Bu tədqiqat, Lactobacillus plantarum (Lp) hüceyrələrini whey protein isolate nanofibrils (WPNFs) ilə əvvəlcədən qoruyaraq W1/O/W2 su-yağ-su ikiqat emulsiyasının daxili su fazasına yerləşdirən və bu probiotik yüklü emulsiyanı koaksial 3D qida çapında daxili nüvə kimi istifadə edən funksional pendir istehsalı yanaşmasını araşdırır. W1/O/W2 ikiqat emulsiyası probiotikin yerləşdiyi W1 daxili su fazasını yağ təbəqəsi ilə əhatə edən və bu quruluşu ikinci xarici su fazası W2 daxilində paylayan çoxqatlı enkapsulyasiya sistemidir. Optimallaşdırılmış sistemdə %4,0 PGPR, %50 W1, %60 yağ fazası və xarici fazada %5,0 WPI istifadə edilmiş; emulsiyada Lp canlılığı 4 °C-də 14 günün sonunda %90,44 səviyyəsində qorunmuşdur. Koaksial çapda emulsiya daxili nüvə, WPNF ilə modifikasiya edilmiş F20 emal olunmuş pendir isə xarici quruluş kimi istifadə edilmiş; çap olunmuş nümunələrdə probiotik sayı təxminən 6,78–8,06 log10 CFU/g aralığında qalmış və forma sapması 14 günün sonunda yalnız −%3,5 ± 1,5 olmuşdur. Nəticələr ikiqat emulsiya ilə koaksial 3D çapın probiotik hüceyrələri mexaniki və ətraf mühit stresindən qoruya bilən qida mühəndisliyi sistemi təmin edə biləcəyini göstərir; lakin tədqiqat laboratoriya miqyasındadır və klinik sağlamlıq təsirini və ya sənaye istehsalının uğurunu sınaqdan keçirmir.

W1/O/W2 İkiqat Emulsiyası Nədir?

W1/O/W2 ikiqat emulsiyası kiçik daxili su damcılarının əvvəlcə yağ fazası daxilində kapsullaşdırıldığı və yaranan W1/O damcılarının daha sonra ikinci xarici su fazası W2 daxilində paylandığı çoxbölməli emulsiya sistemidir; bu tədqiqatda probiotik Lactobacillus plantarum hüceyrələri ən daxildəki W1 fazasına yerləşdirilərək yağ təbəqəsi və xarici faza vasitəsilə ətraf mühit stresindən fiziki olaraq ayrılmışdır.

Bu quruluşun əsas üstünlüyü hidrofil bioloji komponentin xarici qida matrisi ilə birbaşa təmasını məhdudlaşdıra bilməsidir. Tədqiqatda bu xüsusiyyət yalnız saxlama üçün deyil, həm də nazik koaksial nozzle daxilində mexaniki kəsilmə qüvvəsindən, temperaturdan və ekstremal pH şəraitindən qorunmaq məqsədilə istifadə edilmişdir.

Probiotik niyə birbaşa pendirə qarışdırılmayıb?

Mənbə Cheddar pendirinin probiotik daşıyıcısı kimi uyğun ola biləcəyini, lakin probiotiklərin pendir matrisi ilə birbaşa təmasının zülal hidrolizi və aroma dəyişiklikləri kimi keyfiyyət problemlərinə səbəb ola biləcəyini bildirir. Koaksial çap yanaşmasının məntiqi probiotiki daxili nüvədə saxlamaq və pendir qabığını qoruyucu xarici quruluş kimi istifadə etməkdir.

Buna görə sistem eyni vaxtda iki ayrı mühəndislik problemini həll etməyə çalışır:

• probiotiki canlı saxlaya biləcək daxili faza yaratmaq,
• 3D çapdan sonra formasını qoruya biləcək pendir xarici fazası inkişaf etdirmək.

Whey Protein Nanofibrilləri Probiotikləri Necə Qoruyur?

WPNFs, pH 2,0 şəraitində müsbət yüklənən whey protein nanofibrilləridir və mənfi yüklü Lactobacillus plantarum səthi ilə elektrostatik qarşılıqlı təsirə girərək bakteriyanın ətrafında fiziki zülal baryeri yaradır; TEM görüntüləri bu nanofibrillərin bakteriya səthinə bağlandığını göstərir.

