Aptamer əsaslı flüoresan biosensor, hədəf molekulu seçici şəkildə tanımaq üçün təkzəncirli nuklein turşusu aptamerindən istifadə edən və bu molekulyar tanınma hadisəsini ölçülə bilən flüoresans dəyişikliyinə çevirən biosensor platformasıdır. Bu icmal aminoglikozid antibiotik kanamisinin (kanamycin, KANA) süd, ət, bal və digər mürəkkəb qida sistemlərində müəyyən edilməsinə yönəlmiş flüoresan aptasensorları; aptamer seçimi, bağlanmanın doğrulanması, nişanlı və nişansız siqnal yaradılması, nanomateriallar, nuklein turşusu amplifikasiyası, bölünmüş aptamerlər, qida matrisi müdaxilələri və sahə tətbiqinə keçid baxımından müqayisə edir.

İcmalın ən mühüm elmi mesajlarından biri budur ki, sensorun çox aşağı aşkarlama həddi (Limit of Detection, LOD) göstərməsi istifadə olunan aptamerin hədəfə eyni dərəcədə yüksək intrinsik affinliklə bağlandığını sübut etmir. Aptamer–hədəf bağlanmasının termodinamik gücü adətən dissosiasiya sabiti K_d ilə qiymətləndirildiyi halda, LOD hədəfin tanınması ilə yanaşı flüoresansın çevrilmə səmərəliliyindən, siqnal amplifikasiyasından, fonun basdırılmasından, nümunənin ilkin işlənməsindən və cihazın oxuma qabiliyyətindən təsirlənir. Buna görə K_d və LOD eyni kəmiyyət deyil və birbaşa bir-birinin əvəzinə istifadə oluna bilməz.

Bu fərq xüsusilə KANA-1 üçün kritikdir. İlk KANA aptameri olan KANA-1 üçün immobilizə edilmiş hədəfə əsaslanan erkən tədqiqatda görünən K_d 78,8 nM kimi bildirilmişdir. Buna qarşılıq, daha sonrakı məhlulda aparılmış izotermal titrasiya kalorimetriyası (Isothermal Titration Calorimetry, ITC) tədqiqatları sərbəst KANA ilə eyni güclü və spesifik bağlanmanı təsdiq edə bilməmişdir. İcmal buna baxmayaraq çoxsaylı KANA-1 əsaslı flüoresans sensorlarının nano- və pikomolyar səviyyələrdə LOD bildirməsini ehtiyatla müzakirə edir. Mümkün izahlara erkən seçim proseslərində bərk səthə və ya bağlayıcı qruplara qeyri-spesifik bağlanmanın seçilmiş olması və güclü siqnal amplifikasiyasının qeyri-spesifik qarşılıqlı təsirləri də böyüdə bilməsi daxildir.

Daha yeni aptamerlər bu problemi qismən aradan qaldırmağa çalışır. KANA-4 üçün ITC ilə 320 nM, KANA-5 üçün pH 7,5 şəraitində ITC ilə 51 ± 5 nM K_d bildirilmişdir. İcmal KANA-5-i əhatə etdiyi ədəbiyyatda fizioloji şəraitə yaxın mühitdə güclü məhlul-fazada bağlanma doğrulamasına malik ən yüksək affinlikli KANA aptamerlərindən biri kimi önə çıxarır. Bununla belə, seçicilik hələ də vacibdir; KANA-4 və KANA-5-in tobramisin kimi struktur baxımından əlaqəli aminoglikozidlərə müəyyən dərəcədə çarpaz bağlanma göstərə bildiyi bildirilir.

Flüoresans aptasensorlar iki geniş dizayn ailəsində araşdırılır. Nişanlı sistemlərdə FAM, Cy3 və ya Cy5 kimi flüoroforlar və BHQ1, qızıl nanohissəcikləri, qrafen və ya karbon nanoboruları kimi söndürücülər istifadə oluna bilər. Nişansız sistemlərdə isə Thioflavin T (ThT), thiazole orange (TO), N-methyl mesoporphyrin IX (NMM), SYBR Green I kimi quruluşa həssas boyalardan və ya karbon və metal nanoklasterlərinin öz flüoresans xüsusiyyətlərindən istifadə oluna bilər.

Nuklein turşusu siqnal amplifikasiyası LOD-ni daha da aşağı sala bilər. İcmalda katalitik saç sancaq birləşməsi (Catalytic Hairpin Assembly, CHA), hibridləşmə zəncir reaksiyası (Hybridization Chain Reaction, HCR), rolling circle amplification (RCA), strand displacement amplification (SDA), DNA walker sistemləri və ekzonukleaza dəstəkli hədəf geri dövriyyəsi kimi yanaşmalar nəzərdən keçirilir. Bu üsullar bir və ya az sayda hədəf tanınması hadisəsindən çoxsaylı flüoresans siqnalı yarada bilər; lakin əlavə komponentlər, daha uzun proses, optimallaşdırma ehtiyacı və qeyri-spesifik fon siqnalını böyütmə riski yarada bilər.

Real qida analizi üçün ən böyük maneələrdən biri matris effektidir. Süd zülalları və yağları, ətdəki biomolekullar, balın yüksək şəkər tərkibi və qidalardakı ionlar aptamerin səth adsorbsiyasını, G-kvadrupleks əmələ gəlməsini, nanohissəcik davranışını və flüoresans intensivliyini hədəf KANA-dan asılı olmayaraq dəyişə bilər. Buna görə sensorun təmiz bufer məhlulundakı aşağı LOD-si işlənməmiş real qidada eyni kəmiyyət dəqiqliyinin əldə ediləcəyi demək deyil.

İcmalın ümumi nəticəsi budur ki, flüoresans aptasensorlar sürətli, az cihaz tələb edən və daşına bilən KANA skrininqi üçün güclü tədqiqat platforması yaradır. Bununla belə, standartlaşdırılmış kalibrasiya, real qida matrisi doğrulaması, partiyalararası təkrarlana bilmə, uzunmüddətli sabitlik və tənzimləyici qəbul baxımından LC-MS/MS kimi istinad üsullarını əvəz etdiklərini demək olmaz. Tədqiqat bu texnologiyaları hazır və universal kommersiya həlli kimi deyil, laboratoriya uğurundan etibarlı sahə tətbiqinə keçidi hələ də doğrulama tələb edən inkişaf edən sensor platformaları kimi qiymətləndirir.

