Alkalin proteazla elde edilen kerevit kabuğu protein hidrolizatı (alkaline-protease-derived crayfish shell protein hydrolysate, ACSP), kerevit kabuğu proteinlerinin alkalin proteaz ile enzimatik parçalanması sonucunda oluşan karma bir peptit hidrolizatıdır. Araştırmacılar önce papain, alkalin proteaz, nötral proteaz, tripsin ve pepsin kullanarak beş farklı kerevit kabuğu protein hidrolizatı hazırlamış; bunları antioksidan ve anti-inflamatuvar özellikler açısından taramış; öne çıkan ACSP ve NCSP'yi LPS ile uyarılmış IEC-6 bağırsak epitel hücrelerinde incelemiş ve en güçlü genel hücresel etkiyi gösteren ACSP'yi DSS ile akut kolit oluşturulan fare modelinde değerlendirmiştir. Son aşamada ACSP'nin peptit bileşimi LC–MS/MS ile karakterize edilmiştir.

İlk taramada ACSP'nin DPPH ve ABTS•⁺ radikalleri için IC₅₀ değerleri sırasıyla 0,888 ± 0,004 ve 0,853 ± 0,003 mg/mL olarak bulunmuştur. ACSP ayrıca beş hidrolizat arasında en yüksek hidroksil radikali süpürme aktivitesini %29,525 ± 0,499 ve en yüksek süperoksit anyon radikali süpürme aktivitesini %47,310 ± 1,351 olarak göstermiştir. Nötral proteaz hidrolizatı NCSP ise ABTS•⁺ IC₅₀ değeri ve FRAP indirgeme kapasitesi bakımından bazı ölçümlerde ACSP'den daha güçlü sonuç vermiştir. Bu nedenle ilk aşama tek bir testin sonucuna göre değil, farklı antioksidan ve anti-inflamatuvar göstergelerin birlikte değerlendirilmesine dayanmaktadır.

LPS ile uyarılmış IEC-6 hücrelerinde ACSP ve NCSP, pro-inflamatuvar iNOS, IL-1β, IL-6 ve TNF-α değişikliklerini azaltırken anti-inflamatuvar IL-10 yönündeki yanıtı artırmıştır; ACSP genel olarak daha güçlü etki göstermiştir. Fare deneyinde 100, 200 ve 400 mg/kg vücut ağırlığı dozlarında verilen ACSP, DSS'nin oluşturduğu kilo kaybı, hastalık aktivitesi, kolon kısalması, histolojik hasar ve goblet hücresi kaybını dozla ilişkili biçimde hafifletmiştir. Yüksek doz ACSP grubunda 14. gün hastalık aktivite indeksi 3,60 ± 0,55 iken DSS model grubunda 9,40 ± 1,14'tür; histolojik skor ise sırasıyla 4,80 ± 0,40 ve 10,40 ± 0,80 olarak raporlanmıştır.

ACSP aynı zamanda pro-inflamatuvar sitokinleri, miyeloperoksidaz aktivitesini ve nitrik oksit düzeylerini azaltmış; süperoksit dismutaz ve katalaz aktivitelerinin toparlanmasıyla ve ZO-1, claudin-1 ve occludin gibi sıkı bağlantı proteinlerinin yeniden artmasıyla ilişkilendirilmiştir. LC–MS/MS analizi ACSP içinde 516 peptit dizisi tanımlamıştır. Bununla birlikte bu çalışma insanlarda kolit tedavisinin etkinliğini veya güvenliğini göstermemektedir. Bulgular hücre sistemi ve kısa süreli fare modeli düzeyindedir; gastrointestinal stabilite, bağırsaktan emilim, farmakokinetik, sistemik maruziyet, uzun dönem güvenlik, alerjenite ve klinik etkinlik değerlendirilmemiştir.

Araştırmanın temel problemi

İnflamatuvar bağırsak hastalıkları; ülseratif kolit ve Crohn hastalığı gibi kronik inflamatuvar bozuklukları kapsar. Hastalık sürecinde genetik yatkınlık, çevresel etkenler, bağırsak mikrobiyotasındaki bozulma, oksidatif stres ve aşırı bağışıklık aktivasyonu gibi çok sayıda bileşen birlikte rol oynayabilir. Çalışmanın yazarları mevcut farmakolojik tedavilerin önemli olmasına rağmen yan etkiler, ikincil yanıt kaybı, maliyet ve mukozal iyileşmenin her hastada tam olmaması gibi sınırlılıklara sahip olabileceğini belirterek gıda kaynaklı biyolojik olarak aktif peptitleri araştırılmaya değer bir alan olarak ele almaktadır.

Çalışmanın ikinci problemi kaynak kullanımına ilişkindir. Kerevit (Procambarus clarkii) işleme endüstrisinde kabuklar önemli miktarda yan ürün oluşturur. Kaynağa göre kabuk kısmı toplam kerevit biyokütlesinin yaklaşık %60–70'ini oluşturabilir ve yaklaşık %20–30 kitin ile %20–40 protein içerebilir. Buna rağmen bu materyalin yüksek katma değerli kullanımı sınırlıdır. Bu nedenle araştırma hem bağırsak sağlığına yönelik biyolojik aktiviteyi hem de deniz/akuatik gıda işleme yan ürününün değerlendirilmesini aynı deneysel çerçevede ele almaktadır.

