Ultrasəs dəstəkli fermentativ zülal hidrolizatı bitki mənşəli zülalların fermentlər vasitəsilə daha kiçik peptidlərə parçalanmasının ultrasəs kavitasiya ilə dəstəkləndiyi peptid qarışığıdır. Bu in vitro tədqiqat fasulye və balqabaq toxumu zülallarına ultrasəsin fermentativ hidrolizdən əvvəl və ya sonra tətbiq edilməsinin hidroliz dərəcəsini və antioksidant tutumu necə dəyişdirdiyini; əldə olunan peptid fraksiyalarının LPS və palmitik turşu ilə stimullaşdırılmış RAW264.7 makrofaqlarında iltihabi və oksidativ cavabı azaldıb-azaltmadığını araşdırmışdır.

Ultrasəs ön emalı hər iki bitki zülalı mənbəyində hidroliz dərəcəsinin ən yüksək olduğu emal olmuşdur. Fasulye hidrolizatında hidroliz dərəcəsi nəzarət qrupunda %28,64 olduğu halda ön ultrasəs qrupunda %34,06-ya; balqabaq toxumunda isə %63,06-dan %70,87-yə yüksəlmişdir. Fasulye hidrolizatında ABTS və ORAC antioksidant tutumu da ön emalla nəzərəçarpacaq dərəcədə artmışdır. Balqabaq toxumunda ən yüksək ORAC ön ultrasəs qrupunda müşahidə edilərkən, ABTS baxımından ön və son ultrasəs qrupları statistik olaraq bir-birindən fərqlənməmişdir.

Ultrasəs ön emalı ilə yaradılan hidrolizatlar 3–10 kDa və <3 kDa olmaqla iki molekulyar kütlə fraksiyasına ayrılmışdır. RAW264.7 hüceyrələrində bütün fraksiyalar 32,5–500 µg/mL aralığında %95-dən yuxarı hüceyrə canlılığı göstərmiş və LPS + palmitik turşunun yaratdığı NO istehsalını dozadan asılı şəkildə basdırmışdır. Sonrakı təcrübələrdə 250 µg/mL konsentrasiyasından istifadə edilmişdir.

Peptidlərin iltihabi stimula qədər, eyni vaxtda və ya başladıqdan sonra tətbiqini müqayisə edən təcrübələrdə bütün fraksiyalar müsbət nəzarətlə müqayisədə NO və ROS istehsalını azaltmışdır. Ümumilikdə ən güclü antiinflamatuar cavab eyni vaxtda tətbiq zamanı müşahidə edilmiş və fasulyenin <3 kDa fraksiyası olan CB3 bir çox sonlanımda önə çıxmışdır. CB3 Nos-2 və Cox-2 mRNA səviyyələrini %70-dən çox azaltmış, TNF-α istehsalında təxminən %75 azalma göstərmiş və IL-6 ilə MCP-1 üzərində də ən güclü təsirlərdən birini yaratmışdır.

Bununla belə, tədqiqat NF-κB/MAPK və ya NRF2 yollarını birbaşa ölçməmişdir. Bu yolların iştirakı NO, ROS, Nos-2/Cox-2 və sitokin dəyişikliklərindən və əvvəlki ədəbiyyatdan çıxarılır. Aktiv peptid ardıcıllıqları da LC-MS/MS ilə müəyyən edilməmişdir. Buna görə nəticələr qida mənşəli peptidlərin potensial antiinflamatuar bioloji aktivliyinə dair laboratoriya sübutudur; insanlarda ağızdan qəbuldan sonra eyni effektivliyin yarandığını göstərmir.

Tədqiqatın əsas problemi

Piylənmə ilə əlaqəli xroniki aşağı dərəcəli iltihab lipopolisaxaridlər və doymuş yağ turşuları kimi stimulların immun hüceyrələrdə iltihabi siqnal yollarını davamlı aktiv saxlaya bildiyi mürəkkəb bioloji vəziyyətdir. Makrofaqlarda bu cavab NO, ROS, proinflamatuar fermentlər və sitokinlərin yüksəlməsi ilə birlikdə müşahidə oluna bilər.

Bitki zülallarının fermentativ hidrolizi zamanı açığa çıxan qısa peptidlərin bəziləri antioksidant və ya antiinflamatuar bioloji aktivlik göstərə bilər. Lakin hidrolizin səmərəliliyinə zülal quruluşunun ferment üçün nə qədər açıq olması, zülal aqreqasiyası və ferment–substrat təmasının yetərliliyi kimi xüsusiyyətlər təsir edir.

Bu tədqiqatın əsas texnoloji sualı ultrasəs kavitasiyasının zülal quruluşunu hidrolizdən əvvəl açaraq fermentlərin substrata çıxışını artırıb-artırmamasıdır. İkinci sual isə yaranan peptidlərin yalnız kimyəvi antioksidant testlərdə deyil, iltihabi makrofaq modelində də bioloji cavab yaradıb-yaratmamasıdır.

Ultrasəs niyə fermentativ hidrolizə kömək edə bilər?

Ultrasəs tətbiqində maye mühitdə böyüyüb çökməyə uğrayan kavitasiya qabarcıqları yarana bilər. Mənbə bu mikromühitlərin zülal–zülal qarşılıqlı təsirlərini poza, zülalların ikincili və üçüncülü quruluşunu aça, aqreqatları dağıda və fermentin çata bildiyi səth sahəsini artıra biləcəyini izah edir.