Kanamisin niyə qida təhlükəsizliyi baxımından izlənilir?

Kanamisin (KANA), aminoglikozid sinfindən antibiotikdir. Mənbə baytarlıq və heyvandarlıq tətbiqlərində həddindən artıq və ya uyğun olmayan istifadənin heyvan mənşəli qidalarda qalıqlara səbəb ola biləcəyini və buna görə qalıq monitorinqinin qida təhlükəsizliyi baxımından mühüm olduğunu izah edir.

İcmal giriş bölməsində nümunə tənzimləyici hədlər kimi Avropa İttifaqında süd üçün 150 µg/kg və Çində 200 µg/kg maksimum qalıq limiti dəyərlərini göstərir. Bu dəyərlər icmalın mənbə göstərərək verdiyi tənzimləyici nümunələrdir; Verianla tərəfindən yeni və ya müstəqil qanunvericilik qiymətləndirilməsi kimi hazırlanmayıb.

Aptamer nədir və kanamisini necə tanıya bilər?

Aptamer müəyyən bir hədəf molekuluna bağlanmaq üçün seçilən və tipik olaraq təxminən 15–100 nukleotiddən ibarət təkzəncirli DNA və ya RNA oliqonukleotididir; KANA aptasensorlarında aptamer hədəf antibiotiki molekulyar tanınma elementi kimi tanıyır və bağlanma nəticəsində yaranan struktur və ya səthi dəyişiklik daha sonra flüoresans siqnalına çevrilir.

Aptamerlərin anticisim və ferment kimi klassik biotanıma molekullarına alternativ olaraq araşdırılmasının əsas səbəbləri kimyəvi yolla sintez edilə bilmələri, istehsal partiyaları arasında daha nəzarətli tərkib, kimyəvi modifikasiyaya açıq olmaları və müxtəlif sensor arxitekturalarına asanlıqla qoşula bilmələridir.

SELEX nədir?

Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX), böyük təsadüfi nuklein turşusu ardıcıllığı hovuzundan müəyyən hədəfə daha uyğun bağlanma xüsusiyyətləri göstərən ardıcıllıqların ardıcıl seçim və çoxaltma dövrləri ilə zənginləşdirildiyi aptamer seçim üsuludur.

Kiçik molekullarda klassik SELEX-in xüsusi problemi var: hədəfin bərk səthə bağlanması hədəf molekulun əlçatanlığını və ya kimyəvi təqdimatını dəyişə bilər. Bundan əlavə, nuklein turşusu hədəf əvəzinə muncuğa, səthə və ya bağlayıcı kimyəvi qrupa da yapışa bilər. KANA-1 mübahisəsinin əsasında bu ehtimal dayanır.

Capture-SELEX niyə hazırlanmışdır?

Capture-SELEX yanaşmasında kiçik hədəf molekulu səthə bağlamaq əvəzinə oliqonukleotid kitabxanası tamamlayıcı tutma ardıcıllığı vasitəsilə səthə immobilizə edilə bilər. Sərbəst hədəf gəldikdə hədəfə bağlanan namizəd ardıcıllıqlar struktur dəyişikliyə uğrayaraq səthdən ayrıla və seçilə bilər. Bu yanaşma kiçik üzvi hədəfin kimyəvi olaraq immobilizə edilməsindən qaynaqlanan pozulmanı azaltmağı məqsəd qoyur.

KANA aptamerlərinin inkişafı

KANA-2.2 üzərində sonrakı post-SELEX qısaltma və struktur əsaslı optimallaşdırma ilə 42 nukleotidlik KANA-2b_opt variantı hazırlanmış və təxminən 109 ± 15 nM K_d bildirilmişdir. Bu nümunə aptamer seçimindən sonra lazımsız ardıcıllıqların çıxarılmasının və ya struktur arxitekturasının yenidən qurulmasının bağlanma performansını dəyişə biləcəyini göstərir.

Kd ilə LOD arasındakı fərq nədir?

K_d aptamer ilə hədəf arasındakı tarazlıq bağlanmasının termodinamik gücünü ifadə etdiyi halda, LOD bütün sensor sisteminin hədəfi fondan etibarlı şəkildə ayıra bildiyi ən aşağı analit səviyyəsini ifadə edir; siqnal amplifikasiyası sayəsində LOD aptamerin K_d dəyərindən rəqəmsal olaraq çox aşağı ola bilər və bu, təkbaşına aptamerin fövqəladə yüksək affinliyə malik olduğunu göstərmir.

Kd-nin konseptual riyaziyyatı

Mənbə icmal K_d üçün açıq tənlik vermir. Sadə 1:1 bağlanma tarazlığı üçün aşağıdakı standart əlaqə yalnız öyrədici fon kimi istifadə edilə bilər:

\[ A + K \rightleftharpoons AK \]

\[ K_d=\frac{[A][K]}{[AK]} \]

Burada \(A\) sərbəst aptameri, \(K\) sərbəst KANA-nı, \(AK\) isə aptamer–KANA kompleksini göstərir. Konsentrasiyalar eyni vahiddə verildikdə K_d-nin vahidi konsentrasiyadır; bu icmalda əsasən nM və ya µM istifadə olunur.

Sadə və müqayisə edilə bilən şəraitdə daha aşağı K_d daha güclü bağlanmaya uyğun gəlir. Lakin müxtəlif pH, bufer, ion gücü, immobilizasiya forması və ölçmə üsulları ilə əldə edilmiş K_d dəyərlərinin birbaşa sıralanması etibarlı deyil.

LOD niyə Kd-dən aşağı ola bilər?

Sensor yalnız “neçə molekul bağlandı?” sualını passiv şəkildə oxumaq məcburiyyətində deyil. Bir hədəf–aptamer tanınma hadisəsi ferment dövrəsini, DNA walker, HCR, CHA və ya başqa amplifikasiya zəncirini işə sala bilər. Beləliklə, az sayda tanınma hadisəsi çoxsaylı flüoresan məhsul və ya siqnal dəyişikliyi yarada bilər.

Buna görə analitik sistemin LOD-si bağlanma affinliyi + siqnal çevrilməsi + amplifikasiya + fon səs-küyü + optik oxuma + nümunə hazırlığının birgə nəticəsidir.