Protein hidrolizatı nedir?

Protein hidrolizatı, büyük protein moleküllerinin enzimler aracılığıyla daha küçük peptitlere ve peptit parçalarına bölünmesiyle elde edilen karışımdır. Proteazın hangi peptit bağlarını tercih ederek kestiği, ortaya çıkan peptitlerin uzunluğunu, amino asit dizilerini ve dolayısıyla fizikokimyasal özelliklerini değiştirebilir. Bu nedenle aynı kerevit kabuğu proteini farklı proteazlarla parçalandığında biyolojik etkinliği farklı hidrolizatlar ortaya çıkabilir.

Bu araştırmanın temel deneysel mantığı tam olarak budur: aynı temel protein kaynağı beş farklı proteazla hidrolize edilmiş, oluşan ürünler karşılaştırılmış ve en güçlü genel biyolojik aktiviteye sahip aday daha ileri deney aşamalarına taşınmıştır.

Kerevit kabuğu hidrolizatları nasıl hazırlandı?

Kerevit kabukları küçük parçalara ayrılmış, kurutulmuş, mekanik olarak öğütülmüş ve 60 mesh elekten geçirilmiştir. Kabuk tozu önce 1:10 (w/v) oranında petrol eteriyle karıştırılarak oda sıcaklığında 6 saat manyetik karıştırmaya tabi tutulmuş ve yağ içeren çözücü filtrasyonla uzaklaştırılmıştır.

Yağı giderilmiş materyal daha sonra 1 M HCl ile 1:10 (w/v) oranında 2 saat dekalsifiye edilmiştir. Karışım 5000×g'de 20 dakika santrifüj edilmiş, süpernatan uzaklaştırılmış ve katı kalıntı kurutularak dekalsifiye kerevit kabuğu tozu elde edilmiştir.

Hidroliz aşamasında kabuk tozu distile su içinde 1:25 (w/v) oranında dağıtılmış ve beş farklı proteaz için belirlenen koşullarda 6 saat hidrolize edilmiştir. Reaksiyon sonunda enzimler 95 °C'de 15 dakika tutulularak inaktive edilmiş; ürün 0,45 µm filtreden geçirilmiş, filtrat liyofilize edilmiş ve 4 °C'de saklanmıştır.

Kaynak ayrıca hidrolizatların 4 °C'de 0, 7, 15 ve 30 günlük depolama sonrasında antioksidan ve anti-inflamatuvar testler tekrarlanarak fonksiyonel stabilitesinin değerlendirildiğini yöntem bölümünde belirtmektedir. Bununla birlikte ana makale sonuç bölümünde bu depolama serisine ait ayrıntılı nicel sonuçlar ayrı bir ana sonuç seti halinde sunulmamıştır; bu nedenle Verianla metninde kaynakta bulunmayan stabilite sayıları oluşturulmamıştır.

ACSP Neden Beş Hidrolizat Arasından İleri Deneylere Taşındı?

ACSP bütün antioksidan testlerde tek başına birinci olmadığı halde, radikal süpürme, SOD/CAT yanıtı, NO salımı ve albumin denatürasyonu testlerinde güçlü ve dengeli bir profil göstermiş; ACSP ile NCSP ilk hücresel aşamaya seçilmiş ve LPS ile uyarılmış IEC-6 hücrelerinde ACSP genel olarak daha güçlü anti-inflamatuvar yanıt verdiği için fare modelinde ACSP değerlendirilmiştir.

Beş hidrolizatın antioksidan taraması

DPPH ve ABTS testlerinde IC₅₀ değerinin daha düşük olması, %50 radikal süpürme seviyesine daha düşük hidrolizat konsantrasyonunda ulaşıldığını ve dolayısıyla daha güçlü aktiviteyi ifade eder. FRAP ve doğrudan süpürme yüzdelerinde ise daha yüksek değer daha güçlü antioksidan yanıt anlamına gelir. Dolayısıyla Tablo 2 tek bir “kazanan” testten değil, farklı redoks özelliklerini ölçen birden fazla metrikten oluşmaktadır.

Kaynak Şekil 1'de ACSP'nin SOD aktivitesini yaklaşık %25, CAT aktivitesini %18'den fazla artırdığı ve PCSP ile PECSP'ye göre bu artışların anlamlı derecede yüksek olduğu raporlanmaktadır. Hücresiz sistemde ACSP, SNP kaynaklı NO salımını %20'den fazla baskılamış ve ısı ile indüklenen albumin denatürasyonunda %12,21 ile en yüksek inhibisyonu göstermiştir.

