Щелочтук протеаза менен алынган дарыя рагынын кабыгынан алынган белок гидролизаты (alkaline-protease-derived crayfish shell protein hydrolysate, ACSP) — дарыя рагынын кабыгындагы белоктор щелочтук протеаза менен ферменттик ажыроого учураганда пайда болгон аралаш пептид гидролизаты. Изилдөөчүлөр адегенде папаин, щелочтук протеаза, нейтралдуу протеаза, трипсин жана пепсин колдонуп беш түрдүү дарыя рагынын кабык белок гидролизатын даярдашкан; аларды антиоксиданттык жана сезгенүүгө каршы касиеттери боюнча скринингден өткөрүшкөн; алдыга чыккан ACSP жана NCSP ни LPS менен стимулданган IEC-6 ичеги эпителий клеткаларында изилдеп, жалпы клеткалык таасири эң күчтүү болгон ACSP ни DSS менен курч колит түзүлгөн чычкан моделинде баалашкан. Акыркы этапта ACSP нин пептиддик курамы LC–MS/MS менен мүнөздөлгөн.

Алгачкы скринингде ACSP нин DPPH жана ABTS•⁺ радикалдары үчүн IC₅₀ көрсөткүчтөрү тиешелүүлүгүнө жараша 0,888 ± 0,004 жана 0,853 ± 0,003 mg/mL болгон. ACSP ошондой эле беш гидролизаттын ичинен гидроксил радикалын тазалоо активдүүлүгүнүн эң жогорку көрсөткүчүн %29,525 ± 0,499 жана супероксид анион радикалын тазалоо активдүүлүгүнүн эң жогорку көрсөткүчүн %47,310 ± 1,351 көрсөткөн. Нейтралдуу протеаза гидролизаты NCSP болсо ABTS•⁺ IC₅₀ көрсөткүчү жана FRAP калыбына келтирүү жөндөмү боюнча айрым өлчөөлөрдө ACSP ге караганда күчтүүрөөк натыйжа берген. Ошондуктан биринчи этап бир эле тесттин жыйынтыгына эмес, ар түрдүү антиоксиданттык жана сезгенүүгө каршы көрсөткүчтөрдү биргелешип баалоого негизделген.

LPS менен стимулданган IEC-6 клеткаларында ACSP жана NCSP сезгенүүнү күчөтүүчү iNOS, IL-1β, IL-6 жана TNF-α өзгөрүүлөрүн азайтып, сезгенүүгө каршы IL-10 багытындагы жоопту күчөткөн; жалпы алганда ACSP күчтүүрөөк таасир көрсөткөн. Чычкан тажрыйбасында дене салмагына карата 100, 200 жана 400 mg/kg дозаларында берилген ACSP DSS жараткан салмак жоготууну, оорунун активдүүлүгүн, жоон ичегинин кыскарышын, гистологиялык зыянды жана бокал сымал клеткалардын жоголушун дозага байланыштуу түрдө жеңилдеткен. Жогорку дозалуу ACSP тобунда 14-күндөгү оорунун активдүүлүк индекси 3,60 ± 0,55 болсо, DSS моделдик тобунда 9,40 ± 1,14 болгон; гистологиялык балл тиешелүүлүгүнө жараша 4,80 ± 0,40 жана 10,40 ± 0,80 деп билдирилген.

ACSP ошондой эле сезгенүүнү күчөтүүчү цитокиндерди, миелопероксидаза активдүүлүгүн жана азот оксидинин деңгээлин азайткан; супероксид дисмутаза жана каталаза активдүүлүгүнүн калыбына келиши, ошондой эле ZO-1, claudin-1 жана occludin сыяктуу тыгыз байланыш белокторунун кайра көбөйүшү менен байланышкан. LC–MS/MS анализи ACSP ичинде 516 пептиддик ырааттуулукту аныктаган. Бирок бул изилдөө адамдарда колитти дарылоонун натыйжалуулугун же коопсуздугун көрсөтпөйт. Натыйжалар клетка системасы жана кыска мөөнөттүү чычкан модели деңгээлинде; ашказан-ичеги туруктуулугу, ичегиден сиңирүү, фармакокинетика, системалык таасирленүү, узак мөөнөттүү коопсуздук, аллергендүүлүк жана клиникалык натыйжалуулук бааланган эмес.

Изилдөөнүн негизги көйгөйү

Сезгенүүчү ичеги оорулары жаралуу колит жана Crohn оорусу сыяктуу өнөкөт сезгенүү бузулууларын камтыйт. Оору процессинде генетикалык ыктуулук, айлана-чөйрө факторлору, ичеги микробиотасынын бузулушу, оксидативдик стресс жана ашыкча иммундук активдешүү сыяктуу көптөгөн компоненттер бирге роль ойношу мүмкүн. Изилдөөнүн авторлору учурдагы фармакологиялык дарылоолор маанилүү болгонуна карабастан, терс таасирлер, экинчи жооптун жоголушу, баасы жана былжыр челдин айыгышы ар бир бейтапта толук болбой калышы сыяктуу чектөөлөр болушу мүмкүн экенин белгилеп, азыктан алынган биологиялык активдүү пептиддерди изилдөөгө татыктуу багыт катары карашат.

