HyAT аминотрансферазаи вобаста ба пиридоксал 5′-фосфат (Pyridoxal 5′-phosphate, PLP) мебошад, ки аз пайдарпаии геномии вобаста ба Hymenobacter sp. PAMC 26554, ки аз лишайникҳои Антарктика ҷудо шудааст, интихоб гардида, дорои печиши синфи III буданаш пешбинӣ шудааст. Ин таҳқиқот ба ҷойи чен кардани суръати реаксияи биохимиявӣ ё интихобпазирии субстрати HyAT, чаҳорчӯбаи сохтории марбут ба вазифаи каталитикии ферментро шарҳ медиҳад. Муҳаққиқон сохтори кристаллии apo-и HyAT, яъне сохтореро, ки дар он кофактор ё субстрати пайвастшуда нишон дода нашудааст, бо ҳалли 2,31 Å муайян кардаанд; минтақаҳои чандири наздики ҷойи фаъолро бо ултрасентрифугакунии таҳлилӣ, муқоисаҳои кристаллографӣ, таҳлили B-фактор, ҷустуҷӯи гомологҳои сохторӣ ва муқоисаи пайдарпаӣ омӯхтаанд.

HyAT дар маҳлул ҳамчун гомотетрамери устувор мушоҳида шудааст. Бо вуҷуди ин, ҷойи фаъоли каталитикӣ дар дохили як мономер пурра ташаккул намеёбад: β-қабати марказии як мономер бо спиралҳои α1, α2 ва α11 дар домени калони мономери ҳамсоя якҷоя шикофи байнисубъединиро ташкил медиҳанд. Аз ин рӯ, тетрамерро аз ҷиҳати сохторӣ метавон ҳамчун пайвастшавии пушт-ба-пушти ду гомодимери функсионалӣ тасаввур кард; ҳар як гомодимер ду ҷойи фаъоли симметрӣ дорад.

Натиҷаи марказии таҳқиқот ин аст, ки ҳалқаи α10–α11, ки ба даромадгоҳи ҷойи фаъол ҳамсоя аст, дар apo-HyAT чандирии равшани сохторӣ нишон медиҳад. Дар ин ҳалқа, ки боқимондаҳои D303–S314-ро дар бар мегирад, пайдарпаии 303-DDKPLPLGLTYS-314 ҷойгир аст ва пролинҳои P306 ва P308 мотиви P-x-P-ро ташкил медиҳанд. “x” дар ифодаи мотив мавқеи ягонаи аминокислотаро байни ду пролин нишон медиҳад; дар HyAT ин мавқеъ L307, яъне лейцин аст. Муҳаққиқон пешниҳод мекунанд, ки хусусиятҳои геометрии пролинҳо, ки метавонанд ташаккули спиралро халалдор кунанд, метавонанд гирифтани сохтори дуюмдараҷаи сахтро аз ҷониби ин ҳалқа маҳдуд карда, ба чандирии маҳаллӣ саҳм гузоранд.

Дар сохтори apo на танҳо ҳалқаи α10–α11, балки минтақаи N-терминалӣ низ бетартиб аст. Тақрибан боқимондаҳои N-терминалии 1–31 дар зичии электронӣ ҳал нашудаанд ва дар аксари ҳашт мономери мустақил модел аз P32 оғоз карда шудааст. Баръакс, ядрои сафеда дар байни ҳашт мономер бо тақрибан 0,30 Å RMSD хеле хуб ҳампӯш мешавад. Ин зиддият нишон медиҳад, ки ҳангоми нигоҳ доштани печиши умумии сафеда, минтақаҳои муайяни атрофи ҷойи фаъол метавонанд хеле ҳаракатноктар бошанд.

Муҳаққиқон apo-HyAT-ро махсусан бо аминотрансферазаи Vibrio fluvialis, ки сохторҳои apo ва бо PMP пайвастшудаи он маълуманд, ва бо дигар гомологҳои синфи III-и бо лиганд пайвастшуда муқоиса кардаанд. Он ки дар гомологҳо дар ҳолати пайвастшавии кофактор/лиганд ҳалқаҳои мувофиқ тартибноктар ва бозуи N-терминалӣ устувортар мебошанд, онҳоро ба пешниҳоди модели гузариш аз бетартибӣ ба тартиб барои HyAT овардааст. Аммо ин таҳқиқот сохтори кристаллии бо лиганд пайвастшудаи HyAT-ро ҳал накардааст. Аз ин рӯ, он ки лиганд ҳалқаи P-x-P-и HyAT-ро мустақиман мебандад ё минтақаи N-терминалиро мустақиман устувор мекунад, ҳанӯз натиҷае нест, ки дар худи HyAT аз ҷиҳати сохторӣ нишон дода шуда бошад; ин гипотезаи механистиест, ки бо муқоисаи гомологҳо дастгирӣ мешавад.

Нигоҳдории минтақаи дорои P-x-P на танҳо дар HyAT-и аз Антарктика, балки дар гомологҳои гипертермофилӣ, аз қабили Pyrococcus horikoshii OT3, Thermococcus kodakarensis KOD1 ва Thermococcus litoralis DSM 5473, муҳаққиқонро ба тафсири васеътари эволютсионӣ овардааст. Муаллифон пешниҳод мекунанд, ки бо вуҷуди талаботи гуногуни устувории скелети глобалии сафеда дар муҳитҳои хеле сард ва хеле гарм, мотиви пролин метавонад роҳи ҳалли умумӣ барои нигоҳ доштани ҳаракатнокии маҳаллӣ дар атрофи ҷойи фаъол бошад. Ин тафсири эволютсияи конвергентӣ озмоиши мустақими мутобиқшавӣ нест; он тафсири илмиест, ки ба муқоисаи пайдарпаӣ ва сохтор асос ёфтааст.

Аминотрансфераза ва PLP чист?

Аминотрансферазаҳо оилаи ферментҳое мебошанд, ки метавонанд гурӯҳи аминро аз аминокислота ба кетокислота ё ба самти баръакс интиқол диҳанд. Ин реаксияҳо дар маркази равандҳое чун мубодилаи нитрогени ҳуҷайравӣ, биосинтези аминокислотаҳо ва таҷзияи аминокислотаҳо қарор доранд. Бисёр аминотрансферазаҳо барои катализ кофактори пиридоксал 5′-фосфат (PLP)-ро истифода мебаранд. PLP молекулаи ёрирасонест, ки дар давоми реаксия ба табдили химиявии гурӯҳи амин миёнаравӣ мекунад. Шакли аминшудаи PLP пиридоксамин 5′-фосфат (PMP) ном дорад.

