Ultratovush yordamidagi fermentativ oqsil gidrolizati — o‘simlik oqsillarining fermentlar yordamida kichikroq peptidlarga parchalanishi ultratovush kavitatsiyasi bilan qo‘llab-quvvatlanadigan peptidlar aralashmasidir. Ushbu in vitro tadqiqot loviya va qovoq urug‘i oqsillariga ultratovushni fermentativ gidrolizdan oldin yoki keyin qo‘llash gidroliz darajasi va antioksidant sig‘imni qanday o‘zgartirishini; hosil bo‘lgan peptid fraksiyalari LPS va palmitik kislota bilan qo‘zg‘atilgan RAW264.7 makrofaglarida yallig‘lanish va oksidativ javobni kamaytiradimi-yo‘qmi, shuni o‘rgandi.

Ultratovush oldindan ishlovi har ikkala o‘simlik oqsili manbasida ham gidroliz darajasi eng yuqori bo‘lgan ishlov bo‘ldi. Loviya gidrolizatida gidroliz darajasi nazorat guruhida %28,64 bo‘lgan bo‘lsa, old ultratovush guruhida %34,06 gacha; qovoq urug‘ida esa %63,06 dan %70,87 gacha oshdi. Loviya gidrolizatida ABTS va ORAC antioksidant sig‘imi ham oldindan ishlov bilan sezilarli oshdi. Qovoq urug‘ida eng yuqori ORAC old ultratovush guruhida kuzatilgan bo‘lsa, ABTS bo‘yicha old va keyingi ultratovush guruhlari statistik jihatdan bir-biridan farq qilmadi.

Ultratovush oldindan ishlovi bilan tayyorlangan gidrolizatlar 3–10 kDa va <3 kDa bo‘lgan ikki molekulyar massa fraksiyasiga ajratildi. RAW264.7 hujayralarida barcha fraksiyalar 32,5–500 µg/mL oralig‘ida %95 dan yuqori hujayra yashovchanligini ko‘rsatdi va LPS + palmitik kislota sababli NO hosil bo‘lishini dozaga bog‘liq tarzda bostirdi. Keyingi tajribalarda 250 µg/mL konsentratsiya ishlatildi.

Peptidlarni yallig‘lanish qo‘zg‘atuvchisidan oldin, u bilan bir vaqtda yoki u boshlanganidan keyin qo‘llashni solishtirgan tajribalarda barcha fraksiyalar musbat nazoratga nisbatan NO va ROS ishlab chiqarilishini kamaytirdi. Umuman olganda, eng kuchli yallig‘lanishga qarshi javob bir vaqtda qo‘llash paytida kuzatildi va loviyaning <3 kDa fraksiyasi bo‘lgan CB3 ko‘plab yakuniy ko‘rsatkichlarda ajralib turdi. CB3 Nos-2 va Cox-2 mRNA darajalarini %70 dan ko‘proq kamaytirdi, TNF-α ishlab chiqarilishida taxminan %75 kamayishni ko‘rsatdi va IL-6 hamda MCP-1 ga ham eng kuchli ta’sirlardan birini yuzaga keltirdi.

Biroq tadqiqot NF-κB/MAPK yoki NRF2 yo‘llarini bevosita o‘lchamagan. Ushbu yo‘llarning ishtiroki NO, ROS, Nos-2/Cox-2 va sitokin o‘zgarishlaridan hamda avvalgi adabiyotlardan kelib chiqib taxmin qilinadi. Faol peptid ketma-ketliklari ham LC-MS/MS bilan aniqlanmagan. Shu sababli natijalar oziq-ovqatdan kelib chiqadigan peptidlarning potensial yallig‘lanishga qarshi biologik faolligiga doir laboratoriya dalilidir; odamlarda og‘iz orqali iste’moldan keyin xuddi shunday samaradorlik yuzaga kelishini ko‘rsatmaydi.

Tadqiqotning asosiy muammosi

Semizlik bilan bog‘liq surunkali past darajali yallig‘lanish — lipopolisaxaridlar va to‘yingan yog‘ kislotalari kabi stimullar immun hujayralarda yallig‘lanish signal yo‘llarini doimiy faol saqlashi mumkin bo‘lgan murakkab biologik holatdir. Makrofaglarda bu javob NO, ROS, yallig‘lanishga oid fermentlar va sitokinlarning oshishi bilan birga kuzatilishi mumkin.

O‘simlik oqsillarining fermentativ gidrolizi paytida ajralib chiqadigan qisqa peptidlarning ayrimlari antioksidant yoki yallig‘lanishga qarshi biologik faollik ko‘rsatishi mumkin. Biroq gidroliz samaradorligiga oqsil tuzilmasining ferment uchun qanchalik ochiq ekani, oqsil agregatsiyasi va ferment–substrat kontaktining yetarliligi kabi xususiyatlar ta’sir qiladi.

Ushbu tadqiqotning asosiy texnologik savoli — ultratovush kavitatsiyasi oqsil tuzilmasini gidrolizdan oldin ochib, fermentlarning substratga yetib borishini oshiradimi-yo‘qmi. Ikkinchi savol esa hosil bo‘lgan peptidlar faqat kimyoviy antioksidant testlarda emas, balki yallig‘langan makrofag modelida ham biologik javob hosil qiladimi-yo‘qmi.

Ultratovush nima uchun fermentativ gidrolizga yordam berishi mumkin?