Изилдөөнүн экинчи көйгөйү ресурстарды пайдаланууга байланыштуу. Рак сымал (Procambarus clarkii) иштетүү өнөр жайында кабыктар олуттуу көлөмдө кошумча продукт түзөт. Булакка ылайык, кабык бөлүгү жалпы дарыя рагынын биомассасынын болжол менен %60–70 ын түзүшү жана болжол менен %20–30 хитин менен %20–40 белокту камтышы мүмкүн. Ошого карабастан бул материалды жогорку кошумча нарк менен пайдалануу чектелүү. Ошондуктан изилдөө ичеги ден соолугуна багытталган биологиялык активдүүлүктү да, деңиз/акватикалык азык-түлүк иштетүүнүн кошумча продуктусун баалоону да бир эле эксперименттик алкакта карайт.

Белок гидролизаты деген эмне?

Белок гидролизаты — чоң белок молекулалары ферменттер аркылуу кичине пептиддерге жана пептид бөлүктөрүнө бөлүнгөндө алынуучу аралашма. Протеазанын кайсы пептид байланыштарын артык көрүп кесиши пайда болгон пептиддердин узундугун, аминокислота ырааттуулугун жана ошону менен бирге физика-химиялык касиеттерин өзгөртө алат. Ошондуктан бир эле дарыя рагынын кабыгынын белогу ар башка протеазалар менен ажыратылганда биологиялык активдүүлүгү ар башка гидролизаттар пайда болушу мүмкүн.

Бул изилдөөнүн негизги эксперименттик логикасы дал ушунда: бир эле негизги белок булагы беш башка протеаза менен гидролизделип, алынган продуктылар салыштырылган жана жалпы биологиялык активдүүлүгү эң күчтүү талапкер кийинки эксперименттик этаптарга өткөрүлгөн.

Рак сымал кабыгынын гидролизаттары кантип даярдалды?

Рак сымалдын кабыктары майда бөлүктөргө бөлүнүп, кургатылып, механикалык майдаланып жана 60 mesh электен өткөрүлгөн. Кабык порошогу адегенде 1:10 (w/v) катышында петролей эфири менен аралаштырылып, бөлмө температурасында 6 саат магниттик аралаштыруудан өткөрүлгөн жана май камтыган эриткич фильтрация менен алынып салынган.

Майсыздандырылган материал андан кийин 1 M HCl менен 1:10 (w/v) катышында 2 саат декальцинацияланган. Аралашма 5000×g да 20 мүнөт центрифугаланып, супернатант алынып салынган жана катуу калдык кургатылып, декальцинацияланган дарыя рагынын кабыгынын порошогу алынган.

Гидролиз этабында кабык порошогу дистилденген сууда 1:25 (w/v) катышында дисперсияланып, беш башка протеаза үчүн аныкталган шарттарда 6 саат гидролизделген. Реакциянын аягында ферменттер 95 °C де 15 мүнөт кармалып инактивацияланган; продукт 0,45 µm фильтрден өткөрүлүп, фильтрат лиофилизацияланып жана 4 °C де сакталган.

Булак ошондой эле методдор бөлүмүндө гидролизаттардын 4 °C де 0, 7, 15 жана 30 күн сакталгандан кийин антиоксиданттык жана сезгенүүгө каршы тесттер кайталап жүргүзүлүп, функционалдык туруктуулугу бааланганын билдирет. Бирок негизги макаланын натыйжалар бөлүмүндө бул сактоо сериясына тиешелүү кеңири сандык натыйжалар өзүнчө негизги натыйжалар топтому катары берилген эмес; ошондуктан Verianla текстинде булакта жок туруктуулук сандары түзүлгөн эмес.

Эмне Үчүн ACSP Беш Гидролизаттын Арасынан Кийинки Тажрыйбаларга Өткөрүлдү?

ACSP бардык антиоксиданттык тесттерде жалгыз биринчи орунда болбосо да, радикалдарды тазалоо, SOD/CAT жообу, NO бөлүнүшү жана альбумин денатурациясы тесттеринде күчтүү жана тең салмактуу профиль көрсөткөн; ACSP менен NCSP биринчи клеткалык этапка тандалып, LPS менен стимулданган IEC-6 клеткаларында ACSP жалпы алганда күчтүүрөөк сезгенүүгө каршы жооп бергендиктен, чычкан моделинде ACSP бааланган.

Беш гидролизаттын антиоксиданттык скрининги

DPPH жана ABTS тесттеринде IC₅₀ көрсөткүчүнүн төмөн болушу %50 радикал тазалоо деңгээлине гидролизаттын төмөнүрөөк концентрациясында жеткенин, демек активдүүлүк күчтүүрөөк экенин билдирет. FRAP жана түз тазалоо пайыздарында болсо жогорку көрсөткүч күчтүүрөөк антиоксиданттык жоопту билдирет. Демек, 2-таблица бир эле “жеңүүчү” тесттен эмес, ар башка редокс касиеттерин өлчөгөн бир нече метрикадан турат.

Булактын 1-сүрөтүндө ACSP SOD активдүүлүгүн болжол менен %25, CAT активдүүлүгүн %18 ден көп жогорулатканы жана бул өсүштөр PCSP жана PECSP ге салыштырмалуу статистикалык жактан жогору болгону билдирилет. Клеткасыз системада ACSP SNP келип чыккан NO бөлүнүшүн %20 дан көп басаңдатып, жылуулук менен индукцияланган альбумин денатурациясында %12,21 менен эң жогорку ингибицияны көрсөткөн.

