezi kuanza.

Ingawa lebo zinazoonekana katika mchoro wa chanzo zina 125 na 250 µg/mL, maandishi ya mbinu yanaeleza kuwa majaribio makuu ya muda-tatu yalifanywa kwa mkusanyiko mmoja, 250 µg/mL, na maelezo ya Figure 4–7 pia yanaeleza matumizi ya 250 µg/mL. Tofauti hii ya uwasilishaji ndani ya chanzo inapaswa kuhifadhiwa katika tafsiri.

Jukumu la kisayansi la Figure 2

SDS-PAGE inaonyesha usambazaji wa protini kubwa, na Tricine-SDS-PAGE unaonyesha peptidi ndogo. Kubaki kwa bendi za phaseolin katika maharagwe, huku bendi kubwa za protini za akiba zikipotea zaidi katika mbegu za maboga, kunaeleza tofauti ya usagikaji wa malighafi hizi mbili.

Katika maelezo ya Figure 2, kufafanuliwa kwa PSP na PSH kama “common bean protein” na “common bean hydrolysate” hakulingani na maandishi; muktadha wa jaribio unaonyesha kuwa PSP/PSH zinawakilisha protini/hidrolizati ya mbegu za maboga.

Jukumu la kisayansi la Figure 3

Figure 3 inalinganisha mwitikio wa dozi wa NO wa sehemu nne za peptidi katika safu ya 32,5–500 µg/mL. CB3 katika maharagwe na PS10 katika mbegu za maboga zinaonyesha baadhi ya profaili zenye nguvu zaidi.

Grafu pia hutoa msingi wa majaribio wa kuchagua 250 µg/mL kwa majaribio yaliyofuata.

Figure 4 na Figure 5 zinapaswa kusomwa pamoja vipi?

Figure 4 inaonyesha mwitikio wa NO na Figure 5 mwitikio wa ROS katika muda mitatu tofauti. Ingawa matokeo yote mawili kwa ujumla hupungua kwa matibabu ya peptidi, mpangilio wa nguvu wa sehemu si sawa.

Kwa hiyo, kufafanua shughuli ya kupinga uchochezi kwa NO pekee au ROS pekee kutakuwa pungufu. Chanzo kilitumia vipimo hivi viwili kama matokeo ya kibaolojia yanayokamilishana.

Figure 6 inaonyesha nini?

Figure 6 inalinganisha viwango vya mRNA vya Nos-2 na Cox-2 wakati wa co-treatment. LPS + PA iliongeza sana jeni zote mbili, huku sehemu zote za peptidi zikipunguza uelezaji.

CB3 ilionyesha ukandamizaji wa zaidi ya %70 katika jeni zote mbili. Matokeo haya yanaunga mkono kuwa mabadiliko ya NO ya seli yalitokea, angalau kwa sehemu, pamoja na mabadiliko katika kiwango cha uelezaji wa jeni.

Figure 7 inaonyesha nini?

Figure 7 inalinganisha viwango vya protini vya TNF-α, IL-6 na MCP-1 kwa ELISA. Kupungua kwa vipatanishi vyote vitatu vya pro-uchochezi katika sehemu zote za peptidi kunaendana na ukandamizaji mpana wa mwitikio wa uchochezi.

CB3 ilionyesha profaili yenye nguvu na thabiti zaidi katika saitokini zote tatu.

Nguvu za utafiti

• Matumizi ya ultrasound kabla na baada yalilinganishwa moja kwa moja katika vyanzo vilevile vya protini za mimea.
• Miundo tofauti ya protini ya maharagwe na mbegu za maboga ilitathminiwa katika mfumo uleule wa majaribio.
• Uwezo wa kioksidanti wa kemikali ulipimwa kwa kanuni mbili tofauti, ABTS na ORAC.
• Hidrolizati ziligawanywa kwa uzito wa molekuli na shughuli ya kibaolojia ikachunguzwa katika kiwango cha sehemu.
• Mwitikio wa seli ulitathminiwa si kwa NO pekee bali pamoja na ROS, mRNA na saitokini tatu tofauti.
• Muda wa peptidi kulingana na kichocheo cha uchochezi ulijaribiwa katika modeli tatu tofauti.
• Marudio ya kibaolojia yalifanywa katika siku huru na kuungwa mkono na marudio ya kiufundi.