Таҳқиқоти манбаъ тамоми механизми реаксияи аминотрансферазаро аз нав намесанҷад. Маълумоти PLP/PMP дар ин ҷо барои фаҳмидани он зарур аст, ки сохтори HyAT дар атрофи кадом кофактор амал мекунад. Дар ин таҳқиқот барои HyAT арзиши мустақиман ченшудаи \(K_m\), \(k_{cat}\), ҳарорати оптималӣ ё махсусияти субстрат дода нашудааст.

Хусусияти сохтории аминотрансферазаҳои синфи III

Аминотрансферазаҳо аз рӯйи монандии пайдарпаӣ ва хусусиятҳои печиш ба синфҳои гуногун ҷудо мешаванд. Аминотрансферазаҳои синфи III печиши паймоне доранд, ки дар марказ β-қабат ва дар атрофи он α-спиралҳо ҷойгиранд. Дар ин оила воҳиди функсионалӣ аксаран димер ё тетрамер аст ва ҷойҳои фаъол дар интерфейсҳое ташаккул меёбанд, ки субъединиҳо бо ҳам тамос доранд.

Ин хусусият муҳим аст; зеро “ҷойи фаъол” танҳо ҷайбе нест, ки дар як занҷири сафеда ҷой гирифта бошад. Дар HyAT, вақте унсурҳои сохтории як мономер ва унсурҳои сохтории мономери ҳамсоя ба мавқеи дурусти фазоӣ меоянд, ҷайби барои катализ зарур пурра мешавад. Аз ин рӯ, тарзи пайвастшавии субъединиҳо қисми вазифаи сохтории фермент мебошад.

HyAT чӣ гуна интихоб шуд?

Муҳаққиқон пайдарпаии аминотрансферазаҳои синфи III-ро ҳамчун дархост истифода бурда, ба пайдарпаии сафедаи эҳтимолӣ бо рақами дастрасии NCBI AMR27191.1 расиданд. Дар ҳоле ки бахши усулҳои манбаъ хабар медиҳад, ки ин пайдарпаӣ дар пайдарпаии пурраи геномии Hymenobacter psoromatis PAMC 26554, ки аз лишайникҳои Антарктика ҷудо шудааст, ҷой дорад, сафеда дар тамоми таҳқиқот аз Hymenobacter sp. PAMC 26554 сарчашма гирифта, HyAT номида шудааст. Пайдарпаии домен бо InterProScan ҳамчун аминотрансферазаи синфи III аннотатсия шудааст.

Манбаъ хабар намедиҳад, ки барои HyAT рақами муайяни формалии EC таъйин шудааст, зеро озмоишҳои функсионалии кофӣ вуҷуд надоранд. Аз ин рӯ, ин таҳқиқоти сохторӣ муайян накардааст, ки сафеда кадом субстратҳои дақиқи биохимиявиро бо кадом суръат табдил медиҳад.

Чаро Мотиви P-x-P дар HyAT Муҳим Аст?

Мотиви P-x-P дар HyAT пайдарпаии P306–L307–P308 мебошад, ки дар ҳалқаи α10–α11-и даромадгоҳи ҷойи фаъол ҷойгир аст ва муҳаққиқон пешниҳод мекунанд, ки ду пролин бо маҳдуд кардани ташаккули сохтори дуюмдараҷаи маҳаллӣ метавонанд ба чандир мондани ҳалқа дар ҳолати apo мусоидат кунанд. Аҳамияти ин мотив аз афзоиши мустақиман ченшудаи суръати каталитикӣ не, балки аз он бармеояд, ки зичии электронӣ, B-фактор, фарқиятҳои сохтории байни мономерҳо ва муқоисаҳои гомологӣ ҳамон минтақаро ҳаракатнок нишон медиҳанд.

Чаро пролин аминокислотаи махсус аст?

Азбаски занҷири паҳлуии пролин ба нитрогени скелет бармегардад ва пайваст мешавад, он геометрияи скелетро нисбат ба бисёр аминокислотаҳои дигар сахттар маҳдуд мекунад. Ин хусусият метавонад пайвастагии баъзе геометрияҳои спиралиро вайрон кунад. Таҳқиқоти манбаъ чунин шарҳ медиҳад, ки хусусияти “helix breaker”-и P306 ва P308 метавонад ба пешгирии ташаккули сохтори дуюмдараҷаи сахт дар ҳалқаи α10–α11 мусоидат кунад.

Ин маънои онро надорад, ки “азбаски ду пролин мавҷуд аст, чандирии ҳалқа ҳатман танҳо аз пролинҳо сарчашма мегирад”. Таҳқиқот мотиви P-x-P-ро ҳамчун номзади муҳими сохторӣ муайян мекунад; озмоише, ки таъсири мотивро бо мутацияҳои ҷудогона санҷад, анҷом дода нашудааст.

Ҳалқаи α10–α11 дақиқ дар куҷост?

Дар манбаъ ҳалқаи чандири α10–α11 байни боқимондаҳои D303–S314 муайян карда мешавад. Ҳалқа ба даромадгоҳи шикофи ҷойи фаъол ҳамсоя аст. Ҳалқаи α1–α2 дар якҷоягӣ бо P86–K91 қисми деворҳои паҳлуии каналеро ташкил медиҳад, ки субстрат ё кофактор аз он ба ҷойи фаъол дастрасӣ пайдо мекунад.

Аз ин рӯ, чандирии ҳалқа танҳо ҳаракати дурдасти сатҳӣ нест; он бевосита дар паҳлуи геометрияи даромадгоҳи ҷойи фаъол ба амал меояд. Асоси сохтории идеяи “gating” ё дарвозабонии муаллифон ҳамин аст.

B-фактор чиро нишон медиҳад?

B-фактори кристаллографӣ параметрест, ки бо бетартибии мавқеӣ ё ҳаракатнокии атомҳо дар дохили сохтори кристаллӣ алоқаманд буда, бо воҳиди Ų ифода мешавад. Дар Расми 2-и манбаъ минтақаҳои дорои B-фактори пасттар борик/кабуд ва минтақаҳои дорои B-фактори баландтар, ки бинобар ин чандиртар тафсир мешаванд, ғафс/сурх нишон дода шудаанд. Ҳалқаҳои α1–α2 ва α10–α11 аз минтақаҳое мебошанд, ки чандирии баланд дар онҳо равшан аст.

