Гидролизати ферментативии сафеда, ки бо ултрасадо дастгирӣ мешавад, омехтаи пептидҳост, ки дар он таҷзияи сафедаҳои растанӣ ба пептидҳои хурдтар тавассути ферментҳо бо кавитатсияи ултрасадоӣ тақвият дода мешавад. Ин таҳқиқоти in vitro омӯхтааст, ки истифодаи ултрасадо ба сафедаҳои лӯбиё ва тухми каду пеш ё пас аз гидролизи ферментативӣ дараҷаи гидролиз ва қобилияти антиоксидантиро чӣ гуна тағйир медиҳад; инчунин оё фраксияҳои пептидии бадастомада посухи илтиҳобӣ ва оксидативиро дар макрофагҳои RAW264.7, ки бо LPS ва кислотаи палмитинӣ ангезиш ёфтаанд, коҳиш медиҳанд ё не.

Коркарди пешакии ултрасадоӣ дар ҳар ду манбаи сафедаи растанӣ баландтарин дараҷаи гидролизро ба вуҷуд овард. Дар гидролизати лӯбиё дараҷаи гидролиз аз %28,64 дар гурӯҳи назоратӣ то %34,06 дар гурӯҳи ултрасадои пешакӣ ва дар тухми каду аз %63,06 то %70,87 афзуд. Қобилияти антиоксидантии ABTS ва ORAC дар гидролизати лӯбиё низ бо коркарди пешакӣ ба таври назаррас зиёд шуд. Дар тухми каду баландтарин ORAC дар гурӯҳи ултрасадои пешакӣ мушоҳида шуд, дар ҳоле ки гурӯҳҳои ултрасадои пешакӣ ва баъдӣ аз рӯи ABTS аз ҷиҳати оморӣ аз ҳам фарқ накарданд.

Гидролизатҳое, ки бо коркарди пешакии ултрасадоӣ ҳосил шуданд, ба ду фраксияи вазни молекулавӣ, 3–10 kDa ва <3 kDa, ҷудо карда шуданд. Дар ҳуҷайраҳои RAW264.7 ҳамаи фраксияҳо дар доираи 32,5–500 µg/mL қобилияти зиндамонии ҳуҷайраро зиёда аз %95 нишон доданд ва истеҳсоли NO-ро, ки аз LPS + кислотаи палмитинӣ ба вуҷуд омада буд, вобаста ба доза пахш карданд. Дар таҷрибаҳои минбаъда консентратсияи 250 µg/mL истифода шуд.

Дар таҷрибаҳое, ки додани пептидҳоро пеш аз ангезандаи илтиҳобӣ, ҳамзамон бо он ё баъд аз оғоз шудани он муқоиса карданд, ҳамаи фраксияҳо истеҳсоли NO ва ROS-ро нисбат ба назорати мусбат коҳиш доданд. Дар маҷмӯъ, посухи пурқувваттарини зиддиилтиҳобӣ ҳангоми истифодаи ҳамзамон мушоҳида шуд ва CB3, фраксияи <3 kDa-и лӯбиё, дар бисёр натиҷаҳо фарқ карда истод. CB3 сатҳи mRNA-и Nos-2 ва Cox-2-ро зиёда аз %70 коҳиш дод, истеҳсоли TNF-α-ро тақрибан %75 паст кард ва ба IL-6 ва MCP-1 низ яке аз таъсирҳои пурқувваттаринро нишон дод.

Бо вуҷуди ин, таҳқиқот роҳҳои NF-κB/MAPK ё NRF2-ро мустақиман чен накардааст. Иштироки ин роҳҳо аз тағйироти NO, ROS, Nos-2/Cox-2 ва ситокинҳо, инчунин аз адабиёти қаблӣ бароварда мешавад. Пайдарпаии пептидҳои фаъол низ бо LC-MS/MS муайян нашудааст. Аз ин рӯ, натиҷаҳо далели лабораторӣ дар бораи фаъолияти эҳтимолии биологии зиддиилтиҳобии пептидҳои аз ғизо ҳосилшуда мебошанд; онҳо нишон намедиҳанд, ки пас аз истеъмоли даҳонӣ дар одамон ҳамон самаранокӣ ба вуҷуд меояд.

Масъалаи асосии таҳқиқот

Илтиҳоби музмини дараҷаи паст, ки бо фарбеҳӣ алоқаманд аст, ҳолати мураккаби биологист, ки дар он ангезандаҳое мисли липополисахаридҳо ва кислотаҳои чарбии сершуда метавонанд роҳҳои сигналии илтиҳобиро дар ҳуҷайраҳои иммунӣ доимо фаъол нигоҳ доранд. Дар макрофагҳо ин посух метавонад бо болоравии NO, ROS, ферментҳои проилтиҳобӣ ва ситокинҳо ҳамроҳ бошад.

Баъзе пептидҳои кӯтоҳе, ки ҳангоми гидролизи ферментативии сафедаҳои растанӣ озод мешаванд, метавонанд фаъолияти биологии антиоксидантӣ ё зиддиилтиҳобӣ нишон диҳанд. Аммо самаранокии гидролиз аз хусусиятҳое мисли то кадом андоза барои фермент кушода будани сохтори сафеда, агрегатсияи сафеда ва кофӣ будани тамоси фермент–субстрат вобаста аст.

Саволи асосии технологии ин таҳқиқот он аст, ки оё кавитатсияи ултрасадоӣ бо кушодани сохтори сафеда пеш аз гидролиз дастрасии ферментҳоро ба субстрат зиёд мекунад ё не. Саволи дуюм ин аст, ки оё пептидҳои ҳосилшуда на танҳо дар санҷишҳои кимиёвии антиоксидантӣ, балки дар модели макрофагии илтиҳобӣ низ посухи биологӣ ба вуҷуд меоранд.

Чаро ултрасадо метавонад ба гидролизи ферментативӣ кӯмак кунад?