Vikwazo vikuu vya utafiti

• Utafiti ni modeli ya seli ya in vitro pekee; hauonyeshi ufanisi wa matibabu kwa binadamu au wanyama.
• Mfuatano wa aminoasidi wa peptidi hai haukutambuliwa kwa LC-MS/MS.
• Chaji ya umeme ya peptidi na uhusiano halisi wa muundo–shughuli haukuamuliwa.
• Kufunga moja kwa moja kwa TLR4 au uondoaji wa LPS hakukupimwa kwa majaribio.
• Fosforilesheni ya NF-κB/MAPK haikuthibitishwa kwa Western blot.
• NF-κB reporter assay haikufanywa.
• Uhamaji wa NRF2 kwenda kwenye kiini haukutathminiwa moja kwa moja.
• Haijulikani kama mkusanyiko wa in vitro wa 250 µg/mL unaweza kupatikana kwenye utumbo au mzunguko wa damu kupitia lishe ya kawaida.
• Uthabiti wa peptidi katika njia ya chakula na upenyezaji wa utumbo haukutathminiwa.
• Hakuna data ya uthabiti wa plasma au famakokinetiki.
• Upanuzi wa kiwango cha viwanda na uwezekano wa kiuchumi haukujaribiwa.
• Ramani pana ya uboreshaji wa masafa, amplitudo na muda wa ultrasound haikuandaliwa.

Hitimisho zinazoungwa mkono na utafiti

Kutumia ultrasound kabla ya hidrolisisi ya kienzimu kuliongeza kiwango cha hidrolisisi cha protini za maharagwe na mbegu za maboga katika masharti ya majaribio yaliyotumika.

Matumizi ya ultrasound kabla na baada kwa ujumla yaliongeza uwezo wa kioksidanti wa hidrolizati uliopimwa kwa ABTS na ORAC; matumizi ya awali yalikuwa na nguvu zaidi hasa katika matokeo ya ORAC ya maharagwe na mbegu za maboga.

Sehemu za peptidi zilizopatikana kutoka matibabu ya awali ya ultrasound zilipunguza uzalishaji wa NO na ROS unaosababishwa na LPS + asidi ya palmitiki katika seli RAW264.7.

Sehemu za peptidi zilipunguza mRNA ya Nos-2 na Cox-2 pamoja na uzalishaji wa TNF-α, IL-6 na MCP-1.

Sehemu ya CB3 ilikuwa mojawapo ya sehemu zenye nguvu na thabiti zaidi katika matokeo mengi ya seli ya kupinga uchochezi.

Uhusiano kati ya ukubwa wa peptidi na shughuli ya kibaolojia hutegemea chanzo cha protini na matokeo yanayopimwa.

Hitimisho ambazo utafiti hauungi mkono

Utafiti hauonyeshi kuwa peptidi za maharagwe au mbegu za maboga hutibu unene kupita kiasi, kisukari au ugonjwa wa ini lenye mafuta kwa binadamu.

Haijaonyeshwa kuwa mkusanyiko wa utamaduni wa seli wa 250 µg/mL unaweza kufikiwa katika tishu za binadamu kwa lishe ya kawaida.

Mwingiliano wa moja kwa moja wa molekuli wa CB3 au sehemu nyingine na NF-κB, MAPK, NRF2 au TLR4 haujathibitishwa.

Haijulikani ni mfuatano gani maalum wa peptidi unaowajibika kwa shughuli ya kioksidanti au ya kupinga uchochezi.

Haijaonyeshwa kuwa uzito mdogo wa molekuli hutoa shughuli kubwa zaidi ya kibaolojia katika kila hali.

Haijaonyeshwa kuwa matibabu ya awali ya ultrasound ndiyo mchakato bora zaidi kiuchumi au kiufundi kwa kiwango cha viwanda.