Albumin denatürasyonunun baskılanması ve hücresiz NO testi, anti-inflamatuvar potansiyel için tarama göstergeleridir. Bunlar tek başına canlı organizmada inflamasyon yolaklarının doğrudan düzenlendiğini kanıtlamaz. Yazarlar da hücresiz test sonuçlarının makrofaj kaynaklı mediyatörlerin doğrudan modülasyonunu göstermediğini tartışma bölümünde özellikle belirtmektedir.

DPPH radikal süpürme denklemi

DPPH süpürme aktivitesi (%) = [A₀ − (A₁ − A₂)] / A₀ × 100

Burada A₀, metanol + DPPH içeren kontrolün absorbansıdır; A₁, numune + DPPH karışımının absorbansıdır; A₂ ise numune + metanol içeren numune körünün absorbansıdır. Numune renginin veya kendi optik özelliklerinin DPPH sinyaline katkısını A₂ ile düzeltmek, gerçek radikal süpürme etkisini daha doğru ayırmaya yardımcı olur.

Hidrolizatlar 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 ve 1,0 mg/mL konsantrasyonlarında incelenmiş ve DPPH ölçümü 517 nm'de gerçekleştirilmiştir. IC₅₀, %50 süpürme aktivitesi sağlayan hidrolizat konsantrasyonu olarak tanımlanmıştır.

ABTS•⁺ testi

ABTS•⁺ testinde hidrolizatlar yine 0,2–1,0 mg/mL aralığında değerlendirilmiştir. ABTS radikal katyonu 7 mM ABTS ile 2,45 mM potasyum persülfatın 1:1 hacim oranında karıştırılması ve karışımın oda sıcaklığında karanlıkta 16–24 saat bekletilmesiyle hazırlanmıştır. Çalışma solüsyonu 734 nm'de 0,70 ± 0,02 absorbansa seyreltilmiş; numune ile 6 dakika inkübasyondan sonra ölçüm yapılmıştır.

ABTS•⁺ süpürme aktivitesi (%) = (A₀ − A₁) / A₀ × 100

A₀ kör kontrolün, A₁ ise test numunesinin absorbansıdır.

FRAP ve diğer radikal testleri

FRAP testi ferrik demirin indirgenme kapasitesini değerlendirir ve sonuçlar kuru numune başına µmol Fe(II) eşdeğeri olarak ifade edilmiştir. Araştırmacılar 100–1000 µM FeSO₄ standartlarından y = 0,2638x + 0,0651 ve R² = 0,9992 kalibrasyon eğrisi oluşturmuştur.

Hidroksil radikali testinde numune 1 mg/mL konsantrasyonunda kullanılmış ve süpürme yüzdesi şu şekilde hesaplanmıştır:

•OH süpürme aktivitesi (%) = [(A₀ − A) / A₀] × 100

Süperoksit anyon testinde ise katekol otooksidasyonu izlenmiş ve hesaplama:

O₂•⁻ süpürme aktivitesi (%) = [1 − (ΔA_s − ΔA_b) / ΔA₀] × 100

biçiminde yapılmıştır. ΔA_s, ΔA_b ve ΔA₀ sırasıyla numune, numune körü ve su kontrolünde 0 ile 5 dakika arasındaki absorbans değişimlerini ifade eder.

NO salımının ve albumin denatürasyonunun inhibisyonu

SNP kaynaklı NO salımı hücresiz bir sistemde Griess reaksiyonuyla değerlendirilmiştir:

NO salımı inhibisyonu (%) = (A_blank − A_sample) / A_blank × 100

Albumin denatürasyonu testinde %1 BSA içeren karışım 37 °C'de 15 dakika bekletilmiş ve ardından 90 °C'de 20 dakika ısıtılmıştır. Bulanıklık 660 nm'de ölçülmüş ve inhibisyon:

Denatürasyon inhibisyonu (%) = (A_blank − A_sample) / A_blank × 100

formülüyle hesaplanmıştır.

IEC-6 hücre modeli nasıl kuruldu?

IEC-6 hücreleri, %10 fetal sığır serumu, 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin ve 0,1 IU/mL insülin içeren DMEM ortamında 37 °C ve %5 CO₂ koşullarında kültüre edilmiştir.

Canlılık zaman serisi için hücreler 96 kuyucuklu plakalarda 1 × 10⁵ hücre/mL yoğunluğunda hazırlanmış ve ACSP veya NCSP'nin 0,1–2,0 mg/mL konsantrasyonlarıyla 48 saate kadar muamele edilmiştir. CCK-8 ölçümleri 0, 12, 24, 36 ve 48. saatlerde yapılmıştır. ACSP'de en büyük canlılık artışı 36. saatte 0,05 mg/mL düzeyinde; NCSP'de ise 36. saatte 0,25 mg/mL düzeyinde gözlenmiştir.

İnflamasyon deneyinde hücreler 12 kuyucuklu plakalarda 3 × 10⁵ hücre/kuyucuk yoğunluğunda 12 saat kültüre edilmiş, 0,1 mg/mL LPS ile 4 saat uyarılmış ve daha sonra 0,025–0,5 mg/mL ACSP veya NCSP ile 24 saat muamele edilmiştir.