WPNF hazırlanması

%5,0 (w/w) WPI məhlulu pH 2,0-a tənzimləndi və 30 dəqiqə maqnit qarışdırıcı ilə qarışdırıldı. Məhlul daha sonra 4 °C-də 9000 r/min sürətlə 15 dəqiqə sentrifuqadan keçirildi və 0,45 μm filtrdən süzüldü.

Filtrat 80 °C-də, 200 rpm-də 10 saat saxlanıldı. Bu proses nəticəsində WPI zülallarının fibrilyar quruluşlar yaratması təmin edildi.

Probiotikin WPNF ilə örtülməsi

Lactobacillus plantarum 1.0665 üçün başlanğıc canlı hüceyrə sayı 9,26 log10 CFU/mL olaraq verilmişdir. Hüceyrələr MRS maye mühitində 37 °C-də 24 saat aktivləşdirildi; sentrifuqalama, fosfat tamponu ilə yuma və CaCl2 daxilində yenidən suspenziyaya salma mərhələlərindən sonra Lp məhlulu WPNF məhluluna 1:49 (v/v) nisbətində əlavə edildi.

Qarışıq 15 dəqiqə vorteksləndi və otaq temperaturunda 1 saat saxlanıldı. TEM görüntülərində nəzarət bakteriyasının səthi hamar olduğu halda, WPNF tətbiqindən sonra fibrillərin hüceyrə səthi ətrafında aydın şəkildə yerləşdiyi görülür.

Mənbə WPNF üçün +27,68 ± 1,52 mV, bakterial suspenziya üçün isə −0,38 ± 0,09 mV zeta potensialı bildirir. Bu əks yüklər WPNF–bakteriya öz-özünə təşkilini dəstəkləyən elektrostatik mexanizmlə uyğundur.

İkiqat emulsiyanın quruluşu

Probiotik yüklü daxili fazaya %5,0 (w/v) fruktooligosaxarid (FOS) əlavə edildi. FOS bakteriyaları saxlama müddətində dəstəkləmək üçün prebiyotik komponent kimi istifadə edildi.

İlk emulsifikasiya mərhələsində PGPR zeytun yağı daxilində həll edildi və Lp-WPNF ehtiva edən W1 fazası bu yağ fazasına əlavə edilərək yüksək kəsilməli homogenizasiya ilə W1/O emulsiyası yaradıldı.

İkinci mərhələdə W1/O emulsiyası WPI ehtiva edən xarici su fazası W2 ilə yenidən homogenləşdirilərək W1/O/W2 quruluşu yaradıldı.

İkiqat Emulsiya Üçün Ən Uyğun Formulasiya Necə Müəyyən Edildi?

Tədqiqatda damcı ölçüsü, zeta potensialı və saxlama sabitliyi birlikdə qiymətləndirilərək W1/O/W2 sistemi üçün %4,0 PGPR, %50 daxili su fazası, %60 yağ fazası və xarici su fazasında %5,0 WPI optimal şərt kimi seçilmişdir.

PGPR konsentrasiyası

PGPR %2,0-dan %4,0-a artırıldıqda W1/O damcı ölçüsü 1353,3 nm-dən 139,8 nm-ə qədər azalmışdır. %5,0 PGPR-də isə damcı ölçüsü yenidən 545,6 nm-ə yüksəlmişdir.

%4,0 PGPR istifadə olunan emulsiyanın zeta potensialı −35,25 mV olaraq bildirilmiş və sonrakı təcrübələr üçün bu konsentrasiya seçilmişdir.

Daxili su fazasının nisbəti

W1 nisbəti %50 olduqda W1/O damcı ölçüsü minimum olan 69,08 nm-ə çatmışdır. Daha yüksək su nisbətlərində mövcud emulqator miqdarının genişlənən interfeysi yetərincə örtə bilməməsi daha böyük damcıların yaranması ilə əlaqələndirilmişdir.