Ultratovush qo‘llanganda suyuq muhitda o‘sib, keyin kollapsga uchraydigan kavitatsiya pufakchalari paydo bo‘lishi mumkin. Manba ushbu mikro-muhitlar oqsil–oqsil o‘zaro ta’sirlarini buzishi, oqsillarning ikkilamchi va uchlamchi tuzilishini ochishi, agregatlarni tarqatishi va ferment yetib bora oladigan sirt maydonini oshirishi mumkinligini tushuntiradi.

Bu fizik o‘zgarishlar yangi proteaza fermentini hosil qilmaydi. Asosiy ta’sir mavjud oqsil substratining pepsin va pankreatin kabi fermentlar uchun yanada qulayroq bo‘lishidir.

Ultratovushni Fermentativ Gidrolizdan Oldin Qo‘llash Nima Uchun Samaraliroq Bo‘ldi?

Manba natijalariga ko‘ra, old ultratovush hali parchalanmagan oqsil tuzilmasi va agregatlarini fermentlar bilan kontaktdan oldin o‘zgartirgani sababli ferment–substrat kirish imkonini oshirdi; keyingi ultratovush esa fermentativ kesishlarning katta qismi allaqachon tugagandan so‘ng qo‘llangan va shu bois gidroliz darajasiga qo‘shishi mumkin bo‘lgan qo‘shimcha hissasi cheklangan bo‘lib qolgan.

Oqsil manbalari

Tadqiqotda organik Bayo navli loviya va qovoq urug‘i ishlatilgan. Materiallar Meksikaning Tlaxcala hududidagi mahalliy ishlab chiqaruvchilardan olingan.

Loviya va qovoq urug‘i maydalangan va 0,18 mm elakdan o‘tkazilgan. Qovoq urug‘i uni lipidlarni chiqarib tashlash uchun 1:20 og‘irlik/hajm nisbatida geksan bilan 60 °C da 1 soat ishlov berilgan.

Oqsil ekstraksiyasida unlar suvda 1:10 og‘irlik/hajm nisbatida suspenziyalangan. Loviya uchun pH 8, qovoq urug‘i uchun pH 11 ga sozlangan; suspenziyalar 25 °C da 1 soat aralashtirilgan. Birinchi sentrifugatsiya 5000×g da 15 daqiqa bajarilgan, supernatant pH 4,5 ga keltirilib 10.000×g da 15 daqiqa yana sentrifugatsiya qilingan. Oqsil cho‘kmalari −50 °C va 0,1 mBar sharoitida 48 soat liyofilizatsiya qilingan.

Gastrointestinal fermentativ gidroliz

Loviya va qovoq urug‘i oqsil konsentratlari suvda 1:20 og‘irlik/hajm nisbatida tarqatilgan va pH 1 M HCl bilan 2 ga sozlangan.

Pepsin ferment:substrat nisbati 1:20 og‘irlik/og‘irlik bo‘ladigan tarzda qo‘shilgan va 37 °C da 2 soat inkubatsiya qilingan. Keyin pH 7,5 ga oshirilib pepsin faolsizlantirilgan, cho‘chqa manbali pankreatin yana 1:20 ferment:substrat nisbatida qo‘shilgan va yana 2 soat inkubatsiya qilingan.

Hazm 75 °C da 20 daqiqa qizdirish orqali to‘xtatilgan, namunalar 16.000×g da 10 daqiqa sentrifugatsiya qilingan va olingan supernatantlar liyofilizatsiya qilingan.

Ultratovush sharoitlari

Oldindan ishlovda ultratovush pepsin va pankreatin qo‘shilishidan oldin tabiiy oqsil konsentratiga qo‘llangan. Keyingi ishlovda esa ultratovush pepsin–pankreatin hazmi tugagandan so‘ng hosil bo‘lgan gidrolizatga qo‘llangan.

Loviya va qovoq urug‘i bir xil tarzda gidrolizlanmadi

SDS-PAGE natijalarida loviya oqsilidagi taxminan 35–48 kDa fazeolin subbirliklari gidrolizdan keyin sezilarli darajada saqlanib qolgan. Manba fazeolin loviya umumiy oqsillarining muhim qismini tashkil etishini va gastrointestinal hazmga chidamli ekanini bildiradi.

Aksincha, qovoq urug‘i oqsillarining asosiy 11S globulin va 2S albumin bantlari hazmdan keyin katta darajada yo‘qolgan. Qovoq urug‘i gidrolizatining loviyaga nisbatan ancha yuqori gidroliz darajasini ko‘rsatishi shu oqsil tuzilmasi farqi bilan mos keladi.

Tricine-SDS-PAGE har ikkala manbada ham 10 kDa dan kichik peptidlar hosil bo‘lganini ko‘rsatdi.

ABTS va ORAC bir xil narsani o‘lchaydimi?

Yo‘q. Manba antioksidant sig‘imni ikki xil kimyoviy prinsip bilan baholagan. ABTS testi asosan elektron ko‘chirishga asoslangan antioksidant sig‘im o‘lchovini, ORAC esa vodorod atomi ko‘chishi bilan bog‘liq radikalni tutib qolish sig‘imini ifodalaydi.

Ikki testni birgalikda ishlatish peptid aralashmasining antioksidant xususiyatini faqat bitta reaksiya turiga qarab baholamaslik imkonini beradi. Biroq yuqori ABTS yoki ORAC qiymati inson tanasida xuddi shuncha kattalikdagi klinik antioksidant ta’sir yuzaga kelishini ko‘rsatmaydi.