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Utafiti asilia: Ultrasound-Assisted Enzymatic Hydrolysates from Common Bean and Pumpkin Seed Proteins: Antioxidant and Anti-Inflammatory Properties

Waandishi: Erick Huerta-Rodriguez; Omar Sanchez-Jimenez; Cristina Chuck-Hernández; Margarita L. Martinez-Fierro; Idalia Garza-Veloz; Diana L. Cárdenas-Chávez; Cesar A. Ponce-Ponce de Leon; Maria del Refugio Rocha-Pizaña.

Mwandishi anayewasiliana: Maria del Refugio Rocha-Pizaña.

Taasisi: Escuela de Ingenieria y Ciencias, Tecnologico de Monterrey, Monterrey, Mexico; Molecular Medicine Laboratory, Unidad Academica de Medicina Humana y C.S, Universidad Autonoma de Zacatecas, Zacatecas, Mexico.

Jarida: Antioxidants.

Mchapishaji: MDPI, Basel, Switzerland.

Taarifa ya uchapishaji: 2026; juzuu 15; toleo 5; makala 578. Tarehe ya uchapishaji: 3 Mayıs 2026.

DOI: 10.3390/antiox15050578

Aina ya chanzo: Makala asilia ya utafiti wa majaribio iliyopitiwa na wataalamu na yenye ufikiaji wazi; teknolojia ya protini za chakula na modeli ya makrofaji ya in vitro.

Leseni: Creative Commons Attribution (CC BY).

Nyenzo za mimea: Maharagwe ya kikaboni Bayo na mbegu za maboga; Tlaxcala, Mexico.

Hidrolisisi ya protini: Pepsin na pancreatin; katika kila hatua uwiano wa kimeng'enya:substrati 1:20 uzito/uzito; pepsin katika pH 2 na 37 °C kwa 2 saa; kisha pH 7,5 na pancreatin kwa 2 saa; uzimaji wa kimeng'enya kwa 75 °C kwa 20 dakika.

Ultrasound: Branson 450S-Digital Sonifier; 20 kHz; amplitudo %70; 10 dakika; 25 sekunde imewashwa/25 sekunde imezimwa; bafu ya barafu.

Sehemu za peptidi: Maharagwe CB10 (3–10 kDa), CB3 (<3 kDa); mbegu za maboga PS10 (3–10 kDa), PS3 (<3 kDa).

Uchambuzi wa kioksidanti: ABTS na ORAC; matokeo yaliripotiwa kama µmol Trolox equivalents/g protein.

Modeli ya seli: Makrofaji za panya RAW264.7, passage 10.

Kichocheo cha uchochezi: LPS 100 ng/mL + asidi ya palmitiki 100 µM.

Mkusanyiko mkuu wa peptidi katika seli: 250 µg/mL.

Matokeo ya seli: Uhai wa seli, nitriti/NO, DCFH-DA ROS, mRNA ya Nos-2 na Cox-2, TNF-α, IL-6 na MCP-1.

qPCR: Mbinu ya \(2^{-\Delta\Delta C_T}\); Ppib kama udhibiti wa ndani.

Takwimu: Shapiro–Wilk normality test; Levene variance homogeneity test; one-way ANOVA na Tukey post hoc; p<0,05.

Muundo wa marudio: Marudio matatu huru ya kibaolojia; triplikati za kiufundi katika kila marudio ya kibaolojia.

Programu: GraphPad Prism 10.6.1 na Minitab 22.4.0.0.

Nyenzo ya Supplementary: Figure S1 inaonyesha athari za sehemu nne za peptidi kwa uhai wa seli RAW264.7.

Ufadhili: Sehemu ya Funding ya chanzo inaeleza kuwa hakuna ufadhili wa nje uliopokelewa.

Msaada na shukrani: Msaada wa vifaa vya maabara kutoka Tecnologico de Monterrey; wazalishaji/mashirika ya ndani waliotoa maharagwe ya kikaboni na mbegu za maboga; ufadhili wa utafiti wa SECIHTI No. 1049616.

Kamati ya maadili: Haitumiki.