Yağ fazasının nisbəti

W1/O/W2 emulsiyasında yağ fazası %60 olduqda damcı ölçüsü 553,01 nm-ə düşmüş və bu şərt sonrakı təcrübələr üçün seçilmişdir. %60–70 yağ fazasında saxlama zamanı serum fazasının yaranmadığı bildirilmişdir.

WPI konsentrasiyası

Xarici fazada %5,0 WPI istifadə edildikdə damcı ölçüsü 579,4 nm ilə minimuma çatmışdır. Daha aşağı zülal səviyyəsi yetərsiz interfeys örtülməsi, daha yüksək səviyyə isə zülal aqreqasiyası və ya depletion flocculation ehtimalı ilə əlaqələndirilmişdir.

Mikroskopik təsdiq

CLSM analizində Lp DAPI ilə mavi, WPNFs Nile blue ilə yaşıl və zeytun yağı Nile Red ilə qırmızı göstərilmişdir. Birləşdirilmiş görüntülərdə bu siqnalların emulsiya damcıları daxilində üst-üstə düşməsi və xarici W2 fazasında mavi bakterial siqnalın olmaması probiotikin daxili fazada saxlanıldığını dəstəkləyir.

W1/O/W2 Sistemi Probiotik Canlılığını Nə Dərəcədə Qorudu?

W1/O/W2 ikiqat emulsiyası qorunmamış Lp hüceyrələri ilə müqayisədə saxlama, temperatur və ekstremal pH şəraitində nəzərəçarpacaq dərəcədə daha yüksək canlılıq təmin etmiş; 4 °C-də 14 günlük saxlamanın sonunda probiotik canlılığı %90,44 səviyyəsində qorunmuşdur.

14 günlük saxlama müddətində canlı hüceyrə səviyyəsi 8,92 log CFU/g-dən 8,48 log CFU/g-ə düşmüşdür. Buna qarşılıq qorunmamış nəzarət qrupunda azalma daha nəzərəçarpacaq olmuşdur.

Tədqiqat həmçinin ikiqat emulsiyanın orta yağ təbəqəsinin xarici su fazasındakı turşu və ya qələvinin W1 daxili fazasına çatmasını məhdudlaşdıraraq pH stresinə qarşı fiziki baryer yaratdığını irəli sürür.

Mənbədə burada kiçik, lakin mühüm hesabat uyğunsuzluğu vardır: metod bölməsində pH stress testləri pH 2,0 və 11,0 kimi göstərildiyi halda Şəkil 4 və nəticələr mətni pH 2,0 və 12,0 dəyərlərini göstərir. Buna görə həqiqətən hansı qələvi şəraitin istifadə edildiyini PDF əsasında dəqiqləşdirmək mümkün deyil.

İstilikdən qorunma

Metod bölməsində test şərtləri 65 °C-də 30 dəqiqə və 90 °C-də 15 saniyə kimi verilir. Nəticələr mətnində isə bir cümlədə nəzarət qrupunun “60 °C-də 30 dəqiqə”dən sonra %9,87 canlılıq göstərdiyi yazılıb. Bu temperatur dəyəri metod və Şəkil 4 ilə uyğunsuzdur; məlumat burada səssizcə düzəldilməyib.

Eyni cümlə W1/O/W2 emulsiyasında canlılığın %73,53 olduğunu bildirir. Ümumi eksperimental meyl ikiqat emulsiyanın termal stress altında qorunmamış hüceyrələrdən daha yüksək canlılıq təmin etdiyini dəstəkləyir.

Tədqiqatın Metodu və Nəticələri

Daxili nüvənin reologiyası

Koaksial 3D çapda daxili nüvənin 0,4 mm diametrli nazik nozzle daxilindən axa bilməsi lazım olduğuna görə aşağı özlülük və shear-thinning davranışı vacibdir.

%60 və %70 yağ fazalı W1/O/W2 emulsiyalarının görünən özlülüyü shear rate artdıqca kəskin azalmışdır. Bu shear-thinning davranışı materialın nozzle daxilində axıcılaşa biləcəyini göstərir.

