Гидролизати сафедаи пӯсти харчанги дарёӣ, ки бо протеазаи ишқорӣ ба даст оварда шудааст (alkaline-protease-derived crayfish shell protein hydrolysate, ACSP), гидролизати омехтаи пептидӣ мебошад, ки дар натиҷаи таҷзияи ферментативии сафедаҳои пӯсти харчанги дарёӣ бо протеазаи ишқорӣ ҳосил мешавад. Муҳаққиқон аввал бо истифода аз папаин, протеазаи ишқорӣ, протеазаи нейтралӣ, трипсин ва пепсин панҷ гидролизати гуногуни сафедаи пӯсти харчанги дарёӣ омода карда; онҳоро аз рӯйи хусусиятҳои антиоксидантӣ ва зиддиилтиҳобӣ скрининг намуда; ACSP ва NCSP-и барҷастаро дар ҳуҷайраҳои эпителиалии рӯдаи IEC-6, ки бо LPS ангезиш ёфта буданд, омӯхтаанд ва ACSP-ро, ки таъсири умумии ҳуҷайравии қавитарин нишон дод, дар модели мушии колити шадиде, ки бо DSS ба вуҷуд оварда шудааст, арзёбӣ кардаанд. Дар марҳилаи ниҳоӣ таркиби пептидии ACSP бо LC–MS/MS тавсиф шудааст.

Дар скрининги ибтидоӣ барои радикалҳои DPPH ва ABTS•⁺ қиматҳои IC₅₀-и ACSP мутаносибан 0,888 ± 0,004 ва 0,853 ± 0,003 mg/mL муайян шудаанд. ACSP инчунин дар байни панҷ гидролизат баландтарин фаъолияти тозакунии радикали гидроксилро бо %29,525 ± 0,499 ва баландтарин фаъолияти тозакунии радикали аниони супероксидро бо %47,310 ± 1,351 нишон додааст. Гидролизати протеазаи нейтралӣ NCSP бошад, аз рӯйи қимати ABTS•⁺ IC₅₀ ва қобилияти барқароркунии FRAP дар баъзе ченкуниҳо нисбат ба ACSP натиҷаи қавитар додааст. Аз ин рӯ, марҳилаи аввал на ба натиҷаи як озмоиш, балки ба арзёбии якҷояи нишондиҳандаҳои гуногуни антиоксидантӣ ва зиддиилтиҳобӣ асос ёфтааст.

Дар ҳуҷайраҳои IEC-6, ки бо LPS ангезиш ёфта буданд, ACSP ва NCSP тағйироти iNOS, IL-1β, IL-6 ва TNF-α-и проилтиҳобиро коҳиш дода, посухи зиддиилтиҳобиро дар самти IL-10 зиёд кардаанд; ACSP дар маҷмӯъ таъсири қавитар нишон додааст. Дар таҷрибаи мушҳо ACSP, ки бо вояҳои 100, 200 ва 400 mg/kg вазни бадан дода шуд, талафоти вазн, фаъолияти беморӣ, кӯтоҳшавии колон, осеби гистологӣ ва талафоти ҳуҷайраҳои бокалмонандро, ки DSS ба вуҷуд оварда буд, ба таври вобаста ба воя сабук кардааст. Дар гурӯҳи ACSP-и вояи баланд индекси фаъолияти беморӣ дар рӯзи 14-ум 3,60 ± 0,55 буд, дар ҳоле ки дар гурӯҳи модели DSS 9,40 ± 1,14 буд; холҳои гистологӣ мутаносибан 4,80 ± 0,40 ва 10,40 ± 0,80 гузориш шудаанд.

ACSP ҳамчунин ситокинҳои проилтиҳобӣ, фаъолияти миелопероксидаза ва сатҳҳои оксиди нитрогенро коҳиш дода; бо барқароршавии фаъолияти супероксиддисмутаза ва каталаза ва бо афзоиши дубораи сафедаҳои пайвастагии зич, аз ҷумла ZO-1, claudin-1 ва occludin, алоқаманд дониста шудааст. Таҳлили LC–MS/MS дар ACSP 516 пайдарпаии пептидиро муайян кардааст. Бо вуҷуди ин, ин таҳқиқот самаранокӣ ё бехатарии табобати колитро дар одамон нишон намедиҳад. Натиҷаҳо дар сатҳи низоми ҳуҷайравӣ ва модели кӯтоҳмуддати муш мебошанд; устувории меъдаву рӯда, ҷаббиш аз рӯда, фармакокинетика, таъсиргирии системавӣ, бехатарии дарозмуддат, аллергенӣ ва самаранокии клиникӣ арзёбӣ нашудаанд.

Мушкилоти асосии таҳқиқот

Бемориҳои илтиҳобии рӯда ихтилолҳои музмини илтиҳобӣ, аз ҷумла колити захмдор ва бемории Crohn-ро дар бар мегиранд. Дар раванди беморӣ омилҳои сершумор, аз ҷумла майли генетикӣ, омилҳои муҳити зист, вайроншавии микробиотаи рӯда, стресси оксидативӣ ва фаъолшавии аз ҳад зиёди иммунӣ метавонанд якҷоя нақш бозанд. Муаллифони таҳқиқот бо таъкид бар он ки табобатҳои фармакологии мавҷуда муҳиманд, аммо метавонанд дорои маҳдудиятҳое чун таъсирҳои номатлуб, аз даст рафтани посухи дуюмдараҷа, хароҷот ва пурра набудани шифои луобпарда дар ҳар бемор бошанд, пептидҳои биологии фаъоли аз ғизо гирифташударо ҳамчун соҳаи арзандаи таҳқиқ баррасӣ мекунанд.