Ҳангоми истифодаи ултрасадо дар муҳити моеъ ҳубобчаҳои кавитатсионӣ метавонанд пайдо шуда, калон шаванд ва баъд фурӯ резанд. Манбаъ мефаҳмонад, ки ин микромуҳитҳо метавонанд мутақобилаи сафеда–сафедаро вайрон кунанд, сохторҳои дуюмӣ ва сеюмини сафедаҳоро боз намоянд, агрегатҳоро пароканда созанд ва масоҳати сатҳеро, ки фермент ба он дастрасӣ дорад, зиёд кунанд.

Ин тағйироти физикӣ ферменти нави протеазӣ эҷод намекунанд. Таъсири асосӣ он аст, ки субстрати мавҷудаи сафеда барои ферментҳое мисли пепсин ва панкреатин дастрастар мешавад.

Чаро Истифодаи Ултрасадо Пеш Аз Гидролизи Ферментативӣ Самараноктар Буд?

Тибқи натиҷаҳои манбаъ, ултрасадои пешакӣ бо тағйир додани сохтори ҳанӯз таҷзиянашудаи сафеда ва агрегатҳо пеш аз тамос бо ферментҳо дастрасии фермент–субстратро зиёд кард; ултрасадои баъдӣ бошад, пас аз он истифода шуд, ки қисми зиёди буришҳои ферментативӣ аллакай анҷом ёфта буданд, бинобар ин саҳми иловагии он ба дараҷаи гидролиз маҳдудтар монд.

Манбаъҳои сафеда

Дар таҳқиқот лӯбиёи органикии навъи Bayo ва тухми каду истифода шудаанд. Мавод аз истеҳсолкунандагони маҳаллӣ дар минтақаи Tlaxcala, Mexico гирифта шудааст.

Лӯбиё ва тухми каду майда карда шуда, аз элаки 0,18 mm гузаронида шуданд. Орди тухми каду барои дур кардани липидҳо бо гексан дар таносуби вазн/ҳаҷм 1:20, дар 60 °C барои 1 соат коркард шуд.

Ҳангоми экстраксияи сафеда ордҳо дар об бо таносуби вазн/ҳаҷм 1:10 суспензия шуданд. pH барои лӯбиё ба 8 ва барои тухми каду ба 11 танзим карда шуд; суспензияҳо дар 25 °C барои 1 соат омехта шуданд. Сентрифугакунии аввал дар 5000×g барои 15 дақиқа гузаронида шуд, сипас супернатант ба pH 4,5 расонида шуда, дар 10.000×g барои 15 дақиқа боз сентрифуга шуд. Таҳшинҳои сафеда дар −50 °C ва 0,1 mBar барои 48 соат лиофилизатсия шуданд.

Гидролизи ферментативии меъдаю рӯда

Консентратҳои сафедаи лӯбиё ва тухми каду дар об бо таносуби вазн/ҳаҷм 1:20 паҳн карда шуда, pH бо 1 M HCl ба 2 танзим шуд.

Пепсин бо таносуби фермент:субстрат 1:20 вазн/вазн илова ва дар 37 °C барои 2 соат инкубатсия шуд. Сипас pH ба 7,5 баланд карда шуда, пепсин ғайрифаъол гардид, панкреатини аз хук ҳосилшуда боз бо таносуби фермент:субстрат 1:20 илова ва барои 2 соати дигар инкубатсия шуд.

Ҳазм бо гарм кардан дар 75 °C барои 20 дақиқа боздошта шуд, намунаҳо дар 16.000×g барои 10 дақиқа сентрифуга ва супернатантҳои бадастомада лиофилизатсия шуданд.

Шароити ултрасадо

Дар коркарди пешакӣ ултрасадо ба консентрати сафедаи табиӣ пеш аз илова кардани пепсин ва панкреатин истифода шуд. Дар коркарди баъдӣ ултрасадо ба гидролизате истифода шуд, ки баъд аз анҷоми ҳазми пепсин–панкреатин ба даст омада буд.

Лӯбиё ва тухми каду ба як шакл гидролиз нашуданд

Дар натиҷаҳои SDS-PAGE зервоҳидҳои фазаолини тақрибан 35–48 kDa дар сафедаи лӯбиё пас аз гидролиз ба таври назаррас боқӣ монданд. Манбаъ қайд мекунад, ки фазаолин қисми муҳими сафедаҳои умумии лӯбиёро ташкил медиҳад ва ба ҳазми меъдаю рӯда тобовар аст.

Баръакс, бандҳои асосии 11S globulin ва 2S albumin-и сафедаҳои тухми каду пас аз ҳазм то андозаи зиёд аз байн рафтанд. Дараҷаи гидролизи гидролизати тухми каду нисбат ба лӯбиё хеле баландтар буд, ки бо ин фарқи сохтори сафеда мувофиқат мекунад.

Tricine-SDS-PAGE нишон дод, ки дар ҳар ду манбаъ пептидҳои камтар аз 10 kDa ҳосил шудаанд.

Оё ABTS ва ORAC як чизро чен мекунанд?

Не. Манбаъ қобилияти антиоксидантиро бо ду принсипи гуногуни кимиёвӣ арзёбӣ кардааст. Санҷиши ABTS асосан ченкунии қобилияти антиоксидантиро бар асоси интиқоли электрон ифода мекунад, дар ҳоле ки ORAC қобилияти безарарсозии радикалҳоро, ки бо интиқоли атоми гидроген алоқаманд аст, нишон медиҳад.

Истифодаи ҳар ду санҷиш имкон медиҳад, ки хусусияти антиоксидантии омехтаи пептид танҳо аз рӯи як навъи реаксия арзёбӣ нашавад. Аммо баланд будани қимати ABTS ё ORAC нишон намедиҳад, ки дар бадани инсон таъсири клиникии антиоксидантии ба ҳамон андоза ба вуҷуд меояд.