Peptid fraksiyalari qanday hosil qilindi?

Hujayraviy tajribalar uchun ultratovush oldindan ishlovi qo‘llangan loviya va qovoq urug‘i gidrolizatlari ultrafiltratsiya orqali molekulyar massalariga ko‘ra ajratilgan:

• CB10: loviya 3–10 kDa fraksiyasi
• CB3: loviya <3 kDa fraksiyasi
• PS10: qovoq urug‘i 3–10 kDa fraksiyasi
• PS3: qovoq urug‘i <3 kDa fraksiyasi

Kichikroq Peptidlar Har Doim Kuchliroq Yallig‘lanishga Qarshi Ta’sir Ko‘rsatdimi?

Yo‘q. Loviyada <3 kDa CB3 fraksiyasi ko‘plab hujayraviy yakuniy ko‘rsatkichlarda eng kuchli fraksiya bo‘lgan bo‘lsa, qovoq urug‘ida NO bostirilishi bo‘yicha 3–10 kDa PS10 fraksiyasi PS3 dan kuchliroq edi; bu natija biologik samaradorlik faqat molekulyar massaga emas, peptid ketma-ketligiga, aminokislota tarkibiga va strukturaviy xususiyatlarga ham bog‘liq ekanini ko‘rsatadi.

RAW264.7 makrofag modeli

RAW264.7 sichqon makrofag hujayralari DMEM/F12 muhitida %10 FBS va %1 penitsillin–streptomitsin bilan, 37 °C, %5 CO₂ va %95 nam havo sharoitida yetishtirilgan. Barcha hujayraviy tajribalarda passage 10 ishlatilgan.

Yallig‘lanish modelida hujayralar 100 ng/mL LPS va 100 µM palmitik kislota bilan qo‘zg‘atilgan. Ushbu ikki stimulni birgalikda qo‘llash semizlik bilan bog‘liq endotoksin va to‘yingan yog‘ kislotasi stressini makrofag darajasida taqlid qilishni maqsad qilgan.

Dastlabki doza skriningi

Gidrolizat fraksiyalari 32,5–500 µg/mL oralig‘ida sinovdan o‘tkazilgan. Barcha fraksiyalarda hujayra yashovchanligi %95 dan yuqori bo‘lib qolgan.

LPS + palmitik kislota musbat nazorati NO ishlab chiqarilishini manfiy nazoratga nisbatan taxminan to‘rt baravar oshirgan. To‘rt peptid fraksiyasining barchasi NO ishlab chiqarilishini doza ortishi bilan kamaytirgan.

CB10, CB3 va PS10 uchun 250 µg/mL dan 500 µg/mL ga oshirilganda qo‘shimcha sezilarli kamayish kuzatilmagani sababli asosiy vaqtlashtirish tajribalarida 250 µg/mL ishlatilgan.

Pre-, co- va post-treatment nimani anglatadi?

NO natijalari

Har uch vaqtlashtirish tartibida ham peptid fraksiyalari LPS + PA musbat nazoratiga nisbatan NO ishlab chiqarilishini sezilarli kamaytirgan.

Pre-treatment tartibida CB3 va PS10 eng kuchli NO bostirilishini ko‘rsatgan. Bu topilma loviya va qovoq urug‘i uchun bir xil molekulyar massa fraksiyasi eng yaxshi emasligini ko‘rsatadi.

Co-treatment vaqtida barcha fraksiyalar kuchli bostirish ko‘rsatgan va CB3 eng yaqqol javobni yuzaga keltirgan.

Post-treatment tartibida PS3 dan tashqari fraksiyalar NO darajasini manfiy nazorat darajasigacha tushirgan. Bu natija peptidlar nafaqat yallig‘lanish stimulidan oldin, balki javob boshlanganidan keyin ham in vitro samarali bo‘lishi mumkinligini ko‘rsatadi.

ROS natijalari

DCFH-DA flyuorestsensiyasi hujayra ichidagi oksidant yuk uchun ishlatiladigan bilvosita ko‘rsatkichdir. LPS + PA barcha vaqtlashtirish tartiblarida ROS signalini oshirgan.

Barcha peptid fraksiyalari musbat nazoratga nisbatan ROS ishlab chiqarilishini sezilarli bostirgan. Pre-treatment paytida fraksiyalarning ROS ga ta’siri o‘rtasida yaqqol farq kuzatilmagan.

Co-treatment paytida CB3 ROS ni eng kuchli bostirgan fraksiyalardan biri bo‘lgan. Manba shuningdek CB3 va PS3 kabi kichikroq peptid fraksiyalari hujayra ichidagi ROS ni bostirishda kattaroq fraksiyalardan kuchli bo‘lishi mumkinligini muhokama qiladi.

Post-treatment paytida to‘rt fraksiyaning barchasi ROS darajasini musbat nazoratdan va manba bayoniga ko‘ra manfiy nazoratdan ham pastga tushirgan.

NO va ROS bir xil biologik yakuniy ko‘rsatkich emas

NO ushbu modelda NOS-2 faolligi bilan bog‘liq yallig‘lanishli azot turlari ishlab chiqarilishini; DCFH-DA flyuorestsensiyasi esa hujayra ichidagi oksidativ yuk bilan bog‘liq signalni ifodalaydi. Bir peptid fraksiyasi NO ga kuchli ta’sir ko‘rsatishi, ROS da ham xuddi shu tartibda samarali bo‘lishi kerak degani emas.