Мушкилоти дуюми таҳқиқот ба истифодаи захираҳо марбут аст. Дар саноати коркарди харчанг (Procambarus clarkii) пӯстҳо миқдори назарраси маҳсулоти иловагӣ ташкил медиҳанд. Тибқи манбаъ, қисми пӯст метавонад тақрибан %60–70-и биомассаи умумии харчанги дарёӣро ташкил диҳад ва тақрибан %20–30 хитин ва %20–40 сафеда дошта бошад. Бо вуҷуди ин, истифодаи ин мавод бо арзиши иловагии баланд маҳдуд аст. Аз ин рӯ, таҳқиқот ҳам фаъолияти биологиро барои саломатии рӯда ва ҳам баҳрабардорӣ аз маҳсулоти иловагии коркарди ғизои баҳрӣ/обиро дар як чаҳорчӯбаи таҷрибавӣ баррасӣ мекунад.

Гидролизати сафеда чист?

Гидролизати сафеда омехтаест, ки тавассути тақсим шудани молекулаҳои калони сафеда бо ёрии ферментҳо ба пептидҳои хурдтар ва порчаҳои пептидӣ ба даст меояд. Ин ки протеаза кадом пайвандҳои пептидиро афзалтар мебурад, метавонад дарозии пептидҳои ҳосилшуда, пайдарпаии аминокислотаҳо ва бинобар ин хусусиятҳои физикӣ-химиявии онҳоро тағйир диҳад. Аз ин рӯ, агар як сафедаи пӯсти харчанги дарёӣ бо протеазаҳои гуногун таҷзия шавад, гидролизатҳои дорои фаъолияти биологии гуногун метавонанд пайдо шаванд.

Мантиқи асосии таҷрибавии ин таҳқиқот маҳз ҳамин аст: як манбаи асосии сафеда бо панҷ протеазаи гуногун гидролиз шудааст, маҳсулоти ҳосилшуда муқоиса шудаанд ва номзаде, ки фаъолияти умумии биологии қавитарин дошт, ба марҳилаҳои минбаъдаи таҷрибавӣ гузаронида шудааст.

Гидролизатҳои пӯсти харчанги дарёӣ чӣ гуна омода шуданд?

Пӯстҳои харчанг ба қисмҳои хурд ҷудо, хушк, ба таври механикӣ майда ва аз элаки 60 mesh гузаронида шуданд. Хокаи пӯст аввал бо эфири нафтӣ дар таносуби 1:10 (w/v) омехта шуда, дар ҳарорати хона 6 соат бо омехтакунии магнитӣ коркард ва ҳалкунандаи дорои равған бо филтратсия хориҷ карда шуд.

Маводи аз равған тозашуда баъдан бо 1 M HCl дар таносуби 1:10 (w/v) барои 2 соат декалсификатсия карда шуд. Омехта дар 5000×g барои 20 дақиқа сентрифуга шуд, супернатант хориҷ ва бақияи сахт хушк карда шуда, хокаи декалсификатсияшудаи пӯсти харчанги дарёӣ ба даст омад.

Дар марҳилаи гидролиз хокаи пӯст дар оби дистиллшуда бо таносуби 1:25 (w/v) дисперсия карда шуда, дар шароити муқарраршуда барои панҷ протеазаи гуногун 6 соат гидролиз карда шуд. Дар охири реаксия ферментҳо бо нигоҳ доштан дар 95 °C барои 15 дақиқа ғайрифаъол карда шуданд; маҳсулот аз филтри 0,45 µm гузаронида, филтрат лиофилизатсия ва дар 4 °C нигоҳдорӣ шуд.

Манбаъ инчунин дар бахши усулҳо қайд мекунад, ки устувории функсионалии гидролизатҳо пас аз нигоҳдорӣ дар 4 °C барои 0, 7, 15 ва 30 рӯз бо такрори озмоишҳои антиоксидантӣ ва зиддиилтиҳобӣ арзёбӣ шудааст. Бо вуҷуди ин, дар бахши натиҷаҳои мақолаи асосӣ натиҷаҳои муфассали миқдорӣ барои ин силсилаи нигоҳдорӣ ҳамчун маҷмӯи асосии алоҳидаи натиҷаҳо пешниҳод нашудаанд; бинобар ин дар матни Verianla рақамҳои устуворие, ки дар манбаъ нестанд, сохта нашудаанд.

Чаро ACSP Аз Байни Панҷ Гидролизат Ба Таҷрибаҳои Минбаъда Гузаронида Шуд?

Гарчанде ACSP дар ҳамаи озмоишҳои антиоксидантӣ танҳо худаш ҷои аввалро нагирифт, дар озмоишҳои тозакунии радикалҳо, посухи SOD/CAT, ҷудошавии NO ва денатуратсияи альбумин профили қавӣ ва мутавозин нишон дод; ACSP ва NCSP ба марҳилаи аввали ҳуҷайравӣ интихоб шуданд ва азбаски ACSP дар ҳуҷайраҳои IEC-6-и бо LPS ангезишёфта дар маҷмӯъ посухи зиддиилтиҳобии қавитар нишон дод, ACSP дар модели муш арзёбӣ шуд.

Скрининги антиоксидантии панҷ гидролизат

Дар озмоишҳои DPPH ва ABTS пасттар будани қимати IC₅₀ маънои онро дорад, ки сатҳи %50 тозакунии радикал бо консентратсияи пасттари гидролизат ба даст омадааст ва бинобар ин фаъолият қавитар аст. Дар FRAP ва фоизҳои тозакунии мустақим бошад, қимати баландтар посухи антиоксидантии қавитарро ифода мекунад. Аз ин рӯ, Ҷадвали 2 аз як озмоиши ягонаи “ғолиб” не, балки аз якчанд метрикае иборат аст, ки хусусиятҳои гуногуни редоксиро чен мекунанд.

Дар Расми 1-и манбаъ гузориш шудааст, ки ACSP фаъолияти SOD-ро тақрибан %25, фаъолияти CAT-ро зиёда аз %18 зиёд кардааст ва ин афзоишҳо нисбат ба PCSP ва PECSP ба таври назаррас баландтар будаанд. Дар низоми бе ҳуҷайра ACSP ҷудошавии NO-ро, ки аз SNP сарчашма мегирифт, зиёда аз %20 фурӯ нишонда ва дар денатуратсияи альбумине, ки бо гармӣ ба вуҷуд оварда шудааст, бо %12,21 баландтарин ингибитсияро нишон додааст.