Bu fiziki dəyişikliklər yeni proteaz fermenti yaratmır. Əsas təsir mövcud zülal substratının pepsin və pankreatin kimi fermentlər üçün daha əlçatan hala gəlməsidir.

Ultrasəsi Fermentativ Hidrolizdən Əvvəl Tətbiq Etmək Niyə Daha Effektiv idi?

Mənbə nəticələrinə görə ön ultrasəs hələ parçalanmamış zülal quruluşunu və aqreqatları fermentlərlə təmasdan əvvəl dəyişdirdiyi üçün ferment–substrat əlçatanlığını artırmış; son ultrasəs isə fermentativ kəsilmələrin böyük hissəsi artıq tamamlandıqdan sonra tətbiq edilmiş və buna görə hidroliz dərəcəsinə verə biləcəyi əlavə töhfə daha məhdud qalmışdır.

Zülal mənbələri

Tədqiqatda üzvi Bayo sortu fasulye və balqabaq toxumundan istifadə edilmişdir. Materiallar Meksikanın Tlaxcala bölgəsindəki yerli istehsalçılardan əldə edilmişdir.

Fasulye və balqabaq toxumu üyüdülərək 0,18 mm ələkdən keçirilmişdir. Balqabaq toxumu unu lipidləri uzaqlaşdırmaq üçün 1:20 çəki/həcm nisbətində heksanla 60 °C-də 1 saat emal edilmişdir.

Zülal ekstraksiyasında unlar su daxilində 1:10 çəki/həcm nisbətində suspenziya edilmişdir. Fasulye üçün pH 8, balqabaq toxumu üçün pH 11-ə tənzimlənmiş; suspenziyalar 25 °C-də 1 saat qarışdırılmışdır. İlk sentrifuqalama 5000×g-də 15 dəqiqə aparılmış, supernatant pH 4,5-ə gətirilərək 10.000×g-də 15 dəqiqə yenidən sentrifuqalanmışdır. Zülal çöküntüləri −50 °C və 0,1 mBar şəraitində 48 saat liyofilizasiya edilmişdir.

Mədə-bağırsaq fermentativ hidrolizi

Fasulye və balqabaq toxumu zülal konsentratları su daxilində 1:20 çəki/həcm nisbətində paylanmış və pH 1 M HCl ilə 2-yə tənzimlənmişdir.

Pepsin ferment:substrat nisbəti 1:20 çəki/çəki olacaq şəkildə əlavə edilmiş və 37 °C-də 2 saat inkubasiya olunmuşdur. Daha sonra pH 7,5-ə qaldırılaraq pepsin təsirsizləşdirilmiş, donuz mənşəli pankreatin yenə 1:20 ferment:substrat nisbətində əlavə edilmiş və daha 2 saat inkubasiya aparılmışdır.

Həzm 75 °C-də 20 dəqiqə qızdırılmaqla dayandırılmış, nümunələr 16.000×g-də 10 dəqiqə sentrifuqalanmış və əldə edilən supernatantlar liyofilizasiya edilmişdir.

Ultrasəs şərtləri

Ön emalda ultrasəs pepsin və pankreatin əlavə edilməzdən əvvəl təbii zülal konsentratına tətbiq edilmişdir. Son emalda isə ultrasəs pepsin–pankreatin həzmi tamamlandıqdan sonra əldə edilən hidrolizata tətbiq edilmişdir.

Fasulye və balqabaq toxumu eyni şəkildə hidroliz olunmadı

SDS-PAGE nəticələrində fasulye zülalındakı təxminən 35–48 kDa fazeolin alt vahidləri hidrolizdən sonra nəzərəçarpacaq şəkildə qalmışdır. Mənbə fazeolinin fasulye ümumi zülallarının mühüm hissəsini təşkil etdiyini və mədə-bağırsaq həzminə davamlı olduğunu bildirir.

Bunun əksinə, balqabaq toxumu zülallarının əsas 11S qlobulin və 2S albumin zolaqları həzmdən sonra böyük ölçüdə yox olmuşdur. Balqabaq toxumu hidrolizatının fasulyə ilə müqayisədə çox daha yüksək hidroliz dərəcəsi göstərməsi bu zülal quruluşu fərqi ilə uyğundur.

Tricine-SDS-PAGE hər iki mənbədə də 10 kDa-dan aşağı peptidlərin yarandığını göstərmişdir.

ABTS və ORAC eyni şeyi ölçürmü?

Xeyr. Mənbə antioksidant tutumunu iki fərqli kimyəvi prinsip əsasında qiymətləndirmişdir. ABTS testi əsasən elektron ötürülməsinə əsaslanan antioksidant tutum ölçümünü, ORAC isə hidrogen atomu ötürülməsi ilə əlaqəli radikal süpürmə tutumunu təmsil edir.

İki testin birlikdə istifadəsi peptid qarışığının antioksidant xüsusiyyətini yalnız bir reaksiya növünə görə qiymətləndirməməyə imkan verir. Bununla belə, yüksək ABTS və ya ORAC dəyəri insan bədənində eyni böyüklükdə klinik antioksidant təsirin yaranacağını göstərmir.

Peptid fraksiyaları necə yaradıldı?