Фраксияҳои пептидӣ чӣ гуна сохта шуданд?

Барои таҷрибаҳои ҳуҷайравӣ гидролизатҳои лӯбиё ва тухми каду, ки бо ултрасадои пешакӣ коркард шуда буданд, тавассути ултрафилтратсия аз рӯи вазни молекулавӣ ҷудо шуданд:

• CB10: фраксияи лӯбиёи 3–10 kDa
• CB3: фраксияи лӯбиёи <3 kDa
• PS10: фраксияи тухми кадуи 3–10 kDa
• PS3: фраксияи тухми кадуи <3 kDa

Оё Пептидҳои Хурдтар Ҳамеша Таъсири Қавитари Зиддиилтиҳобӣ Нишон Доданд?

Не. Дар лӯбиё фраксияи CB3-и <3 kDa дар бисёр натиҷаҳои ҳуҷайравӣ фраксияи пурқувваттарин буд, дар ҳоле ки дар тухми каду аз нигоҳи пахши NO фраксияи 3–10 kDa PS10 нисбат ба PS3 қавитар буд; ин натиҷа нишон медиҳад, ки самаранокии биологӣ на танҳо ба вазни молекулавӣ, балки ба пайдарпаии пептид, таркиби аминокислотаҳо ва хусусиятҳои сохторӣ низ вобаста аст.

Модели макрофагии RAW264.7

Ҳуҷайраҳои макрофагии муш RAW264.7 дар муҳити DMEM/F12 бо %10 FBS ва %1 пенисиллин–стрептомицин, дар 37 °C, %5 CO₂ ва %95 ҳавои намнок парвариш карда шуданд. Дар ҳамаи таҷрибаҳои ҳуҷайравӣ passage 10 истифода шуд.

Дар модели илтиҳобӣ ҳуҷайраҳо бо 100 ng/mL LPS ва 100 µM кислотаи палмитинӣ ангезиш дода шуданд. Истифодаи ҳамзамони ин ду ангезанда барои тақлид кардани фишори эндотоксинӣ ва кислотаи чарбии сершудаи вобаста ба фарбеҳӣ дар сатҳи макрофаг пешбинӣ шудааст.

Скрининги аввалияи доза

Фраксияҳои гидролизат дар доираи 32,5–500 µg/mL санҷида шуданд. Дар ҳамаи фраксияҳо зиндамонии ҳуҷайра зиёда аз %95 боқӣ монд.

Назорати мусбати LPS + кислотаи палмитинӣ истеҳсоли NO-ро нисбат ба назорати манфӣ тақрибан чор маротиба зиёд кард. Ҳамаи чаҳор фраксияи пептидӣ истеҳсоли NO-ро бо афзоиши доза кам карданд.

Азбаски барои CB10, CB3 ва PS10 ҳангоми боло бурдани консентратсия аз 250 µg/mL то 500 µg/mL коҳиши иловагии назаррас дида нашуд, дар таҷрибаҳои асосии вақт 250 µg/mL истифода шуд.

Pre-, co- ва post-treatment чӣ маъно доранд?

Натиҷаҳои NO

Дар ҳар се тартиби вақт фраксияҳои пептидӣ истеҳсоли NO-ро нисбат ба назорати мусбати LPS + PA ба таври назаррас кам карданд.

Дар тартиби pre-treatment CB3 ва PS10 қавитарин пахши NO-ро нишон доданд. Ин натиҷа нишон медиҳад, ки фраксияи якхелаи вазни молекулавӣ барои лӯбиё ва тухми каду беҳтарин набуд.

Ҳангоми co-treatment ҳамаи фраксияҳо пахши қавӣ нишон доданд ва CB3 посухи равшантаринро ба вуҷуд овард.

Дар тартиби post-treatment фраксияҳо ба истиснои PS3 сатҳи NO-ро то сатҳи назорати манфӣ поён бурданд. Ин натиҷа нишон медиҳад, ки пептидҳо метавонанд на танҳо пеш аз ангезандаи илтиҳобӣ, балки пас аз оғоз шудани посух низ in vitro самаранок бошанд.

Натиҷаҳои ROS

Флуорессенсияи DCFH-DA нишондиҳандаи ғайримустақими бори оксидантӣ дар дохили ҳуҷайра мебошад. LPS + PA дар ҳамаи тартибҳои вақт сигнали ROS-ро зиёд кард.

Ҳамаи фраксияҳои пептидӣ истеҳсоли ROS-ро нисбат ба назорати мусбат ба таври назаррас пахш карданд. Ҳангоми pre-treatment байни таъсири фраксияҳо ба ROS фарқи равшан мушоҳида нашуд.

Ҳангоми co-treatment CB3 яке аз фраксияҳое буд, ки қавитарин пахши ROS-ро нишон дод. Манбаъ ҳамчунин муҳокима мекунад, ки фраксияҳои хурдтари пептидӣ мисли CB3 ва PS3 метавонанд дар пахши ROS-и дохилиҳуҷайравӣ нисбат ба фраксияҳои калонтар қавитар бошанд.

Ҳангоми post-treatment ҳамаи чаҳор фраксия сатҳи ROS-ро аз назорати мусбат ва, тибқи баёни манбаъ, аз назорати манфӣ ҳам пасттар карданд.

NO ва ROS як натиҷаи биологӣ нестанд

NO дар ин модел истеҳсоли навъҳои нитрогении илтиҳобиро, ки бо фаъолияти NOS-2 алоқаманданд, ифода мекунад; флуорессенсияи DCFH-DA бошад сигнали вобаста ба бори оксидативии дохили ҳуҷайраро нишон медиҳад. Қавӣ будани як фраксияи пептидӣ нисбат ба NO маънои онро надорад, ки он бояд барои ROS низ бо ҳамон тартиб муассир бошад.