Haqiqatan, qovoq urug‘i PS10 fraksiyasi NO bostirilishida ajralib turgan bo‘lsa, kichikroq PS3 fraksiyasining ayrim ROS solishtirishlarida kuchli bo‘lishi peptid hajmiga qarab mexanizm farqlanishi mumkinligini ko‘rsatadi.

Nos-2 va Cox-2 nima uchun o‘lchandi?

Nos-2 induksiya qilinadigan azot oksidi sintazasini kodlaydi va yallig‘lanish sharoitida yuqori NO ishlab chiqarilishining asosiy manbalaridan biridir. Cox-2 esa yallig‘lanish bilan bog‘liq prostaglandin sintezida qatnashadigan induksiya qilinadigan siklooksigenazani kodlaydi.

LPS + PA stimulyatsiyasi Nos-2 mRNA sini stimulyatsiya qilinmagan hujayralarga nisbatan 10,5 baravar, Cox-2 mRNA sini taxminan 7 baravar oshirgan.

CB3 bu ikki gen ekspressiyasini %70 dan ko‘proq kamaytirgan. CB10, PS10 va PS3 ham ikkala genni %35 dan ko‘proq bostirgan.

Bu natija NO kamayishi faqat kimyoviy NO tozalashdan iborat emasligini va yallig‘lanish fermentlarining transkripsiya darajasida ham o‘zgarish borligini ko‘rsatadi.

NF-κB/MAPK va NRF2 Yo‘llari Ushbu Tadqiqotda Bevosita Isbotlandimi?

Yo‘q. Nos-2, Cox-2, NO, ROS va sitokinlardagi o‘zgarishlar NF-κB/MAPK bostirilishi va NRF2 bilan bog‘liq antioksidant javobga mos keladi, biroq tadqiqot fosforillangan yo‘l oqsillari, NF-κB reporter faolligi yoki NRF2 yadroviy translokatsiyasini bevosita o‘lchamagani sababli bu mexanizmlar tasdiqlangan molekulyar yo‘l sifatida emas, balki qo‘llab-quvvatlangan gipoteza sifatida baholanishi kerak.

TNF-α

TNF-α surunkali yallig‘lanish vaqtida ko‘plab metabolik va immun javoblarga ta’sir qiluvchi yallig‘lanishga oid sitokindir. Barcha peptid fraksiyalari LPS + PA musbat nazoratiga nisbatan TNF-α ishlab chiqarilishini sezilarli kamaytirgan.

Eng kuchli natija CB3 fraksiyasida ko‘rilgan va manba taxminan %75 kamayishni bildirgan.

IL-6

IL-6 kontekstga qarab ham yallig‘lanishga oid, ham tartibga soluvchi vazifa ko‘rsata oladigan pleiotrop sitokindir. Ushbu hujayra modelida LPS + PA bilan kuchli oshgan.

To‘rt gidrolizat fraksiyasining barchasi IL-6 darajasini besh baravardan ko‘proq kamaytirgan, eng kuchli javob yana CB3 da kuzatilgan.

MCP-1

Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) monotsitlarning yallig‘lanish joylariga ko‘chishini boshqaruvchi xemokindir. Surunkali metabolik yallig‘lanishda ortiqcha MCP-1 ishlab chiqarilishi to‘qimaga immun hujayralari infiltratsiyasini davom ettirishi mumkin.

Barcha fraksiyalar MCP-1 ishlab chiqarilishini kamaytirgan; CB3 taxminan ikki baravar pasayishni ko‘rsatgan.

Uch sitokinning birgalikda kamayishi nimani anglatadi?

TNF-α, IL-6 va MCP-1 ning bir tajriba tartibida bir vaqtda kamayishi faqat bitta sitokinni bevosita neytrallashdan ko‘ra kengroq transkripsion yallig‘lanish javobining bostirilishiga mos keladi.

Mualliflar ushbu naqshni NF-κB o‘qining ehtimoliy ishtiroki bilan talqin qilgan. Biroq yo‘l darajasidagi sababiy bog‘lanish tajribada bevosita ko‘rsatilmagan.

Faol peptidlarning kimligi ma’lummi?

Yo‘q. Ultrafiltratsiya faqat molekulyar massa diapazonlarini ajratgan. CB3 ning <3 kDa bo‘lishi uning tarkibidagi qaysi aniq peptid ketma-ketligi faollik uchun javobgar ekanini bildirmaydi.

Peptidlarning aminokislota ketma-ketliklari, elektr zaryadlari, N- va C-terminal xususiyatlari yoki TLR4 ga bevosita bog‘lanish affinligi ushbu tadqiqotda o‘lchanmagan.

Manba kelajakda LC-MS/MS peptid sekvenslash, molekulyar docking va eksperimental yo‘l tasdiqlashni tavsiya qiladi.