Hüceyrə təcrübələri üçün ultrasəs ön emalı tətbiq edilmiş fasulye və balqabaq toxumu hidrolizatları ultrafiltrasiya ilə molekulyar kütlələrinə görə ayrılmışdır:

• CB10: fasulye 3–10 kDa fraksiyası
• CB3: fasulye <3 kDa fraksiyası
• PS10: balqabaq toxumu 3–10 kDa fraksiyası
• PS3: balqabaq toxumu <3 kDa fraksiyası

Daha Kiçik Peptidlər Həmişə Daha Güclü Antiinflamatuar Təsir Göstərdimi?

Xeyr. Fasulyədə <3 kDa CB3 fraksiyası bir çox hüceyrə sonlanımında ən güclü fraksiya olarkən, balqabaq toxumunda NO basdırılması baxımından 3–10 kDa PS10 fraksiyası PS3-dən daha güclü olmuşdur; bu nəticə bioloji effektivliyin yalnız molekulyar kütlədən deyil, həm də peptid ardıcıllığından, amin turşusu tərkibindən və struktur xüsusiyyətlərindən asılı olduğunu göstərir.

RAW264.7 makrofaq modeli

RAW264.7 siçan makrofaq hüceyrələri DMEM/F12 mühitində %10 FBS və %1 penisillin–streptomisinlə, 37 °C, %5 CO₂ və %95 rütubətli hava şəraitində kultivasiya edilmişdir. Bütün hüceyrə təcrübələrində passage 10 istifadə edilmişdir.

İltihabi modeldə hüceyrələr 100 ng/mL LPS və 100 µM palmitik turşu ilə stimullaşdırılmışdır. Bu iki stimulun birlikdə istifadəsi piylənmə ilə əlaqəli endotoksin və doymuş yağ turşusu stressini makrofaq səviyyəsində təqlid etməyi məqsədləyir.

İlkin doza skrininqi

Hidrolizat fraksiyaları 32,5–500 µg/mL aralığında sınaqdan keçirilmişdir. Bütün fraksiyalarda hüceyrə canlılığı %95-dən yuxarı qalmışdır.

LPS + palmitik turşu müsbət nəzarəti NO istehsalını mənfi nəzarətlə müqayisədə təxminən dörd dəfə artırmışdır. Dörd peptid fraksiyasının hamısı NO istehsalını doza ilə birlikdə azaltmışdır.

CB10, CB3 və PS10 üçün 250 µg/mL-dən 500 µg/mL-ə yüksəldikdə əlavə əhəmiyyətli azalma müşahidə edilmədiyi üçün əsas zamanlama təcrübələrində 250 µg/mL istifadə edilmişdir.

Pre-, co- və post-treatment nə deməkdir?

NO nəticələri

Üç zamanlama düzənində də peptid fraksiyaları LPS + PA müsbət nəzarətinə görə NO istehsalını əhəmiyyətli dərəcədə azaltmışdır.

Pre-treatment düzənində CB3 və PS10 ən güclü NO basdırılmasını göstərmişdir. Bu tapıntı fasulye və balqabaq toxumu üçün eyni molekulyar kütlə fraksiyasının ən yaxşı olmadığını göstərir.

Co-treatment zamanı bütün fraksiyalar güclü basdırılma göstərmiş və CB3 ən aydın cavabı yaratmışdır.

Post-treatment düzənində PS3-dən başqa fraksiyalar NO səviyyəsini mənfi nəzarət səviyyələrinə qədər azaltmışdır. Bu nəticə peptidlərin yalnız iltihabi stimuldan əvvəl deyil, cavab başladıqdan sonra da in vitro təsirli ola bildiyini göstərir.

ROS nəticələri

DCFH-DA flüoressensiyası hüceyrədaxili oksidant yük üçün istifadə olunan dolayı göstəricidir. LPS + PA bütün zamanlama düzənlərində ROS siqnalını artırmışdır.

Bütün peptid fraksiyaları müsbət nəzarətlə müqayisədə ROS istehsalını əhəmiyyətli dərəcədə basdırmışdır. Pre-treatment zamanı fraksiyaların ROS üzərindəki təsirləri arasında aydın fərq müşahidə edilməmişdir.

Co-treatment zamanı CB3 ən güclü ROS basdırılmasını göstərən fraksiyalardan biri olmuşdur. Mənbə həmçinin CB3 və PS3 kimi daha kiçik peptid fraksiyalarının hüceyrədaxili ROS basdırılmasında daha böyük fraksiyalardan güclü ola bildiyini müzakirə edir.

Post-treatment zamanı dörd fraksiya da ROS səviyyəsini müsbət nəzarətin və mənbənin izahına görə mənfi nəzarətin altına endirmişdir.

NO ilə ROS eyni bioloji sonlanım deyil

NO bu modeldə NOS-2 aktivliyi ilə əlaqəli iltihabi azot növlərinin istehsalını; DCFH-DA flüoressensiyası isə hüceyrə daxilində oksidativ yüklə əlaqəli siqnalı təmsil edir. Bir peptid fraksiyasının NO üzərində güclü olması ROS üzərində də eyni sıralamada təsirli olmasının vacib olduğu anlamına gəlmir.