İcmal müxtəlif tədqiqatların LOD hesablamasında vahid ümumi tənlik istifadə etdiyini göstərmir. Buna görə bütün Cədvəl 2 tədqiqatlarına ortaqmış kimi \(3\sigma/S\) və ya başqa LOD tənliyi aid etmək düzgün deyil.

KANA-1 niyə elmi baxımdan mübahisəlidir?

KANA-1 üçün ilk bildirilmiş 78,8 nM bağlanma dəyəri nişanlı aptamerin KANA ilə modifikasiya edilmiş bərk səthə bağlanmasına əsaslanır. İcmalın istinad etdiyi iki müstəqil ITC tədqiqatı isə sərbəst KANA ilə məhlulda ölçülə bilən eyni spesifik bağlanmanı təsdiq edə bilməmişdir.

İcmal bir-biri ilə ziddiyyət təşkil etməyən iki mümkün izahı müzakirə edir. Birincisi, erkən seçim mərhələlərində bəzi ardıcıllıqların sərbəst KANA əvəzinə bərk səthə və ya bağlayıcı kimyaya meyl göstərmiş ola bilməsidir. İkincisi, nanomaterial və ya nuklein turşusu amplifikasiyası istifadə edən sensor arxitekturalarının qeyri-spesifik kiçik siqnal dəyişikliklərini də böyüdərək güclü görünən analitik cavablar yarada bilməsidir.

Buna görə KANA-1 əsaslı sensorların dərc olunmuş performans məlumatları nəzərə alınmamalı deyil; lakin bu performansların altında duran spesifik molekulyar tanınma ayrıca doğrulanmalıdır.

Nişanlı və nişansız flüoresans aptasensorlar arasında fərq nədir?

Nişanlı aptasensorlarda aptamerə və ya köməkçi DNA ardıcıllığına FAM, Cy3 və ya Cy5 kimi flüoroforlar və ya müəyyən söndürücülər əlavə edilir, nişansız sistemlər isə hədəfə bağlı struktur dəyişikliyini ThT, TO, NMM, SYBR Green I kimi quruluşa həssas boyalar və ya karbon/metal nanoklasterlərinin təbii optik davranışı vasitəsilə oxuyur; nişan aradan qaldırıldıqda sintez və təmizləmə sadələşə bilər, lakin siqnalın matris və ion şəraitindən asılılığı aradan qalxmır.

FRET necə işləyir?

Förster rezonans enerji transferi (FRET), həyəcanlanmış donor flüorofor ilə uyğun spektral xüsusiyyətlərə malik acceptor arasında məsafədən güclü şəkildə asılı enerji ötürülməsidir. Flüorofor ilə söndürücü bir-birinə yaxınlaşdıqda və ya uzaqlaşdıqda flüoresans dəyişə bilər.

Mənbə açıq FRET tənliyi vermir. Standart fiziki əlaqə yalnız öyrədici izah kimi belədir:

\[ E=\frac{1}{1+\left(\frac{r}{R_0}\right)^6} \]

Burada \(E\) FRET səmərəliliyi, \(r\) donor–acceptor arasındakı məsafə, \(R_0\) isə enerji ötürülməsi səmərəliliyinin %50 olduğu xarakterik Förster məsafəsidir. Altıncı dərəcə asılılığı səbəbindən kiçik məsafə dəyişiklikləri böyük flüoresans dəyişikliklərinə çevrilə bilər. Aptasensorlarda hədəfin bağlanmasının DNA konformasiyasını dəyişdirməsi bu məsafə dəyişikliyini yarada bilər.

SET və IFE eyni mexanizm deyil

Surface Energy Transfer (SET), flüorofor ilə xüsusən metal və ya karbon səthi arasındakı enerji ötürülməsinə əsaslanan söndürmə mexanizmidir. Karbon nanoboruları və bəzi nanohissəcik səthləri bu məqsədlə istifadə oluna bilər.

Inner Filter Effect (IFE) isə flüorofor ilə söndürücü arasında həqiqi enerji ötürülməsi tələb etmədən, bir komponentin həyəcanlandırma və ya emissiya işığını udaraq ölçülən flüoresansı azalda bilməsidir. İcmal karbon nöqtələri və graphene oxide quantum dot–AuNP sistemlərində IFE əsaslı arxitekturaları müzakirə edir.

“Turn-on” və “turn-off” sensor nə deməkdir?

Turn-on sistemdə hədəf gəldikdən sonra flüoresans artır. Bu yanaşma aşağı ilkin fon səbəbindən bəzi tətbiqlərdə üstünlük verə bilər. Turn-off sistemdə isə hədəfin bağlanması flüoresansı azaldır. Hər iki siqnal istiqaməti düzgün kalibrasiya və matris nəzarəti təmin edildikdə kəmiyyət ölçməsi üçün istifadə oluna bilər.

Nişanlı sistemlərdə qızıl nanohissəcikləri

Qızıl nanohissəcikləri (AuNPs) yüksək səth sahəsi, DNA adsorbsiyası və güclü flüoresans söndürmə xüsusiyyətləri səbəbindən KANA aptasensorlarında geniş istifadə edilmişdir. Bəzi sistemlərdə FAM nişanlı aptamer AuNP səthinə adsorbsiya olunduqda flüoresans sönür; hədəfin bağlanması aptamerin quruluşunu dəyişdirib onu səthdən uzaqlaşdırdıqda flüoresans bərpa olunur.

İcmal bu mexanizmin real süd kimi zülalla zəngin mühitlərdə ehtiyatla şərh edilməli olduğunu vurğulayır. Zülallar AuNP üzərində “protein corona” yarada bilər və ssDNA-nın birbaşa nanohissəcik səthinə adsorbsiyasını dəyişdirə bilər. Bu vəziyyət təmiz buferdə işləyən mexanizmin işlənməmiş süd və ya serumda eyni şəkildə işləməməsinə səbəb ola bilər.

Qrafen və karbon nanoboruları

Qrafen və karbon nanoboruları π–π qarşılıqlı təsirləri sayəsində təkzəncirli DNA-nı adsorbsiya edə və yüksək söndürmə qabiliyyəti göstərə bilər. İcmalda UCNP–qrafen FRET platformasında KANA-1 aptamerinin qrafenə yaxınlaşması ilə upconversion nanoparticle emissiyasının söndürülməsi, hədəf bağlanması ilə aptamerin ayrılması nəticəsində isə flüoresansın bərpa olunması nümunəsi nəzərdən keçirilir.