Тафсири B-фактор ба шакли мустақими “атом ин қадар Å ҳаракат кардааст” дуруст нест. Бетартибии кристаллографӣ, ҳаракатнокӣ ва хусусиятҳои модел/зичии электронӣ метавонанд якҷоя ба B-фактор таъсир расонанд. Дар ин таҳқиқот муҳим он аст, ки B-факторҳои нормализатсияшуда барои муқоисаи ҳамон минтақаи сохторӣ байни ҳолатҳои гуногуни apo/лиганд ва гомологҳо истифода шудаанд.

Минтақаи N-терминалӣ, ки дар зичии электронӣ дида намешавад, чӣ маъно дорад?

Дар кристаллографияи рентгенӣ модели атомӣ ба харитаи зичии электронӣ, ки аз маълумоти дифраксияи ченшуда ба даст оварда мешавад, ҷойгир карда мешавад. Агар минтақаи полипептидӣ дар кристалл дар як конформатсияи ягона ва устувор набошад, зичии аз он минтақа омада метавонад хеле заиф ё пароканда бошад ва муҳаққиқ наметавонад он боқимондаҳоро боэътимод дар модели атомӣ ҷойгир кунад.

Бо вуҷуди он ки сохтори ядроии HyAT хуб муайян шудааст, сегменти N-терминалии тақрибан 1–31 дар зичии электронӣ ҳал нашудааст. Дар аксари ҳашт занҷири мустақил модел аз P32 оғоз мешавад. Муаллифон инро нишонаи он медонанд, ки минтақаи N-терминалӣ дар ҳолати apo дараҷаи баланди бетартибӣ дорад.

Чаро ҳашт мономер алоҳида муҳим аст?

Мавҷуд будани ҳашт мономери HyAT дар воҳиди асимметрии кристаллографӣ ба муҳаққиқон имкон додааст, ки ҳашт намунаи мустақили ҳамон сафедаро дар дохили кристалл муқоиса кунанд. Дар ҳоле ки ядрои сафеда дар ин мономерҳо бо тақрибан 0,30 Å RMSD ҳампӯш мешавад, роҳҳои скелетии ҳалқаи α10–α11 фарқиятҳои равшантар нишон додаанд.

RMSD (root mean square deviation; решаи миёнаи квадратии инҳироф) меъёри монандии сохторист, ки фарқи миёнаи геометрии мавқеъҳои атомҳо ё Cα-ҳои ҳампӯшшударо ҷамъбаст мекунад. RMSD-и паст нишон медиҳад, ки ядроҳои муқоисашаванда ба ҳам наздиканд. Гетерогении дар ҳалқа мушоҳидашуда нисбат ба RMSD-и тақрибан 0,30 Å-и ядро ин тафсирро дастгирӣ мекунад, ки чандирӣ на ҳамчун вайроншавии тасодуфии паҳншуда дар тамоми сафеда, балки дар минтақаҳои муайян мутамарказ шудааст.

Оё Ҳангоми Пайвастшавии Лиганд Баста Шудани Ҳалқаи HyAT Бевосита Нишон Дода Шудааст?

Не. Сохторе, ки дар ин таҳқиқот ҳал шудааст, apo-HyAT мебошад; сохтори кристаллии HyAT-и бо PLP, PMP ё субстрат пайвастшуда муайян нашудааст. Модели гузариш аз бетартибӣ ба тартиб ба B-факторҳо ва зичии электронии apo-HyAT ва муқоисаи сохтории аминотрансферазаи apo ва бо PMP пайвастшудаи Vibrio fluvialis ва дигар гомологҳои бо лиганд пайвастшуда асос меёбад. Аз ин рӯ, хулосаи “ҳангоми пайвастшавии лиганд ҳалқаи HyAT баста мешавад” аз таҷрибаи мустақими HyAT не, балки аз хулосаи қавии сохторие иборат аст, ки ҳанӯз бояд тасдиқ гардад.

Чаро муқоиса бо Vibrio fluvialis истифода шуд?

Аминотрансферазаи Vibrio fluvialis (VfAT) ҳамчун модели муқоиса истифода шудааст, зеро он яке аз чанд гомологи мувофиқ аст, ки ҳам сохтори apo (PDB: 5ZTX) ва ҳам сохтори бо PMP пайвастшуда (PDB: 4E3Q)-и он маълум аст. Сохторҳои умумии HyAT ва VfAT бо тақрибан 1,18 Å RMSD монанд дониста шудаанд.

Дар таҳлили B-фактори нормализатсияшуда дар минтақаи мувофиқи α10–α11-и apo-VfAT чандирии баланд мушоҳида мешавад, дар ҳоле ки дар VfAT-и бо PMP пайвастшуда B-факторҳои ҳамон минтақа коҳиш меёбанд. Муҳаққиқон инро ҳамчун далели муқоисавӣ истифода кардаанд, ки пайвастшавии кофактор метавонад ҳалқаро тартибноктар кунад.

Минтақаи N-терминалӣ бо ҳалқаи α10–α11 чӣ гуна алоқаманд карда мешавад?

Дар сохторҳои PDB 6JIX, 6IO1 ва 6S54, ки аз наздиктарин гомологҳои сохтории HyAT мебошанд, сегменти N-терминалӣ мотиви тартибноки спирал–гардиш–спирал ташкил карда, дар ҷӯяке ҷойгир мешавад, ки байни ҳалқаҳои α1–α2 ва α10–α11-и субъедини ҳамсоя ба вуҷуд меояд. Ин се сохтор бо мономери HyAT мутаносибан бо тақрибан 1,000 Å, 1,042 Å ва 1,218 Å Cα RMSD ҳампӯш мешаванд.

Дар HyAT бошад, ҳамон қисми N-терминалӣ ҳал нашудааст ва ду ҳалқаи ҳамсоя чандирии баландтар нишон медиҳанд. Мувофиқи модели пешниҳодкардаи муаллифон, устуворшавии ҳалқаи α10–α11 бо таъсири лиганд ё кофактор метавонад барои бозуи N-терминалии субъедини ҳамсоя “docking scaffold”-и мустаҳкам фароҳам оварад; тартибёбии минтақаи N-терминалӣ низ метавонад ҷамъшавии сохтории атрофи ҷойи фаъолро пурра кунад.

Гарчанде ин робита ба муқоисаҳои қавии сохторӣ асос меёбад, сабабият дар HyAT бо мутация, сохтори дорои ҳалли замонӣ, кристалли HyAT-и бо лиганд пайвастшуда ё ченкунии мустақими динамикӣ санҷида нашудааст.

Агар HyAT Тетрамер Бошад, Чаро Ҷойи Фаъоли Функсионалӣ дар Интерфейси Димер Аст?