Tadqiqot Usuli va Natijalari

Eksperimental ishlov zanjiri

1. Loviya va qovoq urug‘i materialini maydalash va oqsil konsentratini tayyorlash.
2. Qovoq urug‘i unini geksan bilan yog‘sizlantirish.
3. Oqsillarni ishqoriy muhitda ekstraksiya qilish va pH 4,5 da cho‘ktirish.
4. Oqsil konsentratlarini liyofilizatsiya qilish.
5. Ultratovush oldindan ishlov guruhida oqsilga 20 kHz, %70 amplituda, 10 daqiqa ultratovush qo‘llash.
6. Pepsin bilan 2 soat va pankreatin bilan 2 soat in vitro gastrointestinal gidroliz.
7. Keyingi ultratovush guruhida fermentativ gidroliz tugagandan so‘ng xuddi shu ultratovush sharoitini qo‘llash.
8. Gidroliz darajasini OPA usuli bilan aniqlash.
9. SDS-PAGE va Tricine-SDS-PAGE bilan oqsil/peptid profillarini baholash.
10. ABTS va ORAC bilan kimyoviy antioksidant sig‘imni o‘lchash.
11. Eng samarali old-ultratovush gidrolizatlarini 3–10 kDa va <3 kDa fraksiyalariga ajratish.
12. RAW264.7 makrofaglarida yashovchanlik va NO doza skriningi.
13. 250 µg/mL bilan pre-, co- va post-treatment tajribalari.
14. NO, ROS, Nos-2, Cox-2, TNF-α, IL-6 va MCP-1 o‘lchovlari.

Gidroliz darajasi qanday o‘lchandi?

Gidroliz darajasi Nielsen va hamkasblarining o-phthaldialdehyde (OPA) usuli yordamida aniqlangan. DH oqsil zanjirlaridagi peptid bog‘larining fermentativ parchalanish darajasini ifodalaydi.

Yuqoriroq DH odatda ko‘proq peptid bog‘lari uzilganini va kichikroq peptidlar hosil bo‘lganini ko‘rsatadi; biroq yuqori DH har bir biologik faollikda avtomatik ravishda yuqori samaradorlik degani emasligi qovoq urug‘i fraksiyasi natijalarida aniq ko‘rinadi.

ABTS va ORAC o‘lchovi

ABTS va ORAC uchun Trolox standart egri chiziqlari tayyorlangan va R² qiymatlari 0,98 dan yuqori saqlangan.

ABTS standart oralig‘i 25–200 µmol/L, ORAC oralig‘i 6,25–200 µmol/L. Natijalar µmol Trolox equivalents/g protein ko‘rinishida xabar qilingan.

Hujayraviy ROS tahlili

ROS ishlab chiqarilishi 10 µM DCFH-DA yordamida baholangan. Hujayralar zond bilan 37 °C da 30 daqiqa inkubatsiya qilingan; flyuorestsensiya 485 nm qo‘zg‘alish va 530 nm emissiya to‘lqin uzunligida Cytation 5 o‘quvchi bilan o‘lchangan.

Natijalar manfiy nazorat %100 deb olinib, nisbiy ROS foizi sifatida berilgan.

NO tahlili

Hujayra kulturasi supernatantidagi NO Griess Reagent System yordamida bilvosita nitrit orqali o‘lchangan. 1,56–100 µM natriy nitrit standart egri chizig‘i ishlatilgan va natijalar µM nitrit sifatida xabar qilingan.

qPCR

Co-treatment tajribalaridan keyin total RNA ajratilgan va cDNA ga aylantirilgan. Nos-2 va Cox-2 genlari QuantStudio 3 qurilmasida qPCR orqali o‘lchangan, Ppib endogen nazorat sifatida ishlatilgan.

Nisbiy mRNA ekspressiyasi \(2^{-\Delta\Delta C_T}\) usuli bilan hisoblangan.

Ushbu usul nishon genning Ct qiymatini avval referens gen bilan normallashtiradi, keyin tajriba guruhini referens sharoit bilan taqqoslab nisbiy ekspressiya o‘zgarishini beradi. Natija mutlaq mRNA molekulalari soni emas, referensga nisbatan necha baravar o‘zgarishdir.

Sitokin tahlili

TNF-α, IL-6 va MCP-1 hujayra kulturasi supernatantlarida ELISA kitlari bilan o‘lchangan. Bu tajribalar faqat co-treatment tartibida va 250 µg/mL peptid fraksiyasi ishlatilgan holda bajarilgan.

Takror tuzilmasi va statistika

DH, ABTS va ORAC tahlillarida uch mustaqil fermentativ gidroliz protsedurasi biologik takror sifatida ishlatilgan va har bir biologik takror texnik jihatdan uch marta o‘lchangan.

Hujayraviy tajribalar turli kunlarda bajarilgan uch mustaqil RAW264.7 hujayra kulturasi bilan biologik triplikat sifatida amalga oshirilgan; har bir biologik takrorda har bir sharoit uchun texnik uchlik quduqlar ishlatilgan.

Normal taqsimot Shapiro–Wilk testi, dispersiya bir xilligi Levene testi bilan α=0,05 darajasida baholangan. Manba barcha ma’lumot to‘plamlari ushbu parametrik farazlarga mos kelganini bildiradi.

Guruhlar bir tomonlama ANOVA va Tukey ko‘p taqqoslash testi bilan tahlil qilingan, p<0,05 ahamiyatli deb qabul qilingan. Tahlillarda GraphPad Prism 10.6.1 va Minitab 22.4.0.0 ishlatilgan.

Figure 1 ning ilmiy roli

Figure 1 peptidlarning yallig‘lanish stimulusiga nisbatan vaqtlashtirilishini ko‘rsatadi. Pre-treatment modeli peptidning stimuldan oldingi ta’sirini, co-treatment bir vaqtda boshlanish ta’sirini, post-treatment esa yallig‘lanish javobi boshlanganidan keyingi ta’sirini o‘rganadi.