Фурӯ нишондани денатуратсияи альбумин ва озмоиши бе ҳуҷайраи NO нишондиҳандаҳои скринингӣ барои потенсиали зиддиилтиҳобӣ мебошанд. Онҳо худ ба худ исбот намекунанд, ки роҳҳои илтиҳоб дар организми зинда мустақиман танзим мешаванд. Муаллифон низ дар бахши муҳокима махсус таъкид мекунанд, ки натиҷаҳои озмоишҳои бе ҳуҷайра модулатсияи мустақими медиаторҳои аз макрофаг сарчашмагирифтаро нишон намедиҳанд.

Муодилаи тозакунии радикали DPPH

Фаъолияти тозакунии DPPH (%) = [A₀ − (A₁ − A₂)] / A₀ × 100

Дар ин ҷо A₀ абсорбсияи контроли дорои метанол + DPPH мебошад; A₁ абсорбсияи омехтаи намуна + DPPH; A₂ бошад, абсорбсияи бланки намунаи дорои намуна + метанол мебошад. Ислоҳи саҳми ранги намуна ё хусусиятҳои оптикии худи он ба сигнали DPPH бо A₂ барои ҷудо кардани дақиқтари таъсири воқеии тозакунии радикал кӯмак мекунад.

Гидролизатҳо дар консентратсияҳои 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 ва 1,0 mg/mL таҳқиқ шуда, ченкунии DPPH дар 517 nm гузаронида шудааст. IC₅₀ ҳамчун консентратсияи гидролизате таъриф шудааст, ки фаъолияти тозакунии %50-ро таъмин мекунад.

Озмоиши ABTS•⁺

Дар озмоиши ABTS•⁺ гидролизатҳо боз дар доираи 0,2–1,0 mg/mL арзёбӣ шудаанд. Катиони радикалии ABTS бо омехта кардани 7 mM ABTS ва 2,45 mM персулфати калий дар таносуби ҳаҷмии 1:1 ва нигоҳ доштани омехта дар ҳарорати хона дар торикӣ барои 16–24 соат омода шудааст. Маҳлули корӣ дар 734 nm то абсорбсияи 0,70 ± 0,02 тунук карда шуда; пас аз 6 дақиқа инкубатсия бо намуна ченкунӣ анҷом дода шудааст.

Фаъолияти тозакунии ABTS•⁺ (%) = (A₀ − A₁) / A₀ × 100

A₀ абсорбсияи контроли бланк ва A₁ абсорбсияи намунаи озмоишӣ мебошад.

FRAP ва дигар озмоишҳои радикалӣ

Озмоиши FRAP қобилияти барқароркунии оҳани ферриро арзёбӣ мекунад ва натиҷаҳо ҳамчун µmol Fe(II) эквивалент ба ҳар намунаи хушк ифода шудаанд. Муҳаққиқон аз стандартҳои 100–1000 µM FeSO₄ каҷи калибровкаи y = 0,2638x + 0,0651 ва R² = 0,9992 сохтаанд.

Дар озмоиши радикали гидроксил намуна бо консентратсияи 1 mg/mL истифода шуда, фоизи тозакунӣ чунин ҳисоб шудааст:

Фаъолияти тозакунии •OH (%) = [(A₀ − A) / A₀] × 100

Дар озмоиши аниони супероксид бошад, автооксидшавии катехол пайгирӣ шуда ва ҳисоб:

Фаъолияти тозакунии O₂•⁻ (%) = [1 − (ΔA_s − ΔA_b) / ΔA₀] × 100

ба ин шакл анҷом шудааст. ΔA_s, ΔA_b ва ΔA₀ мутаносибан тағйироти абсорбсияро байни 0 ва 5 дақиқа дар намуна, бланки намуна ва контроли об ифода мекунанд.

Ингибитсияи ҷудошавии NO ва денатуратсияи альбумин

Ҷудошавии NO-и аз SNP сарчашмагирифта дар низоми бе ҳуҷайра бо реаксияи Griess арзёбӣ шудааст:

Ингибитсияи ҷудошавии NO (%) = (A_blank − A_sample) / A_blank × 100

Дар озмоиши денатуратсияи альбумин омехтаи дорои %1 BSA дар 37 °C барои 15 дақиқа нигоҳ дошта шуда, баъдан дар 90 °C барои 20 дақиқа гарм карда шудааст. Тирагӣ дар 660 nm чен шуда ва ингибитсия:

Ингибитсияи денатуратсия (%) = (A_blank − A_sample) / A_blank × 100

бо ин формула ҳисоб шудааст.

Модели ҳуҷайравии IEC-6 чӣ гуна сохта шуд?

Ҳуҷайраҳои IEC-6 дар муҳити DMEM, ки %10 fetal bovine serum, 100 U/mL пенисиллин, 100 µg/mL стрептомицин ва 0,1 IU/mL инсулин дошт, дар шароити 37 °C ва %5 CO₂ парвариш карда шуданд.

Барои қатори замонии зиндамонӣ, ҳуҷайраҳо дар табақчаҳои 96-чоҳча бо зичии 1 × 10⁵ ҳуҷайра/mL омода карда шуда, бо консентратсияҳои 0,1–2,0 mg/mL-и ACSP ё NCSP то 48 соат коркард шуданд. Ченкуниҳои CCK-8 дар соатҳои 0, 12, 24, 36 ва 48 гузаронида шуданд. Дар ACSP баландтарин афзоиши зиндамонӣ дар соати 36 бо 0,05 mg/mL; дар NCSP бошад, дар соати 36 бо 0,25 mg/mL мушоҳида шуд.

Дар таҷрибаи илтиҳоб ҳуҷайраҳо дар табақчаҳои 12-чоҳча бо зичии 3 × 10⁵ ҳуҷайра/чоҳча барои 12 соат парвариш, бо 0,1 mg/mL LPS барои 4 соат ангезиш ва сипас бо 0,025–0,5 mg/mL ACSP ё NCSP барои 24 соат коркард шуданд.