LPS uygulaması iNOS, IL-1β, IL-6 ve TNF-α gibi pro-inflamatuvar genlerin ekspresyonunu artırırken IL-10'u azaltmıştır. Her iki hidrolizat bu değişimleri ters yönde etkilemiş, ancak ACSP genel olarak NCSP'den daha kuvvetli yanıt göstermiştir. Kültür süpernatanındaki ELISA sonuçlarında da IL-1β, IL-6 ve TNF-α azalırken IL-10 artmıştır.

qPCR'de 2^−ΔΔCt yöntemi ne amaçla kullanıldı?

Çalışmada iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, ZO-1, claudin-1 ve occludin genlerinin göreli mRNA ekspresyonu qPCR ile ölçülmüş ve GAPDH endojen referans gen olarak kullanılmıştır. 2^−ΔΔCt yöntemi, hedef gen sinyalini önce referans gene göre normalize eder, ardından deney grubundaki değişimi karşılaştırma grubuna göre göreli olarak ifade eder. Bu yöntem mutlak molekül sayısı değil, normalize edilmiş göreli ekspresyon değişimi verir.

Fare Deneyinde ACSP Nasıl Test Edildi?

Otuz erkek C57BL/6 fare altı gruba rastgele dağıtılmıştır; kontrol dışında bütün gruplar 7 gün boyunca içme suyunda %3 DSS almış, ardından DSS kesilmiş ve sonraki 7 gün boyunca model grubuna PBS, pozitif kontrol grubuna 200 mg/kg mesalazin, ACSP gruplarına ise 100, 200 veya 400 mg/kg ACSP günde bir kez oral gavajla uygulanmıştır.

Hastalık aktivite indeksi nasıl hesaplandı?

Farelerde kolit şiddeti vücut ağırlığı kaybı, dışkı kıvamı ve makroskopik rektal kanama olmak üzere üç bileşenden değerlendirilmiştir. Her bileşen 0–4 arasında puanlanmıştır.

DAI = vücut ağırlığı kaybı puanı + dışkı kıvamı puanı + rektal kanama puanı

Bu nedenle daha yüksek DAI daha ağır klinik hastalık belirtilerini, daha düşük DAI ise daha hafif belirti toplamını temsil eder. Araştırmacılar değerlendirmeleri grup atamasına kör personelle gerçekleştirmiştir.

Organ indeksi

Dalak ve timus için kullanılan organ indeksi şu şekilde hesaplanmıştır:

Organ indeksi = organ ağırlığı / vücut ağırlığı

Bu oran, organ ağırlığının hayvanın toplam vücut büyüklüğünden bağımsızlaştırılarak gruplar arasında karşılaştırılmasına yardımcı olur.

ACSP hastalık belirtilerini nasıl etkiledi?

DSS uygulaması kilo kaybı, ishal ve kanlı dışkı ile karakterize akut kolit tablosu oluşturmuştur. İki yönlü tekrarlı ölçümler ANOVA'sında tedavi grubu, zaman ve grup × zaman etkileşiminin hem DAI hem de göreli vücut ağırlığında anlamlı olduğu bildirilmiştir; tüm bu etkiler için p < 0,0001'dir.

ACSP gruplarında DAI değerleri model grubundan anlamlı derecede düşüktür ve kaynak bu değişimi dozla ilişkili olarak tanımlamaktadır. ACSP ayrıca DSS ile ilişkili dalak büyümesini ve dalak/vücut ağırlığı oranındaki artışı azaltmıştır. Kolon kısalması da doz arttıkça daha fazla düzelmiştir.

Histopatoloji ne gösterdi?

Kaynak Şekil 4'te gerçek H&E ve AB-PAS histoloji görüntüleri bulunmaktadır. Model grubunda mukozal ülserasyon, kript yapısında bozulma, yoğun inflamatuvar infiltrasyon ve epitel erozyonu görülmüştür. ACSP tedavisiyle kript mimarisi daha iyi korunmuş, ülserasyon ve inflamatuvar infiltrasyon azalmıştır. AB-PAS boyaması goblet hücrelerindeki toparlanmayı göstermiştir.

Bu histolojik görüntüler doğrudan mikroskobik kanıt olduğu için Verianla içinde sentetik mikroskopi görüntüsü üretilmemiştir. Bunun yerine kaynakta verilen nicel histoloji sonuçları korunmuştur.

Model grubunda goblet hücreleri 26,0 ± 2,77 hücre/kript değerinden 3,3 ± 1,73'e düşmüştür. Yüksek doz ACSP grubunda bu sayı 16,4 ± 1,69'a yükselmiştir. Histolojik hasar skoru kontrol grubundaki 0,5 ± 0,2 değerinden model grubunda 10,4 ± 0,8'e çıkmış, yüksek doz ACSP ile 4,8 ± 0,4'e gerilemiştir.

İnflamatuvar sitokinler ve oksidatif stres

Fare kolon dokusunda ACSP, model grubuna göre IL-1β, IL-6 ve TNF-α mRNA ekspresyonunu kaynakta raporlanan sonuçlara göre %38–82; aynı sitokinlerin protein konsantrasyonlarını ise %35–87 azaltmıştır. Etki doza bağlı bir eğilim göstermiştir.