Manba figurasining ko‘rinadigan yorliqlarida 125 va 250 µg/mL bo‘lishiga qaramay, usul matni asosiy uch-vaqtlashtirish tajribalari bitta konsentratsiyada, 250 µg/mL da bajarilganini va Figure 4–7 izohlari ham 250 µg/mL ishlatilganini bildiradi. Manbadagi ushbu taqdimot farqi talqinda saqlanishi kerak.

Figure 2 ning ilmiy roli

SDS-PAGE bilan katta oqsillar, Tricine-SDS-PAGE bilan kichikroq peptidlar taqsimoti ko‘rinadi. Loviyada fazeolin bantlarining chidamli qolishi, qovoq urug‘ida esa yirik zaxira oqsil bantlarining kuchliroq yo‘qolishi ikki xomashyoning hazm bo‘lish farqini tushuntiradi.

Figure 2 izohida PSP va PSH “common bean protein” va “common bean hydrolysate” deb ochilishi matn bilan mos kelmaydi; tajriba konteksti PSP/PSH qovoq urug‘i oqsili/gidrolizatini ifodalashini ko‘rsatadi.

Figure 3 ning ilmiy roli

Figure 3 to‘rt peptid fraksiyasining 32,5–500 µg/mL oralig‘idagi NO doza–javobini solishtiradi. Loviyada CB3, qovoq urug‘ida esa PS10 kuchliroq profillardan birini ko‘rsatadi.

Grafik ayni paytda 250 µg/mL ning keyingi tajribalar uchun tanlanishiga eksperimental asos beradi.

Figure 4 va Figure 5 birgalikda qanday o‘qilishi kerak?

Figure 4 NO, Figure 5 ROS javobini uch xil vaqtlashtirishda ko‘rsatadi. Har ikki yakuniy ko‘rsatkich umuman peptid ishlovi bilan kamaygan bo‘lsa-da, fraksiyalar tartibi bir xil emas.

Shu sababli yallig‘lanishga qarshi faollikni faqat NO yoki faqat ROS orqali ta’riflash to‘liq bo‘lmaydi. Manba bu ikki o‘lchovni bir-birini to‘ldiruvchi biologik yakunlar sifatida ishlatgan.

Figure 6 nimani ko‘rsatadi?

Figure 6 co-treatment paytida Nos-2 va Cox-2 mRNA darajalarini solishtiradi. LPS + PA ikkala genni ham kuchli oshirgan bo‘lsa, barcha peptid fraksiyalari ekspressiyani kamaytirgan.

CB3 ikkala genda ham %70 dan yuqori bostirishni ko‘rsatgan. Bu natija hujayraviy NO o‘zgarishi kamida qisman gen ekspressiyasi darajasidagi o‘zgarish bilan birga yuz berganini qo‘llab-quvvatlaydi.

Figure 7 nimani ko‘rsatadi?

Figure 7 TNF-α, IL-6 va MCP-1 oqsil darajalarini ELISA bilan solishtiradi. Uchala yallig‘lanishga oid mediatorning barcha peptid fraksiyalarida kamayishi keng qamrovli yallig‘lanish javobi bostirilishiga mos keladi.

CB3 uchala sitokinda ham eng izchil kuchli profilni ko‘rsatgan.

Tadqiqotning kuchli tomonlari

• Ultratovushni oldin va keyin qo‘llash bir xil o‘simlik oqsili manbalarida bevosita solishtirilgan.
• Loviya va qovoq urug‘ining turli oqsil tuzilmalari bir xil eksperimental doirada baholangan.
• Kimyoviy antioksidant sig‘im ABTS va ORAC bo‘yicha ikki xil prinsip bilan o‘lchangan.
• Gidrolizatlar molekulyar massaga qarab fraksiyalangan va biologik faollik fraksiya darajasida tekshirilgan.
• Hujayraviy javob faqat NO bilan emas, ROS, mRNA va uch xil sitokin bilan birgalikda baholangan.
• Peptidlarning yallig‘lanish stimulusiga nisbatan vaqtlashtirilishi uch alohida modelda o‘rganilgan.
• Biologik takrorlar mustaqil kunlarda bajarilgan va texnik takrorlar bilan qo‘llab-quvvatlangan.

Tadqiqotning asosiy cheklovlari

• Tadqiqot faqat in vitro hujayra modelidir; odamlarda yoki hayvonlarda terapevtik samaradorlikni ko‘rsatmaydi.
• Faol peptidlarning aminokislota ketma-ketliklari LC-MS/MS bilan aniqlanmagan.
• Peptidlarning elektr zaryadi va haqiqiy tuzilma–faollik munosabati aniqlanmagan.
• TLR4 ga bevosita bog‘lanish yoki LPS neytrallash tajribada o‘lchanmagan.
• NF-κB/MAPK fosforillanishi Western blot bilan tasdiqlanmagan.
• NF-κB reporter assay bajarilmagan.
• NRF2 yadroviy translokatsiyasi bevosita baholanmagan.
• 250 µg/mL in vitro konsentratsiyani oddiy ovqatlanish orqali ichak yoki qon aylanishida hosil qilish mumkinmi, noma’lum.
• Peptidlarning gastrointestinal barqarorligi va ichak o‘tkazuvchanligi baholanmagan.
• Plazma barqarorligi va farmakokinetik ma’lumotlar mavjud emas.
• Sanoat miqyosiga kattalashtirish va iqtisodiy tatbiq etish sinovdan o‘tkazilmagan.
• Ultratovush chastotasi, amplitudasi va davomiyligining keng optimallashtirish xaritasi tuzilmagan.