Истифодаи LPS экспрессияи генҳои проилтиҳобӣ, аз ҷумла iNOS, IL-1β, IL-6 ва TNF-α-ро зиёд карда, IL-10-ро коҳиш дод. Ҳар ду гидролизат ба ин тағйирот дар самти баръакс таъсир карданд, аммо ACSP дар маҷмӯъ нисбат ба NCSP посухи қавитар нишон дод. Дар натиҷаҳои ELISA-и супернатанти культура низ IL-1β, IL-6 ва TNF-α коҳиш ва IL-10 афзоиш ёфт.

Усули 2^−ΔΔCt дар qPCR бо кадом мақсад истифода шуд?

Дар таҳқиқот экспрессияи нисбии mRNA-и генҳои iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, ZO-1, claudin-1 ва occludin бо qPCR чен шуда, GAPDH ҳамчун гени эндогении референсӣ истифода шудааст. Усули 2^−ΔΔCt сигнали гени ҳадафро аввал нисбат ба гени референсӣ нормализатсия мекунад ва сипас тағйиротро дар гурӯҳи таҷрибавӣ нисбат ба гурӯҳи муқоиса ба таври нисбӣ ифода мекунад. Ин усул шумораи мутлақи молекулаҳоро не, балки тағйироти нормализатсияшудаи нисбии экспрессияро медиҳад.

ACSP Дар Таҷрибаи Муш Чӣ Гуна Озмуда Шуд?

Сӣ муши наринаи C57BL/6 ба таври тасодуфӣ ба шаш гурӯҳ тақсим шуданд; ба ғайр аз контрол, ҳамаи гурӯҳҳо барои 7 рӯз дар оби нӯшокӣ %3 DSS гирифтанд, сипас DSS қатъ шуд ва дар 7 рӯзи минбаъда ба гурӯҳи модел PBS, ба гурӯҳи контроли мусбат 200 mg/kg mesalazine ва ба гурӯҳҳои ACSP 100, 200 ё 400 mg/kg ACSP як маротиба дар як рӯз тавассути гаважи даҳонӣ дода шуд.

Индекси фаъолияти беморӣ чӣ гуна ҳисоб шуд?

Шиддати колит дар мушҳо аз рӯйи се ҷузъ: талафоти вазни бадан, консистенсияи наҷосат ва хунравии макроскопии ректалӣ арзёбӣ шуд. Ҳар ҷузъ аз 0–4 хол дода шуд.

DAI = холи талафоти вазни бадан + холи консистенсияи наҷосат + холи хунравии ректалӣ

Аз ин рӯ, DAI-и баландтар нишонаҳои клиникии шадидтар ва DAI-и пасттар маҷмӯи нишонаҳои сабуктарро ифода мекунад. Муҳаққиқон арзёбиҳоро бо кормандоне анҷом доданд, ки аз тақсимоти гурӯҳӣ огоҳ набуданд.

Индекси узв

Индекси узв барои сипурз ва тимус чунин ҳисоб шуд:

Индекси узв = вазни узв / вазни бадан

Ин таносуб имкон медиҳад вазни узв то ҳадди имкон аз андозаи умумии бадани ҳайвон мустақил карда шуда, байни гурӯҳҳо муқоиса шавад.

ACSP ба нишонаҳои беморӣ чӣ гуна таъсир кард?

Истифодаи DSS манзараи колити шадидро, ки бо талафоти вазн, дарунравӣ ва наҷосати хунолуд тавсиф мешавад, ба вуҷуд овард. Дар ANOVA-и дуҷонибаи ченкуниҳои такрорӣ гузориш шуд, ки гурӯҳи табобат, вақт ва таъсири мутақобилаи гурӯҳ × вақт ҳам барои DAI ва ҳам барои вазни нисбии бадан муҳим буданд; барои ҳамаи ин таъсирҳо p < 0,0001 аст.

Қиматҳои DAI дар гурӯҳҳои ACSP нисбат ба гурӯҳи модел ба таври назаррас пасттар буданд ва манбаъ ин тағйиротро вобаста ба воя тавсиф мекунад. ACSP инчунин калоншавии сипурз ва афзоиши таносуби сипурз/вазни баданро, ки бо DSS алоқаманд буданд, коҳиш дод. Кӯтоҳшавии колон низ бо зиёд шудани воя бештар ислоҳ шуд.

Гистопатология чӣ нишон дод?

Дар Расми 4-и манбаъ тасвирҳои воқеии гистологии H&E ва AB-PAS мавҷуданд. Дар гурӯҳи модел захмшавии луобпарда, вайроншавии сохтори крипт, инфилтратсияи шадиди илтиҳобӣ ва эрозияи эпителий мушоҳида шуд. Бо табобати ACSP меъмории крипт беҳтар нигоҳ дошта шуда, захмшавӣ ва инфилтратсияи илтиҳобӣ кам шуданд. Рангкунии AB-PAS барқароршавии ҳуҷайраҳои бокалмонандро нишон дод.

Азбаски ин тасвирҳои гистологӣ далели мустақими микроскопӣ мебошанд, дар Verianla тасвири микроскопии синтетикӣ сохта нашудааст. Ба ҷойи ин натиҷаҳои миқдории гистологии дар манбаъ овардашуда нигоҳ дошта шудаанд.

Дар гурӯҳи модел ҳуҷайраҳои бокалмонанд аз 26,0 ± 2,77 ҳуҷайра/крипт то 3,3 ± 1,73 коҳиш ёфтанд. Дар гурӯҳи ACSP-и вояи баланд ин шумора то 16,4 ± 1,69 баланд шуд. Холи осеби гистологӣ аз 0,5 ± 0,2 дар гурӯҳи контрол то 10,4 ± 0,8 дар гурӯҳи модел боло рафта, бо ACSP-и вояи баланд то 4,8 ± 0,4 поён омад.

Ситокинҳои илтиҳобӣ ва стресси оксидативӣ

Дар бофтаи колони муш ACSP, тибқи натиҷаҳои дар манбаъ гузоришшуда, экспрессияи mRNA-и IL-1β, IL-6 ва TNF-α-ро нисбат ба гурӯҳи модел %38–82 ва консентратсияи сафедавии ҳамин ситокинҳоро %35–87 коҳиш дод. Таъсир тамоюли вобаста ба воя нишон дод.