Həqiqətən, balqabaq toxumunun PS10 fraksiyasının NO basdırılmasında önə çıxmasına qarşılıq daha kiçik PS3 fraksiyasının bəzi ROS müqayisələrində güclü olması, peptid ölçüsünə görə mexanizm fərqlənməsi ola biləcəyini düşündürür.

Nos-2 və Cox-2 niyə ölçüldü?

Nos-2 induksiya olunan nitrik oksid sintazanı kodlayır və iltihabi şəraitdə yüksək NO istehsalının əsas mənbələrindən biridir. Cox-2 isə iltihabla əlaqəli prostaglandin sintezində rol alan induksiya olunan siklooksigenazanı kodlayır.

LPS + PA stimulyasiyası Nos-2 mRNA-sını stimullaşdırılmamış hüceyrələrlə müqayisədə 10,5 dəfə, Cox-2 mRNA-sını təxminən 7 dəfə artırmışdır.

CB3 bu iki genin ekspressiyasını %70-dən çox azaltmışdır. CB10, PS10 və PS3 də hər iki geni %35-dən çox basdırmışdır.

Bu nəticə NO azalmasının yalnız kimyəvi NO təmizlənməsindən ibarət olmadığını və iltihabi fermentlərin transkripsiya səviyyəsində də dəyişdiyini göstərir.

NF-κB/MAPK və NRF2 Yolları Bu Tədqiqatda Birbaşa Sübut Edildimi?

Xeyr. Nos-2, Cox-2, NO, ROS və sitokinlərdəki dəyişikliklər NF-κB/MAPK basdırılması və NRF2 ilə əlaqəli antioksidant cavabla uyğundur, lakin tədqiqat fosforilləşmiş yol zülallarını, NF-κB reporter aktivliyini və ya NRF2 nüvə translokasiyasını birbaşa ölçmədiyi üçün bu mexanizmlər təsdiqlənmiş molekulyar yol kimi deyil, dəstəklənən hipotez kimi qiymətləndirilməlidir.

TNF-α

TNF-α xroniki iltihab zamanı çoxsaylı metabolik və immun cavablara təsir edən proinflamatuar sitokindir. Bütün peptid fraksiyaları LPS + PA müsbət nəzarətinə görə TNF-α istehsalını əhəmiyyətli dərəcədə azaltmışdır.

Ən güclü nəticə CB3 fraksiyasında müşahidə edilmiş və mənbə təxminən %75 azalma bildirmişdir.

IL-6

IL-6 kontekstdən asılı olaraq həm proinflamatuar, həm də tənzimləyici funksiya göstərə bilən pleiotropik sitokindir. Bu hüceyrə modelində LPS + PA ilə güclü şəkildə yüksəlmişdir.

Dörd hidrolizat fraksiyasının hamısı IL-6 səviyyəsini beş dəfədən çox azaltmış, ən güclü cavab yenə CB3-də görülmüşdür.

MCP-1

Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) monositlərin iltihab sahələrinə miqrasiyasını yönləndirən kemokindir. Xroniki metabolik iltihabda həddindən artıq MCP-1 istehsalı toxumaya immun hüceyrə infiltrasiyasını davam etdirə bilər.

Bütün fraksiyalar MCP-1 istehsalını azaltmış; CB3 təxminən ikiqat azalma göstərmişdir.

Üç sitokinin birlikdə azalması nə deməkdir?

TNF-α, IL-6 və MCP-1-in eyni təcrübə düzənində eyni vaxtda azalması yalnız bir sitokinin birbaşa neytrallaşdırılmasından daha geniş transkripsion iltihabi cavabın basdırılması ilə uyğundur.

Müəlliflər bu nümunəni NF-κB oxunun mümkün iştirakı ilə şərh etmişlər. Lakin yol səviyyəsində səbəb əlaqəsi eksperimental olaraq birbaşa göstərilməmişdir.

Aktiv peptidlərin kimliyi məlumdurmu?

Xeyr. Ultrafiltrasiya yalnız molekulyar kütlə diapazonlarını ayırmışdır. CB3-ün <3 kDa olması onun daxilində hansı konkret peptid ardıcıllığının aktivliyə cavabdeh olduğunu göstərmir.

Peptidlərin amin turşusu ardıcıllıqları, elektrik yükləri, N- və C-terminal xüsusiyyətləri və ya TLR4 ilə birbaşa bağlanma affinlikləri bu tədqiqatda ölçülməmişdir.

Mənbə gələcəkdə LC-MS/MS peptid ardıcıllaşdırması, molekulyar docking və eksperimental yol təsdiqini təklif edir.

Tədqiqatın Metodu və Nəticələri

Eksperimental emal zənciri

1. Fasulye və balqabaq toxumu materialının üyüdülməsi və zülal konsentratının hazırlanması.
2. Balqabaq toxumu ununun heksanla yağsızlaşdırılması.
3. Zülalların qələvi mühitdə ekstraksiyası və pH 4,5-də çökdürülməsi.
4. Zülal konsentratlarının liyofilizasiyası.
5. Ultrasəs ön emal qrupunda zülala 20 kHz, %70 amplituda, 10 dəqiqə ultrasəs tətbiqi.
6. Pepsinlə 2 saat və pankreatinlə 2 saat in vitro mədə-bağırsaq hidrolizi.
7. Son ultrasəs qrupunda fermentativ hidroliz bitdikdən sonra eyni ultrasəs şəraitinin tətbiqi.
8. Hidroliz dərəcəsinin OPA üsulu ilə müəyyən edilməsi.
9. SDS-PAGE və Tricine-SDS-PAGE ilə zülal/peptid profillərinin qiymətləndirilməsi.
10. ABTS və ORAC ilə kimyəvi antioksidant tutumun ölçülməsi.
11. Ən effektiv ön-ultrasəs hidrolizatlarının 3–10 kDa və <3 kDa fraksiyalarına ayrılması.
12. RAW264.7 makrofaqlarında canlılıq və NO doza skrininqi.
13. 250 µg/mL ilə pre-, co- və post-treatment təcrübələri.
14. NO, ROS, Nos-2, Cox-2, TNF-α, IL-6 və MCP-1 ölçmələri.