Tadqiqot qo‘llab-quvvatlaydigan xulosalar

Ultratovushni fermentativ gidrolizdan oldin qo‘llash ishlatilgan tajriba sharoitlarida loviya va qovoq urug‘i oqsillarining gidroliz darajasini oshirgan.

Ultratovushni oldin va keyin qo‘llash gidrolizatlarning ABTS va ORAC bilan o‘lchangan antioksidant sig‘imini umuman oshirgan; oldindan qo‘llash ayniqsa loviya va qovoq urug‘i ORAC natijalarida kuchliroq bo‘lgan.

Ultratovush oldindan ishlovidan olingan peptid fraksiyalari RAW264.7 hujayralarida LPS + palmitik kislota sababli NO va ROS ishlab chiqarilishini kamaytirgan.

Peptid fraksiyalari Nos-2 va Cox-2 mRNA sini hamda TNF-α, IL-6 va MCP-1 ishlab chiqarilishini kamaytirgan.

CB3 fraksiyasi hujayraviy yallig‘lanishga qarshi yakunlarning ko‘pchiligida eng kuchli va izchil fraksiyalardan biri bo‘lgan.

Peptid hajmi bilan biologik faollik o‘rtasidagi munosabat oqsil manbasi va o‘lchanayotgan yakuniy ko‘rsatkichga bog‘liq.

Tadqiqot qo‘llab-quvvatlamaydigan xulosalar

Tadqiqot loviya yoki qovoq urug‘i peptidlari odamlarda semizlik, diabet yoki yog‘li jigar kasalligini davolashini ko‘rsatmaydi.

250 µg/mL hujayra kulturasi konsentratsiyasiga oddiy ovqatlanish bilan inson to‘qimalarida erishish mumkinligi ko‘rsatilmagan.

CB3 yoki boshqa fraksiyalarning NF-κB, MAPK, NRF2 yoki TLR4 bilan bevosita molekulyar o‘zaro ta’siri isbotlanmagan.

Qaysi aniq peptid ketma-ketliklari antioksidant yoki yallig‘lanishga qarshi faollik uchun javobgar ekani noma’lum.

Kichikroq molekulyar massa har doim yuqoriroq biologik faollik berishi ko‘rsatilmagan.

Ultratovush oldindan ishlovi sanoat miqyosida iqtisodiy yoki texnik jihatdan eng yaxshi jarayon ekani ko‘rsatilmagan.

Manba va Usul Haqida Izoh

Asl tadqiqot: Ultrasound-Assisted Enzymatic Hydrolysates from Common Bean and Pumpkin Seed Proteins: Antioxidant and Anti-Inflammatory Properties

Mualliflar: Erick Huerta-Rodriguez; Omar Sanchez-Jimenez; Cristina Chuck-Hernández; Margarita L. Martinez-Fierro; Idalia Garza-Veloz; Diana L. Cárdenas-Chávez; Cesar A. Ponce-Ponce de Leon; Maria del Refugio Rocha-Pizaña.

Mas’ul muallif: Maria del Refugio Rocha-Pizaña.

Muassasalar: Escuela de Ingenieria y Ciencias, Tecnologico de Monterrey, Monterrey, Mexico; Molecular Medicine Laboratory, Unidad Academica de Medicina Humana y C.S, Universidad Autonoma de Zacatecas, Zacatecas, Mexico.

Jurnal: Antioxidants.

Nashriyot: MDPI, Basel, Switzerland.

Nashr ma’lumoti: 2026; jild 15; son 5; maqola 578. Nashr sanasi: 3 Mayıs 2026.

DOI: 10.3390/antiox15050578

Manba turi: Taqrizdan o‘tgan, ochiq kirishli original eksperimental tadqiqot maqolasi; oziq-ovqat oqsili texnologiyasi va in vitro makrofag modeli.

Litsenziya: Creative Commons Attribution (CC BY).

O‘simlik materiali: Organik Bayo loviyasi va qovoq urug‘i; Tlaxcala, Mexico.

Oqsil gidrolizi: Pepsin va pankreatin; har bir bosqichda ferment:substrat 1:20 og‘irlik/og‘irlik; pepsin pH 2 va 37 °C da 2 soat; keyin pH 7,5 va pankreatin bilan 2 soat; 75 °C da 20 daqiqa ferment inaktivatsiyasi.

Ultratovush: Branson 450S-Digital Sonifier; 20 kHz; %70 amplituda; 10 daqiqa; 25 soniya yoqilgan/25 soniya o‘chirilgan; muz vannasi.

Peptid fraksiyalari: Loviya CB10 (3–10 kDa), CB3 (<3 kDa); qovoq urug‘i PS10 (3–10 kDa), PS3 (<3 kDa).

Antioksidant tahlil: ABTS va ORAC; natijalar µmol Trolox equivalents/g protein sifatida xabar qilingan.

Hujayra modeli: RAW264.7 sichqon makrofaglari, passage 10.

Yallig‘lanish stimuli: LPS 100 ng/mL + palmitik kislota 100 µM.

Asosiy hujayraviy peptid konsentratsiyasi: 250 µg/mL.