Yüksek doz ACSP grubunda IL-10 mRNA seviyesi model grubunun 5,8 katına, IL-10 protein seviyesi ise 1,67 katına ulaşmıştır. DSS, SOD ve CAT aktivitelerini düşürürken MPO aktivitesini artırmış; ACSP antioksidan enzim aktivitelerini toparlamış ve MPO'yu azaltmıştır. Yüksek doz ACSP kolon NO düzeyini model grubuna göre %80'den fazla azaltmıştır.

Bağırsak bariyeri: ZO-1, claudin-1 ve occludin

Bağırsak epiteli yalnız fiziksel bir duvar değildir. Komşu epitel hücreleri arasındaki sıkı bağlantı kompleksleri, bağırsak lümenindeki maddelerin kontrolsüz biçimde dokuya geçmesini sınırlandıran önemli bir bariyer oluşturur. Çalışma bu yapı için ZO-1, claudin-1 ve occludin proteinlerini incelemiştir.

DSS, bu üç proteinin mRNA düzeylerini belirgin biçimde azaltmıştır. ACSP bunların ekspresyonunu doza bağlı biçimde artırmıştır. ZO-1 mRNA ve protein düzeyi model grubuna kıyasla %70'ten fazla artmış; immünofloresan analizinde ACSP ile tedavi edilen gruptaki ZO-1 floresans yoğunluğu model grubunun 8,9 katına ulaşmıştır. Claudin-1 ve occludin için de benzer yönlü sonuçlar raporlanmıştır.

Western blot ve immünofloresan görüntüleri bu bariyer proteinlerinin artışı ve epitel membranı boyunca dağılımındaki toparlanmayı desteklemektedir. Ancak gerçek immünofloresan ve Western blot görüntüleri deneysel kanıt niteliğinde olduğu için Verianla tarafından yapay olarak yeniden üretilmemiştir.

ACSP hangi peptitleri içeriyor?

LC–MS/MS ile ACSP içinde 516 peptit dizisi tanımlanmıştır. Peptitlerin uzunluğu 3–26 amino asit arasında değişmiştir. Dizi sayısı temelinde peptitlerin %54,37'si 500–1000 Da, %41,94'ü 1000–2000 Da, %2,14'ü 500 Da veya daha düşük ve %1,55'i 2000–3000 Da aralığındadır. Böylece 1 kDa veya daha düşük moleküler kütleye sahip diziler toplamın %56,51'ini oluşturmaktadır.

En yüksek güvenli peptit dizi atamaları

Buradaki −10lgP skoru bir peptidin miktarını veya biyolojik aktivitesinin büyüklüğünü göstermez. Kaynak özellikle daha yüksek skorun veritabanı tabanlı dizi atamasına yönelik daha yüksek tanımlama güvenini ifade ettiğini belirtmektedir.

Peptit tanımlamasında ham LC–MS/MS verileri UniProtKB Procambarus clarkii protein veritabanına karşı PEAKS Studio 11.5 ile aranmıştır. Prekürsör kütle toleransı 10 ppm, fragman toleransı 0,02 Da olarak ayarlanmıştır. Peptit uzunluğu arama sırasında 3–45 amino asitle sınırlandırılmış; N-terminal asetilasyon (+42,01 Da) ile histidin/triptofan oksidasyonu (+15,99 Da) değişken modifikasyon olarak tanımlanmıştır.

Tanımlamalar PEAKS −10lgP ≥ 37,04 eşiğinde filtrelenmiştir. Yanlış keşif oranı peptit-spektrum eşleşmesi düzeyinde %1,0, peptit dizisi düzeyinde %1,4 olarak raporlanmıştır. Bu kalite kontrol, “516 peptit” sayısının yalnızca ham spektrum sayımı olmadığını; belirlenen güven eşiklerinden geçen dizi atamalarını temsil ettiğini anlamak açısından önemlidir.

Önerilen mekanizmalar ne kadar kesin?

Yazarlar ACSP'deki aromatik ve redoks-aktif amino asit kalıntılarının elektron veya hidrojen atomu vererek reaktif oksijen türlerini sınırlayabileceğini tartışmaktadır. Oksidatif stresin azalmasının redoksa duyarlı MAPK ve NF-κB sinyalini zayıflatabileceği; böylece inflamatuvar mediyatörlerin azalmasına ve ZO-1, claudin-1 ile occludin gibi bariyer proteinlerinin toparlanmasına uygun ortam sağlayabileceği ileri sürülmektedir.

Ayrıca AMPK–MLCK–MLC ekseni ve Nrf2–Keap1 gibi yollar olası açıklamalar arasında tartışılmıştır. Ancak çalışmada bu yolakların doğrudan aktivasyonu veya inhibisyonu hedeflenmiş bağlanma deneyleri, özgül inhibitörler, genetik susturma veya yolak bozma deneyleriyle gösterilmemiştir. Araştırmacılar bu mekanizmaları hipotez olarak sunmakta ve hedeflenmiş doğrulama deneylerine ihtiyaç olduğunu açıkça belirtmektedir.