Альбумин денатурациясынын басылышы жана клеткасыз NO тести сезгенүүгө каршы потенциал үчүн скрининг көрсөткүчтөрү болуп саналат. Алар өз алдынча тирүү организмде сезгенүү жолдорунун түздөн-түз жөнгө салынганын далилдебейт. Авторлор да талкуу бөлүмүндө клеткасыз тесттин натыйжалары макрофагдан келип чыккан медиаторлордун түз модификацияланганын көрсөтпөй турганын өзгөчө белгилешет.

DPPH радикалын тазалоо теңдемеси

DPPH тазалоо активдүүлүгү (%) = [A₀ − (A₁ − A₂)] / A₀ × 100

Бул жерде A₀ — метанол + DPPH камтыган контролдун абсорбциясы; A₁ — үлгү + DPPH аралашмасынын абсорбциясы; A₂ — үлгү + метанол камтыган үлгү бланкынын абсорбциясы. Үлгүнүн түсүнүн же өзүнүн оптикалык касиеттеринин DPPH сигналына кошкон салымын A₂ менен оңдоо чыныгы радикал тазалоо таасирин такыраак бөлүүгө жардам берет.

Гидролизаттар 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 жана 1,0 mg/mL концентрацияларында изилденип, DPPH өлчөмү 517 nm де жүргүзүлгөн. IC₅₀ %50 тазалоо активдүүлүгүн камсыз кылган гидролизат концентрациясы катары аныкталган.

ABTS•⁺ тести

ABTS•⁺ тестинде гидролизаттар кайрадан 0,2–1,0 mg/mL аралыгында бааланган. ABTS радикал катиону 7 mM ABTS менен 2,45 mM калий персульфатын 1:1 көлөмдүк катышта аралаштырып, аралашманы бөлмө температурасында караңгыда 16–24 саат кармоо менен даярдалган. Жумушчу эритме 734 nm де 0,70 ± 0,02 абсорбцияга чейин суюлтулган; үлгү менен 6 мүнөт инкубациялангандан кийин өлчөө жүргүзүлгөн.

ABTS•⁺ тазалоо активдүүлүгү (%) = (A₀ − A₁) / A₀ × 100

A₀ — бланк контролдун, A₁ — тест үлгүсүнүн абсорбциясы.

FRAP жана башка радикал тесттери

FRAP тести феррик темирдин калыбына келүү жөндөмүн баалайт жана натыйжалар кургак үлгүгө карата µmol Fe(II) эквиваленти катары берилген. Изилдөөчүлөр 100–1000 µM FeSO₄ стандарттарынан y = 0,2638x + 0,0651 жана R² = 0,9992 калибрлөө ийри сызыгын түзүшкөн.

Гидроксил радикалы тестинде үлгү 1 mg/mL концентрациясында колдонулуп, тазалоо пайызы төмөнкүчө эсептелген:

•OH тазалоо активдүүлүгү (%) = [(A₀ − A) / A₀] × 100

Супероксид анион тестинде болсо катехолдун автооксиддениши байкалып, эсептөө:

O₂•⁻ тазалоо активдүүлүгү (%) = [1 − (ΔA_s − ΔA_b) / ΔA₀] × 100

түрүндө жүргүзүлгөн. ΔA_s, ΔA_b жана ΔA₀ тиешелүүлүгүнө жараша үлгү, үлгү бланкы жана суу контролунда 0 менен 5 мүнөт арасындагы абсорбция өзгөрүүлөрүн билдирет.

NO бөлүнүшүнүн жана альбумин денатурациясынын ингибициясы

SNP келип чыккан NO бөлүнүшү клеткасыз системада Griess реакциясы менен бааланган:

NO бөлүнүшүн ингибициялоо (%) = (A_blank − A_sample) / A_blank × 100

Альбумин денатурациясы тестинде %1 BSA камтыган аралашма 37 °C де 15 мүнөт кармалып, андан кийин 90 °C де 20 мүнөт ысытылган. Булуттуулук 660 nm де өлчөнүп, ингибиция:

Денатурацияны ингибициялоо (%) = (A_blank − A_sample) / A_blank × 100

формуласы менен эсептелген.

IEC-6 клетка модели кантип түзүлдү?

IEC-6 клеткалары %10 fetal bovine serum, 100 U/mL пенициллин, 100 µg/mL стрептомицин жана 0,1 IU/mL инсулин камтыган DMEM чөйрөсүндө 37 °C жана %5 CO₂ шарттарында өстүрүлгөн.

Жашоого жөндөмдүүлүктүн убакыттык катары үчүн клеткалар 96 уячалуу пластинкаларда 1 × 10⁵ клетка/mL тыгыздыкта даярдалып, ACSP же NCSP нин 0,1–2,0 mg/mL концентрациялары менен 48 саатка чейин иштетилген. CCK-8 өлчөөлөрү 0, 12, 24, 36 жана 48-сааттарда жүргүзүлгөн. ACSP де жашоого жөндөмдүүлүктүн эң чоң өсүшү 36-саатта 0,05 mg/mL деңгээлинде; NCSP де болсо 36-саатта 0,25 mg/mL деңгээлинде байкалган.

Сезгенүү тажрыйбасында клеткалар 12 уячалуу пластинкаларда 3 × 10⁵ клетка/уяча тыгыздыкта 12 саат өстүрүлүп, 0,1 mg/mL LPS менен 4 саат стимулдалып, андан кийин 0,025–0,5 mg/mL ACSP же NCSP менен 24 саат иштетилген.