Bütün tezlik diapazonunda saxlama modulu \(G'\), itki modulu \(G''\)-dən yüksək qalmışdır. Bu, emulsiyanın axıcı olmasına baxmayaraq nəzərəçarpacaq elastik/yarı-bərk şəbəkə xarakteri daşıdığını göstərir.

%60 yağ fazalı emulsiya %70-lik emulsiyaya nisbətən daha aşağı modul və özlülük göstərdiyi üçün nazik koaksial nozzle baxımından daha uyğun hesab edilmişdir.

Xarici nüvə: F20 emal olunmuş pendir

Saf Cheddar pendirinin birbaşa çap üçün həddən artıq sərt olduğu qiymətləndirilmişdir. Buna görə əridilmiş Cheddar-a %5 WPNF məhlulu müxtəlif nisbətlərdə əlavə edilmiş və F10, F20, F30 və F40 nümunələri hazırlanmışdır.

F20, %20 WPNF məhlulu fraksiyasının istifadə edildiyi emal olunmuş pendir formuludur. Bu tərif son pendirin quru maddəsində %20 saf WPNF olduğu anlamına gəlmir.

Dinamik shear recovery testlərində aşağı strain (%1) statik vəziyyəti, yüksək strain (%200) isə nozzle daxilində axın şəraitini təmsil etmişdir. Yüksək strain altında \(G'\) və \(G''\) sürətlə azalmış; strain yenidən %1-ə endirildikdə modullar sürətlə bərpa olunmuşdur.

F20 tədqiqatçılar tərəfindən ekstruziya asanlığı ilə çapdan sonra struktur bərpası arasında ən uyğun tarazlığı təmin edən formulasiya kimi seçilmişdir.

Temperaturun xarici nüvəyə təsiri

Pendir nümunələri 25–70 °C arasında araşdırılmışdır. \(G'\) və \(G''\) əvvəlcə artmış, təxminən 35 °C ətrafında maksimuma çatmış və daha sonra pendir yağının əriməsi və zülal matrisinin yumşalması ilə azalmışdır.

Çap üçün xarici nüvə 45 °C-də ekstrüde edilmişdir.

F20-nin çap performansı

Şəkil 6-da Cheddar və F10 çaplarında fasiləli xətlər və kobud səth görüldüyü halda F20 və F30 daha davamlı xətlər yaratmışdır. F40 isə həddən artıq yumşaq olduğundan formasını kifayət qədər qoruya bilməmişdir.

F20 istifadə edilərək çap olunmuş gül modeli hamar səth, aydın sərhədlər və üçölçülü formanın qorunmasını göstərmişdir. Mənbə bu nümunənin ölçülərini 51,41 mm uzunluq, 44,91 mm en və 39,20 mm hündürlük kimi verir.

Koaksial 3D Çap Hibrid Çapdan Niyə Daha Uğurlu Oldu?

Koaksial 3D çap aşağı özlülüklü probiotik emulsiyanı və forma daşıyan pendir matrisini bir-birinə qarışdırmaq əvəzinə ayrı daxili və xarici axınlar şəklində eyni vaxtda ekstrüde etdiyi üçün, probiotik yükünü artırarkən xarici pendir quruluşunun mexaniki dəstəyini qoruya bilmişdir.

Hibrid çap

Hibrid üsulda W1/O/W2 emulsiyası Cheddar pendirinə birbaşa %3, %5 və ya %7 nisbətində qarışdırılmışdır.

%3 və %5 emulsiya ehtiva edən materiallar ekstrüde edilə bilmiş, lakin çap olunmuş kublar sürətlə deformasiyaya uğramışdır. Alt hissələr genişlənmiş və mərkəz çökmüşdür.

%7 emulsiya ehtiva edən qarışıq isə üst-üstə yığılan təbəqələri daşıya bilmədiyinə görə uğurla çap edilə bilməmişdir.

Koaksial çap

Koaksial sistemdə daxili nozzle diametri 0,4 mm, daxili emulsiya axın sürəti 0,08 mL/min olaraq təyin edilmişdir. Xarici nozzle diametri 1,05 mm, pendir çap sürəti isə 25 mm/s-dir.