ACSP İnsanlarda Kolit Tedavisi Olarak Kullanılabilir mi?

Bu çalışma buna cevap vermez. ACSP'nin antioksidan ve anti-inflamatuvar etkileri hücrelerde ve DSS ile oluşturulmuş akut fare koliti modelinde gösterilmiştir; insanlarda doz, emilim, metabolizma, etkinlik, güvenlik, alerjenite veya mevcut tedavilerle etkileşim araştırılmamıştır ve çalışma ACSP'yi klinik tedavi olarak doğrulamamaktadır.

Neden fare modelindeki sonuç doğrudan insana çevrilemez?

DSS modeli bağırsak epiteline kimyasal hasar vererek akut kolit benzeri inflamasyon oluşturur ve deneysel bağırsak inflamasyonunu incelemek için yaygın kullanılan bir hayvan modelidir. Bununla birlikte insan ülseratif koliti ve Crohn hastalığı çok daha karmaşık, kronik ve heterojen hastalıklardır. Genetik yapı, mikrobiyota, bağışıklık sistemi, çevresel etkenler, hastalık süresi ve kullanılan ilaçlar gibi çok sayıda değişken insan hastalığında birlikte rol oynar.

Bu nedenle 400 mg/kg ACSP'nin farelerde etkili olması, insanlar için aynı dozun veya herhangi bir doğrudan dönüştürülmüş dozun etkili ya da güvenli olduğunu göstermez. Çalışmanın kendi sınırlılıkları arasında farmakokinetik, sistemik maruziyet, gastrointestinal stabilite, emilim, kapsamlı güvenlik ve klinik çalışmaların bulunmaması yer almaktadır.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Çalışmanın deneysel katmanları

1. Kerevit kabuğu yağdan ve mineral yapıdan arındırıldı.
2. Beş farklı proteazla PCSP, ACSP, NCSP, TCSP ve PECSP üretildi.
3. Beş hidrolizat antioksidan ve hücresiz anti-inflamatuvar testlerle tarandı.
4. ACSP ve NCSP IEC-6 hücrelerinde canlılık ve LPS kaynaklı inflamasyon açısından değerlendirildi.
5. Genel olarak daha güçlü hücresel etki gösteren ACSP, DSS ile oluşturulan akut kolit fare modeline taşındı.
6. Farelerde hastalık aktivitesi, vücut ağırlığı, kolon uzunluğu, immün organlar, histoloji, goblet hücreleri, sitokinler, oksidatif stres ve sıkı bağlantı proteinleri ölçüldü.
7. ACSP içindeki peptitler LC–MS/MS ile tanımlandı ve protein kaynaklarıyla eşleştirildi.

Hayvan deneyi örneklem yapısı

Toplam 30 erkek C57BL/6 fare kullanılmıştır. Fareler 6 haftalık ve 20 ± 1 g ağırlığındadır. Üç günlük adaptasyondan sonra random sayı prosedürüyle altı gruba, grup başına beş hayvan olacak şekilde dağıtılmıştır. Araştırmacılar örneklem büyüklüğünün deney öncesi güç analizi ile belirlendiğini ve varsayımların Ek Yöntemler'de verildiğini belirtmektedir. Nihai analizden hayvan veya veri noktası çıkarılmamıştır.

Körleme

Vücut ağırlığı, dışkı özellikleri ve genel klinik durum her gün sabit zamanda grup dağılımına kör personel tarafından değerlendirilmiştir. Doku analizleri de veri analizi tamamlanıncaya kadar kodlanmış örnekler üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bu yaklaşım gözlemcinin hangi numunenin hangi tedavi grubundan geldiğini bilmesinin ölçüm üzerindeki etkisini azaltmayı amaçlar.

Histoloji

Distal kolon dokusu %4 paraformaldehit içinde fikse edilmiş, parafine gömülmüş ve 5 µm kalınlıkta kesilmiştir. Hematoksilen-eozin boyaması inflamatuvar infiltrasyon, kript hasarı ve etkilenen alan üzerinden histolojik hasarın değerlendirilmesinde kullanılmıştır. Goblet hücreleri Alcian blue–periodic acid–Schiff (AB-PAS) boyamasıyla belirlenmiştir.

ELISA ve gen ekspresyonu

IEC-6 kültür süpernatanı ve kolon homojenatlarında TNF-α, IL-1β, IL-6 ve IL-10 ELISA kitleriyle ölçülmüştür. qPCR analizinde iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, ZO-1, claudin-1 ve occludin incelenmiş, GAPDH referans gen olarak kullanılmıştır.

Western blot ve immünofloresan

Kolon dokusunda ZO-1, claudin-1 ve occludin proteinleri Western blot ile değerlendirilmiştir. Eşit miktarda protein %12,5 SDS-PAGE ile ayrılmış, PVDF membrana aktarılmış ve ilgili primer antikorlarla inkübe edilmiştir. Sinyaller GAPDH'ye normalize edilmiş ve kontrol grubuna göre göreli olarak ifade edilmiştir.

