Glioblastoma, hızlı büyümesi, beyin dokusuna yaygın biçimde sızması ve mevcut tedavilere direnç geliştirmesi nedeniyle tedavisi son derece güç bir beyin tümörüdür. Cerrahi, radyoterapi ve temozolomid tedavisine rağmen tümörün tekrarlama riski yüksektir. Yeni ilaçların geliştirilmesini zorlaştıran başlıca sorunlardan biri, merkezi sinir sistemini dolaşımdaki maddelerden koruyan kan-beyin bariyeridir. Bu bariyer, küçük moleküllerin büyük bölümünün ve cetuximab gibi büyük biyolojik ilaçların beyne yeterli miktarda ulaşmasını engeller.

Cetuximab, epidermal büyüme faktörü reseptörüne, yani EGFR’ye bağlanan yaklaşık 150 kDa büyüklüğünde bir monoklonal antikordur. EGFR, glioblastomaların önemli bir bölümünde çoğalmış veya aşırı ifade edilmiş olabilir. Bununla birlikte cetuximabın moleküler büyüklüğü ve kan-beyin bariyerini geçememesi, ilacın glioblastomada etkili yoğunluklara ulaşmasını sınırlar.

Bu çalışmada araştırmacılar cetuximabı koruyarak taşıyabilecek, kan-beyin bariyeri hücreleriyle etkileşebilecek ve glioblastoma hücrelerine yönlenebilecek polimerik nanoparçacıklar geliştirmiştir. Nanoparçacıkların temelini, kitosan üzerine poli(metil metakrilat-ko-akrilik asit) zincirleri aşılanarak oluşturulan CPMA kopolimeri ile sodyum aljinat arasındaki elektrostatik kompleksleşme oluşturmaktadır.

Taşıyıcı sistemin yüzeyi, α_vβ₃ ve α_vβ₅ integrinlerine bağlanabilen siklik cRGDfV peptidiyle işlevselleştirilmiştir. Bu integrinler hem kan-beyin bariyeri endotelinde hem de glioblastoma hücrelerinde bulunabildiği için sistem iki aşamalı bir hedefleme mantığına sahiptir. İlk aşamada peptit-integrin etkileşimi nanoparçacığın bariyer hücreleri tarafından alınmasını ve hücre içinden taşınmasını desteklemektedir. İkinci aşamada taşınan cetuximabın glioblastoma hücrelerindeki EGFR sinyalini baskılaması amaçlanmaktadır.

Nanoparçacıklar T-bağlantılı bir mikroakışkan sistemde, sulu ortamda ve sürekli akış altında çift öz-düzenlenme yöntemiyle üretilmiştir. Hedeflendirilmiş ve cetuximab yüklü son formülasyonun dinamik ışık saçılımıyla ölçülen ortalama hidrodinamik çapı 322 ± 24 nm, polidispersite indeksi 0,24 ± 0,02 ve zeta potansiyeli -15 ± 2 mV bulunmuştur. Kriyojenik elektron mikroskobunda ise yüksek derecede hidratlanmış polimer tabakasının bulunmadığı geometrik çap yaklaşık 150 nm olarak görülmüştür.

Cetuximab kapsülleme verimliliği %99,0 ± 0,7, nanoparçacık ağırlığına göre ilaç yükleme oranı ise %16,2 ± 0,07 olarak ölçülmüştür. SDS-PAGE sonuçları, antikorun nanoparçacık içinde bulunduğunu ve karakteristik ağır ve hafif zincirlerinin saptanabildiğini göstermiştir.

Cetuximabın 48 saatlik salımı fizyolojik pH 7,4’te yaklaşık %29, daha asidik pH 6,5’te yaklaşık %21 olmuştur. Asidik ortamda daha hızlı salım beklenebileceği hâlde bu sistemde salım yavaşlamıştır. Araştırmacılar bunu, asidik pH’da anyonik polimer bölgelerinin iyonlaşmasının azalması, polimer ağının daha az su alması ve antikorun geçebileceği etkin gözeneklerin küçülmesiyle açıklamaktadır.