LPS колдонулушу iNOS, IL-1β, IL-6 жана TNF-α сыяктуу сезгенүүнү күчөтүүчү гендердин экспрессиясын көбөйтүп, IL-10 ду азайткан. Эки гидролизат тең бул өзгөрүүлөргө тескери багытта таасир эткен, бирок ACSP жалпы алганда NCSP ге караганда күчтүү жооп көрсөткөн. Культура супернатантындагы ELISA натыйжаларында да IL-1β, IL-6 жана TNF-α азайып, IL-10 көбөйгөн.

qPCR де 2^−ΔΔCt ыкмасы кандай максатта колдонулду?

Изилдөөдө iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, ZO-1, claudin-1 жана occludin гендеринин салыштырма mRNA экспрессиясы qPCR менен өлчөнүп, GAPDH эндогендик референс ген катары колдонулган. 2^−ΔΔCt ыкмасы максаттуу ген сигналын адегенде референс генге карата нормалдаштырып, андан кийин эксперименттик топтогу өзгөрүүнү салыштыруу тобуна карата салыштырма түрдө көрсөтөт. Бул ыкма молекулалардын абсолюттук санын эмес, нормалдаштырылган салыштырма экспрессия өзгөрүүсүн берет.

Чычкан Тажрыйбасында ACSP Кантип Сыналды?

Отуз эркек C57BL/6 чычкан кокустук түрдө алты топко бөлүнгөн; контролдон башка бардык топтор 7 күн бою ичүүчү сууда %3 DSS алган, андан кийин DSS токтотулуп, кийинки 7 күн бою моделдик топко PBS, оң контрол тобуна 200 mg/kg mesalazine, ACSP топторуна болсо 100, 200 же 400 mg/kg ACSP күнүнө бир жолу ооз аркылуу гаваж менен берилген.

Оорунун активдүүлүк индекси кантип эсептелди?

Чычкандардагы колиттин оордугу дене салмагын жоготуу, заңдын консистенциясы жана макроскопиялык ректалдык каноо деген үч компонент боюнча бааланган. Ар бир компонент 0–4 аралыгында балл менен бааланган.

DAI = дене салмагын жоготуу баллы + заң консистенциясынын баллы + ректалдык каноо баллы

Ошондуктан жогорку DAI оор клиникалык оорунун белгилерин, төмөн DAI болсо жеңилирээк белгилердин суммасын билдирет. Изилдөөчүлөр баалоолорду топ бөлүштүрүлүшүн билбеген кызматкерлер менен жүргүзүшкөн.

Орган индекси

Көк боор жана тимус үчүн колдонулган орган индекси төмөнкүчө эсептелген:

Орган индекси = орган салмагы / дене салмагы

Бул катыш орган салмагын жаныбардын жалпы дене көлөмүнүн таасиринен салыштырмалуу ажыратып, топтор арасында салыштырууга жардам берет.

ACSP оорунун белгилерине кандай таасир этти?

DSS колдонулушу салмак жоготуу, ич өтүү жана кандуу заң менен мүнөздөлгөн курч колит көрүнүшүн жараткан. Эки багыттуу кайталанма өлчөөлөр ANOVA сында дарылоо тобу, убакыт жана топ × убакыт өз ара таасири DAI да, салыштырма дене салмагында да маанилүү экени билдирилген; бул таасирлердин баары үчүн p < 0,0001.

ACSP топторунда DAI көрсөткүчтөрү моделдик топко караганда статистикалык жактан төмөн болгон жана булак бул өзгөрүүнү дозага байланыштуу деп сүрөттөйт. ACSP ошондой эле DSS менен байланышкан көк боордун чоңоюшун жана көк боор/дене салмагы катышынын өсүшүн азайткан. Жоон ичегинин кыскарышы да доза көбөйгөн сайын көбүрөөк оңолгон.

Гистопатология эмнени көрсөттү?

Булактагы 4-сүрөттө чыныгы H&E жана AB-PAS гистологиялык сүрөттөрү бар. Моделдик топто былжыр челдин жараланышы, крипт түзүлүшүнүн бузулушу, күчтүү сезгенүү инфильтрациясы жана эпителий эрозиясы байкалган. ACSP менен дарылоодо крипт архитектурасы жакшыраак сакталган, жаралануу жана сезгенүү инфильтрациясы азайган. AB-PAS боёосу бокал сымал клеткалардын калыбына келишин көрсөткөн.

Бул гистологиялык сүрөттөр түз микроскопиялык далил болгондуктан, Verianla ичинде синтетикалык микроскопиялык сүрөт түзүлгөн эмес. Анын ордуна булакта берилген сандык гистология натыйжалары сакталган.

Моделдик топто бокал сымал клеткалар 26,0 ± 2,77 клетка/крипт маанисинен 3,3 ± 1,73 ке түшкөн. Жогорку дозалуу ACSP тобунда бул сан 16,4 ± 1,69 га көтөрүлгөн. Гистологиялык зыян баллы контрол тобундагы 0,5 ± 0,2 маанисинен моделдик топто 10,4 ± 0,8 ге көтөрүлүп, жогорку дозалуу ACSP менен 4,8 ± 0,4 ке түшкөн.

Сезгенүү цитокиндери жана оксидативдик стресс

Чычкандын жоон ичеги ткандарында ACSP булакта билдирилген натыйжаларга ылайык моделдик топко салыштырмалуу IL-1β, IL-6 жана TNF-α mRNA экспрессиясын %38–82; ошол эле цитокиндердин белок концентрацияларын %35–87 азайткан. Таасир дозага байланыштуу тенденция көрсөткөн.