HyAT дар маҳлул тетрамери устувор ташкил медиҳад; аммо тетрамер аз пайвастшавии пушт-ба-пушти ду гомодимери функсионалӣ ба вуҷуд меояд ва ҳар ҷойи фаъол дар интерфейси ду мономери дохили як гомодимер ташаккул меёбад. Аз ин рӯ, “ҳолати олигомерии тетрамерӣ” ва “муносибати асосии субъедини каталитикӣ, ки ҷойи фаъолро ташкил медиҳад” сатҳҳои гуногуни сохториро ифода мекунанд.

Интерфейсҳои аввалия ва дуюмдараҷаи сафеда

Таҳлили PDBePISA дар сохтори кристаллии HyAT ҷуфтҳои занҷири A–B, C–D, E–F ва G–H-ро ҳамчун гомодимерҳои аввалия муайян кардааст. Масоҳати миёнаи интерфейси димери аввалия 2709,9 Ų гузориш шудааст ва манбаъ дар паҳлуи он арзиши p = 0,004-ро додааст. Азбаски мақола тафсири муфассали омории ин арзиши p-ро алоҳида шарҳ намедиҳад, дар ин ҷо ба он маънои нав дода намешавад.

Сипас ду гомодимери функсионалӣ тавассути интерфейси дуюмдараҷаи хурдтар пушт-ба-пушт пайваст шуда, тетрамерро ташкил медиҳанд. Масоҳати миёнаи сатҳи дафншудаи ин тамоси дуюмдараҷа 1133,2 Ų аст. Ҳангоми ташаккули тетрамер ҷойҳои фаъоли ҳар ду димери аввалия дар сатҳи берунии барои ҳалкунанда дастрас боқӣ мемонанд.

Чаро AUC лозим буд?

Дидани ҳашт мономер дар кристалл худ аз худ исбот намекунад, ки сафеда дар маҳлул комплекси ҳаштгона ташкил мекунад; тамосҳои бастабандии кристаллӣ метавонанд ҳамсоягиҳои ғайрибиологӣ ба вуҷуд оранд. Аз ин рӯ, муҳаққиқон ҳолати воқеии олигомериро дар маҳлул алоҳида бо ултрасентрифугакунии таҳлилии суръати седиментатсия (sedimentation velocity analytical ultracentrifugation, SV-AUC) чен кардаанд.

Дар тақсимоти AUC компоненти дорои массаи молекулавии ҳисобшудаи 191,6 kDa %98,7-и сигнали умумиро ташкил додааст ва муҳаққиқон инро ҳамчун далели он тафсир кардаанд, ки HyAT дар маҳлул тетрамери устувор ташкил мекунад.

Муқоиса бо гомологҳои сохторӣ

Холи Z-и Dali нишондиҳандаи мувофиқати сохтории усули Dali мебошад, ки сохторҳои сафедаро аз рӯйи монандии сеандоза муқоиса мекунад. Дар ин ҷо ҷадвал нишон медиҳад, ки HyAT бо гомологҳои гуногуни синфи III, ки айнияти пайдарпаии онҳо танҳо тақрибан %32–40 аст, ҳанӯз ҳам монандии қавии сохторӣ дорад.

Ҳангоми ҳампӯш кардани мономери HyAT бо мономери мувофиқи гомологи тетрамерии PDB 5LH9 1,317 Å RMSD ба даст омадааст. Тетрамерҳои ҳар ду сафеда низ ташкили чорумини монандеро нишон медиҳанд, ки дар он ду гомодимери функсионалӣ пушт-ба-пушт пайваст шудаанд.

Мавҷудияти як мотиви пролин дар ҳадҳои сард ва гарм чӣ гуна тафсир шуд?

Муқоисаи пайдарпаӣ нишон додааст, ки минтақаи дорои P-x-P ғайр аз HyAT, дар гомологҳои археяҳои гипертермофилии Pyrococcus horikoshii OT3, Thermococcus kodakarensis KOD1 ва Thermococcus litoralis DSM 5473 низ нигоҳ дошта шудааст.

Ин мушоҳида дар назари аввал ҷолиб аст; зеро талаботи глобалии устувории сафедае, ки дар муҳити сард кор мекунад, ва сафедаҳое, ки дар ҳарорати хеле баланд кор мекунанд, фарқ мекунанд. Муаллифон пешниҳод мекунанд, ки ин метавонад роҳи ҳалли умумии сохторӣ бошад, ки ба ҷойи тағйир додани чандирии тамоми сафеда танҳо ҳаракатнокии ҳалқаи муайяни наздики ҷойи фаъолро танзим мекунад.

Мубодилаи устуворӣ–фаъолият

Барои катализаи сафеда дараҷаи муайяни ҳаракати сохторӣ лозим аст; дар муқобил, устувории баланди ҳароратӣ одатан метавонад бо скелети сахттар алоқаманд бошад. Муаллифон таниши байни ин ду талабро ҳамчун stability–activity trade-off муҳокима мекунанд.

Дар гомологҳои гипертермофилӣ модели муаллифон чунин аст: дар ҳоле ки ядрои глобалии сафеда барои муқовимат ба денатуратсия дар ҳарорати баланд сахт устувор мешавад, ҳалқаи маҳаллии дорои P-x-P метавонад ҳаракатнокии каталитикии заруриро нигоҳ дорад. Барои HyAT-и аз Антарктика бошад, пешниҳод мешавад, ки ҳамон геометрияи пролин метавонад дар ҳарорати паст ба нигоҳ доштани чандирии маҳаллӣ дар атрофи ҷойи фаъол бар зидди маҳдуд шудани ҳаракатҳои молекулавӣ мусоидат кунад.

Манбаъ ҳамчунин шарҳ медиҳад, ки дар шароити сард мотиви пролин метавонад монеаи энергияи фаъолшавии ҳаракати ҳалқаро паст кунад. Аммо дар таҳқиқот ин энергияи фаъолшавӣ мустақиман чен нашудааст. Аз ин рӯ, ин ифода ченкунии таҷрибавии энергия нест, балки тафсири механизми сохтории муаллифон мебошад.

Ҷудо кардани он чизе, ки таҳқиқот мустақим мегӯяд, аз он чизе, ки пешниҳод мекунад

Усул ва Натиҷаҳои Таҳқиқот

1. Интихоби ген, клонсозӣ ва истеҳсоли сафеда

Пайдарпаии сафедаи эҳтимолӣ бо рақами дастрасии NCBI AMR27191.1 тавассути ҷустуҷӯи монандӣ бо истифода аз пайдарпаии аминотрансферазаҳои синфи III интихоб шудааст. Аннотатсияи домен бо InterProScan анҷом дода шудааст.