Kan-beyin bariyerini taklit etmek için kullanılan hCMEC/D3 insan beyin mikrovasküler endotel hücrelerinde, bütün nanoparçacık gruplarında hücre canlılığı 4 ve 24 saat sonunda %70’in üzerinde kalmıştır. Hedefleyici peptit bulunan nanoparçacıkların hücre içine alınması, hedeflenmemiş formülasyonların yaklaşık iki katına ulaşmıştır. Hücrelerin 4 °C’de inkübe edilmesi alımı büyük ölçüde durdurmuş, 37 °C’de ise belirgin alım görülmüştür. Bu sonuç, nanoparçacık girişinin pasif difüzyondan çok enerji gerektiren endositoz mekanizmalarına dayandığını desteklemektedir.

Hedeflendirilmiş cetuximab yüklü formülasyonun yapay kan-beyin bariyeri modelindeki görünür geçirgenlik katsayısı 8,40 ± 0,16 × 10^-7 cm/s bulunmuştur. Hedefleyici peptit içermeyen cetuximab yüklü sistemde bu değer 5,83 ± 0,26 × 10^-7 cm/s’dir. Böylece peptit işlevselleştirmesi bariyer modeli boyunca taşınmayı yaklaşık %25-45 artırmıştır.

U87 glioblastoma hücrelerinde hedeflendirilmiş cetuximab yüklü nanoparçacıkların hücre içine alınması, 37 °C’de %17,37 ± 0,78 FITC-pozitif hücre düzeyine ulaşmıştır. Cetuximab içermeyen hedeflendirilmiş nanoparçacıklarda bu oran %11,40 ± 1,10’dur. En yüksek nanoparçacık yoğunluğunda ve 24 saat sonunda U87 hücre canlılığı %50’nin altına düşmüştür.

Bu sonuçlar, nanoparçacıkların cetuximabı yüksek verimle kapsülleyebildiğini, integrin hedeflemenin yapay bariyer ve glioblastoma hücrelerinde alımı artırdığını ve kapsüllenmiş antikorun U87 hücrelerinde biyolojik etkisini koruduğunu düşündürmektedir. Ancak çalışma yalnızca hücre kültürü düzeyindedir. Nanoparçacıkların canlı bir organizmada kan-beyin bariyerini geçip geçmediği, tümörde birikip birikmediği, sağlıklı organlara dağılımı, güvenliği ve tümör büyümesi üzerindeki etkisi araştırılmamıştır.

Glioblastomanın tedavisini zorlaştıran temel sorun

Glioblastoma, erişkinlerde görülen en saldırgan birincil beyin tümörlerinden biridir. Çalışmanın giriş bölümünde aktarılan verilere göre malign gliomaların yaklaşık yarısını oluşturmakta ve hızlı hücre çoğalması, çevredeki beyin dokusuna yaygın sızma ve tedavilere dirençle karakterize edilmektedir.

Mevcut standart yaklaşım mümkün olan en geniş cerrahi çıkarımı, radyoterapiyi ve temozolomid temelli kemoterapiyi içerir. Buna rağmen makalede aktarılan klinik literatüre göre medyan sağkalım yaklaşık 12-15 ay düzeyinde kalmaktadır.

Glioblastomanın tedaviye dirençli olmasında birden fazla etken bulunmaktadır:

• Tümör hücrelerinin beyin dokusunun içine mikroskobik uzantılar hâlinde yayılması,
• Aynı tümör içindeki hücrelerin genetik ve biyolojik olarak birbirinden farklı olması,
• Glioma kök hücresi benzeri hücrelerin tedavi sonrasında hayatta kalabilmesi,
• Tümörün metabolik ve genetik uyum yeteneği,
• EGFR, PI3K/Akt/mTOR ve Ras/Raf/MEK/ERK gibi büyüme sinyallerinin etkinleşmesi,
• Kan-beyin bariyerinin sistemik ilaçların tümöre ulaşmasını engellemesi.

Bu çalışma tüm bu sorunların tamamını çözmeyi amaçlamamaktadır. Araştırmanın odak noktası, büyük bir biyolojik ilaç olan cetuximabın kan-beyin bariyeriyle karşılaşan taşıma sorununa yönelik bir nanoteknoloji platformu geliştirmektir.