Hidroliz dərəcəsi necə ölçüldü?

Hidroliz dərəcəsi Nielsen və əməkdaşlarının o-phthaldialdehyde (OPA) üsulu ilə müəyyən edilmişdir. DH zülal zəncirlərindəki peptid bağlarının fermentativ parçalanma dərəcəsini təmsil edir.

Daha yüksək DH ümumiyyətlə daha çox peptid bağının qırıldığını və daha kiçik peptidlərin yarandığını göstərir; lakin daha yüksək DH-nin hər bioloji aktivlikdə avtomatik olaraq daha yüksək effektivlik demək olmadığı balqabaq toxumu fraksiyası nəticələrində aydın görünür.

ABTS və ORAC ölçümü

ABTS və ORAC üçün Trolox standart əyriləri hazırlanmış və R² dəyərləri 0,98-dən yuxarı saxlanılmışdır.

ABTS standart diapazonu 25–200 µmol/L, ORAC diapazonu 6,25–200 µmol/L-dir. Nəticələr µmol Trolox equivalents/g protein şəklində hesabatlandırılmışdır.

Hüceyrədaxili ROS analizi

ROS istehsalı 10 µM DCFH-DA istifadə edilərək qiymətləndirilmişdir. Hüceyrələr probla 37 °C-də 30 dəqiqə inkubasiya olunmuş; flüoressensiya 485 nm eksitasiya və 530 nm emissiya dalğa uzunluqlarında Cytation 5 oxuyucusu ilə ölçülmüşdür.

Nəticələr mənfi nəzarət %100 qəbul edilərək nisbi ROS faizi şəklində verilmişdir.

NO analizi

Hüceyrə kulturası supernatantındakı NO Griess Reagent System ilə dolayı olaraq nitrit üzərindən ölçülmüşdür. 1,56–100 µM natrium nitrit standart əyrisindən istifadə edilmiş və nəticələr µM nitrit kimi hesabatlandırılmışdır.

qPCR

Co-treatment təcrübələrindən sonra total RNA izolə edilmiş və cDNA-ya çevrilmişdir. Nos-2 və Cox-2 genləri QuantStudio 3 cihazında qPCR ilə ölçülmüş, Ppib endogen nəzarət kimi istifadə edilmişdir.

Nisbi mRNA ekspressiyası \(2^{-\Delta\Delta C_T}\) üsulu ilə hesablanmışdır.

Bu üsul hədəf genin Ct dəyərini əvvəlcə istinad genlə normallaşdırır və sonra təcrübə qrupunu istinad şəraiti ilə müqayisə edərək nisbi ekspressiya dəyişikliyini verir. Nəticə mütləq mRNA molekul sayı deyil, istinada görə qat dəyişməsidir.

Sitokin analizi

TNF-α, IL-6 və MCP-1 hüceyrə kulturası supernatantlarında ELISA kitləri ilə ölçülmüşdür. Bu təcrübələr yalnız co-treatment düzənində və 250 µg/mL peptid fraksiyası istifadə edilərək aparılmışdır.

Təkrar strukturu və statistika

DH, ABTS və ORAC analizlərində üç müstəqil fermentativ hidroliz proseduru bioloji təkrar kimi istifadə edilmiş və hər bioloji təkrar texniki olaraq üç dəfə ölçülmüşdür.

Hüceyrə təcrübələri fərqli günlərdə aparılmış üç müstəqil RAW264.7 hüceyrə kulturası ilə bioloji triplikat kimi həyata keçirilmiş; hər bioloji təkrarda hər şərait üçün texniki üçlü quyu istifadə edilmişdir.

Normal paylanma Shapiro–Wilk testi, variasiya homogenliyi Levene testi ilə α=0,05 səviyyəsində qiymətləndirilmişdir. Mənbə bütün məlumat dəstlərinin bu parametrik fərziyyələri ödədiyini bildirir.

Qruplar birtərəfli ANOVA və Tukey çoxsaylı müqayisə testi ilə analiz edilmiş, p<0,05 əhəmiyyətli qəbul edilmişdir. Analizlərdə GraphPad Prism 10.6.1 və Minitab 22.4.0.0 istifadə edilmişdir.

Figure 1-in elmi rolu

Figure 1 peptidlərin iltihabi stimula görə zamanlamasını göstərir. Pre-treatment modeli peptidin stimuldan əvvəlki təsirini, co-treatment eyni vaxtda başlanğıc təsirini, post-treatment isə iltihabi cavab başladıqdan sonrakı təsirini araşdırır.