İmmünofloresan analizinde 5 µm kolon kesitleri üzerinde ZO-1, claudin-1 ve occludin boyaması yapılmış, çekirdekler DAPI ile karşı boyanmış ve floresans yoğunluğu ImageJ 1.8.0 ile nicelleştirilmiştir. Western blot için her gruptan farklı farelere ait üç bağımsız kolon örneği kullanılmış; teknik ölçümler bağımsız biyolojik tekrar olarak sayılmamıştır.

LC–MS/MS cihaz ve analiz koşulları

ACSP peptitleri EASY-nLC 1000 sistemiyle bağlantılı QE kütle spektrometresinde incelenmiştir. ACSP %0,1 formik asitte çözülmüş, 14.000×g'de 20 dakika ve 4 °C'de santrifüj edilmiştir. 1 mg/mL konsantrasyondaki süpernatandan 3 µL, PepMap RSLC C18 kolonuna 250 nL/dakika akış hızında enjekte edilmiştir.

Ham veriler PEAKS Studio 11.5, build 20230821 ile UniProtKB Procambarus clarkii veritabanına karşı aranmıştır. Enzim özgüllüğü “None”, sindirim biçimi “unspecific” olarak seçilmiş, en fazla üç missed cleavage izin verilmiş ve arama peptit uzunluğu 3–45 amino asit olarak ayarlanmıştır.

İstatistiksel analiz

Veriler GraphPad Prism 8 ile analiz edilmiş ve ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur. Parametrik testler öncesinde model artıklarının normalliği Shapiro–Wilk, gruplar arasındaki varyans homojenliği Levene testiyle değerlendirilmiştir.

Zamana bağlı DAI ve göreli vücut ağırlığı, tedavi grubunun gruplar-arası faktör, zamanın grup-içi faktör ve farenin tekrarlı ölçüm birimi olduğu iki yönlü karma tasarımlı tekrarlı ölçümler ANOVA'sıyla analiz edilmiştir. Grup × zaman etkileşimi anlamlı olduğunda deney sonunda DSS model grubuna karşı önceden belirlenmiş karşılaştırmalar için Dunnett çoklu karşılaştırma testi kullanılmıştır.

Deney sonunda bir kez ölçülen sonlanımlar normal dağılım ve varyans homojenliği varsayımları karşılandığında tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey çoklu karşılaştırma testiyle analiz edilmiştir. Bütün testler iki yönlüdür ve p < 0,05 istatistiksel anlamlılık sınırı olarak kullanılmıştır.

Çalışmanın desteklediği sonuçlar

• Proteaz seçimi aynı kerevit kabuğu protein kaynağından elde edilen hidrolizatların ölçülen biyolojik aktivitelerini değiştirmiştir.
• ACSP ve NCSP ilk antioksidan/anti-inflamatuvar taramada en güçlü genel adaylar arasında yer almıştır.
• ACSP, LPS ile uyarılmış IEC-6 hücrelerindeki inflamatuvar belirteçleri genel olarak NCSP'den daha güçlü biçimde düzenlemiştir.
• DSS fare modelinde ACSP 100–400 mg/kg doz aralığında hastalıkla ilişkili çok sayıda göstergede dozla ilişkili iyileşmelerle bağlantılıdır.
• Yüksek doz ACSP, DAI, kolon kısalması, histolojik skor ve goblet hücresi kaybı açısından model grubundan daha iyi sonuç göstermiştir.
• ACSP uygulaması pro-inflamatuvar sitokinlerin azalması, IL-10 artışı, antioksidan enzim aktivitelerinin toparlanması, MPO ve NO'nun azalmasıyla ilişkilidir.
• ZO-1, claudin-1 ve occludin sonuçları, ACSP uygulamasının fare modelinde epitel bariyerinin daha iyi korunmasıyla ilişkili olduğunu desteklemektedir.
• LC–MS/MS, ACSP'nin 516 tanımlanmış peptit dizisi içeren karma bir hidrolizat olduğunu göstermiştir.

Çalışmanın desteklemediği sonuçlar

• ACSP'nin insanlarda ülseratif kolit veya Crohn hastalığını tedavi ettiği gösterilmemiştir.
• Farelerde kullanılan 100–400 mg/kg dozların insanlarda uygun doz olduğu gösterilmemiştir.
• Tek tek 516 peptitten hangisinin veya hangilerinin biyolojik etkiden sorumlu olduğu belirlenmemiştir.
• Peptitlerin bağırsakta sindirime dayanıklılığı doğrudan ölçülmemiştir.
• Bağırsak geçirgenliği, epitel transportu, sistemik dolaşıma geçiş ve farmakokinetik değerlendirilmemiştir.
• NF-κB, MAPK, Nrf2–Keap1 veya AMPK–MLCK–MLC yolaklarının ACSP tarafından doğrudan hedeflendiği deneysel olarak kanıtlanmamıştır.
• Uzun dönem toksisite, kapsamlı güvenlik ve alerjenite değerlendirilmemiştir.
• Klinik çalışma yapılmamıştır.