Kan-beyin bariyeri neden bu kadar güçlü bir engeldir?

Kan-beyin bariyeri, beyin kılcal damarlarını oluşturan endotel hücrelerinin sıkı bağlantılarla birbirine bağlandığı özel bir biyolojik filtredir. Bu hücreler, maddelerin kandan beyin dokusuna geçişini son derece sıkı biçimde düzenler.

Çalışmanın girişinde aktarılan literatüre göre bariyer:

• Küçük moleküllerin yaklaşık %98’ini,
• Monoklonal antikorlar dâhil olmak üzere makromoleküllerin neredeyse tamamını

merkezi sinir sisteminin dışında tutmaktadır.

Glioblastoma kitlesinin merkezindeki damarlar kısmen geçirgen olabilir. Buna karşın tümörün çevre beyin dokusuna sızan kenarları daha sağlam bir kan-beyin bariyeri tarafından korunur. Tümör tekrarının sıklıkla bu sızıcı hücrelerin kaldığı bölgelerde başlaması, yalnızca tümör çekirdeğine ulaşabilen tedavilerin yetersiz kalmasına neden olabilir.

Cetuximab neden seçildi?

Cetuximab, EGFR’nin hücre dışı bölümüne bağlanan kimerik IgG1 sınıfı bir monoklonal antikordur. Yaklaşık molekül büyüklüğü 150 kDa’dır.

EGFR’nin etkinleşmesi hücre içinde iki önemli sinyal ağına bağlanmaktadır:

• PI3K/Akt/mTOR yolu: Hücrenin hayatta kalması, enerji kullanımı, metabolik uyum ve apoptozdan kaçışla ilişkilidir.
• Ras/Raf/MEK/ERK yolu: Hücre çoğalması, göç, damar oluşumu ve tümör büyümesini destekleyebilir.

Çalışmada aktarılan arka plan bilgisine göre EGFR, glioblastomaların yaklaşık %40-45’inde çoğalmış veya aşırı ifade edilmiş olabilir. EGFRvIII adlı sürekli etkin mutant biçim de tümör büyümesini destekleyebilir.

Cetuximab EGFR’ye bağlanarak ligandın reseptörü uyarmasını ve aşağı akım büyüme sinyallerinin etkinleşmesini azaltabilir. Ancak glioblastomada asıl sorun antikorun moleküler hedefinin bulunmaması değil, antikorun hedefe ulaşamamasıdır.

Bu araştırmada cetuximab yeni bir ilaç olarak geliştirilmemiştir. Mevcut antikorun polimerik bir taşıyıcı içinde kapsüllenerek beyin bariyeri ve glioblastoma hücrelerine taşınması araştırılmıştır.

İki aşamalı hedefleme mantığı

Nanoparçacığın yüzeyine bağlanan cRGDfV peptidi, α_vβ₃ ve α_vβ₅ integrinlerine yüksek bağlanma eğilimi gösterebilen siklik bir RGD peptididir.

Bu integrinlerin iki farklı bölgede bulunması çalışmanın hedefleme stratejisinin temelini oluşturur:

1. Kan-beyin bariyeri endotelinde hedefleme: Peptit-integrin etkileşiminin nanoparçacığın endotel hücresi tarafından alınmasını ve transsitozla hücrenin diğer tarafına taşınmasını kolaylaştırması amaçlanır.
2. Glioblastoma hücresinde hedefleme: Aynı peptidin tümör hücresindeki integrinlere bağlanarak nanoparçacık alımını artırması beklenir.
3. EGFR’nin baskılanması: Taşınan cetuximabın EGFR’ye bağlanarak tümör hücresindeki büyüme sinyallerini azaltması hedeflenir.

Bu nedenle sistem yalnızca bir “ilaç kabı” değildir. Nanoparçacık yüzeyindeki peptit biyolojik hedefleme işlevi görürken, çekirdekteki cetuximab ayrı bir moleküler hedefe yönelmektedir.