Mənbə şəklinin görünən etiketlərində 125 və 250 µg/mL olmasına baxmayaraq metod mətni əsas üç-zamanlama təcrübələrinin bir konsentrasiya ilə, 250 µg/mL-də aparıldığını və Figure 4–7 izahları da 250 µg/mL istifadə edildiyini bildirir. Mənbədaxili bu təqdimat fərqi şərhdə qorunmalıdır.

Figure 2-nin elmi rolu

SDS-PAGE ilə böyük zülalların, Tricine-SDS-PAGE ilə daha kiçik peptidlərin paylanması görünür. Fasulyədə fazeolin zolaqlarının davamlı qalması, balqabaq toxumunda isə böyük saxlama zülalı zolaqlarının daha güclü yox olması iki xammalın həzm olunma fərqini izah edir.

Figure 2 izahında PSP və PSH-nin “common bean protein” və “common bean hydrolysate” kimi açılması mətnlə uyğunsuzdur; təcrübə konteksti PSP/PSH-nin balqabaq toxumu zülalı/hidrolizatını təmsil etdiyini göstərir.

Figure 3-ün elmi rolu

Figure 3 dörd peptid fraksiyasının 32,5–500 µg/mL aralığındakı NO doza–cavabını müqayisə edir. Fasulyədə CB3, balqabaq toxumunda isə PS10 daha güclü profillərdən birini göstərir.

Qrafik eyni zamanda 250 µg/mL-nin sonrakı təcrübələr üçün seçilməsinin eksperimental əsasını yaradır.

Figure 4 və Figure 5 birlikdə necə oxunmalıdır?

Figure 4 NO, Figure 5 ROS cavabını üç fərqli zamanlamada göstərir. Hər iki sonlanım ümumilikdə peptid müalicəsi ilə azalsa da, fraksiyaların sıralaması eyni deyil.

Buna görə antiinflamatuar aktivliyi yalnız NO və ya yalnız ROS üzərindən müəyyən etmək natamam olardı. Mənbə bu iki ölçünü bir-birini tamamlayan bioloji sonlanımlar kimi istifadə etmişdir.

Figure 6 nə göstərir?

Figure 6 co-treatment zamanı Nos-2 və Cox-2 mRNA səviyyələrini müqayisə edir. LPS + PA hər iki geni güclü şəkildə artırarkən bütün peptid fraksiyaları ekspressiyanı azaltmışdır.

CB3 hər iki gendə %70-dən çox basdırılma göstərmişdir. Bu nəticə hüceyrə NO dəyişikliklərinin ən azı qismən gen ekspressiyası səviyyəsindəki dəyişikliklə birlikdə baş verdiyini dəstəkləyir.

Figure 7 nə göstərir?

Figure 7 TNF-α, IL-6 və MCP-1 zülal səviyyələrini ELISA ilə müqayisə edir. Hər üç proinflamatuar mediatorun bütün peptid fraksiyalarında azalması geniş miqyaslı iltihabi cavab basdırılması ilə uyğundur.

CB3 üç sitokində də ən ardıcıl güclü profili göstərmişdir.

Tədqiqatın güclü tərəfləri

• Ultrasəs ön və son tətbiqləri eyni bitki zülalı mənbələrində birbaşa müqayisə edilmişdir.
• Fasulye və balqabaq toxumunun fərqli zülal strukturları eyni eksperimental çərçivədə qiymətləndirilmişdir.
• Kimyəvi antioksidant tutum ABTS və ORAC olmaqla iki fərqli prinsip əsasında ölçülmüşdür.
• Hidrolizatlar molekulyar kütləyə görə fraksiyalaşdırılmış və bioloji aktivlik fraksiya səviyyəsində araşdırılmışdır.
• Hüceyrə cavabı yalnız NO ilə deyil, ROS, mRNA və üç fərqli sitokinlə birlikdə qiymətləndirilmişdir.
• Peptidlərin iltihabi stimula görə zamanlaması üç ayrı modeldə araşdırılmışdır.
• Bioloji təkrarlar müstəqil günlərdə aparılmış və texniki təkrarlarla dəstəklənmişdir.

Tədqiqatın əsas məhdudiyyətləri

• Tədqiqat yalnız in vitro hüceyrə modelidir; insanlarda və ya heyvanlarda terapevtik effektivlik göstərmir.
• Aktiv peptidlərin amin turşusu ardıcıllıqları LC-MS/MS ilə müəyyən edilməmişdir.
• Peptidlərin elektrik yükü və həqiqi quruluş–aktivlik əlaqəsi müəyyən edilməmişdir.
• TLR4-ə birbaşa bağlanma və ya LPS neytrallaşdırılması eksperimental olaraq ölçülməmişdir.
• NF-κB/MAPK fosforilləşməsi Western blot ilə təsdiqlənməmişdir.
• NF-κB reporter assay aparılmamışdır.
• NRF2 nüvə translokasiyası birbaşa qiymətləndirilməmişdir.
• 250 µg/mL in vitro konsentrasiyasının normal qidalanma ilə bağırsaqda və ya dövranda əldə edilə bilib-bilməyəcəyi məlum deyil.
• Peptidlərin mədə-bağırsaq stabilliyi və bağırsaq keçiriciliyi qiymətləndirilməmişdir.
• Plazma stabilliyi və farmakokinetik məlumat yoxdur.
• Sənaye miqyasında böyütmə və iqtisadi tətbiqolunma sınaqdan keçirilməmişdir.
• Ultrasəs tezliyi, amplitudası və müddətinin geniş optimallaşdırma xəritəsi çıxarılmamışdır.