Дар ҳақиқат, дар ҳоле ки фраксияи PS10-и тухми каду дар пахши NO фарқ карда истод, қавӣ будани фраксияи хурдтари PS3 дар баъзе муқоисаҳои ROS нишон медиҳад, ки механизми амал вобаста ба андозаи пептид метавонад фарқ кунад.

Чаро Nos-2 ва Cox-2 чен карда шуданд?

Nos-2 синтазаи оксиди нитрикии индуксишавандаро рамзгузорӣ мекунад ва яке аз манбаъҳои асосии истеҳсоли баланди NO дар шароити илтиҳобӣ мебошад. Cox-2 бошад циклооксигеназаи индуксишавандаро рамзгузорӣ мекунад, ки дар синтези простагландинҳои вобаста ба илтиҳоб иштирок мекунад.

Ангезиши LPS + PA mRNA-и Nos-2-ро нисбат ба ҳуҷайраҳои ангезишнаёфта 10,5 маротиба ва mRNA-и Cox-2-ро тақрибан 7 маротиба зиёд кард.

CB3 экспрессияи ин ду генро зиёда аз %70 коҳиш дод. CB10, PS10 ва PS3 низ ҳар ду генро зиёда аз %35 пахш карданд.

Ин натиҷа нишон медиҳад, ки камшавии NO танҳо аз безарарсозии кимиёвии NO иборат нест ва ферментҳои илтиҳобӣ низ дар сатҳи транскрипсия тағйир ёфтаанд.

Оё Роҳҳои NF-κB/MAPK ва NRF2 Дар Ин Таҳқиқот Мустақиман Исбот Шуданд?

Не. Тағйироти Nos-2, Cox-2, NO, ROS ва ситокинҳо бо пахши NF-κB/MAPK ва посухи антиоксидантии вобаста ба NRF2 мувофиқат мекунанд, аммо азбаски таҳқиқот сафедаҳои фосфорилатсияшудаи роҳ, фаъолияти NF-κB reporter ё транслокатсияи ҳастаии NRF2-ро мустақиман чен накардааст, ин механизмҳо бояд ҳамчун гипотезаи дастгиришуда арзёбӣ шаванд, на ҳамчун роҳи молекулавии тасдиқшуда.

TNF-α

TNF-α ситокини проилтиҳобист, ки ҳангоми илтиҳоби музмин ба бисёр посухҳои метаболикӣ ва иммунӣ таъсир мерасонад. Ҳамаи фраксияҳои пептидӣ истеҳсоли TNF-α-ро нисбат ба назорати мусбати LPS + PA ба таври назаррас коҳиш доданд.

Қавитарин натиҷа дар фраксияи CB3 дида шуд ва манбаъ коҳиши тақрибан %75-ро гузориш кардааст.

IL-6

IL-6 ситокини плейотропӣ мебошад, ки вобаста ба контекст метавонад ҳам вазифаи проилтиҳобӣ ва ҳам танзимкунанда дошта бошад. Дар ин модели ҳуҷайравӣ он бо LPS + PA ба таври қавӣ зиёд шуд.

Ҳамаи чаҳор фраксияи гидролизат сатҳи IL-6-ро зиёда аз панҷ маротиба коҳиш доданд ва қавитарин посух боз дар CB3 мушоҳида шуд.

MCP-1

Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) кемокинест, ки муҳоҷирати моноцитҳоро ба минтақаҳои илтиҳоб равона мекунад. Дар илтиҳоби музмини метаболикӣ истеҳсоли аз ҳад зиёди MCP-1 метавонад инфилтратсияи ҳуҷайраҳои иммунӣ ба бофтаро давом диҳад.

Ҳамаи фраксияҳо истеҳсоли MCP-1-ро коҳиш доданд; CB3 коҳиши тақрибан дукарата нишон дод.

Коҳиши ҳамзамони се ситокин чӣ маъно дорад?

Коҳиши ҳамзамони TNF-α, IL-6 ва MCP-1 дар як тартиби таҷриба бо пахши васеътари посухи транскрипсионии илтиҳобӣ мувофиқат мекунад, на танҳо бо безарарсозии мустақими як ситокин.

Муаллифон ин намунаро бо иштироки эҳтимолии меҳвари NF-κB шарҳ додаанд. Аммо робитаи сабабӣ дар сатҳи роҳ ба таври мустақим таҷрибавӣ нишон дода нашудааст.

Оё шахсияти пептидҳои фаъол маълум аст?

Не. Ултрафилтратсия танҳо диапазонҳои вазни молекулавиро ҷудо кардааст. <3 kDa будани CB3 нишон намедиҳад, ки кадом пайдарпаии мушаххаси пептидӣ дар дохили он барои фаъолият масъул аст.

Пайдарпаии аминокислотаҳо, зарядҳои барқӣ, хусусиятҳои N- ва C-терминалӣ ё аффинитети пайвастшавии мустақим ба TLR4 дар ин таҳқиқот чен нашудаанд.

Манбаъ барои оянда пайдарпаисозии пептидӣ бо LC-MS/MS, molecular docking ва тасдиқи таҷрибавии роҳҳоро пешниҳод мекунад.