Пайдарпаии рамзгузори интихобшудаи HyAT аз рӯйи кодон оптимизатсия, синтез ва бо истифода аз ҷойҳои рестриксионии NdeI ва XhoI ба вектори экспрессияи pET28a клон карда шудааст. Плазмиди рекомбинантӣ барои истеҳсоли сафеда ба ҳуҷайраҳои Escherichia coli BL21(DE3) гузаронда шудааст.

Ҳуҷайраҳои трансформатсияшуда дар 4 L муҳити LB, дар ҳузури 50 µg/mL канамисин, дар 37 °C ва 120 rpm парвариш карда шудаанд. Вақте зичии оптикии фарҳанги ҳуҷайравӣ дар 600 nm ба \(OD_{600}=0,6\) расид, 0,5 mM IPTG илова шуда, экспрессияи сафеда индуктсия гардид. Сипас фарҳанг дар 25 °C ва 120 rpm тамоми шаб инкубатсия шудааст.

Ҳуҷайраҳо бо сентрифугакунонӣ дар 5000 rpm барои 20 дақиқа, 4 °C ҷамъ карда шудаанд. Пеллет дар буфери лизис, ки 20 mM Tris-HCl, pH 8,0; 200 mM NaCl; 5 mM имидазол дошт, аз нав суспензия карда шуда, дар 4 °C шикастани ултрасадоӣ татбиқ гардидааст. Фазаи болоии ҳалшаванда пас аз сентрифугакунонӣ дар 15.000 rpm барои 40 дақиқа, 4 °C гирифта шудааст.

2. Ni-NTA ва хроматографияи истисно аз рӯйи андоза

Супернатанти дорои HyAT ба колонкаи агарозаи Ni-NTA гузаронда шудааст. Барои дур кардани сафедаҳои ғайриспецификӣ буфери дорои 30 mM имидазол истифода шуда; сафедаи ҳадаф бо 300 mM имидазол элюатсия карда шудааст.

Теги N-терминалии полигистидин бо тромбин аз плазмаи гов тавассути инкубатсия дар 4 °C тамоми шаб хориҷ карда шудааст. Сипас бо истифода аз системаи ÄKTA avant FPLC ва колонкаи HiLoad Superdex 200 pg хроматографияи истисно аз рӯйи андоза анҷом дода шудааст. Буфери колонка 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 ва 200 mM NaCl мебошад.

Сафедаи тозашуда бо SDS-PAGE тасдиқ, бо филтри 10 kDa MWCO Amicon Ultra то 50 mg/mL консентратсия ва барои кристаллизатсия тару тоза истифода шудааст. Гуфта шудааст, ки барои истифодаи баъдӣ дар −80 °C нигоҳ дошта шудааст.

3. Кристаллизатсия

Скрининги ибтидоии кристаллизатсия дар пластинаҳои sitting-drop-и 96-чуқурча дар 23 °C гузаронда шудааст. Дар ҳар қатра 400 nL сафедаи HyAT бо 400 nL маҳлули скрининги кристаллизатсия омехта шудааст. Консентратсияҳои сафеда 15 mg/mL ва 30 mg/mL санҷида шудаанд.

MCSG I–IV, PGA Screen ва маҷмӯаҳои мутобиқшудаи скрининги SGC истифода шудаанд. Кристаллҳои мувофиқтарин тақрибан пас аз 1 рӯз дар шароити 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5; 0,2 M MgCl₂; %15 PEG 8000 мушоҳида шудаанд.

4. Ҷамъоварии маълумоти дифраксияи рентгенӣ

Як кристалл дар хатти нури макромолекулавии кристаллографияи BL-5C дар Pohang Light Source II чен карда шудааст. Пеш аз гузоштани кристалл ба гониометр, он барои муддати кӯтоҳ ба маҳлули резервуарӣ ғӯтонда шудааст, ки ба он криопротектор бо консентратсияи ниҳоии %20 (v/v) глисерол илова карда шуда буд.

Тасвирҳои дифраксия бо 1° оссилятсия барои ҳар кадр, дар энергияи 12,658 keV ва дарозии мавҷи 0,97949 Å бо детектори Eiger 9M ҷамъоварӣ шудаанд. Маълумот бо HKL2000 индексатсия, интегратсия ва миқёскунӣ шудааст.

Кристаллҳо ба гурӯҳи фазоии P2₁ тааллуқ доранд. Параметрҳои ҳуҷайраи воҳид:

• a = 100,81 Å
• b = 152,26 Å
• c = 117,37 Å
• α = 90°
• β = 104,9°
• γ = 90°

5. Ҳалли сохтор ва рафинамент

Модели ибтидоӣ бо истифода аз сохтори taurine-2-oxo-glutarate aminotransferase бо коди PDB 6JIX ҳамчун қолаби ҷойивазкунии молекулавӣ сохта шудааст. Дар ҳисобкунии MOLREP/CCP4i, бар асоси коэффисиенти Matthews V_M = 2,42 ва миқдори ҳалкунанда %49,24, дар воҳиди асимметрӣ ҳашт молекула моделсозӣ шудааст.

Сохтан ва ислоҳи дастии модел бо Coot ва рафинаменти такрории автоматӣ бо phenix.refinement анҷом дода шудааст. Сохтори ниҳоӣ бо MolProbity тасдиқ шудааст. Координатаҳои атомӣ ва факторҳои сохторӣ ба Protein Data Bank бо коди дастрасии PDB 22PO супурда шудаанд.

Rmerge чиро чен мекунад?

Манбаъ дар Table 1 \(R_{merge}\)-ро ба шакли зерин муайян мекунад:

\[ R_{\mathrm{merge}}= \frac{\sum |\langle I\rangle-I|} {\sum \langle I\rangle} \]

Формула чиро ҳисоб мекунад? Ҷамъбаст мекунад, ки ченкуниҳои такрории як инъикоси кристаллографӣ аз арзиши миёнаи умумии интенсивӣ то чӣ андоза дур мешаванд.

Тағйирёбандаҳо: \(I\) як интенсивии дифраксияи ченшударо; \(\langle I\rangle\) бошад миёнаи интенсивии ченкуниҳои такрории ҳамон инъикосро ифода мекунад.

Воҳид: Азбаски сурат ва махраҷ дар як воҳиди интенсивӣ ҳастанд, \(R_{merge}\) беандоза аст.