F20 xarici material 45 °C-də, W1/O/W2 daxili fazası isə otaq temperaturunda eyni vaxtda ekstrüde edilmişdir.

Mənbədə qida boyası ilə qırmızı rənglənmiş daxili emulsiyanın kənara sızmaması, xarici F20 təbəqəsinin daxili nüvəni uğurla əhatə etdiyinə vizual sübut kimi təqdim edilmişdir.

Forma dəqiqliyi

Koaksial nümunələrdə 14 günün sonunda yalnız yüngül kənar kiçilməsi müşahidə edilmiş; hibrid nümunələrdə görülən alt hissənin yayılması və ya təbəqə çökməsi müşahidə edilməmişdir.

3D Çap Probiotik Hüceyrələri Öldürdümü?

Qorunmamış probiotik hüceyrələr 0,4 mm daxili nozzle istifadə edildikdə nəzərəçarpacaq canlılıq itkisi yaşadığı halda W1/O/W2 emulsiyası ilə kapsullaşdırılmış hüceyrələrin hibrid və koaksial çapdan sonra canlılığı %95-dən yuxarı qalmışdır; bu nəticə emulsiyanın ekstruziya shear stresinə qarşı mühüm qoruyucu rol oynadığını göstərir.

Probiotik məhlulunun birbaşa 0,4 mm koaksial nozzle daxilindən keçirilməsi ilə yaradılmış nəzarət qrupunda canlılıq yalnız %55,23 olaraq verilmişdir.

Buna qarşılıq W1/O/W2 ilə qorunan probiotiklərdə hibrid və koaksial çapın canlılıq nisbətləri arasında statistik baxımdan əhəmiyyətli fərq aşkar edilməmişdir.

Saxlama sonunda çap olunmuş nümunələrdə canlı bakteriya sayı **6,78–8,06 log10 CFU/g** aralığında qalmışdır.

Mənbə bunu probiotik qidalar üçün kifayət hesab edilən səviyyələrlə müqayisə edir; lakin bu mikrobioloji canlılıq nəticəsi məhsulun insanlarda klinik sağlamlıq faydası verdiyini birbaşa sübut etmir.

Aromanın qorunması

Elektron burun analizində Cheddar, F20, koaksial probiotik pendir və W1/O/W2 emulsiyası müqayisə edilmişdir.

F20 və koaksial çap olunmuş məhsulun radar profilləri bir-birinə yaxın olmuşdur. Buna qarşılıq daxili nüvə emulsiyasının aroma profili aydın şəkildə fərqlidir.

PCA analizində PC1 ümumi variasiyanın %76,4-nü, PC2 isə %13,3-nü izah etmişdir. Beləliklə, ilk iki komponent birlikdə ümumi variasiyanın %89,7-sini təmsil etmişdir.

F20 və koaksial çap olunmuş nümunələrin PCA məkanında eyni klasterə yaxın yerləşməsi, xarici pendir təbəqəsinin daxili emulsiyanın aroma təsirini maskalaya bildiyi şərhini dəstəkləyir.

Tədqiqatın dəstəklədiyi nəticələr

• WPNF, Lp hüceyrə səthində fiziki qoruyucu quruluş yarada bilər.
• Probiotik hüceyrələr W1/O/W2 ikiqat emulsiyasının daxili su fazasında saxlanıla bilər.
• Optimallaşdırılmış ikiqat emulsiya 14 gün ərzində yüksək Lp canlılığını qoruya bilər.
• W1/O/W2 sistemi temperatur, pH və ekstruziya stresinə qarşı qoruma təmin edə bilər.
• F20 emal olunmuş pendir koaksial 3D çapda uyğun xarici quruluş kimi istifadə edilə bilər.
• Koaksial çap hibrid çapa nisbətən daha yüksək həndəsi sabitlik təmin etmişdir.
• Koaksial çap olunmuş məhsul 14 günlük soyuducu saxlama müddətində aşağı forma sapması göstərmişdir.
• Xarici pendir matrisi daxili emulsiyanın aroma profilinin son məhsula əks olunmasını azaltmışdır.