Жогорку дозалуу ACSP тобунда IL-10 mRNA деңгээли моделдик топтун 5,8 эсесине, IL-10 белок деңгээли 1,67 эсесине жеткен. DSS SOD жана CAT активдүүлүгүн төмөндөтүп, MPO активдүүлүгүн көбөйткөн; ACSP антиоксидант ферменттердин активдүүлүгүн калыбына келтирип, MPO ну азайткан. Жогорку дозалуу ACSP жоон ичегидеги NO деңгээлин моделдик топко караганда %80 ден көп азайткан.

Ичеги тосмосу: ZO-1, claudin-1 жана occludin

Ичеги эпителийи жөн гана физикалык дубал эмес. Коңшу эпителий клеткаларынын ортосундагы тыгыз байланыш комплекстери ичеги люмениндеги заттардын ткандарга көзөмөлсүз өтүшүн чектеген маанилүү тосмо түзөт. Изилдөө бул түзүлүш үчүн ZO-1, claudin-1 жана occludin белокторун караган.

DSS бул үч белоктун mRNA деңгээлдерин олуттуу азайткан. ACSP алардын экспрессиясын дозага байланыштуу көбөйткөн. ZO-1 mRNA жана белок деңгээли моделдик топко салыштырмалуу %70 тен көп көбөйгөн; иммунофлуоресценция анализинде ACSP менен дарыланган топтогу ZO-1 флуоресценция интенсивдүүлүгү моделдик топтун 8,9 эсесине жеткен. Claudin-1 жана occludin үчүн да ушул багыттагы натыйжалар билдирилген.

Western blot жана иммунофлуоресценция сүрөттөрү бул тосмо белокторунун көбөйүшүн жана эпителий мембранасы боюнча бөлүштүрүлүшүнүн калыбына келишин колдойт. Бирок чыныгы иммунофлуоресценция жана Western blot сүрөттөрү эксперименттик далил болгондуктан, Verianla тарабынан жасалма түрдө кайра түзүлгөн эмес.

ACSP кайсы пептиддерди камтыйт?

LC–MS/MS менен ACSP ичинде 516 пептиддик ырааттуулук аныкталган. Пептиддердин узундугу 3–26 аминокислота аралыгында өзгөргөн. Ырааттуулук санынын негизинде пептиддердин %54,37 си 500–1000 Da, %41,94 ү 1000–2000 Da, %2,14 ү 500 Da же андан төмөн жана %1,55 и 2000–3000 Da аралыгында. Ошентип, 1 kDa же андан төмөн молекулалык массага ээ ырааттуулуктар жалпы санын %56,51 ин түзөт.

Эң жогорку ишенимдүү пептид ырааттуулук дайындоолору

Бул жердеги −10lgP баллы пептиддин санын же биологиялык активдүүлүгүнүн күчүн көрсөтпөйт. Булак өзгөчө жогорку балл маалымат базасына негизделген ырааттуулукту дайындоодо идентификация ишениминин жогору экенин билдирерин белгилейт.

Пептид идентификациясында чийки LC–MS/MS маалыматтары UniProtKB Procambarus clarkii белок маалымат базасына каршы PEAKS Studio 11.5 менен изделген. Прекурсор масса толеранттуулугу 10 ppm, фрагмент толеранттуулугу 0,02 Da болуп коюлган. Издөө учурунда пептид узундугу 3–45 аминокислота менен чектелген; N-terminal ацетилденүү (+42,01 Da) жана гистидин/триптофан оксидденүүсү (+15,99 Da) өзгөрмө модификация катары аныкталган.

Идентификациялар PEAKS −10lgP ≥ 37,04 чегинде фильтрленген. Жалган табылга көрсөткүчү пептид-спектр дал келүү деңгээлинде %1,0, пептид ырааттуулугу деңгээлинде %1,4 деп билдирилген. Бул сапат контролу “516 пептид” саны жөн гана чийки спектрлердин саны эмес экенин, белгиленген ишеним чектеринен өткөн ырааттуулук дайындоолорун билдирерин түшүнүү үчүн маанилүү.

Сунушталган механизмдер канчалык анык?

Авторлор ACSP деги ароматтык жана редокс-активдүү аминокислота калдыктары электрон же суутек атомун берип, реактивдүү кычкылтек түрлөрүн чектей алышы мүмкүн экенин талкуулашат. Оксидативдик стресстин азайышы редокско сезимтал MAPK жана NF-κB сигналын алсыратышы мүмкүн; мунун натыйжасында сезгенүү медиаторлорунун азайышына жана ZO-1, claudin-1 менен occludin сыяктуу тосмо белокторунун калыбына келиши үчүн ылайыктуу шарт түзүлүшү мүмкүн деп сунушталат.

Мындан тышкары AMPK–MLCK–MLC огу жана Nrf2–Keap1 сыяктуу жолдор мүмкүн болгон түшүндүрмөлөрдүн арасында талкууланган. Бирок изилдөөдө бул жолдордун түз активдешүүсү же ингибициясы максаттуу байланыштыруу эксперименттери, спецификалык ингибиторлор, генетикалык басаңдатуу же жолду бузуу эксперименттери менен көрсөтүлгөн эмес. Изилдөөчүлөр бул механизмдерди гипотеза катары сунуштап, максаттуу тастыктоо эксперименттери зарыл экенин ачык белгилешет.

ACSP Адамдарда Колитти Дарылоо Үчүн Колдонулушу Мүмкүнбү?