Нақши математикӣ: Ҷамъи фарқиятҳои мутлақ байни ченкуниҳои такрории инъикос ба ҷамъи интенсивиҳои миёна нормализатсия мешавад.

Тафсир: Вақте ченкуниҳо ба арзиши миёна наздиктар мешаванд, нисбат хурд мешавад. Аммо арзиш бояд якҷоя бо қабати ҳал ва хусусиятҳои маълумот арзёбӣ гардад. Манбаъ \(R_{merge}=0,084\)-и умумӣ ва 0,724-ро дар қабати баландтарини ҳал гузориш медиҳад.

Rcryst ва Rfree чиро нишон медиҳанд?

Манбаъ арзиши \(R_{cryst}\)-ро чунин муайян мекунад:

\[ R_{\mathrm{cryst}}= \frac{\sum \left||F_o|-|F_c|\right|} {\sum |F_o|} \]

\(F_o\) амплитудаи фактори сохтории таҷрибавӣ мушоҳидашударо; \(F_c\) амплитудаи фактори сохтории аз модели атомӣ ҳисобшударо ифода мекунад. \(R_{cryst}\) ченаки беандозаи мувофиқат аст, ки то чӣ андоза модели атомии рафинаментшуда маълумоти дифраксияи мушоҳидашударо бозтавлид мекунад.

Дар манбаъ \(R_{cryst}=0,196\), дар қабати баландтарини ҳал 0,241 дода шудааст.

Барои R_free манбаъ муодилаи нави ҷудогона наменависад; хабар медиҳад, ки он бо истифода аз маҷмӯи санҷишӣ, ки %5-и ҳамаи инъикосҳо аз марҳилаҳои рафинамент берун нигоҳ дошта шудаанд, ҳисоб карда шудааст. Ҳамин тавр, барои назорати он ки модел танҳо ба маълумоти рафинаменти худ аз ҳад зиёд мутобиқ нашавад, назорати мустақил таъмин мешавад. Манбаъ \(R_{free}=0,25\), дар қабати баландтарини ҳал 0,315-ро гузориш додааст.

I/σ(I), пуррагӣ ва redundancy чӣ маъно доранд?

I/σ(I) нисбати интенсивии дифраксияи ченшуда ба номуайянии худи он мебошад. Манбаъ миёнаи умумиро 17,32 ва барои қабати баландтарини ҳал 1,8 медиҳад.

Пуррагӣ (completeness) нишон медиҳад, ки чанд фоизи инъикосҳои нодири назариявӣ ченшаванда дар маҷмӯи маълумот мавҷуданд. Барои маҷмӯи маълумоти HyAT пуррагии умумӣ %99,3 ва дар қабати баландтарини ҳал %98,2 мебошад.

Redundancy нишон медиҳад, ки як инъикоси нодир ба ҳисоби миёна чанд маротиба чен шудааст. Манбаъ арзишҳои умумии 6,5 ва 6,1-ро дар қабати баландтарини ҳал гузориш додааст.

6. Шароити ултрасентрифугакунии таҳлилӣ

Ҳолати олигомеризатсияи HyAT бо истифода аз ултрасентрифугаи таҳлилии Proteome Lab XL-A ва ротори AN-60 Ti омӯхта шудааст. Сафеда дар буфери 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 ва 200 mM NaCl омода карда шудааст.

Бо SEDNTERP v3.0.4 дар манбаъ мутаносибан арзишҳои зерин ҳисоб шудаанд:

• ҳаҷми хоси қисмӣ: 0,7356 mL/g,
• зичии буфер: 1,00709 g/mL,
• часпакии буфер: 0,01026 Poise,
• ҳарорати ҳисоб: 20 °C.

Намуна то 42.000 rpm расонда шуда, дар шароити ибтидоии 20 °C барои 10 дақиқа нигоҳ дошта шудааст. Профили седиментатсия дар 280 nm ҳар 5 дақиқа назорат шуда ва ҳамагӣ 40 скани абсорбанс бо SEDFIT v18.1 таҳлил шудааст. Визуализатсия бо GraphPad Prism v5.02 анҷом шуда; интерфейсҳои сафеда бо PDBePISA арзёбӣ шудаанд.

7. Меъмории сохтории мономер

Мономери HyAT печиши канонии аминотрансферазаҳои синфи III-ро дорад ва β-қабати марказии ҳафтришта бо α-спиралҳо иҳота шудааст.

Сафеда ба ду домени асосии сохторӣ ҷудо мешавад. Домени калон β-қабати марказии аз риштаҳои β4–β10 ташаккулёфта ва α-спиралҳои атрофи онро дар бар мегирад. Домени хурд бошад аз сегментҳои гусаста, ки ҳам аз N-терминал ва ҳам аз C-терминал меоянд, иборат аст; се β-ришта аз N-терминал, чор β-ришта аз C-терминал ва спиралҳои α12, α14 ва α15-ро дар бар мегирад.

Байни ду домен ду минтақаи шарнирӣ муайян шудааст. Шарнири аввал сегменти D53–D67 дар минтақаи N-терминалӣ байни β3 ва α1 мебошад. Шарнири дуюм байни α11 ва α12 ҷойгир аст ва манбаъ хабар медиҳад, ки дар ин ҷо як боқимондаи аспарагин печиши спиралии маҳаллӣ ташкил медиҳад.

8. Ҷузъҳои сохтории ҷойи фаъол

Ковокии каталитикии HyAT дар шикофи байнисубъединӣ ҷойгир аст, ки β-қабати марказии як мономер ва спиралҳои α1, α2 ва α11 аз домени калони субъедини ҳамсоя якҷоя ташкил медиҳанд.

Манбаъ хабар медиҳад, ки D251 ва боқимондаи ҳифзшудаи ҷойи фаъол K280 дар ҷайби пайвастшавии кофактор аз ҷиҳати фазоӣ ташкил шудаанд. Расми 1 ҳамчунин V253-ро ҳамчун яке аз боқимондаҳои муҳими атрофи ҷойи фаъол нишон медиҳад; аммо азбаски матн барои V253 мисли D251 ё K280 вазифаи каталитикии алоҳида муайян намекунад, дар ин ҷо нақши иловагӣ дода намешавад.

9. Бетартибии ҳалқа ва N-терминал

Зичии электронӣ махсусан дар ду ҳалқа заиф ё гусаста аст:

• Ҳалқаи α1–α2: P86–K91,
• Ҳалқаи α10–α11: D303–S314.

Илова бар ин, тақрибан боқимондаҳои N-терминалии 1–31 комилан ҳал нашудаанд. Дар аксари ҳашт занҷир модел аз P32 оғоз мешавад.