Дар гурӯҳи ACSP-и вояи баланд сатҳи mRNA-и IL-10 ба 5,8 баробари гурӯҳи модел ва сатҳи сафедаи IL-10 ба 1,67 баробар расид. DSS фаъолияти SOD ва CAT-ро кам ва фаъолияти MPO-ро зиёд кард; ACSP фаъолияти ферментҳои антиоксидантиро барқарор ва MPO-ро коҳиш дод. ACSP-и вояи баланд сатҳи NO-и колонро нисбат ба гурӯҳи модел зиёда аз %80 коҳиш дод.

Монеаи рӯда: ZO-1, claudin-1 ва occludin

Эпителии рӯда танҳо девори ҷисмонӣ нест. Комплексҳои пайвастагии зич байни ҳуҷайраҳои ҳамсояи эпителий монеаи муҳимеро ташкил медиҳанд, ки гузариши беназорати моддаҳоро аз люмени рӯда ба бофта маҳдуд мекунад. Таҳқиқот барои ин сохтор сафедаҳои ZO-1, claudin-1 ва occludin-ро омӯхтааст.

DSS сатҳи mRNA-и ин се сафедаро ба таври назаррас коҳиш дод. ACSP экспрессияи онҳоро ба таври вобаста ба воя зиёд кард. Сатҳи mRNA ва сафедаи ZO-1 нисбат ба гурӯҳи модел зиёда аз %70 афзоиш ёфт; дар таҳлили иммунофлуоресценсия шиддати флуоресценсияи ZO-1 дар гурӯҳи бо ACSP табобатшуда ба 8,9 баробари гурӯҳи модел расид. Барои Claudin-1 ва occludin низ натиҷаҳои ҳамсамт гузориш шуданд.

Тасвирҳои Western blot ва иммунофлуоресценсия афзоиши ин сафедаҳои монеа ва барқароршавии тақсимоти онҳо дар тӯли мембранаи эпителийро дастгирӣ мекунанд. Аммо азбаски тасвирҳои воқеии иммунофлуоресценсия ва Western blot далели таҷрибавӣ мебошанд, онҳо аз ҷониби Verianla ба таври сунъӣ бозсозӣ нашудаанд.

ACSP кадом пептидҳоро дар бар мегирад?

Бо LC–MS/MS дар ACSP 516 пайдарпаии пептидӣ муайян шудааст. Дарозии пептидҳо байни 3–26 аминокислота тағйир ёфтааст. Аз рӯйи шумораи пайдарпаӣ, %54,37 пептидҳо дар доираи 500–1000 Da, %41,94 дар 1000–2000 Da, %2,14 дар 500 Da ё камтар ва %1,55 дар 2000–3000 Da қарор доранд. Ҳамин тавр, пайдарпаии дорои массаи молекулавии 1 kDa ё камтар %56,51-и умумиро ташкил медиҳанд.

Таъинотҳои пайдарпаии пептидӣ бо эътимоди баландтарин

Холи −10lgP дар ин ҷо миқдори пептид ё бузургии фаъолияти биологии онро нишон намедиҳад. Манбаъ махсус қайд мекунад, ки холи баландтар эътимоди баландтари идентификацияро барои таъиноти пайдарпаии ба пойгоҳи додаҳо асосёфта ифода мекунад.

Барои идентификацияи пептидҳо маълумоти хоми LC–MS/MS бо PEAKS Studio 11.5 дар муқобили пойгоҳи додаҳои сафедаи UniProtKB Procambarus clarkii ҷустуҷӯ шудааст. Таҳаммулпазирии массаи прекурсор 10 ppm ва таҳаммулпазирии фрагмент 0,02 Da таъин шудааст. Дар ҷустуҷӯ дарозии пептид ба 3–45 аминокислота маҳдуд шуда; ацетилатсияи N-terminal (+42,01 Da) ва оксидшавии гистидин/триптофан (+15,99 Da) ҳамчун модификатсияҳои тағйирёбанда муайян шудаанд.

Идентификацияҳо дар ҳадди PEAKS −10lgP ≥ 37,04 филтр шудаанд. Сатҳи кашфи бардурӯғ дар сатҳи мувофиқати пептид-спектр %1,0 ва дар сатҳи пайдарпаии пептид %1,4 гузориш шудааст. Ин назорати сифат барои фаҳмидани он муҳим аст, ки шумораи “516 пептид” танҳо шумориши спектрҳои хом нест, балки таъиноти пайдарпаиест, ки аз ҳадҳои муқарраршудаи эътимод гузаштаанд.

Механизмҳои пешниҳодшуда то чӣ андоза қатъӣ ҳастанд?

Муаллифон муҳокима мекунанд, ки боқимондаҳои аминокислотаҳои ароматикӣ ва редокс-фаъоли ACSP метавонанд бо додани электрон ё атоми гидроген намудҳои реактивии оксигенро маҳдуд кунанд. Пешниҳод мешавад, ки коҳиши стресси оксидативӣ метавонад сигнали MAPK ва NF-κB-и ҳассос ба редоксро заиф созад; ба ин тартиб барои коҳиши медиаторҳои илтиҳобӣ ва барқароршавии сафедаҳои монеа, аз ҷумла ZO-1, claudin-1 ва occludin, шароити мувофиқ фароҳам оварад.

Илова бар ин, меҳвари AMPK–MLCK–MLC ва роҳҳое чун Nrf2–Keap1 дар байни шарҳҳои эҳтимолӣ муҳокима шудаанд. Аммо дар таҳқиқот фаъолшавӣ ё ингибитсияи мустақими ин роҳҳо бо таҷрибаҳои мақсадноки пайвастшавӣ, ингибиторҳои мушаххас, хомӯшкунии генетикӣ ё таҷрибаҳои вайронкунии роҳ нишон дода нашудааст. Муҳаққиқон ин механизмҳоро ҳамчун гипотеза пешниҳод карда, зарурати таҷрибаҳои мақсадноки тасдиқиро ошкоро таъкид мекунанд.