Усул ва Натиҷаҳои Таҳқиқот

Занҷираи марҳилаҳои таҷрибавӣ

1. Майда кардани маводи лӯбиё ва тухми каду ва омода кардани консентрати сафеда.
2. Равғанзудоии орди тухми каду бо гексан.
3. Экстраксияи сафедаҳо дар муҳити ишқорӣ ва таҳшинкунӣ дар pH 4,5.
4. Лиофилизатсияи консентратҳои сафеда.
5. Дар гурӯҳи коркарди пешакии ултрасадоӣ истифодаи ултрасадои 20 kHz, амплитудаи %70, барои 10 дақиқа ба сафеда.
6. Гидролизи gastrointestinal-и in vitro бо пепсин барои 2 соат ва панкреатин барои 2 соат.
7. Дар гурӯҳи ултрасадои баъдӣ истифодаи ҳамон шароити ултрасадо пас аз анҷоми гидролизи ферментативӣ.
8. Муайян кардани дараҷаи гидролиз бо усули OPA.
9. Арзёбии профилҳои сафеда/пептид бо SDS-PAGE ва Tricine-SDS-PAGE.
10. Чен кардани қобилияти кимиёвии антиоксидантӣ бо ABTS ва ORAC.
11. Ҷудо кардани гидролизатҳои самараноктарини ултрасадои пешакӣ ба фраксияҳои 3–10 kDa ва <3 kDa.
12. Скрининги дозаи зиндамонӣ ва NO дар макрофагҳои RAW264.7.
13. Таҷрибаҳои pre-, co- ва post-treatment бо 250 µg/mL.
14. Ченкуниҳои NO, ROS, Nos-2, Cox-2, TNF-α, IL-6 ва MCP-1.

Дараҷаи гидролиз чӣ гуна чен карда шуд?

Дараҷаи гидролиз бо истифода аз усули o-phthaldialdehyde (OPA)-и Nielsen ва ҳамкоронаш муайян карда шуд. DH дараҷаи таҷзияи ферментативии пайвандҳои пептидиро дар занҷирҳои сафеда ифода мекунад.

DH-и баландтар одатан нишон медиҳад, ки пайвандҳои бештари пептидӣ шикаста ва пептидҳои хурдтар ҳосил шудаанд; аммо натиҷаҳои фраксияҳои тухми каду равшан нишон медиҳанд, ки DH-и баландтар дар ҳар фаъолияти биологӣ ба таври худкор маънои самаранокии баландтарро надорад.

Ченкунии ABTS ва ORAC

Барои ABTS ва ORAC хатҳои стандартии Trolox омода ва қиматҳои R² аз 0,98 боло нигоҳ дошта шуданд.

Диапазони стандартии ABTS 25–200 µmol/L ва диапазони ORAC 6,25–200 µmol/L буд. Натиҷаҳо ҳамчун µmol Trolox equivalents/g protein гузориш шуданд.

Таҳлили ROS-и ҳуҷайравӣ

Истеҳсоли ROS бо истифода аз 10 µM DCFH-DA арзёбӣ шуд. Ҳуҷайраҳо бо зонд дар 37 °C барои 30 дақиқа инкубатсия шуданд; флуорессенсия дар дарозии мавҷи ангезиши 485 nm ва эмиссияи 530 nm бо хонандаи Cytation 5 чен карда шуд.

Натиҷаҳо бо қабул кардани назорати манфӣ ҳамчун %100 ба шакли фоизи нисбии ROS пешниҳод шуданд.

Таҳлили NO

NO дар супернатанти фарҳанги ҳуҷайра ба таври ғайримустақим тавассути нитрит бо Griess Reagent System чен карда шуд. Хати стандартии sodium nitrite-и 1,56–100 µM истифода шуда, натиҷаҳо ҳамчун µM нитрит гузориш шуданд.

qPCR

Пас аз таҷрибаҳои co-treatment total RNA ҷудо ва ба cDNA табдил дода шуд. Генҳои Nos-2 ва Cox-2 дар дастгоҳи QuantStudio 3 бо qPCR чен шуданд ва Ppib ҳамчун назорати эндогенӣ истифода шуд.

Экспрессияи нисбии mRNA бо усули \(2^{-\Delta\Delta C_T}\) ҳисоб карда шуд.

Ин усул аввал қимати Ct-и гени ҳадафро бо гени истинодӣ нормализатсия карда, сипас гурӯҳи таҷрибавиро бо шароити истинодӣ муқоиса намуда, тағйироти нисбии экспрессияро медиҳад. Натиҷа шумораи мутлақи молекулаҳои mRNA нест, балки тағйироти чандкарата нисбат ба истинод мебошад.

Таҳлили ситокинҳо

TNF-α, IL-6 ва MCP-1 дар супернатантҳои фарҳанги ҳуҷайра бо маҷмӯаҳои ELISA чен карда шуданд. Ин таҷрибаҳо танҳо дар тартиби co-treatment ва бо истифода аз фраксияи пептидии 250 µg/mL гузаронида шуданд.

Сохтори такрорҳо ва омор

Дар таҳлилҳои DH, ABTS ва ORAC се расмиёти мустақили гидролизи ферментативӣ ҳамчун такрори биологӣ истифода шуданд ва ҳар такрори биологӣ аз ҷиҳати техникӣ се маротиба чен карда шуд.

Таҷрибаҳои ҳуҷайравӣ ҳамчун трипликати биологӣ бо се фарҳанги мустақили ҳуҷайраҳои RAW264.7, ки дар рӯзҳои гуногун гузаронида шуданд, иҷро гардиданд; дар ҳар такрори биологӣ барои ҳар шароит се чоҳи техникӣ истифода шуд.

Тақсимоти муқаррарӣ бо Shapiro–Wilk test ва якхелагии дисперсия бо Levene test дар сатҳи α=0,05 арзёбӣ шуданд. Манбаъ мегӯяд, ки ҳамаи маҷмӯаҳои маълумот ба ин фарзияҳои параметрӣ ҷавобгӯ буданд.

Гурӯҳҳо бо one-way ANOVA ва Tukey multiple comparison test таҳлил шуданд ва p<0,05 муҳим ҳисобида шуд. Дар таҳлилҳо GraphPad Prism 10.6.1 ва Minitab 22.4.0.0 истифода шуданд.

Нақши илмии Figure 1

Figure 1 вақтбандии додани пептидҳоро нисбат ба ангезандаи илтиҳобӣ нишон медиҳад. Модели pre-treatment таъсири пептидро пеш аз ангезанда, co-treatment таъсири оғози ҳамзамон ва post-treatment таъсирро пас аз оғоз шудани посухи илтиҳобӣ меомӯзад.