Karbon nanoborusu əsaslı başqa bir quruluşda ssDNA və dsDNA-nın CNT-yə fərqli adsorbsiya davranışından istifadə edilmiş və süd analizində 0,4 nM LOD bildirilmişdir.

Siqnal amplifikasiyası niyə istifadə olunur?

Aptamerin tək bir KANA molekulunu tanıması çox kiçik optik dəyişiklik yarada bilər. Nuklein turşusu amplifikasiya sistemləri bu kiçik tanınma hadisəsini çoxsaylı DNA məhsuluna və ya flüorofor dəyişikliyinə çevirməyi məqsəd qoyur.

Ekzonukleaza dəstəkli hədəf geri dövriyyəsi

Exonuclease I və ya Exonuclease III istifadə edən sistemlərdə hədəfin bağlanması müəyyən DNA strukturlarının həzm olunmasını işə sala bilər. Həzm olunduqdan sonra KANA yenidən sərbəst buraxılaraq yeni aptamer molekuluna bağlana bilər. Beləliklə, tək hədəf molekulu bir neçə siqnal dövründə iştirak edə bilər.

Bu mexanizm çox aşağı analit səviyyələrində güclü siqnal yaratmağa kömək edə bilər; lakin sensorun yekun performansı ferment aktivliyi, temperatur, pH, DNA ardıcıllığı və reaksiya müddətinin ciddi nəzarətindən asılıdır.

Bölünmüş aptamer nədir və niyə istifadə olunur?

Bölünmüş aptamer tam uzunluqlu aptamerin hədəfin tanınması zamanı birlikdə işləyən iki və ya daha çox qısa nuklein turşusu fraqmentinə ayrıldığı dizayndır; məqsəd lazımsız qatlanmanı və sintez mürəkkəbliyini azaltmaq, hədəfin əlçatanlığını artırmaq və hədəf olduqda fraqmentlərin yenidən birləşməsini birbaşa siqnal yaratma mexanizminə çevirməkdir.

İcmalda KANA-1 ardıcıllığı iki hissəyə bölünmüşdür:

Bölmə prosesi sadəcə “aptameri ikiyə kəsmək” deyil. Yanlış bölünmə nöqtəsi hədəf bağlanma cibini poza və ya fraqmentlərin yenidən birləşmə enerjisini çox aşağı sala bilər. İcmal çevik loop sahələrinin və ya əsas hədəf bağlanma bölgəsindən uzaq stem–loop birləşmələrinin namizəd kəsim nöqtələri kimi qiymətləndirilə bildiyini, lakin universal split-aptamer dizayn qaydasının hələ mövcud olmadığını bildirir.

Bölmə prosesinin termodinamik dəyəri

Tam uzunluqlu tək molekulun qatlanması ilə iki ayrı fraqmentin məhlulda düzgün mövqedə qarşılaşıb yenidən birləşməsi eyni termodinamik proses deyil. İki fraqmentin birləşməsi əlavə entropik xərc yarada bilər və buna görə intrinsik affinlik tam uzunluqlu aptamerlə müqayisədə azala bilər.

Əvəzində fraqmentlərin ayrı olduqda daha az qeyri-spesifik qatlanma etməsi, hədəf gəldikdə daha seçici yenidən birləşmə təmin etməsi və fon siqnalını azaltması sensor spesifikliyi baxımından üstünlük yarada bilər. Buna görə split aptamer dizaynında yalnız K_d deyil, fon, yenidən birləşmə kinetikası, fraqment konsentrasiyası və real qida matrisi tolerantlığı birlikdə qiymətləndirilməlidir.

Split aptamer + CuAAC

İcmaldakı ilk nümunələrdən biri KANA-S1 və KANA-S2-nin mis(I) katalizli azid–alkin sikloəlavə reaksiyası (CuAAC) ilə birləşdirildiyi sistemdir. Hədəf olmadıqda iki fraqment bir-birindən uzaqda qalır. KANA olduqda fraqmentlərin hədəfin ətrafında bir araya gəlməsi azid və alkin reaktiv qruplarını yaxınlaşdırır və flüoresan triazol məhsulunun əmələ gəlməsinə imkan verir.

Split aptamer + DNA-AgNC + Exo I

Başqa bir sistemdə KANA-S1, KANA-S2 və tamamlayıcı DNA ilə DNA-templated silver nanocluster (DNA-AgNC) flüoresansı birləşdirilmişdir. KANA olduqda duplex strukturundakı dəyişiklik Exonuclease I həzmini və siqnalın azalmasını işə salır. İcmalda bu sistem üçün 1,07 nM LOD və təxminən 45 dəqiqəlik analiz müddəti bildirilmişdir.

Split aptamer + G4/ThT

KANA-S1 və KANA-S1/S2 kombinasiyaları G ilə zəngin olduqları üçün G-kvadrupleks (G4) yarada və Thioflavin T ilə flüoresans verə bilər. KANA bağlanması G4 quruluşunu pozduqda ThT ayrılır və siqnal azalır. İcmalda KANA-S1/ThT üçün 4,88 nM, KANA-S1/S2/ThT üçün 4,53 nM LOD göstərilir.

İlkin emal tətbiq edilmiş və KANA əlavə olunmuş süd nümunələrində bu iki sistem üçün təxminən %97,6–104,5 və %98,4–105,9 geri qazanım aralıqları bildirilmişdir. Bu nəticələr nəzarətli spike-recovery doğrulamasıdır; təbii şəkildə kontaminə olmuş, işlənməmiş hər süd nümunəsində eyni performansın təmin edildiyi demək deyil.

DNA tweezer ilə çoxlu antibiotik aşkarlanması

İcmal KANA və enrofloksasini eyni arxitekturada tanıya bilən iki funksiyalı DNA tweezer dizaynını da nəzərdən keçirir. KANA-S1 və KANA-S2 hədəfi tanıdıqda DNA maqqaş quruluşu bağlanır və flüorofor ilə söndürücü arasındakı məsafə dəyişərək flüoresans azalır.

Bu yanaşma çoxlu qalıq skrininqi baxımından maraqlıdır; lakin FAM və ROX emissiyalarının qismən üst-üstə düşməsi siqnal çarpaz danışmasına səbəb ola bilər. Bundan əlavə, struktur baxımından əlaqəli antibiotiklərə qarşı çarpaz cavab real çoxqalıqlı qida nümunələrində ayrıca sınaqdan keçirilməlidir.