Оё ACSP Метавонад Ҳамчун Табобати Колит Дар Одамон Истифода Шавад?

Ин таҳқиқот ба ин савол ҷавоб намедиҳад. Таъсирҳои антиоксидантӣ ва зиддиилтиҳобии ACSP дар ҳуҷайраҳо ва модели колити шадиди муш, ки бо DSS ба вуҷуд оварда шудааст, нишон дода шудаанд; дар одамон воя, ҷаббиш, метаболизм, самаранокӣ, бехатарӣ, аллергенӣ ё ҳамкории мутақобила бо табобатҳои мавҷуда омӯхта нашудаанд ва таҳқиқот ACSP-ро ҳамчун табобати клиникӣ тасдиқ намекунад.

Чаро натиҷаи модели мушро мустақиман ба инсон татбиқ кардан мумкин нест?

Модели DSS бо расонидани осеби химиявӣ ба эпителии рӯда илтиҳоби монанд ба колити шадид ба вуҷуд меорад ва модели ҳайвонии васеъ истифодашаванда барои омӯзиши илтиҳоби таҷрибавии рӯда мебошад. Бо вуҷуди ин, колити захмдор ва бемории Crohn дар одамон бемориҳои хеле мураккабтар, музмин ва гетерогенӣ мебошанд. Сохтори генетикӣ, микробиота, низоми иммунӣ, омилҳои муҳити зист, давомнокии беморӣ ва доруҳои истифодашаванда аз ҷумлаи тағйирёбандаҳои сершумореанд, ки дар бемории инсон якҷоя нақш доранд.

Аз ин рӯ, самаранок будани 400 mg/kg ACSP дар мушҳо маънои онро надорад, ки ҳамин воя ё ягон вояи мустақиман табдилшуда барои одамон самаранок ё бехатар аст. Аз маҳдудиятҳои худи таҳқиқот набудани фармакокинетика, таъсиргирии системавӣ, устувории меъдаву рӯда, ҷаббиш, арзёбии фарогири бехатарӣ ва таҳқиқоти клиникӣ мебошанд.

Усул ва Натиҷаҳои Таҳқиқот

Қабатҳои таҷрибавии таҳқиқот

1. Пӯсти харчанг аз равған ва сохтори минералӣ тоза карда шуд.
2. Бо панҷ протеазаи гуногун PCSP, ACSP, NCSP, TCSP ва PECSP истеҳсол шуданд.
3. Панҷ гидролизат бо озмоишҳои антиоксидантӣ ва зиддиилтиҳобии бе ҳуҷайра скрининг шуданд.
4. ACSP ва NCSP дар ҳуҷайраҳои IEC-6 аз рӯйи зиндамонӣ ва илтиҳоби ба LPS вобаста арзёбӣ шуданд.
5. ACSP, ки дар маҷмӯъ таъсири ҳуҷайравии қавитар нишон дод, ба модели мушии колити шадиде, ки бо DSS ба вуҷуд оварда шудааст, гузаронида шуд.
6. Дар мушҳо фаъолияти беморӣ, вазни бадан, дарозии колон, узвҳои иммунӣ, гистология, ҳуҷайраҳои бокалмонанд, ситокинҳо, стресси оксидативӣ ва сафедаҳои пайвастагии зич чен шуданд.
7. Пептидҳои ACSP бо LC–MS/MS муайян ва бо манбаъҳои сафеда мувофиқ карда шуданд.

Сохтори намунаи таҷрибаи ҳайвонот

Дар маҷмӯъ 30 муши наринаи C57BL/6 истифода шуд. Мушҳо 6-ҳафтаина ва 20 ± 1 g вазн доштанд. Пас аз се рӯзи мутобиқшавӣ бо тартиби рақамҳои тасодуфӣ ба шаш гурӯҳ, ҳар гурӯҳ панҷ ҳайвон, тақсим карда шуданд. Муҳаққиқон қайд мекунанд, ки андозаи намуна бо таҳлили қудрати пеш аз таҷриба муайян шуда, фарзияҳо дар Усулҳои Иловагӣ оварда шудаанд. Аз таҳлили ниҳоӣ ягон ҳайвон ё нуқтаи маълумот хориҷ нашудааст.

Кӯрсозӣ

Вазни бадан, хусусиятҳои наҷосат ва ҳолати умумии клиникӣ ҳар рӯз дар вақти доимӣ аз ҷониби кормандоне арзёбӣ шуданд, ки аз тақсимоти гурӯҳӣ огоҳ набуданд. Таҳлилҳои бофта низ то анҷоми таҳлили маълумот дар намунаҳои рамзгузоришуда иҷро шуданд. Ин равиш барои кам кардани таъсири дониши нозир дар бораи он ки кадом намуна ба кадом гурӯҳи табобат тааллуқ дорад, ба ченкунӣ нигаронида шудааст.

Гистология

Бофтаи колони дисталӣ дар %4 параформальдегид фиксация шуда, дар парафин ҷойгир ва бо ғафсии 5 µm бурида шуд. Рангкунии гематоксилин-эозин барои арзёбии осеби гистологӣ аз рӯйи инфилтратсияи илтиҳобӣ, осеби крипт ва минтақаи осебдида истифода шуд. Ҳуҷайраҳои бокалмонанд бо рангкунии Alcian blue–periodic acid–Schiff (AB-PAS) муайян шуданд.

ELISA ва экспрессияи ген

Дар супернатанти культураи IEC-6 ва гомогенатҳои колон TNF-α, IL-1β, IL-6 ва IL-10 бо маҷмӯаҳои ELISA чен шуданд. Дар таҳлили qPCR iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, ZO-1, claudin-1 ва occludin омӯхта шуда, GAPDH ҳамчун гени референсӣ истифода шуд.