Гарчанде дар тамғаҳои намоёни шакли манбаъ 125 ва 250 µg/mL мавҷуд аст, матни усул мегӯяд, ки таҷрибаҳои асосии се-вақтбандӣ бо як консентратсия, дар 250 µg/mL гузаронида шудаанд ва шарҳҳои Figure 4–7 низ истифодаи 250 µg/mL-ро нишон медиҳанд. Ин фарқи пешниҳоди дохилии манбаъ бояд дар тафсир нигоҳ дошта шавад.

Нақши илмии Figure 2

Бо SDS-PAGE тақсимоти сафедаҳои калон ва бо Tricine-SDS-PAGE тақсимоти пептидҳои хурдтар дида мешавад. Боқӣ мондани бандҳои фазаолин дар лӯбиё ва аз байн рафтани қавитари бандҳои сафедаҳои калони захиравӣ дар тухми каду фарқи ҳазмшавии ин ду ашёи хомро шарҳ медиҳад.

Дар шарҳи Figure 2 кушода шудани PSP ва PSH ҳамчун “common bean protein” ва “common bean hydrolysate” бо матн мувофиқат намекунад; контексти таҷриба нишон медиҳад, ки PSP/PSH сафеда/гидролизати тухми кадуро ифода мекунанд.

Нақши илмии Figure 3

Figure 3 посухи доза–NO-и чаҳор фраксияи пептидиро дар доираи 32,5–500 µg/mL муқоиса мекунад. Дар лӯбиё CB3 ва дар тухми каду PS10 яке аз профилҳои қавитарро нишон медиҳанд.

График ҳамчунин асоси таҷрибавии интихоб шудани 250 µg/mL барои таҷрибаҳои минбаъдаро таъмин мекунад.

Figure 4 ва Figure 5-ро чӣ гуна бояд якҷоя хонд?

Figure 4 посухи NO ва Figure 5 посухи ROS-ро дар се вақтбандии гуногун нишон медиҳанд. Гарчанде ҳар ду натиҷа умуман бо коркарди пептидӣ коҳиш меёбанд, тартиби фраксияҳо яксон нест.

Аз ин рӯ, муайян кардани фаъолияти зиддиилтиҳобӣ танҳо аз рӯи NO ё танҳо аз рӯи ROS нопурра хоҳад буд. Манбаъ ин ду ченакро ҳамчун натиҷаҳои биологии якдигарро пуркунанда истифода кардааст.

Figure 6 чӣ нишон медиҳад?

Figure 6 сатҳҳои mRNA-и Nos-2 ва Cox-2-ро ҳангоми co-treatment муқоиса мекунад. LPS + PA ҳар ду генро ба таври қавӣ зиёд кард, дар ҳоле ки ҳамаи фраксияҳои пептидӣ экспрессияро коҳиш доданд.

CB3 дар ҳар ду ген пахши зиёда аз %70 нишон дод. Ин натиҷа дастгирӣ мекунад, ки тағйироти NO-и ҳуҷайравӣ ҳадди ақал қисман ҳамзамон бо тағйироти сатҳи экспрессияи ген ба амал омадааст.

Figure 7 чӣ нишон медиҳад?

Figure 7 сатҳҳои сафедаи TNF-α, IL-6 ва MCP-1-ро бо ELISA муқоиса мекунад. Коҳиши ҳар се медиатори проилтиҳобӣ дар ҳамаи фраксияҳои пептидӣ бо пахши васеи посухи илтиҳобӣ мувофиқат мекунад.

CB3 дар ҳар се ситокин профили қавӣ ва устувортаринро нишон дод.

Ҷиҳатҳои қавии таҳқиқот

• Истифодаи ултрасадо пеш ва баъд дар ҳамон манбаъҳои сафедаи растанӣ мустақиман муқоиса шуд.
• Сохторҳои гуногуни сафедаи лӯбиё ва тухми каду дар як чаҳорчӯбаи таҷрибавӣ арзёбӣ шуданд.
• Қобилияти кимиёвии антиоксидантӣ бо ду принсипи гуногун, ABTS ва ORAC, чен карда шуд.
• Гидролизатҳо аз рӯи вазни молекулавӣ фраксия карда шуданд ва фаъолияти биологӣ дар сатҳи фраксия омӯхта шуд.
• Посухи ҳуҷайравӣ на танҳо бо NO, балки ҳамзамон бо ROS, mRNA ва се ситокини гуногун арзёбӣ шуд.
• Вақтбандии пептидҳо нисбат ба ангезандаи илтиҳобӣ дар се модели ҷудогона омӯхта шуд.
• Такрорҳои биологӣ дар рӯзҳои мустақил гузаронида шуда, бо такрорҳои техникӣ дастгирӣ шуданд.

Маҳдудиятҳои асосии таҳқиқот

• Таҳқиқот танҳо модели ҳуҷайравии in vitro мебошад; самаранокии терапевтиро дар одамон ё ҳайвонот нишон намедиҳад.
• Пайдарпаии аминокислотаҳои пептидҳои фаъол бо LC-MS/MS муайян нашудааст.
• Заряди барқии пептидҳо ва робитаи воқеии сохтор–фаъолият муайян нашудааст.
• Пайвастшавии мустақим ба TLR4 ё безарарсозии LPS таҷрибавӣ чен нашудааст.
• Фосфорилатсияи NF-κB/MAPK бо Western blot тасдиқ нашудааст.
• NF-κB reporter assay гузаронида нашудааст.
• Транслокатсияи ҳастаии NRF2 мустақиман арзёбӣ нашудааст.
• Маълум нест, ки консентратсияи in vitro-и 250 µg/mL тавассути ғизои муқаррарӣ дар рӯда ё гардиши хун ба даст меояд ё не.
• Устувории gastrointestinal-и пептидҳо ва гузарониши рӯда арзёбӣ нашудааст.
• Маълумоти устувории плазма ва фармакокинетикӣ мавҷуд нест.
• Миқёсбардории саноатӣ ва имконпазирии иқтисодӣ санҷида нашудааст.
• Харитаи васеи оптимизатсияи басомад, амплитуда ва давомнокии ултрасадо таҳия нашудааст.