Qida matrisinin təsiri aptasensor performansını niyə dəyişdirir?

Qida matrisi təsiri süd zülalı və yağı, ət komponentləri, şəkərlər, duzlar və digər ionların aptamer bağlanmasını, nanohissəcik səthini və ya flüoresans yaranmasını KANA konsentrasiyasından asılı olmayaraq dəyişdirməsidir; buna görə buferdə əldə edilən aşağı LOD və yüksək siqnal-küy nisbəti real qida nümunəsində avtomatik olaraq qorunmur.

Süddə protein corona problemi

Xüsusilə AuNP əsaslı sensorlarda zülalların nanohissəcik səthinə adsorbsiya olaraq zülal qatı yaratması vacibdir. Aptamer artıq birbaşa qızıl səthlə deyil, bu yeni səth mühiti ilə qarşılıqlı təsir göstərə bilər. Aptamer adsorbsiyası və hədəfə bağlı desorbsiya sensorun əsas mexanizmidirsa, bu vəziyyət siqnal məntiqini dəyişə bilər.

İonlar və G-kvadrupleks

G4 strukturları ətrafdakı ionlardan təsirlənir. Buna görə G4/ThT və ya G4/NMM istifadə edən nişansız sistemlərdə qidanın təbii ion tərkibi, hədəf KANA olmasa belə, G4 qatlanma tarazlığını və boya flüoresansını dəyişə bilər.

Nümunənin ilkin işlənməsi niyə qaçılmaz ola bilər?

İcmalın açıq nəticəsi budur ki, bütün qida növləri üçün vahid universal ilkin işləmə protokolu yoxdur. Sensor mexanizmi, hədəf konsentrasiya aralığı və qida matrisi birlikdə qiymətləndirilməlidir.

Geri qazanım faizi nəyi göstərir?

İcmaldakı bir çox sensor tədqiqatı məlum miqdarda KANA əlavə olunmuş süd, bal, balıq və ya ət nümunələrində geri qazanım testləri barədə məlumat verir. Geri qazanım əlavə edilmiş analitin analiz sonunda nə qədərinin ölçülə bildiyini qiymətləndirir.

Mənbə vahid ümumi geri qazanım tənliyi vermir. Spike-recovery təcrübələri üçün standart öyrədici ifadə belədir:

\[ \mathrm{Recovery}(\%)= \frac{C_{\mathrm{spike\ sonrası}}-C_{\mathrm{başlangıç}}} {C_{\mathrm{eklenen}}} \times100 \]

Təxminən %100 geri qazanım əlavə edilmiş miqdarın böyük hissəsinin düzgün ölçüldüyünü düşündürür. %100-dən bir qədər yuxarı nəticələr də eksperimental qeyri-müəyyənlik, kalibrasiya və ya matris təsiri səbəbindən yarana bilər. Yaxşı geri qazanım sensorun bütün real sahə nümunələrində tənzimləyici istinad üsulu qədər dəqiq olduğunu təkbaşına sübut etmir.

RSD nəyi ölçür?

Relative Standard Deviation (RSD), təkrar ölçmələrin orta qiymətə nisbətən nisbi səpələnməsini göstərir. Mənbə vahid RSD düsturu vermir; standart öyrədici tərif:

\[ \mathrm{RSD}(\%)=\frac{s}{\bar{x}}\times100 \]

Burada \(s\) standart sapma, \(\bar{x}\) isə təkrar ölçmələrin orta qiymətidir. Daha aşağı RSD müvafiq eksperimental şəraitdə daha aşağı nisbi ölçmə dəyişkənliyinə işarə edir; lakin laboratoriya daxilində aşağı RSD müxtəlif istehsal partiyaları, cihazlar və qida matrisləri arasındakı uzunmüddətli təkrarlana bilməni avtomatik olaraq sübut etmir.

Tədqiqatın metodu və nəticələri

Bu tədqiqat yeni eksperiment aparmır. Wang və Qiu dərc edilmiş KANA aptamerlərini və flüoresans aptasensor tədqiqatlarını bir araya gətirərək seçim strategiyaları, bağlanmanın xarakterizasiyası, LOD, xətti diapazon, analiz şəraiti, qida matrisi, nümunənin ilkin işlənməsi, geri qazanım, RSD və sensor mexanizmi baxımından tənqidi şəkildə müqayisə edir.

Mənbə PRISMA axın diaqramı, əvvəlcədən qeydiyyatdan keçmiş sistematik icmal protokolu, ətraflı verilənlər bazası axtarış sətirləri və ya meta-analiz metodu barədə məlumat vermir. Buna görə tədqiqat Verianla-da formal sistematik icmal və ya meta-analiz kimi təsnif edilməyib.

Cədvəl 2 necə oxunmalıdır?

İcmalın ən geniş məlumat cədvəli müxtəlif flüoresans KANA sensorlarını müqayisə edir. Lakin sətirlər fərqli laboratoriyalara, fərqli aptamerlərə, fərqli qida matrislərinə, fərqli pH-lara, temperaturlara, reaksiya müddətlərinə, ilkin işləmə üsullarına və amplifikasiya arxitekturalarına aiddir.

Buna görə “LOD-si ən kiçik olan sətir ən yaxşı sensordur” şəklində birölçülü sıralama elmi baxımdan düzgün deyil.

Bu cədvəl icmalın əsas konseptual dərsini görünən edir: ITC ilə güclü bağlanan KANA-5-in bir sensor dizaynındakı LOD-si güclü amplifikasiya istifadə edən KANA-1 platformalarının LOD-sindən çox yüksək ola bilər. Sensor həssaslığı ilə molekulyar bağlanma affinliyi fərqli səviyyələrdir.

Nişanlı platformaların kəmiyyət meyli

İcmal amplifikasiyasız AuNP əsaslı nişanlı sistemlərdə LOD dəyərlərinin təxminən 0,0001–71,53 nM kimi çox geniş diapazonda bildirildiyini qeyd edir. Bu genişlik nanohissəcik ölçüsünün, səth kimyasının, aptamer sıxlığının, mühit ionlarının və oxuma quruluşunun performansa güclü təsir göstərə bildiyini göstərir.