Western blot ва иммунофлуоресценсия

Дар бофтаи колон сафедаҳои ZO-1, claudin-1 ва occludin бо Western blot арзёбӣ шуданд. Миқдори баробари сафеда бо %12,5 SDS-PAGE ҷудо, ба мембранаи PVDF интиқол ва бо антителаҳои ибтидоии мувофиқ инкубатсия шуд. Сигналҳо ба GAPDH нормализатсия ва нисбат ба гурӯҳи контрол ифода шуданд.

Дар таҳлили иммунофлуоресценсия дар буришҳои 5 µm-и колон рангкунии ZO-1, claudin-1 ва occludin анҷом шуда, ядроҳо бо DAPI муқобилранг ва шиддати флуоресценсия бо ImageJ 1.8.0 миқдорӣ карда шуд. Барои Western blot аз ҳар гурӯҳ се намунаи мустақили колон аз мушҳои гуногун истифода шуд; ченкуниҳои техникӣ ҳамчун такрори мустақили биологӣ ҳисоб нашуданд.

Дастгоҳ ва шароити таҳлили LC–MS/MS

Пептидҳои ACSP дар спектрометри массаи QE, ки ба низоми EASY-nLC 1000 пайваст буд, омӯхта шуданд. ACSP дар %0,1 кислотаи формик ҳал, дар 14.000×g барои 20 дақиқа ва 4 °C сентрифуга шуд. Аз супернатанти консентратсияи 1 mg/mL, 3 µL ба сутуни PepMap RSLC C18 бо суръати ҷараёни 250 nL/дақиқа ворид шуд.

Маълумоти хом бо PEAKS Studio 11.5, build 20230821 дар муқобили пойгоҳи додаҳои UniProtKB Procambarus clarkii ҷустуҷӯ шуд. Мушаххасияти фермент “None”, шакли ҳазм “unspecific” интихоб шуда, то се missed cleavage иҷозат дода шуд ва дарозии пептид барои ҷустуҷӯ 3–45 аминокислота муқаррар шуд.

Таҳлили оморӣ

Маълумот бо GraphPad Prism 8 таҳлил шуда, ҳамчун миёна ± инҳирофи стандартӣ пешниҳод шуд. Пеш аз озмоишҳои параметрӣ нормалии боқимондаҳои модел бо Shapiro–Wilk ва яксон будани дисперсия байни гурӯҳҳо бо санҷиши Levene арзёбӣ шуд.

DAI-и вобаста ба вақт ва вазни нисбии бадан бо ANOVA-и дуҷонибаи тарҳи омехтаи ченкуниҳои такрорӣ таҳлил шуданд, ки дар он гурӯҳи табобат омили байнигурӯҳӣ, вақт омили дохилигурӯҳӣ ва муш воҳиди ченкунии такрорӣ буд. Вақте таъсири мутақобилаи гурӯҳ × вақт муҳим буд, барои муқоисаҳои пешакӣ муайяншуда бо гурӯҳи модели DSS дар охири таҷриба санҷиши муқоисаҳои сершумори Dunnett истифода шуд.

Натиҷаҳое, ки дар охири таҷриба як маротиба чен шуданд, вақте фарзияҳои тақсимоти нормалӣ ва яксон будани дисперсия иҷро шуданд, бо ANOVA-и якҷониба ва сипас санҷиши муқоисаҳои сершумори Tukey таҳлил шуданд. Ҳама санҷишҳо дуҷониба буданд ва p < 0,05 ҳамчун ҳади аҳамияти оморӣ истифода шуд.

Натиҷаҳое, ки таҳқиқот дастгирӣ мекунад

• Интихоби протеаза фаъолияти биологии ченшудаи гидролизатҳои аз як манбаи сафедаи пӯсти харчанги дарёӣ гирифташударо тағйир дод.
• ACSP ва NCSP дар скрининги ибтидоии антиоксидантӣ/зиддиилтиҳобӣ дар байни қавитарин номзадҳои умумӣ буданд.
• ACSP маркерҳои илтиҳобиро дар ҳуҷайраҳои IEC-6-и бо LPS ангезишёфта дар маҷмӯъ нисбат ба NCSP қавитар танзим кард.
• Дар модели мушии DSS, ACSP дар доираи вояи 100–400 mg/kg бо беҳбудиҳои вобаста ба воя дар бисёр нишондиҳандаҳои марбут ба беморӣ алоқаманд буд.
• ACSP-и вояи баланд аз рӯйи DAI, кӯтоҳшавии колон, холи гистологӣ ва талафоти ҳуҷайраҳои бокалмонанд нисбат ба гурӯҳи модел натиҷаи беҳтар нишон дод.
• Истифодаи ACSP бо коҳиши ситокинҳои проилтиҳобӣ, афзоиши IL-10, барқароршавии фаъолияти ферментҳои антиоксидантӣ ва коҳиши MPO ва NO алоқаманд аст.
• Натиҷаҳои ZO-1, claudin-1 ва occludin дастгирӣ мекунанд, ки истифодаи ACSP дар модели муш бо ҳифзи беҳтари монеаи эпителӣ алоқаманд аст.
• LC–MS/MS нишон дод, ки ACSP гидролизати омехтаест, ки 516 пайдарпаии пептидии муайяншударо дар бар мегирад.

Натиҷаҳое, ки таҳқиқот дастгирӣ намекунад

• Нишон дода нашудааст, ки ACSP колити захмдор ё бемории Crohn-ро дар одамон табобат мекунад.
• Нишон дода нашудааст, ки вояҳои 100–400 mg/kg-и дар мушҳо истифодашуда барои одамон вояи мувофиқ мебошанд.
• Муайян нашудааст, ки кадом яке ё кадоме аз 516 пептид барои таъсири биологӣ масъуланд.
• Муқовимати пептидҳо ба ҳазм дар рӯда мустақиман чен нашудааст.
• Гузаронандагии рӯда, интиқоли эпителӣ, гузариш ба гардиши системавӣ ва фармакокинетика арзёбӣ нашудаанд.
• Ба таври таҷрибавӣ исбот нашудааст, ки роҳҳои NF-κB, MAPK, Nrf2–Keap1 ё AMPK–MLCK–MLC аз ҷониби ACSP мустақиман ҳадаф қарор мегиранд.
• Токсикияти дарозмуддат, бехатарии фарогир ва аллергенӣ арзёбӣ нашудаанд.
• Таҳқиқоти клиникӣ гузаронида нашудааст.