Hujayraviy yakunlar: Hujayra yashovchanligi, nitrit/NO, DCFH-DA ROS, Nos-2 va Cox-2 mRNA, TNF-α, IL-6 va MCP-1.

qPCR: \(2^{-\Delta\Delta C_T}\) usuli; Ppib endogen nazorat.

Statistika: Shapiro–Wilk normallik testi; Levene dispersiya bir xilligi testi; bir tomonlama ANOVA va Tukey post hoc; p<0,05.

Takror tuzilmasi: Uch mustaqil biologik takror; har bir biologik takrorda texnik triplikatlar.

Dasturiy ta’minot: GraphPad Prism 10.6.1 va Minitab 22.4.0.0.

Supplementary material: Figure S1 to‘rt peptid fraksiyasining RAW264.7 hujayra yashovchanligiga ta’sirini ko‘rsatadi.

Moliyalashtirish: Manbaning Funding bo‘limi tashqi moliyalashtirish olinmaganini bildiradi.

Ko‘mak va minnatdorchilik: Tecnologico de Monterrey laboratoriya materiali ko‘magi; organik loviya va qovoq urug‘ini taqdim etgan mahalliy ishlab chiqaruvchi/tashkilotlar; SECIHTI tadqiqot stipendiyasi No. 1049616.

Etika qo‘mitasi: Qo‘llanilmaydi.

Axborotli rozilik: Qo‘llanilmaydi.

Ma’lumotlar mavjudligi: Original hissalar maqola va qo‘shimcha materialda taqdim etilgan; qo‘shimcha savollar mas’ul muallifga yo‘naltirilishi mumkin.

Manfaatlar to‘qnashuvi: Mualliflar manfaatlar to‘qnashuvini bildirmagan.

Muallif hissalari: Konseptuallashtirish Maria del Refugio Rocha-Pizaña, Cristina Chuck-Hernández, Margarita L. Martinez-Fierro va Idalia Garza-Veloz; metodologiya Erick Huerta-Rodriguez va Maria del Refugio Rocha-Pizaña; validatsiya va formal tahlil Erick Huerta-Rodriguez; tadqiqot Erick Huerta-Rodriguez va Omar Sanchez-Jimenez; dastlabki qoralama Erick Huerta-Rodriguez; nazorat, loyiha boshqaruvi va moliyalashtirishni olish Maria del Refugio Rocha-Pizaña tomonidan amalga oshirilgan.

Manbadagi nomlash izohi: Qovoq turi nomi abstract da “Cucurbita argyoesperma”, kirish va usulda “Cucurbita argyosperma” tarzida berilgan. Verianla bu farqni manba ichidagi imlo nomuvofiqligi sifatida saqlaydi.

Manba Figure 2 izohi: Figure 2 izohida PSP va PSH xato ravishda “common bean” deb ochilgandek ko‘rinadi; tajriba matni ularning qovoq urug‘i oqsili va gidrolizati ekanini aniq ko‘rsatadi.

Figure 1 usul izohi: Vizualda 125 va 250 µg/mL yorliqlari bo‘lishiga qaramay, Bo‘lim 2.8.3 va Figure 4–7 asosiy tajribalarda 250 µg/mL ishlatilganini bildiradi. Verianla asosiy hujayraviy natijalarda 250 µg/mL qiymatini asos qilib oladi va vizualdagi farqni yashirmaydi.

Asosiy mexanistik cheklov: NF-κB/MAPK va NRF2 yo‘llarining ishtiroki quyi oqim natijalaridan kelib chiqib taxmin qilinadi; bevosita pathway faollashtirish tajribalari bajarilmagan.

Peptid kimligi cheklovi: Fraksiyalar faqat molekulyar massa bo‘yicha ta’riflangan. Biofaol ketma-ketliklar, aminokislota tarkibi va retseptor bilan bog‘lanish mexanizmlari bevosita aniqlanmagan.

Translyatsiya cheklovi: Gastrointestinal barqarorlik, Caco-2 ga o‘xshash intestinal transport, plazma barqarorligi, farmakokinetika va og‘iz orqali qabul qilingan peptidlar 250 µg/mL ekvivalent to‘qima ta’siriga yetadimi-yo‘qmi sinovdan o‘tkazilmagan.

Sanoat cheklovi: Ultratovush oldindan ishlovi laboratoriya darajasida afzallik ko‘rsatgan; chastota, amplituda, davomiylik va miqyosni kattalashtirishning iqtisodiy optimallashtirilishi yakunlanmagan.

Verianla bayon qilish usuli: Ushbu mazmun faqat abstract yoki conclusion tarjimasi emas. Oqsil ekstraksiyasi, gastrointestinal gidroliz, ultratovushni oldin/keyin qo‘llash, molekulyar massa fraksiyalash, SDS-PAGE/Tricine-SDS-PAGE, DH, ABTS, ORAC, hujayra yashovchanligi, NO, ROS, uch vaqtlashtirish tartibi, qPCR, sitokin ELISA si, statistika va mexanistik cheklovlar alohida ilmiy qatlamlar sifatida qayta tuzilgan.

Sog‘liq talqini cheklovi: Natijalar laboratoriya sharoitidagi o‘simlik oqsili gidrolizatlariga tegishli bo‘lib, loviya yoki qovoq urug‘i iste’moli odamlarda muayyan yallig‘lanish kasalliklarini davolashini ko‘rsatmaydi.