Бул изилдөө бул суроого жооп бербейт. ACSP нин антиоксиданттык жана сезгенүүгө каршы таасирлери клеткаларда жана DSS менен түзүлгөн курч чычкан колити моделинде көрсөтүлгөн; адамдарда доза, сиңирүү, метаболизм, натыйжалуулук, коопсуздук, аллергендүүлүк же учурдагы дарылоолор менен өз ара таасир изилденген эмес жана изилдөө ACSP ни клиникалык дарылоо катары тастыктабайт.

Эмне үчүн чычкан моделиндеги натыйжаны түздөн-түз адамга которууга болбойт?

DSS модели ичеги эпителийине химиялык зыян келтирип, курч колитке окшош сезгенүү түзөт жана эксперименттик ичеги сезгенүүсүн изилдөө үчүн кеңири колдонулган жаныбар модели болуп саналат. Бирок адамдагы жаралуу колит жана Crohn оорусу кыйла татаал, өнөкөт жана гетерогендүү оорулар. Генетикалык түзүлүш, микробиота, иммундук система, айлана-чөйрө факторлору, оорунун узактыгы жана колдонулган дарылар сыяктуу көптөгөн өзгөрмөлөр адам оорусунда бирге роль ойнойт.

Ошондуктан чычкандарда 400 mg/kg ACSP натыйжалуу болушу адамдар үчүн ошол эле доза же түз которулган кандайдыр бир доза натыйжалуу же коопсуз экенин көрсөтпөйт. Изилдөөнүн өз чектөөлөрүнүн арасында фармакокинетика, системалык таасирленүү, ашказан-ичеги туруктуулугу, сиңирүү, комплекстүү коопсуздук жана клиникалык изилдөөлөрдүн жоктугу бар.

Изилдөөнүн Ыкмасы жана Жыйынтыктары

Изилдөөнүн эксперименттик катмарлары

1. Рак сымалдын кабыгы майдан жана минералдык түзүлүштөн тазаланган.
2. Беш башка протеаза менен PCSP, ACSP, NCSP, TCSP жана PECSP өндүрүлгөн.
3. Беш гидролизат антиоксиданттык жана клеткасыз сезгенүүгө каршы тесттер менен скринингден өткөрүлгөн.
4. ACSP жана NCSP IEC-6 клеткаларында жашоого жөндөмдүүлүк жана LPS келип чыккан сезгенүү боюнча бааланган.
5. Жалпы алганда күчтүүрөөк клеткалык таасир көрсөткөн ACSP DSS менен түзүлгөн курч колит чычкан моделине өткөрүлгөн.
6. Чычкандарда оорунун активдүүлүгү, дене салмагы, жоон ичегинин узундугу, иммундук органдар, гистология, бокал сымал клеткалар, цитокиндер, оксидативдик стресс жана тыгыз байланыш белоктору өлчөнгөн.
7. ACSP ичиндеги пептиддер LC–MS/MS менен аныкталып, белок булактары менен дал келтирилген.

Жаныбар тажрыйбасындагы үлгү түзүмү

Жалпы 30 эркек C57BL/6 чычкан колдонулган. Чычкандар 6 жумалык жана 20 ± 1 g салмакта болгон. Үч күндүк адаптациядан кийин кокустук сан процедурасы менен алты топко, ар бир топко беш жаныбардан бөлүштүрүлгөн. Изилдөөчүлөр үлгү көлөмү тажрыйбага чейинки күч анализи менен аныкталганын жана божомолдор Кошумча Ыкмаларда берилгенин белгилешет. Акыркы анализден бир да жаныбар же маалымат чекити чыгарылган эмес.

Сокурлоо

Дене салмагы, заңдын өзгөчөлүктөрү жана жалпы клиникалык абал күн сайын бир убакта топ бөлүштүрүлүшүн билбеген кызматкерлер тарабынан бааланган. Ткань анализдери да маалыматтарды талдоо аяктаганга чейин коддолгон үлгүлөрдө жүргүзүлгөн. Бул ыкма байкоочунун кайсы үлгү кайсы дарылоо тобуна таандык экенин билүүсүнүн өлчөөгө болгон таасирин азайтууну көздөйт.

Гистология

Дисталдык жоон ичеги тканы %4 параформальдегидде фиксацияланып, парафинге салынган жана 5 µm калыңдыкта кесилген. Гематоксилин-эозин боёосу сезгенүү инфильтрациясын, крипт зыяндарын жана жабыркаган аймакты эске алуу менен гистологиялык зыянды баалоодо колдонулган. Бокал сымал клеткалар Alcian blue–periodic acid–Schiff (AB-PAS) боёосу менен аныкталган.

ELISA жана ген экспрессиясы

IEC-6 культура супернатантында жана жоон ичеги гомогенаттарында TNF-α, IL-1β, IL-6 жана IL-10 ELISA комплекттери менен өлчөнгөн. qPCR анализинде iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, ZO-1, claudin-1 жана occludin каралып, GAPDH референс ген катары колдонулган.

Western blot жана иммунофлуоресценция

Жоон ичеги тканында ZO-1, claudin-1 жана occludin белоктору Western blot менен бааланган. Белоктун тең өлчөмү %12,5 SDS-PAGE менен бөлүнүп, PVDF мембранага өткөрүлүп, тиешелүү биринчилик антителолор менен инкубацияланган. Сигналдар GAPDH ге нормалдаштырылып, контрол тобуна салыштырмалуу берилген.