Bununla birlikte çalışma, canlı beyinde bu üç basamağın art arda gerçekleştiğini göstermemiştir. Kan-beyin bariyeri ve glioblastoma hücre deneyleri ayrı in vitro sistemlerde yürütülmüştür.

Nanoparçacığın temel bileşenleri

CPMA kopolimeri

Taşıyıcının katyonik bileşeni, kitosan omurgasına metil metakrilat ve akrilik asit zincirleri aşılanarak oluşturulmuştur. Bu kopolimer makalede CPMA olarak kısaltılmıştır.

Nicel proton NMR sonuçlarına göre kopolimerin bileşimi:

• Kitosan ile toplam PMMA ve PAAc bölümü arasında 73:27 ağırlık oranı,
• PMMA ile PAAc arasında 63:37 ağırlık oranı

göstermiştir.

Kitosan pozitif yük taşıyan amin grupları sağlar. PMMA hidrofobik özelliklere, PAAc ise iyonlaşabilir karboksilik asit gruplarına katkıda bulunur. Bu yapı CPMA’nın kendi içinde öz-düzenlenebilmesini ve aljinatla elektrostatik kompleks oluşturmasını sağlar.

Sodyum aljinat

Aljinat negatif yüklü bir polisakkarittir. Pozitif yüklü kitosan bölgeleriyle etkileşerek polielektrolit kompleksin oluşmasına katkı sağlar. Cetuximab, nanoparçacık oluşturulmadan önce aljinat fazına eklenmiş ve polimerler birleşirken yapının içinde kapsüllenmiştir.

STPP çapraz bağlayıcı

Sodyum tripolifosfat, kitosanın pozitif yüklü bölgelerini iyonik olarak çapraz bağlamak ve oluşan nanoparçacıkların fiziksel kararlılığını artırmak amacıyla kullanılmıştır.

PEP hedefleme bileşeni

Çalışmada PEP adı verilen hedefleyici yapı:

• cRGDfV siklik peptidini,
• Sekiz etilen glikol biriminden oluşan PEG8 ara zincirini,
• Kopolimere bağlanmayı sağlayan terminal tiyol grubunu

içermektedir.

PEG ara zinciri peptidin polimer yüzeyinden dışarı uzanmasını ve integrinlere bağlanabilecek esnek bir konum kazanmasını amaçlar.

Hedefleme peptidi polimere nasıl bağlandı?

Peptidin CPMA’ya bağlanması iki kimyasal basamakta gerçekleştirilmiştir.

1. CPMA üzerindeki kitosan amin gruplarına, EDC/NHS kimyası kullanılarak 6-maleimidoheksanoik asit bağlanmıştır.
2. Tiyol uçlu cRGDfV-PEG-SH yapısı, maleimid-tiyol Michael katılma reaksiyonuyla bu ara bağlayıcıya eklenmiştir.

Proton NMR analizinde maleimid sinyalinin azalması ve peptitle uyumlu yeni sinyalin ortaya çıkması, bağlanmayı desteklemiştir.

Nicel sonuçlar:

• CPMA üzerindeki MHA modifikasyonu: %3 ağırlık/ağırlık,
• Ellman testiyle tiyol tüketimi: %85 ± 2,
• Son kopolimerde PEP içeriği: %4,3 ağırlık/ağırlık.

Mikroakışkan üretim neden kullanıldı?

Geleneksel kap içi üretimde polimerlerin karşılaşma hızı, karışımın her noktasında aynı olmayabilir. Bu durum farklı büyüklükte ve yapıda nanoparçacıkların oluşmasına yol açabilir.

Araştırmacılar iki sıvı akışını kontrollü biçimde bir araya getiren T-bağlantılı bir mikroakışkan cihaz kullanmıştır. Sistemde:

• Bir girişten %0,1 ağırlık/hacim CPMA veya CPMA-PEP çözeltisi,
• Diğer girişten %0,09 ağırlık/hacim aljinat ve gerektiğinde cetuximab karışımı

verilmiştir.