Qrafen və CNT əsaslı sistemlər daha dar diapazonda nümunələnmiş və təxminən 0,018–0,4 nM səviyyələrində LOD-lar bildirilmişdir. UCNP–qrafen FRET sistemi əlavə nuklein turşusu amplifikasiyası olmadan 0,018 nM səviyyəsinə çatan nümunələrdən biridir.

Ferment dəstəkli və nuklein turşusu amplifikasiyalı sistemlər daha aşağı LOD-lara çata bilər; bunun müqabilində reaksiya komponentlərinin sayı, müddət və optimallaşdırma mürəkkəbliyi artır.

Nişansız platformaların kəmiyyət meyli

G4/intercalator boya sistemlərində icmal təxminən 0,3–59 nM arasında LOD dəyərləri bildirir. Bu platformaların performansı yalnız hədəfdən deyil, istifadə olunan boyanın xüsusiyyətlərindən, G4 topologiyasından və mühit ionlarından da asılıdır.

Carbon dots və graphene oxide quantum dots əsaslı IFE sistemlərində təxminən 3,6–18 nM səviyyəsində LOD-lar bildirilmişdir. Bu sistemlər hazırlama asanlığı və fotostabillik üstünlüyü təqdim etsə də, güclü amplifikasiya olmadıqda analitik həssaslıq daha məhdud ola bilər.

Metal nanoklaster sistemlərində təxminən 1,2 × 10⁻³–22,6 nM arasında LOD-lar bildirilmiş; RCA və ya DNA walker kimi amplifikasiyalarla daha aşağı səviyyələrə enilmişdir. Ratiometrik dizaynlar ikinci flüoresans kanalını daxili istinad kimi istifadə etməklə matris mənşəli siqnal sürüşməsini qismən kompensasiya edə bilər.

Ratiometrik flüoresans niyə vacibdir?

Təkkanallı flüoresans ölçməsində işıq mənbəyi, prob miqdarı, cihaz həssaslığı və ya matris dəyişikliyi siqnalı hədəfdən asılı olmayaraq dəyişə bilər. Ratiometrik sistem hədəfə həssas bir kanalla daha sabit istinad kanalının nisbətindən istifadə edir. Bu daxili normallaşdırma bütün müdaxilələri aradan qaldırmasa da, siqnal sürüşməsini azalda bilər.

Mənbədə önə çıxan real nümunə doğrulamaları

AuNP əsaslı bəzi süd tədqiqatlarında təxminən %96–105 aralığında geri qazanım və aşağı təkrəqəmli RSD dəyərləri bildirilmişdir. CNT əsaslı süd analizində %98,5–103 geri qazanım və təxminən %3,81–4,67 RSD bildirilmişdir. HCR/SG I yanaşmasında süd, balıq və donuz əti üçün %90,2–114,0 geri qazanım və təxminən %1,13–3,25 RSD göstərilmişdir.

Bu dəyərlər fərqli tədqiqatlardan gəldiyi üçün eyni sensorun müxtəlif versiyaları kimi birləşdirilməməlidir. Geri qazanım aralıqlarının %100-ə yaxın olması nəzarətli əlavəetmə təcrübələrində dəqiqliyin yaxşı ola biləcəyini göstərir; lakin real bazar nümunələrində tənzimləyici üsula bərabər performansın sübutu deyil.

KANA-4-ün pH asılılığı

KANA-4 yüngül turş mühit şəraitində seçilmiş aptamerdir. İcmal ITC ilə təxminən 0,32 µM K_d bildirir, pH yüksəldikcə affinliyin zəiflədiyini və pH 7,5 ətrafında təxminən 2 µM səviyyəsinə enə bildiyini qeyd edir.

Bu nəticə “aptamerin K_d-si sabit və dəyişməz identifikasiya nömrəsidir” yanaşmasının yanlış olduğunu göstərir. Bağlanma tarazlığı bufer və pH kimi şərtlərdən asılıdır.

KANA-5 niyə vacibdir?

KANA-5 əvvəllər aşağı ardıcıllıq zənginləşməsi səbəbindən nəzərdən çıxarılmış bir Capture-SELEX təcrübəsindəki aşağı bolluqlu ardıcıllıqların yenidən araşdırılması ilə müəyyən edilmişdir. ITC pH 7,5-də 51 ± 5 nM K_d göstərmişdir. Nüvə maqnit rezonansı (NMR) analizi ligand bağlandıqda aptamerin daha yaxşı müəyyən edilmiş üçölçülü bağlanma cibi yaradacaq şəkildə qatlandığını göstərmişdir.

Bu vəziyyət yalnız aşağı rəqəmsal K_d dəyəri əldə etməkdən daha əhəmiyyətlidir; bağlanmanın struktur əsasına dair müstəqil məlumat verir. Bununla belə, KANA-5-in bəzi tobramisin çarpaz bağlanmaları göstərməsi güclü affinliyin mütləq seçicilik demək olmadığını da xatırladır.

Seçicilik niyə yalnız “başqa antibiotiklərlə sınaqdan keçirildi” demək deyil?

Aminoglikozidlər oxşar kimyəvi motivləri paylaşa bilər. İcmal KANA sensorlarının çoxunda struktur baxımından əlaqəsiz antibiotiklərlə nəzarət aparıldığını, buna qarşılıq digər aminoglikozidlərə qarşı sistematik çarpaz reaktivlik testlərinin daha məhdud olduğunu bildirir.

Həqiqi seçicilik qiymətləndirilməsi yalnız penisillin və ya tetrasiklin kimi çox fərqli molekullarla deyil, KANA-ya kimyəvi baxımdan yaxın aminoglikozid analoqları ilə də aparılmalıdır.

Ağıllı telefon və daşına bilən oxuma

İcmal kağız mikroaxın cihazlarını, əl fluorometrlərini və ağıllı telefon əsaslı flüoresans görüntüləməni sahə istifadəsi üçün mümkün yollar kimi qiymətləndirir. Telefon kamerası aşağı qiymət və əlçatanlıq üstünlüyü verə bilər; lakin kamera modelləri, ətraf işıq və görüntü emalı alqoritmləri arasındakı dəyişkənlik kəmiyyət təkrarlana bilməsinə təsir göstərə bilər.

Buna görə “telefonla görüntülənə bilir” ifadəsi təkbaşına tənzimləyici dəqiqlikdə daşına bilən cihaz əldə edildiyi demək deyil.