Иммунофлуоресценция анализинде 5 µm жоон ичеги кесиндилеринде ZO-1, claudin-1 жана occludin боёосу жүргүзүлүп, ядролор DAPI менен каршы боёлгон жана флуоресценция интенсивдүүлүгү ImageJ 1.8.0 менен сандык бааланган. Western blot үчүн ар бир топтон ар башка чычкандарга таандык үч көз карандысыз жоон ичеги үлгүсү колдонулган; техникалык өлчөөлөр көз карандысыз биологиялык кайталануу катары эсептелген эмес.

LC–MS/MS жабдыгы жана анализ шарттары

ACSP пептиддери EASY-nLC 1000 системасына байланышкан QE масс-спектрометрде изилденген. ACSP %0,1 кумурска кислотасында эритилип, 14.000×g да 20 мүнөт жана 4 °C де центрифугаланган. 1 mg/mL концентрациядагы супернатанттан 3 µL, PepMap RSLC C18 колонкасына 250 nL/мүнөт агым ылдамдыгы менен киргизилген.

Чийки маалыматтар PEAKS Studio 11.5, build 20230821 менен UniProtKB Procambarus clarkii маалымат базасына каршы изделген. Фермент спецификалуулугу “None”, сиңирүү формасы “unspecific” деп тандалып, эң көп үч missed cleavage уруксат берилген жана издөөдө пептид узундугу 3–45 аминокислота болуп коюлган.

Статистикалык анализ

Маалыматтар GraphPad Prism 8 менен анализденип, орточо ± стандарттык четтөө катары берилген. Параметрдик тесттерден мурда моделдин калдыктарынын нормалдуулугу Shapiro–Wilk, топтор арасындагы дисперсиянын бир тектүүлүгү Levene тести менен бааланган.

Убакытка байланыштуу DAI жана салыштырма дене салмагы, дарылоо тобу топтор аралык фактор, убакыт топ ичиндеги фактор жана чычкан кайталанма өлчөө бирдиги болгон эки багыттуу аралаш дизайндагы кайталанма өлчөөлөр ANOVA сы менен анализденген. Топ × убакыт өз ара таасири маанилүү болгондо тажрыйбанын аягында DSS моделдик тобуна каршы алдын ала белгиленген салыштыруулар үчүн Dunnett көп салыштыруу тести колдонулган.

Тажрыйбанын аягында бир жолу өлчөнгөн натыйжалар нормалдуу бөлүштүрүү жана дисперсия бир тектүүлүгү божомолдору аткарылганда бир багыттуу ANOVA, андан кийин Tukey көп салыштыруу тести менен анализденген. Бардык тесттер эки тараптуу жана p < 0,05 статистикалык маанилүүлүк чеги катары колдонулган.

Изилдөө колдогон жыйынтыктар

• Протеаза тандоосу бир эле дарыя рагынын кабыгынын белок булагынан алынган гидролизаттардын өлчөнгөн биологиялык активдүүлүгүн өзгөрткөн.
• ACSP жана NCSP алгачкы антиоксиданттык/сезгенүүгө каршы скринингде эң күчтүү жалпы талапкерлердин арасында болгон.
• ACSP LPS менен стимулданган IEC-6 клеткаларындагы сезгенүү маркерлерин жалпы алганда NCSP ге караганда күчтүүрөөк жөнгө салган.
• DSS чычкан моделинде ACSP 100–400 mg/kg доза аралыгында ооруга байланыштуу көптөгөн көрсөткүчтөрдүн дозага байланыштуу жакшырышы менен байланышкан.
• Жогорку дозалуу ACSP DAI, жоон ичегинин кыскарышы, гистологиялык балл жана бокал сымал клеткалардын жоголушу боюнча моделдик топко караганда жакшыраак натыйжа көрсөткөн.
• ACSP колдонулушу сезгенүүнү күчөтүүчү цитокиндердин азайышы, IL-10 көбөйүшү, антиоксидант фермент активдүүлүктөрүнүн калыбына келиши, MPO жана NO азайышы менен байланышкан.
• ZO-1, claudin-1 жана occludin натыйжалары ACSP колдонулушу чычкан моделинде эпителий тосмосунун жакшыраак сакталышы менен байланышканын колдойт.
• LC–MS/MS ACSP 516 аныкталган пептид ырааттуулугун камтыган аралаш гидролизат экенин көрсөткөн.

Изилдөө колдобогон жыйынтыктар

• ACSP адамда жаралуу колитти же Crohn оорусун дарылай турганы көрсөтүлгөн эмес.
• Чычкандарда колдонулган 100–400 mg/kg дозалар адамдар үчүн ылайыктуу доза экени көрсөтүлгөн эмес.
• 516 пептиддин кайсынысы же кайсылары биологиялык таасир үчүн жооптуу экени аныкталган эмес.
• Пептиддердин ичегиде сиңирүүгө туруктуулугу түз өлчөнгөн эмес.
• Ичеги өткөрүмдүүлүгү, эпителий транспорту, системалык кан айланууга өтүшү жана фармакокинетика бааланган эмес.
• NF-κB, MAPK, Nrf2–Keap1 же AMPK–MLCK–MLC жолдору ACSP тарабынан түз максатталганын эксперименттик түрдө далилденген эмес.
• Узак мөөнөттүү уулуулук, комплекстүү коопсуздук жана аллергендүүлүк бааланган эмес.
• Клиникалык изилдөө жүргүзүлгөн эмес.