Çalışmanın güçlü tarafı ve temel sınırlılığı

Çalışmanın önemli güçlü yönlerinden biri tek bir test sonucuna dayanmamasıdır. Araştırmacılar enzimatik taramayı kimyasal antioksidan testleri, hücre modeli, fare modeli, histoloji, biyokimyasal belirteçler, gen ekspresyonu, protein analizi ve peptidomik karakterizasyonla birbirine bağlayan aşamalı bir deney tasarımı kurmuştur.

Buna karşılık ana sınırlılık ACSP'nin tek bir saf molekül değil, 516 tanımlanmış dizi içeren karma bir hidrolizat olmasıdır. Bu nedenle hangi peptitlerin hangi hedefe hangi bağlanma veya sinyal mekanizmasıyla etki ettiği çözülmemiştir. Ayrıca hayvan deneyi kısa süreli akut DSS modelidir; kronik insan inflamatuvar bağırsak hastalığının bütün biyolojisini temsil etmez.

Kaynak ve Yöntem Notu

Özgün çalışma: Anti-Inflammatory Protein Hydrolysate Screened from Crayfish Shells Attenuates Colitis by Oxidative Stress Suppression, Inflammation Reduction and Barrier Reconstruction

Yazarlar: Lei Dong; Hao Wang; Yongmin Wu; Jinyang Peng; Shaohao Lai; Zexin Zhao; Yongqi Yin; Jun Cai.

Corresponding author: Jun Cai.

Kurumlar: School of Life and Health Sciences, Hubei University of Technology, Wuhan, China; College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou, China.

Dergi: Foods.

Yayınevi: MDPI, Basel, Switzerland.

Cilt / sayı / makale numarası: 15(19), 3389.

DOI: 10.3390/foods15193389.

Makale türü: Article; deneysel preklinik araştırma.

Received: Version of Record PDF'de 14 Ağustos 2026.

Revised: Version of Record PDF'de 18 Eylül 2026.

Accepted: Version of Record PDF'de 20 Eylül 2026.

Published: Version of Record PDF ve ana makale kaydında 23 Eylül 2026.

Metadata notu: MDPI'nin ayrı Version Notes ekranı gönderim, revizyon, kabul ve yayın tarihlerini Version of Record PDF'ye göre bir gün daha erken göstermektedir. Bilimsel kaynak kimliğinde Version of Record PDF tarihleri esas alınmıştır.

Hakemlik durumu: Foods, MDPI tarafından yayımlanan uluslararası hakemli bir açık erişim dergisidir. Makalenin akademik editörü Ronaldo Vagner Thomatieli-Santos olarak belirtilmiştir.

Lisans: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Finansman: National Natural Science Foundation of China, proje 32302019; Research Fund for Key R&D Projects in Hubei Province, proje 2022BBA0053.

Etik kurul: Hubei University of Technology Animal Ethics Committee; protokol HBUT20250021; onay tarihi 25 Haziran 2025.

Bilgilendirilmiş onam: Uygulanamaz.

Veri erişilebilirliği: Çalışmanın özgün katkıları makale ve ek materyaller içinde sunulmaktadır; ek sorular corresponding author'a yönlendirilebilir.

Çıkar çatışması: Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmiştir.

Yazar katkıları: Kavramsallaştırma: L.D., H.W., Y.W.; metodoloji: L.D., J.P.; yazılım: S.L.; doğrulama: L.D., H.W., Y.W.; formal analiz: S.L.; araştırma: J.P., S.L.; kaynaklar: J.C., Z.Z.; veri kürasyonu: J.P.; görselleştirme: L.D., H.W.; danışmanlık/süpervizyon: J.C., Z.Z.; proje yönetimi: L.D., J.C., Z.Z.; finansman edinimi: J.C., Z.Z.; ilk taslak: L.D.; gözden geçirme ve düzenleme: J.C., Z.Z., Y.Y.

Ek materyaller: ACSP total ion chromatogramı; LC–MS/MS kalite kontrol grafikleri; açıklamalı MS/MS spektrumları; DAI puanlama ölçütleri; kolon histolojik hasar ölçütleri; primer dizileri; LC elüsyon gradyanı; LC–MS/MS arama parametreleri; peptit tanımlama sonuçları ve a priori örneklem büyüklüğü hesaplamasının varsayımları.

Temel bilimsel sınır: Bu çalışma insanlarda tedavi deneyi değildir. ACSP'nin insanlarda oral biyoyararlanımı, bağırsak emilimi, farmakokinetiği, etkin dozu, uzun dönem güvenliği, alerjenitesi ve klinik yararı belirlenmemiştir.

Mekanizma sınırı: Çalışmada ölçülen sitokin, oksidatif stres ve bariyer proteinlerindeki değişiklikler ACSP ile uyumludur; ancak NF-κB/MAPK, Nrf2–Keap1 ve AMPK–MLCK–MLC gibi önerilen yolaklar doğrudan hedef doğrulama deneyleriyle kanıtlanmamıştır.