Хулосаҳое, ки таҳқиқот дастгирӣ мекунад

Истифодаи ултрасадо пеш аз гидролизи ферментативӣ дар шароити таҷрибавии истифодашуда дараҷаи гидролизи сафедаҳои лӯбиё ва тухми кадуро зиёд кардааст.

Истифодаи ултрасадо пеш ва баъд умуман қобилияти антиоксидантии гидролизатҳоро, ки бо ABTS ва ORAC чен шуд, зиёд кардааст; истифодаи пешакӣ махсусан дар натиҷаҳои ORAC-и лӯбиё ва тухми каду қавитар буд.

Фраксияҳои пептидии аз коркарди пешакии ултрасадоӣ бадастомада истеҳсоли NO ва ROS-ро, ки аз LPS + кислотаи палмитинӣ ба вуҷуд омада буд, дар ҳуҷайраҳои RAW264.7 коҳиш доданд.

Фраксияҳои пептидӣ mRNA-и Nos-2 ва Cox-2 ва истеҳсоли TNF-α, IL-6 ва MCP-1-ро коҳиш доданд.

Фраксияи CB3 дар аксари натиҷаҳои ҳуҷайравии зиддиилтиҳобӣ яке аз фраксияҳои қавитар ва устувортарин буд.

Робитаи байни андозаи пептид ва фаъолияти биологӣ аз манбаи сафеда ва натиҷаи ченшаванда вобаста аст.

Хулосаҳое, ки таҳқиқот дастгирӣ намекунад

Таҳқиқот нишон намедиҳад, ки пептидҳои лӯбиё ё тухми каду фарбеҳӣ, диабет ё бемории ҷигари чарбиро дар одамон табобат мекунанд.

Нишон дода нашудааст, ки консентратсияи фарҳанги ҳуҷайравии 250 µg/mL тавассути ғизои муқаррарӣ дар бофтаҳои инсон ба даст меояд.

Мутақобилаи мустақими молекулавии CB3 ё фраксияҳои дигар бо NF-κB, MAPK, NRF2 ё TLR4 исбот нашудааст.

Маълум нест, ки кадом пайдарпаии мушаххаси пептидӣ барои фаъолияти антиоксидантӣ ё зиддиилтиҳобӣ масъул аст.

Нишон дода нашудааст, ки вазни молекулавии хурдтар дар ҳама ҳолат фаъолияти биологии баландтар медиҳад.

Нишон дода нашудааст, ки коркарди пешакии ултрасадоӣ дар миқёси саноатӣ аз ҷиҳати иқтисодӣ ё техникӣ беҳтарин раванд мебошад.

Ёддошт оид ба Манбаъ ва Усул

Таҳқиқоти аслӣ: Ultrasound-Assisted Enzymatic Hydrolysates from Common Bean and Pumpkin Seed Proteins: Antioxidant and Anti-Inflammatory Properties

Муаллифон: Erick Huerta-Rodriguez; Omar Sanchez-Jimenez; Cristina Chuck-Hernández; Margarita L. Martinez-Fierro; Idalia Garza-Veloz; Diana L. Cárdenas-Chávez; Cesar A. Ponce-Ponce de Leon; Maria del Refugio Rocha-Pizaña.

Муаллифи масъул: Maria del Refugio Rocha-Pizaña.

Муассисаҳо: Escuela de Ingenieria y Ciencias, Tecnologico de Monterrey, Monterrey, Mexico; Molecular Medicine Laboratory, Unidad Academica de Medicina Humana y C.S, Universidad Autonoma de Zacatecas, Zacatecas, Mexico.

Маҷалла: Antioxidants.

Ношир: MDPI, Basel, Switzerland.

Маълумоти нашр: 2026; ҷилд 15; шумора 5; мақола 578. Санаи нашр: 3 Mayıs 2026.

DOI: 10.3390/antiox15050578

Навъи манбаъ: Мақолаи аслии таҳқиқоти таҷрибавии баррасишуда ва дастрасии кушода; технологияи сафедаҳои ғизоӣ ва модели макрофагии in vitro.

Иҷозатнома: Creative Commons Attribution (CC BY).

Маводи растанӣ: Лӯбиёи органикии Bayo ва тухми каду; Tlaxcala, Mexico.

Гидролизи сафеда: Пепсин ва панкреатин; дар ҳар марҳила фермент:субстрат 1:20 вазн/вазн; пепсин дар pH 2 ва 37 °C барои 2 соат; баъдан pH 7,5 ва панкреатин барои 2 соат; ғайрифаъолсозии фермент дар 75 °C барои 20 дақиқа.

Ултрасадо: Branson 450S-Digital Sonifier; 20 kHz; амплитуда %70; 10 дақиқа; 25 сония фаъол/25 сония ғайрифаъол; ҳаммоми ях.

Фраксияҳои пептидӣ: Лӯбиё CB10 (3–10 kDa), CB3 (<3 kDa); тухми каду PS10 (3–10 kDa), PS3 (<3 kDa).

Таҳлили антиоксидантӣ: ABTS ва ORAC; натиҷаҳо ҳамчун µmol Trolox equivalents/g protein гузориш шудаанд.

Модели ҳуҷайра: Макрофагҳои муш RAW264.7, passage 10.

Ангезандаи илтиҳобӣ: LPS 100 ng/mL + кислотаи палмитинӣ 100 µM.

Консентратсияи асосии пептидӣ дар ҳуҷайра: 250 µg/mL.