Tədqiqatın dəstəkləmədiyi nəticələr

• Məhsulun insanlar üzərində klinik sağlamlıq faydası göstərilməmişdir.
• Probiotiklərin bağırsaqda kolonizasiyası bu təcrübədə ölçülməmişdir.
• Uzunmüddətli rəf ömrü 14 gündən artıq müddət üçün təsdiqlənməmişdir.
• Sənaye miqyaslı fasiləsiz istehsal sınaqdan keçirilməmişdir.
• İstehlakçı sensor paneli aparılmamışdır; aroma qiymətləndirməsi elektron buruna əsaslanır.
• İqtisadi fizibilite və ya kommersiya istehsal xərci hesablanmamışdır.
• Koaksial çapın bütün pendir formulalarında eyni uğuru göstərəcəyi sübut edilməmişdir.

Mənbə daxilində qeyri-müəyyənliklər

Məqalədə pH stress şərtlərində 11,0 ilə 12,0 arasında, istilik stress bölməsində isə 60 °C ilə 65 °C arasında hesabat uyğunsuzluqları vardır. Bundan əlavə, koaksial çap ölçülərinin dizayndan “əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənmədiyini” bildirən cümlədə P<0,05 yazılması statistik ifadə baxımından daxili ziddiyyətdir. Verianla mətni bu dəyərləri səssizcə düzəltmir, mənbədəki qeyri-müəyyənliyi görünən saxlayır.

Mənbə və Metod Qeydi

Orijinal başlıq: Encapsulation of probiotics in W1/O/W2 emulsion for coaxial 3D printing probiotic-riched cheese products.

Müəlliflər: Yupeng Qi, Yuhe Wang, Jiali Hu, Bo Song, Lei Zhang, Chunhong Liu və Jing Xu.

Birgə birinci müəlliflər: Yupeng Qi və Yuhe Wang.

Məsul müəlliflər: Chunhong Liu və Jing Xu.

Qurumlar: Northeast Agricultural University; Key Laboratory of Agricultural Functional Molecule Design and Utilization of Heilongjiang Province; Key Laboratory of Soybean Biology of Ministry of Education China; Heilongjiang Green Food Science Research Institute.

Platforma: SSRN.

SSRN Abstract No.: 6889393.

Mənbə növü: Eksperimental tədqiqat preprinti.

Rəyçilik statusu: Rəyçi qiymətləndirməsindən keçməyib.

DOI: Mənbədə göstərilməyib.

Maliyyələşdirmə: Heilongjiang Provincial Postdoctoral Science Foundation.

Maraqlar toqquşması: Müəlliflər məlum maliyyə maraqlar toqquşmasının və ya tədqiqata təsir edə biləcək şəxsi münasibətin olmadığını bəyan etmişlər.

Probiotik:Lactobacillus plantarum 1.0665.

Əsas enkapsulyasiya sistemi: WPNF ilə örtülmüş Lp ehtiva edən W1/O/W2 su-yağ-su ikiqat emulsiyası.

Optimallaşdırılmış emulsiya: %4,0 PGPR, %50 W1, %60 yağ fazası və xarici fazada %5,0 WPI.

Koaksial çap: Daxili nozzle 0,4 mm və 0,08 mL/min; xarici nozzle 1,05 mm; xarici F20 pendir fazası 45 °C-də və 25 mm/s çap sürəti ilə ekstrüde edilmişdir.

Analiz üsulları: TEM, CLSM, zeta potensialı və damcı ölçüsünün ölçülməsi, reologiya, 3D çap həndəsəsi, koloniya sayımı, elektron burun və PCA.

Statistika: Təcrübələr üç ayrı təkrarda aparılmış, nəticələr orta ± standart sapma kimi verilmiş, ANOVA üçün SPSS V20.0 istifadə edilmiş və ümumi əhəmiyyət səviyyəsi p<0,05 olaraq göstərilmişdir.

Əsas məhdudiyyət: Tədqiqat laboratoriya miqyaslı çap və 14 günlük soyuq saxlama ilə məhduddur. Probiotik hüceyrələrin canlılığı göstərilsə də, klinik sağlamlıq təsiri, real həzm sistemi performansı və sənaye miqyası təsdiqlənməmişdir.