Tədqiqatın dəstəklədiyi nəticələr

Ultrasəsin fermentativ hidrolizdən əvvəl tətbiqi istifadə olunan eksperimental şəraitdə fasulye və balqabaq toxumu zülallarının hidroliz dərəcəsini artırmışdır.

Ultrasəs ön və son tətbiqi hidrolizatların ABTS və ORAC ilə ölçülən antioksidant tutumunu ümumilikdə artırmışdır; ön tətbiq xüsusilə fasulye və balqabaq toxumu ORAC nəticələrində daha güclü olmuşdur.

Ultrasəs ön emalından əldə edilən peptid fraksiyaları RAW264.7 hüceyrələrində LPS + palmitik turşu mənşəli NO və ROS istehsalını azaltmışdır.

Peptid fraksiyaları Nos-2 və Cox-2 mRNA-sını və TNF-α, IL-6 və MCP-1 istehsalını azaltmışdır.

CB3 fraksiyası hüceyrə antiinflamatuar sonlanımlarının çoxunda ən güclü və ən ardıcıl fraksiyalardan biri olmuşdur.

Peptid ölçüsü ilə bioloji aktivlik arasındakı əlaqə zülal mənbəyindən və ölçülən sonlanımdan asılıdır.

Tədqiqatın dəstəkləmədiyi nəticələr

Tədqiqat fasulye və ya balqabaq toxumu peptidlərinin insanlarda piylənməni, diabeti və ya yağlı qaraciyər xəstəliyini müalicə etdiyini göstərmir.

250 µg/mL hüceyrə kulturası konsentrasiyasının normal qidalanma ilə insan toxumalarında əldə edilə bildiyi göstərilməmişdir.

CB3 və ya digər fraksiyaların NF-κB, MAPK, NRF2 və ya TLR4 üzərində birbaşa molekulyar qarşılıqlı təsiri sübut edilməmişdir.

Hansı konkret peptid ardıcıllıqlarının antioksidant və ya antiinflamatuar aktivliyə cavabdeh olduğu məlum deyil.

Daha kiçik molekulyar kütlənin hər vəziyyətdə daha yüksək bioloji aktivlik verdiyi göstərilməmişdir.

Ultrasəs ön emalının sənaye miqyasında iqtisadi və ya texniki baxımdan ən yaxşı proses olduğu göstərilməmişdir.

Mənbə və Metod Qeydi

Orijinal tədqiqat: Ultrasound-Assisted Enzymatic Hydrolysates from Common Bean and Pumpkin Seed Proteins: Antioxidant and Anti-Inflammatory Properties

Müəlliflər: Erick Huerta-Rodriguez; Omar Sanchez-Jimenez; Cristina Chuck-Hernández; Margarita L. Martinez-Fierro; Idalia Garza-Veloz; Diana L. Cárdenas-Chávez; Cesar A. Ponce-Ponce de Leon; Maria del Refugio Rocha-Pizaña.

Məsul müəllif: Maria del Refugio Rocha-Pizaña.

Qurumlar: Escuela de Ingenieria y Ciencias, Tecnologico de Monterrey, Monterrey, Mexico; Molecular Medicine Laboratory, Unidad Academica de Medicina Humana y C.S, Universidad Autonoma de Zacatecas, Zacatecas, Mexico.

Jurnal: Antioxidants.

Nəşriyyat: MDPI, Basel, Switzerland.

Nəşr məlumatı: 2026; cild 15; say 5; məqalə 578. Nəşr tarixi: 3 Mayıs 2026.

DOI: 10.3390/antiox15050578

Mənbə növü: Resenziyalı, açıq girişli orijinal eksperimental tədqiqat məqaləsi; qida zülalı texnologiyası və in vitro makrofaq modeli.

Lisenziya: Creative Commons Attribution (CC BY).

Bitki materialı: Üzvi Bayo fasulyəsi və balqabaq toxumu; Tlaxcala, Mexico.

Zülal hidrolizi: Pepsin və pankreatin; hər mərhələdə ferment:substrat 1:20 çəki/çəki; pepsin pH 2 və 37 °C-də 2 saat; ardınca pH 7,5 və pankreatinlə 2 saat; 75 °C-də 20 dəqiqə ferment inaktivasiyası.

Ultrasəs: Branson 450S-Digital Sonifier; 20 kHz; %70 amplituda; 10 dəqiqə; 25 saniyə açıq/25 saniyə bağlı; buz vannası.

Peptid fraksiyaları: Fasulye CB10 (3–10 kDa), CB3 (<3 kDa); balqabaq toxumu PS10 (3–10 kDa), PS3 (<3 kDa).

Antioksidant analiz: ABTS və ORAC; nəticələr µmol Trolox equivalents/g protein kimi hesabatlandırılmışdır.

Hüceyrə modeli: RAW264.7 siçan makrofaqları, passage 10.

İltihabi stimul: LPS 100 ng/mL + palmitik turşu 100 µM.

Əsas hüceyrə peptid konsentrasiyası: 250 µg/mL.