Maşın öyrənməsi icmalda hansı rolda nəzərdən keçirilir?

Maşın öyrənməsi bu məqalənin eksperimental olaraq sınaqdan keçirdiyi sensor komponenti deyil; nəticə və gələcək perspektivlər bölməsində gələcək siqnal emalı yanaşması kimi müzakirə olunur. Çoxölçülü flüoresans barmaq izləri, ratiometrik siqnallar və ya excitation–emission matrix verilənlərindən istifadə etməklə matris mənşəli fon ilə hədəf siqnalının daha yaxşı ayrılması potensialı nəzərdən keçirilir.

İcmal həmçinin məlumat əldə edilməsinin standartlaşdırılmasının, reprezentativ təlim verilənlər dəstlərinin, fərqli qida matrisləri arasında model ötürülə bilməsinin və daşına bilən cihazlarda işləyə biləcək şərh edilə bilən yüngül alqoritmlərin vacib olduğunu vurğulayır. Buna görə maşın öyrənməsi mövcud matris problemini avtomatik həll edən sübut olunmuş həll deyil, araşdırılmalı tamamlayıcı istiqamətdir.

LC-MS/MS ilə aptasensorların rolu niyə fərqlidir?

İcmal LC-MS/MS-ni antibiotik qalıqlarının dəqiq kəmiyyət analizi və çoxanalitli ölçmə baxımından istinad yanaşması kimi qiymətləndirir. Flüoresans aptasensorların əsas üstünlüyü daha az cihaz tələbi, qısa analiz müddəti və daşına bilmə potensialıdır.

Buna görə gələcəkdə mümkün istifadə modeli yalnız “LC-MS/MS əvəzinə sensor” olmaq məcburiyyətində deyil. Sürətli sahə skrininqinin aptasensorla aparıldığı və təsdiq tələb edən nümunələrin istinad laboratoriya üsuluna göndərildiyi pilləli yanaşmalar texniki baxımdan daha real ola bilər. Lakin bu son cümlə tədqiqat nəticəsi deyil, icmalın ortaya qoyduğu performans fərqindən çıxarılan tətbiq səviyyəli izahlı nəticədir.

İcmalın güclü tərəfləri

Tədqiqat yalnız LOD siyahısı təqdim etmir. Aptamer seçim üsulunu, doğrulama texnikasını, siqnal çevirmə mexanizmini, real nümunənin ilkin işlənməsini, matris təsirini, amplifikasiya arxitekturasını və sahə tətbiqi problemlərini eyni çərçivədə müzakirə edir.

Xüsusilə KANA-1 barədə uzun müddətdir davam edən bağlanma mübahisəsini sensor performans cədvəli ilə birlikdə nəzərdən keçirməsi “çox həssas sensor = çox yaxşı aptamer” şəklində sadələşdirici şərhin qarşısını alır.

İcmalın və sahənin əsas məhdudiyyətləri

Mənbə müxtəlif sensor tədqiqatlarındakı eksperimental şərtlərin standart olmadığını göstərir. pH, temperatur, inkubasiya müddəti, nümunə hazırlığı və matris fərqli olduğundan LOD-ların birbaşa sıralanması məhduddur.

KANA-1-in spesifik məhlul-fazada bağlanma qabiliyyəti tam həll edilməmişdir. Buna baxmayaraq ədəbiyyatdakı sensorların böyük hissəsi KANA-1 istifadə edir.

Bir çox tədqiqat spiked nümunələrlə doğrulanmışdır; təbii kontaminasiya və geniş real bazar nümunələri üçün doğrulama daha məhduddur.

Partiyalararası sensor istehsalının təkrarlana bilməsi və uzunmüddətli sabitlik bir çox platformada sistematik şəkildə bildirilmir.

Nanomaterialların səth kimyası və xüsusən metal nanoklasterlərin əmələ gəlməsi istehsal partiyaları arasında dəyişkənlik yarada bilər.

Fərqli qidalar üçün universal nümunə ilkin işləmə üsulu yoxdur.

Tənzimləyici qəbul üçün kalibrasiya, keyfiyyətə nəzarət, istinad üsulu ilə müqayisə və çoxmərkəzli doğrulama baxımından əlavə tədqiqat tələb olunur.

Tədqiqatın dəstəklədiyi nəticələr

• Aptamer əsaslı flüoresans platformalar KANA üçün çox aşağı analitik aşkarlama hədlərinə çata bilən müxtəlif sensor arxitekturalarına imkan verir.
• Kd və LOD fərqli fiziki və analitik anlayışlardır və bir-birinin yerinə istifadə oluna bilməz.
• KANA-1 çoxsaylı sensorda istifadə olunsa da, spesifik məhlul bağlanması barədə mühüm doğrulama qeyri-müəyyənliyi qalır.
• KANA-5 ITC və NMR ilə daha güclü struktur/termodinamik doğrulamaya malik yeni nəsil namizədlərdən biridir.
• Nişanlı və nişansız sistemlərin fərqli xərc, mürəkkəblik, həssaslıq və matris tolerantlığı profilləri var.
• Siqnal amplifikasiyası LOD-ni ciddi şəkildə aşağı sala bilər, lakin üsulu daha mürəkkəb və fon siqnalına daha həssas edə bilər.
• Bölünmüş aptamerlər struktur sadəliyi və hədəfə bağlı yenidən birləşmə baxımından üstünlük verə bilər; lakin müstəqil bağlanma doğrulaması hələ də lazımdır.
• Qida matrisi və nümunənin ilkin işlənməsi real analitik performansın mərkəzi komponentləridir.
• Flüoresans aptasensorlar sahə skrininqi baxımından ümidvericidir, lakin LC-MS/MS-nin tənzimləyici kəmiyyət doğrulama rolunu hələ ümumilikdə öz üzərinə götürməyib.

Tədqiqatın dəstəkləmədiyi nəticələr

İcmal bütün KANA-1 sensorlarının yanlış işlədiyini göstərmir. Müzakirə olunan problem müşahidə edilən analitik siqnalın nə dərəcədə spesifik KANA–aptamer bağlanmasına əsaslandığının hər platformada yetərincə doğrulanmamasıdır.