Ridhaa yenye taarifa: Haitumiki.

Upatikanaji wa data: Michango asilia imewasilishwa katika makala na nyenzo ya ziada; maswali ya ziada yanaweza kuelekezwa kwa mwandishi anayewasiliana.

Mgongano wa maslahi: Waandishi hawakuripoti mgongano wa maslahi.

Michango ya waandishi: Uundaji wa dhana Maria del Refugio Rocha-Pizaña, Cristina Chuck-Hernández, Margarita L. Martinez-Fierro na Idalia Garza-Veloz; metodolojia Erick Huerta-Rodriguez na Maria del Refugio Rocha-Pizaña; uthibitishaji na uchambuzi rasmi Erick Huerta-Rodriguez; utafiti Erick Huerta-Rodriguez na Omar Sanchez-Jimenez; rasimu ya kwanza Erick Huerta-Rodriguez; usimamizi, usimamizi wa mradi na upatikanaji wa ufadhili ulifanywa na Maria del Refugio Rocha-Pizaña.

Dokezo la majina ndani ya chanzo: Jina la spishi ya maboga linaonekana kama “Cucurbita argyoesperma” katika abstract na kama “Cucurbita argyosperma” katika utangulizi na mbinu. Verianla huhifadhi tofauti hii kama kutokulingana kwa tahajia ndani ya chanzo.

Dokezo la Figure 2 ya chanzo: Katika maelezo ya Figure 2, PSP na PSH zinaonekana kufafanuliwa kimakosa kama “common bean”; maandishi ya majaribio yanaonyesha wazi kuwa zinawakilisha protini na hidrolizati ya mbegu za maboga.

Dokezo la mbinu la Figure 1: Ingawa mchoro una lebo za 125 na 250 µg/mL, Sehemu 2.8.3 na Figure 4–7 zinaeleza kuwa 250 µg/mL ilitumika katika majaribio makuu. Verianla hutumia thamani ya 250 µg/mL katika matokeo makuu ya seli na haifichi tofauti iliyo kwenye mchoro.

Kikomo kikuu cha mekanizimu: Ushiriki wa njia za NF-κB/MAPK na NRF2 unatolewa kutoka kwa matokeo ya chini ya njia; majaribio ya moja kwa moja ya uamilishaji wa pathway hayakufanywa.

Kikomo cha utambulisho wa peptidi: Sehemu zilifafanuliwa kwa uzito wa molekuli pekee. Mfuatano wa bioactive, muundo wa aminoasidi na mekanizimu za kufunga vipokezi hazikuamuliwa moja kwa moja.

Kikomo cha uhamishaji kwenda kwa binadamu: Uthabiti wa gastrointestinal, usafirishaji wa intestinal unaofanana na Caco-2, uthabiti wa plasma, famakokinetiki na iwapo peptidi zinazotumiwa kwa mdomo zinaweza kufikia mfiduo wa tishu unaolingana na 250 µg/mL havikujaribiwa.

Kikomo cha viwanda: Matibabu ya awali ya ultrasound yalionyesha faida katika kiwango cha maabara; uboreshaji wa kiuchumi wa masafa, amplitudo, muda na kuongeza kiwango haujakamilika.

Mbinu ya uwasilishaji ya Verianla: Maudhui haya si tafsiri ya abstract au conclusion pekee. Uchimbaji wa protini, hidrolisisi ya gastrointestinal, matumizi ya ultrasound kabla/baada, ugawaji kwa uzito wa molekuli, SDS-PAGE/Tricine-SDS-PAGE, DH, ABTS, ORAC, uhai wa seli, NO, ROS, mipangilio mitatu ya muda, qPCR, ELISA ya saitokini, takwimu na vikwazo vya mekanizimu vimepangwa upya kama tabaka tofauti za kisayansi.

Kikomo cha tafsiri ya afya: Matokeo yanahusu hidrolizati za protini za mimea katika mazingira ya maabara na hayaonyeshi kuwa ulaji wa maharagwe au mbegu za maboga hutibu magonjwa mahususi ya uchochezi kwa binadamu.