Ҳангоми ҳампӯш кардани ҳашт мономери мустақил, RMSD-и ядро тақрибан 0,30 Å аст, дар ҳоле ки конформатсияҳои скелетии ҳалқаи α10–α11 ба таври равшан ҷудо мешаванд. Муҳаққиқон инро ҳамчун нишонаи мавҷудияти маҷмӯи конформатсияҳо дар ферменти apo, ба ҷойи як сохтори собити ҳалқа, тафсир кардаанд.

10. Пайдарпаии P-x-P

Дар дохили ҳалқаи α10–α11-и HyAT дар манбаъ сегменти зерин дода шудааст:

303-DDKPLPLGLTYS-314

Пролинҳои ин ҷо:

• P306,
• P308.

Аз ин рӯ, мотиви марказӣ ба шакли P306-L307-P308 аст.

Тафсири сохтории манбаъ ин аст, ки ду пролин метавонанд ташаккули сохтори дуюмдараҷаи спиралии сахтро халалдор карда, гуногунии конформатсионии маҳаллиро зиёд кунанд. Аммо азбаски ягон озмоиши функсионалӣ бо мутацияи яке аз пролинҳо гузаронда нашудааст, андозаи таъсири мотивро аз ин таҳқиқот ба таври миқдорӣ баровардан мумкин нест.

11. Модели тартибёбӣ, ки аз муқоисаи гомологҳо бароварда шудааст

Дар сохтори apo-и HyAT ҳалқаи α10–α11 ва бозуи N-терминалӣ бетартибанд. Баръакс, дар гомологҳои интихобшуда бозуи N-терминалии спирал–гардиш–спирал дар ҷӯяки байни ҳалқаҳои α1–α2 ва α10–α11-и мономери ҳамсоя ҷой гирифта, бо тамосҳои қутбӣ/ғайриқутбӣ дастгирӣ мешавад.

Муаллифон аз ин муқоиса модели пайдарпайи зеринро пешниҳод мекунанд:

1. Дар ҳолати apo ҳалқаи α10–α11-и дорои P-x-P метавонад чандир бошад ва конформатсияҳои кушодатарро намуна гирад.
2. Ин сохтор метавонад дастрасии даромадгоҳи ҷойи фаъолро зиёд кунад.
3. Пайвастшавии лиганд ё кофактор метавонад гузариши ҳалқаро ба конформатсияи тартибноктар таъмин кунад.
4. Ҳалқаи устувортар метавонад барои бозуи N-терминалии субъедини ҳамсоя сатҳи сохтории docking фароҳам оварад.
5. Тартибёбии бозуи N-терминалӣ метавонад ҷамъшавии атрофи ҷойи фаъолро пурра кунад.

Ин панҷ марҳила механизми пешниҳодкардаи муҳаққиқон мебошад. Ҳамаи марҳилаҳо дар HyAT мустақиман дар пайдарпаии замонӣ мушоҳида нашудаанд.

12. Муқоисаи эволютсионӣ

Минтақаи мувофиқи ҳалқаи дорои P-x-P дар гомологҳои гипертермофилӣ низ ошкор шудааст. Организмҳои дар таҳқиқот номбаршуда:

• Pyrococcus horikoshii OT3,
• Thermococcus kodakarensis KOD1,
• Thermococcus litoralis DSM 5473.

Муаллифон ин умумиятро ҳамчун стратегияи эволютсияи конвергентӣ тафсир мекунанд, ки дар он ҳатто агар устувории глобалии сафеда зери фишори интихобӣ дар самтҳои гуногун бошад, чандирии маҳаллии атрофи ҷойи фаъол метавонад тавассути геометрияи пролин танзим шавад.

Натиҷаҳое, ки таҳқиқот дастгирӣ мекунад

• Сохтори кристаллии apo-и HyAT бо ҳалли 2,31 Å муайян шудааст.
• HyAT дар маҳлул асосан ташкили устувори тетрамерӣ нишон медиҳад.
• Ҷойи фаъоли функсионалӣ дар интерфейси гомодимерии байни мономерҳо ташаккул меёбад.
• Ҳалқаи α10–α11 D303–S314 ва ҳалқаи α1–α2 P86–K91 дар сохтори apo чандирӣ/бетартибии баланд нишон медиҳанд.
• Тақрибан боқимондаҳои N-терминалии 1–31 дар зичии электронии сохтори apo ҳал нашудаанд.
• Дар ҳоле ки ядрои ҳашт мономер монандии баланд нишон медиҳад, ҳалқаи α10–α11 гетерогении бештари сохторӣ дорад.
• Дар ҳалқаи α10–α11-и HyAT мотиви P306–L307–P308 P-x-P мавҷуд аст.
• Муқоисаи гомологҳои apo ва бо кофактор пайвастшуда бо гипотезаи тартибёбии маҳаллӣ, ки бо пайвастшавии лиганд алоқаманд аст, мувофиқат мекунад.
• Нигоҳдории мотиви монанд ба P-x-P дар гомологҳои гипертермофилии омӯхташуда мушоҳидаи муқоисавиест, ки тафсири эволютсияи конвергентии муаллифонро дастгирӣ мекунад.

Умумисозиҳое, ки таҳқиқот дастгирӣ намекунад

• Дар ин таҳқиқот муайян нашудааст, ки HyAT дар кадом субстрати табиӣ фаъолияти баландтарин дорад.
• Барои HyAT арзишҳои \(K_m\), \(V_{max}\), \(k_{cat}\) ё самаранокии каталитикӣ гузориш нашудаанд.
• То чӣ андоза мутацияҳои P306 ё P308 фаъолиятро тағйир медиҳанд, санҷида нашудааст.
• Сохтори кристаллии HyAT-и бо лиганд пайвастшуда ҳал нашудааст.
• Гузариши пешниҳодшудаи кушода→баста дар HyAT дар ҷараёни вақт мустақиман тасвир нашудааст.
• Аз ҷиҳати биохимиявӣ исбот нашудааст, ки мотиви P-x-P дастрасии субстратро ҳатман назорат мекунад.
• Механизми эволютсияи конвергентӣ байни мутобиқшавии сард ва гарм бо озмоиши мустақими эволютсионӣ тасдиқ нашудааст.
• Ин таҳқиқоти сохторӣ самаранокии биокатализи саноатӣ ё миқёси истеҳсолро нишон намедиҳад.