Изилдөөнүн күчтүү жагы жана негизги чектөөсү

Изилдөөнүн маанилүү күчтүү жактарынын бири — бир эле тесттин жыйынтыгына таянбаганы. Изилдөөчүлөр ферменттик скринингди химиялык антиоксидант тесттер, клетка модели, чычкан модели, гистология, биохимиялык маркерлер, ген экспрессиясы, белок анализи жана пептидомдук мүнөздөмө менен байланыштырган этаптуу эксперименттик дизайн түзүшкөн.

Ал эми негизги чектөө — ACSP бир гана таза молекула эмес, 516 аныкталган ырааттуулукту камтыган аралаш гидролизат. Ошондуктан кайсы пептид кайсы бутага кандай байланышуу же сигнал механизми аркылуу таасир этери аныкталган эмес. Мындан тышкары, жаныбар тажрыйбасы кыска мөөнөттүү курч DSS модели; ал адамдагы өнөкөт сезгенүүчү ичеги оорусунун бардык биологиясын чагылдырбайт.

Булак жана Ыкма Жөнүндө Эскертүү

Түп нуска изилдөө: Anti-Inflammatory Protein Hydrolysate Screened from Crayfish Shells Attenuates Colitis by Oxidative Stress Suppression, Inflammation Reduction and Barrier Reconstruction

Авторлор: Lei Dong; Hao Wang; Yongmin Wu; Jinyang Peng; Shaohao Lai; Zexin Zhao; Yongqi Yin; Jun Cai.

Corresponding author: Jun Cai.

Мекемелер: School of Life and Health Sciences, Hubei University of Technology, Wuhan, China; College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou, China.

Журнал: Foods.

Басмакана: MDPI, Basel, Switzerland.

Том / сан / макала номери: 15(19), 3389.

DOI: 10.3390/foods15193389.

Макаланын түрү: Article; эксперименттик преклиникалык изилдөө.

Received: Version of Record PDF де 14 Август 2026.

Revised: Version of Record PDF де 18 Сентябрь 2026.

Accepted: Version of Record PDF де 20 Сентябрь 2026.

Published: Version of Record PDF жана негизги макала каттоосунда 23 Сентябрь 2026.

Метадайындар боюнча эскертүү: MDPI нин өзүнчө Version Notes экраны тапшыруу, оңдоо, кабыл алуу жана жарыялоо даталарын Version of Record PDF ге салыштырмалуу бир күн эрте көрсөтөт. Илимий булактын идентификациясында Version of Record PDF даталары негиз катары алынган.

Рецензия статусу: Foods — MDPI тарабынан чыгарылган эл аралык рецензияланган ачык жеткиликтүү журнал. Макаланын академиялык редактору Ronaldo Vagner Thomatieli-Santos деп көрсөтүлгөн.

Лицензия: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Каржылоо: National Natural Science Foundation of China, долбоор 32302019; Research Fund for Key R&D Projects in Hubei Province, долбоор 2022BBA0053.

Этика комитети: Hubei University of Technology Animal Ethics Committee; протокол HBUT20250021; бекитүү күнү 25 Июнь 2025.

Маалымдалган макулдук: Колдонулбайт.

Маалыматтардын жеткиликтүүлүгү: Изилдөөнүн оригиналдуу салымдары макалада жана кошумча материалдарда берилген; кошумча суроолор corresponding author га багытталышы мүмкүн.

Кызыкчылыктардын кагылышы: Авторлор кызыкчылыктардын кагылышы жок экенин билдиришкен.

Авторлордун салымы: Концептуалдаштыруу: L.D., H.W., Y.W.; методология: L.D., J.P.; программалык камсыздоо: S.L.; текшерүү: L.D., H.W., Y.W.; формалдык анализ: S.L.; изилдөө: J.P., S.L.; ресурстар: J.C., Z.Z.; маалыматтарды курациялоо: J.P.; визуалдаштыруу: L.D., H.W.; кеңеш берүү/супервизия: J.C., Z.Z.; долбоорду башкаруу: L.D., J.C., Z.Z.; каржылоону алуу: J.C., Z.Z.; алгачкы долбоор: L.D.; карап чыгуу жана редакциялоо: J.C., Z.Z., Y.Y.

Кошумча материалдар: ACSP total ion chromatogram; LC–MS/MS сапат контролунун графиктери; аннотацияланган MS/MS спектрлери; DAI балл берүү критерийлери; жоон ичегинин гистологиялык зыян критерийлери; праймер ырааттуулуктары; LC элюция градиенти; LC–MS/MS издөө параметрлери; пептид идентификациясынын натыйжалары жана a priori үлгү көлөмүн эсептөөнүн божомолдору.

Негизги илимий чек: Бул изилдөө адамдардагы дарылоо сыноосу эмес. ACSP нин адамдардагы ооз аркылуу биожеткиликтүүлүгү, ичегиден сиңүүсү, фармакокинетикасы, натыйжалуу дозасы, узак мөөнөттүү коопсуздугу, аллергендүүлүгү жана клиникалык пайдасы аныкталган эмес.

Механизм боюнча чек: Изилдөөдө өлчөнгөн цитокин, оксидативдик стресс жана тосмо белокторундагы өзгөрүүлөр ACSP менен шайкеш; бирок NF-κB/MAPK, Nrf2–Keap1 жана AMPK–MLCK–MLC сыяктуу сунушталган жолдор түз максатты тастыктоо эксперименттери менен далилденген эмес.