Натиҷаҳои ҳуҷайравӣ: Зиндамонии ҳуҷайра, нитрит/NO, DCFH-DA ROS, mRNA-и Nos-2 ва Cox-2, TNF-α, IL-6 ва MCP-1.

qPCR: Усули \(2^{-\Delta\Delta C_T}\); Ppib ҳамчун назорати эндогенӣ.

Омор: Shapiro–Wilk normality test; Levene variance homogeneity test; one-way ANOVA ва Tukey post hoc; p<0,05.

Сохтори такрорҳо: Се такрори мустақили биологӣ; трипликатҳои техникӣ дар ҳар такрори биологӣ.

Нармафзор: GraphPad Prism 10.6.1 ва Minitab 22.4.0.0.

Маводи Supplementary: Figure S1 таъсири чаҳор фраксияи пептидиро ба зиндамонии ҳуҷайраҳои RAW264.7 нишон медиҳад.

Маблағгузорӣ: Бахши Funding-и манбаъ мегӯяд, ки маблағгузории беруна гирифта нашудааст.

Дастгирӣ ва сипос: Дастгирии маводи лабораторӣ аз Tecnologico de Monterrey; истеҳсолкунандагон/ташкилотҳои маҳаллӣ, ки лӯбиёи органикӣ ва тухми каду таъмин карданд; стипендияи таҳқиқотии SECIHTI No. 1049616.

Кумитаи ахлоқ: Татбиқ намешавад.

Ризоияти огоҳона: Татбиқ намешавад.

Дастрасии маълумот: Саҳмҳои аслӣ дар мақола ва маводи иловагӣ пешниҳод шудаанд; саволҳои иловагӣ метавонанд ба муаллифи масъул равона карда шаванд.

Бархӯрди манфиатҳо: Муаллифон бархӯрди манфиатҳоро гузориш накардаанд.

Саҳми муаллифон: Консептуализатсия Maria del Refugio Rocha-Pizaña, Cristina Chuck-Hernández, Margarita L. Martinez-Fierro ва Idalia Garza-Veloz; методология Erick Huerta-Rodriguez ва Maria del Refugio Rocha-Pizaña; валидатсия ва таҳлили формалӣ Erick Huerta-Rodriguez; таҳқиқот Erick Huerta-Rodriguez ва Omar Sanchez-Jimenez; лоиҳаи аввал Erick Huerta-Rodriguez; назорат, идоракунии лоиҳа ва дарёфти маблағгузорӣ аз ҷониби Maria del Refugio Rocha-Pizaña анҷом дода шудааст.

Ёддошти номгузорӣ дар дохили манбаъ: Номи навъи каду дар abstract ҳамчун “Cucurbita argyoesperma” ва дар муқаддима ва усул ҳамчун “Cucurbita argyosperma” омадааст. Verianla ин фарқро ҳамчун номувофиқии имло дар дохили манбаъ нигоҳ медорад.

Ёддошти Figure 2-и манбаъ: Дар шарҳи Figure 2 PSP ва PSH ба назар мерасад, ки иштибоҳан ҳамчун “common bean” кушода шудаанд; матни таҷрибавӣ равшан нишон медиҳад, ки онҳо сафеда ва гидролизати тухми кадуро ифода мекунанд.

Ёддошти усули Figure 1: Гарчанде дар тасвир тамғаҳои 125 ва 250 µg/mL мавҷуданд, Бахши 2.8.3 ва Figure 4–7 нишон медиҳанд, ки дар таҷрибаҳои асосӣ 250 µg/mL истифода шудааст. Verianla дар натиҷаҳои асосии ҳуҷайравӣ қимати 250 µg/mL-ро асос мегирад ва фарқи тасвирро пинҳон намекунад.

Маҳдудияти асосии механистӣ: Иштироки роҳҳои NF-κB/MAPK ва NRF2 аз натиҷаҳои поёноби роҳ бароварда мешавад; таҷрибаҳои мустақими фаъолсозии pathway гузаронида нашудаанд.

Маҳдудияти шахсияти пептид: Фраксияҳо танҳо аз рӯи вазни молекулавӣ муайян шудаанд. Пайдарпаии биоактивӣ, таркиби аминокислотаҳо ва механизмҳои пайвастшавӣ ба ретсептор мустақиман муайян нашудаанд.

Маҳдудияти транслятсионӣ: Устувории gastrointestinal, интиқоли intestinal-и монанд ба Caco-2, устувории плазма, фармакокинетика ва он ки оё пептидҳои даҳонӣ метавонанд ба таъсири бофтавии баробар ба 250 µg/mL расанд ё не, санҷида нашудаанд.

Маҳдудияти саноатӣ: Коркарди пешакии ултрасадоӣ дар сатҳи лабораторӣ бартарӣ нишон дод; оптимизатсияи иқтисодии басомад, амплитуда, давомнокӣ ва миқёсбардорӣ анҷом наёфтааст.

Усули баёни Verianla: Ин муҳтаво танҳо тарҷумаи abstract ё conclusion нест. Экстраксияи сафеда, гидролизи gastrointestinal, истифодаи ултрасадо пеш/баъд, фраксиябандии вазни молекулавӣ, SDS-PAGE/Tricine-SDS-PAGE, DH, ABTS, ORAC, зиндамонии ҳуҷайра, NO, ROS, се тартиби вақт, qPCR, ELISA-и ситокинҳо, омор ва маҳдудиятҳои механистӣ ҳамчун қабатҳои ҷудогонаи илмӣ аз нав сохторбандӣ шудаанд.

Маҳдудияти тафсири саломатӣ: Натиҷаҳо ба гидролизатҳои сафедаҳои растанӣ дар шароити лабораторӣ дахл доранд ва нишон намедиҳанд, ки истеъмоли лӯбиё ё тухми каду бемориҳои мушаххаси илтиҳобиро дар одамон табобат мекунад.