Маҳдудияти асосии таҳқиқот ва ниёз ба озмоишҳои минбаъда

Муҳимтарин ниёзи кушодаи таҳқиқотии мақола омӯзиши сохтори бо лиганд пайвастшудаи HyAT ва вазифаи мустақими биохимиявии он мебошад. Муаллифон равшан қайд мекунанд, ки барои дақиқ кардани вазифаи воқеии ҳалқаи α10–α11 таҳқиқоти иловагии сохторӣ ва биохимиявии бо лиганд пайвастшуда лозим аст.

Хусусан мутацияҳои ҳадафманди боқимондаҳои мотив ба мисли P306/P308, кристалли HyAT-и бо лиганд пайвастшуда ё дигар сохторҳои дорои ҳалли баланд ва озмоишҳои мувофиқи фаъолият/пайвастшавӣ барои санҷидани робитаҳои сабабие, ки дар модели сохтории мавҷуда пешниҳод шудаанд, зарур хоҳанд буд. Навъҳои озмоиш дар ин ҷумлаи охир озмоишҳое нестанд, ки дар таҳқиқоти мавҷуда анҷом дода шудаанд; онҳо чаҳорчӯбаи омӯзандаеро ташкил медиҳанд, ки шарҳ медиҳад номуайянии мавҷуда бо кадом навъи далели мустақим бартараф карда мешавад.

Ёддошт оид ба Манбаъ ва Усул

Таҳқиқоти аслӣ: Structural Insights into the N-Terminus and a Flexible P-x-P Loop near the Active Site of a Class III Aminotransferase

Муаллифон: Jisub Hwang; Hackwon Do; Jun Hyuck Lee.

Тартиби муаллифон: Jisub Hwang → Hackwon Do → Jun Hyuck Lee.

Саҳми баробар: Дар PDF-и манбаъ нишонаи ҳаммуаллифии аввал/саҳми баробар гузориш нашудааст.

Corresponding authors: Hackwon Do ва Jun Hyuck Lee.

Аффилиатсия 1: Research Unit for Low-Temperature Convergence Technology, Korea Polar Research Institute, Incheon 21990, Republic of Korea.

Аффилиатсия 2: Department of Polar Sciences, University of Science and Technology, Incheon 21990, Republic of Korea.

Маҷалла: Crystals.

Ношир: MDPI, Basel, Switzerland.

Ҷилд / мақола: Volume 16, Article 576.

DOI: 10.3390/cryst16090576.

Санаи ирсол: 10 августи 2026.

Санаи бознигарӣ: 28 августи 2026.

Санаи қабул: 1 сентябри 2026.

Санаи нашр: 3 сентябри 2026.

Навъи манбаъ: Мақолаи таҳқиқотии биологияи сохтории таҷрибавӣ / кристаллографияи сафеда.

Вазъи рецензия: Мақолаи нашршудаи маҷалла мебошад; дар PDF санаҳои received, revised, accepted ва published мавҷуданд.

Пайванди расмӣ: https://doi.org/10.3390/cryst16090576

Иҷозатнома: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Махзани маълумоти сохтори сафеда: RCSB Protein Data Bank.

Коди дастрасии PDB: 22PO.

Маблағгузорӣ: Гранти Korea Polar Research Institute; рақамҳои лоиҳаҳои KOPRI PE26150 ва PE26220, ки аз ҷониби Ministry of Oceans and Fisheries маблағгузорӣ шудаанд.

Бархӯрди манфиатҳо: Муаллифон изҳор кардаанд, ки бархӯрди манфиатҳо надоранд.

Дастрасии маълумот: Маҷмӯи маълумоти сохторие, ки дар ин таҳқиқот тавлид шудааст, дар RCSB PDB Protein Data Bank барои HyAT бо рақами дастрасии 22PO пешниҳод мешавад.

Саҳмҳои муаллифон: Консептуализатсия, назорат ва идоракунии лоиҳа H.D. ва J.H.L.; таҳқиқот ва методология J.H. ва H.D.; куратсияи маълумот J.H.; таҳлили формалӣ ва тасдиқ J.H. ва H.D.; визуализатсия J.H. ва H.D.; тарҳи аввал J.H. ва H.D.; бознигарӣ ва таҳрир H.D. ва J.H.L.

Изҳороти истифодаи зеҳни сунъӣ: Муаллифон изҳор кардаанд, ки барои беҳтар кардани равшанӣ, грамматика ва хонданпазирии матни англисии мақола ChatGPT (GPT-5.6, OpenAI)-ро истифода бурдаанд; натиҷаро худ бознигарӣ ва таҳрир карда, масъулияти мазмуни нашрро ба дӯш гирифтаанд.

Маводи иловагӣ: Мақолаи манбаъ Figure S1, Figure S2 ва Figure S3-ро ҳамчун маводи иловагӣ рӯйхат мекунад. Азбаски ин файлҳои маводи иловагӣ дар PDF-и асосии боркардаи корбар вуҷуд надоранд, дар арзёбии Verianla расмҳои иловагӣ мустақилона аз назаргузаронии визуалӣ нагузаштаанд. Натиҷаҳое, ки матни асосӣ дар бораи ин расмҳо ба таври равшан гузориш медиҳад, нигоҳ дошта шудаанд.

Ёддошти дохилиманбаъӣ оид ба усули олигомер: Table 2 дар сатри HyAT барои ҳолати олигомерӣ ифодаи “Tetramer (GPC)”-ро истифода мебарад. Баръакс, Methods 2.4, Results 3.2 ва Figure 1B ба таври равшан хабар медиҳанд, ки олигомеризатсияи HyAT бо sedimentation velocity analytical ultracentrifugation (SV-AUC) таҳлил шудааст. Verianla ин фарқиятро хомӯшона ислоҳ накардааст; ҳангоми асос гирифтани таҷрибаи SV-AUC дар шарҳи муфассали усул ва натиҷа, фарқи нишонаи ҷадвалро ҳамчун номувофиқии дохилиманбаъӣ нигоҳ доштааст.

Ҳадди асосии тафсири илмӣ: Таҳқиқот сохтори apo-и HyAT-ро мустақиман муайян кардааст. Тартибёбии ҳалқа пас аз пайвастшавии лиганд/кофактор, устуворшавии N-терминал, механизми дарвозабонии ҷойи фаъол ва модели мутобиқшавии конвергентӣ дар ҳадҳои ҳароратӣ қисман тафсирҳое мебошанд, ки аз муқоисаи сохтор ва пайдарпаии гомологҳо бароварда шудаанд. Сохтори бо лиганд пайвастшудаи HyAT ва вазифаи мустақими биохимиявии мотив дар оянда бояд тасдиқ карда шаванд.