Ҷиҳати қавӣ ва маҳдудияти асосии таҳқиқот

Яке аз ҷиҳатҳои муҳими қавии таҳқиқот ин аст, ки он ба натиҷаи як озмоиш такя намекунад. Муҳаққиқон тарҳи марҳилавии таҷрибавӣ сохтанд, ки скрининги ферментативиро бо озмоишҳои химиявии антиоксидантӣ, модели ҳуҷайравӣ, модели муш, гистология, маркерҳои биохимиявӣ, экспрессияи ген, таҳлили сафеда ва тавсифи пептидомӣ мепайвандад.

Дар муқобил, маҳдудияти асосӣ он аст, ки ACSP на як молекулаи пок, балки гидролизати омехтаест, ки 516 пайдарпаии муайяншударо дар бар мегирад. Аз ин рӯ, ҳанӯз ҳал нашудааст, ки кадом пептидҳо ба кадом ҳадаф тавассути кадом механизми пайвастшавӣ ё сигналӣ таъсир мекунанд. Илова бар ин, таҷрибаи ҳайвонот модели кӯтоҳмуддати DSS-и шадид аст; он тамоми биологияи бемории музмини илтиҳобии рӯдаи инсонро инъикос намекунад.

Ёддошт оид ба Манбаъ ва Усул

Таҳқиқоти аслӣ: Anti-Inflammatory Protein Hydrolysate Screened from Crayfish Shells Attenuates Colitis by Oxidative Stress Suppression, Inflammation Reduction and Barrier Reconstruction

Муаллифон: Lei Dong; Hao Wang; Yongmin Wu; Jinyang Peng; Shaohao Lai; Zexin Zhao; Yongqi Yin; Jun Cai.

Corresponding author: Jun Cai.

Муассисаҳо: School of Life and Health Sciences, Hubei University of Technology, Wuhan, China; College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou, China.

Маҷалла: Foods.

Нашриёт: MDPI, Basel, Switzerland.

Ҷилд / шумора / рақами мақола: 15(19), 3389.

DOI: 10.3390/foods15193389.

Навъи мақола: Article; таҳқиқоти таҷрибавии пешазклиникӣ.

Received: Дар Version of Record PDF 14 Август 2026.

Revised: Дар Version of Record PDF 18 Сентябр 2026.

Accepted: Дар Version of Record PDF 20 Сентябр 2026.

Published: Дар Version of Record PDF ва сабти асосии мақола 23 Сентябр 2026.

Ёддошти метамаълумот: Экрани алоҳидаи Version Notes-и MDPI санаҳои ирсол, бозбинӣ, қабул ва нашрро нисбат ба Version of Record PDF як рӯз барвақттар нишон медиҳад. Барои ҳувияти илмии манбаъ санаҳои Version of Record PDF асос гирифта шудаанд.

Ҳолати рецензия: Foods маҷаллаи байналмилалии рецензияшавандаи дастраси кушодаест, ки аз ҷониби MDPI нашр мешавад. Муҳаррири академии мақола Ronaldo Vagner Thomatieli-Santos нишон дода шудааст.

Литсензия: Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).

Маблағгузорӣ: National Natural Science Foundation of China, лоиҳа 32302019; Research Fund for Key R&D Projects in Hubei Province, лоиҳа 2022BBA0053.

Кумитаи ахлоқ: Hubei University of Technology Animal Ethics Committee; протокол HBUT20250021; санаи тасдиқ 25 Июн 2025.

Ризоияти огоҳона: Татбиқ намешавад.

Дастрасии маълумот: Саҳмҳои аслии таҳқиқот дар мақола ва маводи иловагӣ пешниҳод шудаанд; саволҳои иловагӣ метавонанд ба corresponding author равона шаванд.

Бархӯрди манфиатҳо: Муаллифон изҳор кардаанд, ки бархӯрди манфиатҳо вуҷуд надорад.

Саҳми муаллифон: Консептуализатсия: L.D., H.W., Y.W.; методология: L.D., J.P.; нармафзор: S.L.; тасдиқ: L.D., H.W., Y.W.; таҳлили формалӣ: S.L.; таҳқиқ: J.P., S.L.; захираҳо: J.C., Z.Z.; куратсияи маълумот: J.P.; визуализатсия: L.D., H.W.; машварат/супервизия: J.C., Z.Z.; идоракунии лоиҳа: L.D., J.C., Z.Z.; ҷалби маблағгузорӣ: J.C., Z.Z.; тарҳи аввал: L.D.; бозбинӣ ва таҳрир: J.C., Z.Z., Y.Y.

Маводи иловагӣ: ACSP total ion chromatogram; графикҳои назорати сифати LC–MS/MS; спектрҳои эзоҳшудаи MS/MS; меъёрҳои холгузории DAI; меъёрҳои осеби гистологии колон; пайдарпаии праймерҳо; градиенти элюсияи LC; параметрҳои ҷустуҷӯи LC–MS/MS; натиҷаҳои идентификацияи пептид ва фарзияҳои ҳисобкунии a priori андозаи намуна.

Ҳадди асосии илмӣ: Ин таҳқиқот озмоиши табобат дар одамон нест. Биодастрасии даҳонии ACSP дар одамон, ҷаббиши рӯдавӣ, фармакокинетика, вояи самаранок, бехатарии дарозмуддат, аллергенӣ ва фоидаи клиникӣ муайян нашудаанд.

Ҳадди механизм: Тағйироти ченшуда дар ситокинҳо, стресси оксидативӣ ва сафедаҳои монеа бо ACSP мувофиқанд; аммо роҳҳои пешниҳодшуда, аз ҷумла NF-κB/MAPK, Nrf2–Keap1 ва AMPK–MLCK–MLC, бо таҷрибаҳои мустақими тасдиқи ҳадаф исбот нашудаанд.