Hüceyrə sonlanımları: Hüceyrə canlılığı, nitrit/NO, DCFH-DA ROS, Nos-2 və Cox-2 mRNA, TNF-α, IL-6 və MCP-1.

qPCR: \(2^{-\Delta\Delta C_T}\) üsulu; Ppib endogen nəzarət.

Statistika: Shapiro–Wilk normallıq testi; Levene variasiya homogenliyi testi; birtərəfli ANOVA və Tukey post hoc; p<0,05.

Təkrar strukturu: Üç müstəqil bioloji təkrar; hər bioloji təkrarda texniki triplikatlar.

Proqram təminatı: GraphPad Prism 10.6.1 və Minitab 22.4.0.0.

Supplementary material: Figure S1 dörd peptid fraksiyasının RAW264.7 hüceyrə canlılığı üzərindəki təsirini göstərir.

Maliyyələşdirmə: Mənbənin Funding bölməsi xarici maliyyələşdirmə alınmadığını bildirir.

Dəstək və təşəkkür: Tecnologico de Monterrey laboratoriya materialı dəstəyi; üzvi fasulye və balqabaq toxumu təmin edən yerli istehsalçı/qurumlar; SECIHTI tədqiqat təqaüdü No. 1049616.

Etik komitə: Tətbiq edilmir.

Məlumatlandırılmış razılıq: Tətbiq edilmir.

Məlumat əlçatanlığı: Orijinal töhfələr məqalə və əlavə materialda təqdim edilmişdir; əlavə suallar məsul müəllifə yönəldilə bilər.

Maraqlar toqquşması: Müəlliflər maraqlar toqquşması bildirməmişdir.

Müəllif töhfələri: Konseptuallaşdırma Maria del Refugio Rocha-Pizaña, Cristina Chuck-Hernández, Margarita L. Martinez-Fierro və Idalia Garza-Veloz; metodologiya Erick Huerta-Rodriguez və Maria del Refugio Rocha-Pizaña; validasiya və formal analiz Erick Huerta-Rodriguez; tədqiqat Erick Huerta-Rodriguez və Omar Sanchez-Jimenez; ilkin qaralama Erick Huerta-Rodriguez; nəzarət, layihə idarəçiliyi və maliyyələşdirmənin əldə olunması Maria del Refugio Rocha-Pizaña tərəfindən aparılmışdır.

Mənbədaxili adlandırma qeydi: Balqabaq növünün adı abstract-da “Cucurbita argyoesperma”, giriş və metodda “Cucurbita argyosperma” kimi keçir. Verianla bu fərqi mənbədaxili yazım uyğunsuzluğu kimi qoruyur.

Mənbə Figure 2 qeydi: Figure 2 izahında PSP və PSH səhvən “common bean” kimi açılmış görünür; təcrübə mətni bunların balqabaq toxumu zülalı və hidrolizatı olduğunu açıq şəkildə göstərir.

Figure 1 metod qeydi: Şəkil üzərində 125 və 250 µg/mL etiketləri olsa da Bölmə 2.8.3 və Figure 4–7 əsas təcrübələrdə 250 µg/mL istifadə edildiyini bildirir. Verianla əsas hüceyrə nəticələrində 250 µg/mL dəyərini əsas götürür və şəkildəki fərqi gizlətmir.

Əsas mexanistik məhdudiyyət: NF-κB/MAPK və NRF2 yollarının iştirakı aşağı axın nəticələrindən çıxarılır; birbaşa pathway aktivləşmə təcrübələri aparılmamışdır.

Peptid kimliyi məhdudiyyəti: Fraksiyalar yalnız molekulyar kütləyə görə müəyyən edilmişdir. Biyoaktiv ardıcıllıqlar, amin turşusu tərkibi və reseptor bağlanma mexanizmləri birbaşa müəyyən edilməmişdir.

Translyasiya məhdudiyyəti: Mədə-bağırsaq stabilliyi, Caco-2 bənzəri intestinal transport, plazma stabilliyi, farmakokinetika və ağızdan qəbul edilən peptidlərin 250 µg/mL ekvivalent toxuma məruz qalmasına çatıb-çatmadığı sınaqdan keçirilməmişdir.

Sənaye məhdudiyyəti: Ultrasəs ön emalı laboratoriya səviyyəsində üstünlük göstərmişdir; tezlik, amplituda, müddət və miqyasın böyüdülməsinin iqtisadi optimallaşdırılması tamamlanmamışdır.

Verianla təqdimat üsulu: Bu məzmun yalnız abstract və ya conclusion tərcüməsi deyil. Zülal ekstraksiyası, mədə-bağırsaq hidrolizi, ultrasəs ön/son tətbiqi, molekulyar kütlə fraksiyalaşdırılması, SDS-PAGE/Tricine-SDS-PAGE, DH, ABTS, ORAC, hüceyrə canlılığı, NO, ROS, üç zamanlama düzəni, qPCR, sitokin ELISA-sı, statistika və mexanistik məhdudiyyətlər ayrı elmi qatlar şəklində yenidən qurulmuşdur.

Sağlamlıq şərhi məhdudiyyəti: Nəticələr laboratoriya şəraitindəki bitki zülalı hidrolizatlarına aiddir və fasulye və ya balqabaq toxumu istehlakının insanlarda konkret iltihabi xəstəlikləri müalicə etdiyini göstərmir.