Tədqiqat vahid “ən yaxşı KANA sensoru” müəyyən etmir. Ən aşağı LOD-yə malik sistem eyni zamanda ən yüksək spesifikliyə, ən qısa müddətə, ən sadə ilkin işləməyə, ən yüksək təkrarlana bilməyə və ya ən yaxşı real qida performansına malik olmaya bilər.

Spiked süd, balıq, ət və ya bal nümunələrində yaxşı geri qazanım dəyərləri bütün təbii qida nümunələri üçün eyni dəqiqliyə zəmanət vermir.

İcmal flüoresans aptasensorların hazırkı vəziyyətdə tənzimləyici laboratoriya üsullarını tamamilə əvəz etdiyini və ya kommersiyalaşdırma probleminin həll olunduğunu göstərmir.

Maşın öyrənməsinin matris təsirini həll etdiyini sübut etmir; onu gələcəkdə araşdırılmalı siqnal emalı istiqamətlərindən biri kimi müzakirə edir.

Gələcək tədqiqatlar üçün mənbədə önə çıxan tələblər

İcmal gələcəkdə xüsusilə məhlulda müstəqil şəkildə doğrulanmış yüksək affinlikli aptamerlərə, sistematik aminoglikozid seçicilik testlərinə, fərqli real qida matrislərində standartlaşdırılmış doğrulamaya, partiyalararası istehsal nəzarətinə, uzunmüddətli sabitlik tədqiqatlarına və daha sadə nümunə hazırlama üsullarına ehtiyac olduğunu bildirir.

Daşına bilən fluorometrlər, kağız əsaslı platformalar və ağıllı telefon oxuması sahə tətbiqini asanlaşdıra bilər. Lakin cihazlararası kalibrasiya və ölçmə standartlaşdırılması olmadan daşına bilmə təkbaşına kəmiyyət etibarlılığı təmin etmir.

Sənaye və tənzimləyici istifadəyə keçid üçün standart istehsal prosesləri, keyfiyyətə nəzarət meyarları, sabitlik protokolları və fərqli qida matrislərini əhatə edən geniş doğrulama verilənlər dəstləri tələb olunur.

Mənbə və metod qeydi

Orijinal başlıq: Aptamer-Based Fluorescent Biosensors for Kanamycin Detection in Food Systems: Design Strategies, Sensing Mechanisms, and Practical Applications.

Müəlliflər: Shijing Wang; Jieqiong Qiu.

Məsul müəllif: Jieqiong Qiu.

Bərabər töhfə: Mənbədə bərabər töhfə və ya birgə birinci müəlliflik bəyanatı yoxdur.

Qurum: College of Life Sciences and Medicine, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China.

Jurnal: Foods.

Nəşriyyatçı: MDPI, Basel, Switzerland.

Cild / say / məqalə nömrəsi: 15(15), 2758.

DOI: 10.3390/foods15152758.

Rəsmi nəşr qeydi: MDPI Foods məqalə səhifəsi; DOI vasitəsilə əlçatandır.

Təqdimetmə tarixi: 29 iyun 2026.

Reviziya tarixi: 30 iyul 2026.

Qəbul tarixi: 2 avqust 2026.

Nəşr tarixi: 5 avqust 2026.

Akademik redaktor: Seyed-Ahmad Shahidi.

Mənbə növü: Review. Tədqiqat yeni laboratoriya eksperimenti və ya meta-analiz deyil.

Resenziya statusu: Foods, MDPI tərəfindən nəşr olunan resenziyalı beynəlxalq qida elmi jurnalıdır. Fərdi resenziya hesabatları bu qiymətləndirmədə araşdırılmayıb.

Lisenziya: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Müəllif töhfələri: Konseptuallaşdırma S.W. və J.Q.; ədəbiyyat axtarışı və təhlil, ilkin layihə, metod və tədqiqat S.W.; vizuallaşdırma S.W. və J.Q.; resurslar, nəzərdən keçirmə/redaktə, nəzarət, layihə idarəetməsi və maliyyələşmənin təmin edilməsi J.Q. tərəfindən bildirilib.

Maliyyələşmə: Foundation of Zhejiang Sci-Tech University, China; Grant No. 23042137-Y.

Etika komitəsi: Tətbiq edilmir; tədqiqat insan və ya heyvan üzərində yeni eksperiment aparılan araşdırma deyil.

Məlumatlandırılmış razılıq: Tətbiq edilmir.

Verilənlərin əlçatanlığı: Müəlliflər bu icmalda yeni verilənlərin yaradılmadığını və ya təhlil edilmədiyini və buna görə verilənlərin paylaşılmasının tətbiq edilə bilmədiyini bildiriblər.

Maraqlar toqquşması: Müəlliflər tədqiqata təsir göstərə biləcək məlum maliyyə marağı və ya şəxsi münasibət olmadığını bildiriblər.

Əsas mənbə quruluşu: İcmal KANA aptamerlərini, nişanlı flüoresans üsullarını, nişansız üsulları, split-aptamer tətbiqlərini, real qida matrislərini və gələcək sahə tətbiqlərini müqayisə edir.

Əsas metodoloji sərhəd: Müqayisə olunan sensor performansları heterogen mənbələrdən gəlir. Fərqli LOD dəyərləri eyni eksperimental şəraitdə və ya eyni qida matrisi üzərində əldə edilməyib. Buna görə rəqəmsal performans sıralaması üsulların bütöv üstünlüyü kimi şərh edilməməlidir.

KANA-1 doğrulama qeydi: İlk immobilizə edilmiş hədəf tədqiqatındakı 78,8 nM görünən Kd sonrakı məhlul-faza ITC analizlərində eyni şəkildə təsdiq edilməyib. İcmal bunu sahənin həll edilməmiş əsas problemlərindən biri kimi qiymətləndirir.

Şəkil metodu: Mənbədə aptamer ikincili strukturları, AuNP, qrafen/CNT, amplifikasiya, G4 boya, metal nanoklaster və split-aptamer mexanizmlərini əhatə edən doqquz şəkil ailəsi var. Verianla məzmununda mənbə şəkillərinin piksel kompozisiyası köçürülməyib; mərkəzi elmi əlaqələr orijinal, miqyassız SVG sxemləri ilə yenidən ifadə edilib.

Formula qeydi: Mənbə məqalə Kd, LOD, recovery, RSD və FRET kimi anlayışlardan istifadə edir, lakin onların ümumi riyazi tənliklərini formula kimi vermir.