İki akışın hızı ayrı ayrı 0,3 mL/dakika olarak ayarlanmış ve çözeltilerin pH değeri 6,0’a getirilmiştir. Bu pH, katyonik ve anyonik polimerlerin yeterli mutlak yüzey yüküne sahip olduğu, fakat çözünürlüğünü koruduğu koşul olarak seçilmiştir.

Akışlar birleştiğinde hızlı ve homojen elektrostatik kompleksleşme meydana gelmiş, ardından STPP eklenerek yapı çapraz bağlanmıştır.

Çift öz-düzenlenme ne anlama geliyor?

Çalışmadaki “double self-assembly”, yani çift öz-düzenlenme kavramı iki ayrı yapısal süreci anlatır:

1. Amfifilik CPMA kopolimerinin kendi içindeki hidrofobik ve hidrofilik bölgeler nedeniyle nanoölçekte düzenlenmesi,
2. Pozitif yüklü CPMA ile negatif yüklü aljinatın birbiriyle elektrostatik kompleks oluşturması.

Bu iki süreç aynı üretim akışında gerçekleşerek cetuximabı çevreleyen çekirdek-kabuk benzeri bir polimerik yapı oluşturmuştur.

Cetuximab kapsülleme verimliliği

Çalışmada kapsülleme verimliliği şu formülle hesaplanmıştır:

\[ \%EE = \frac{\text{Toplam eklenen ilaç} - \text{Serbest ve kapsüllenmemiş ilaç}} {\text{Toplam eklenen ilaç}} \times 100 \]

Değişkenlerin anlamı:

• %EE: Eklenen cetuximabın yüzde kaçının nanoparçacık içinde tutulduğunu gösteren kapsülleme verimliliğidir.
• Toplam eklenen ilaç: Üretimin başlangıcında sisteme verilen cetuximab miktarıdır.
• Serbest ve kapsüllenmemiş ilaç: Nanoparçacıklar çöktürüldükten sonra sıvı üst fazda kalan cetuximab miktarıdır.

Sonuç %99,0 ± 0,7 bulunmuştur. Bu değer, başlangıçta eklenen cetuximabın neredeyse tamamının nanoparçacık fraksiyonuyla ilişkili olduğunu göstermektedir.

Bununla birlikte yöntem antikoru doğrudan nanoparçacığın içinde saymamış, üst sıvıda bulunmayan miktarı kapsüllenmiş kabul etmiştir. SDS-PAGE analizi, nanoparçacık fraksiyonundaki antikor bantlarını göstererek bu dolaylı hesabı desteklemiştir.

İlaç yükleme oranı

İlaç yükleme oranı şu ilişkiyle hesaplanmıştır:

\[ \%DL = \frac{\text{Nanoparçacık içinde bulunan toplam ilaç miktarı}} {\text{Toplam nanoparçacık ağırlığı}} \times 100 \]

Burada:

• %DL: Nanoparçacık kütlesinin yüzde kaçının cetuximabdan oluştuğunu gösterir.
• Toplam ilaç miktarı: Kapsüllenmiş olarak hesaplanan cetuximab miktarıdır.
• Toplam nanoparçacık ağırlığı: Polimerler, çapraz bağlayıcı ve ilaç dâhil son taşıyıcı sistemin ağırlığıdır.

Cetuximab yükleme oranı %16,2 ± 0,07 ağırlık/ağırlık bulunmuştur.

Nanoparçacıkların büyüklüğü ve yüzey özellikleri

PEC, hedefleme peptidi ve cetuximab içermeyen temel polielektrolit kompleksidir. PEC-PEP, hedefleme peptidi eklenmiş boş taşıyıcıdır. PEC@CET, cetuximab yüklü fakat hedefleme peptidi bulunmayan sistemdir. PEC-PEP@CET ise hem PEP hedefleme ligandı hem de cetuximab içeren son formülasyondur.

Cetuximabın eklenmesi hidrodinamik çapı yaklaşık 265-270 nm’den 318-322 nm aralığına yükseltmiştir. PDI değerlerinin 0,20-0,27 aralığında kalması, büyüklük dağılımının tamamen tek tip olmasa da görece kontrollü olduğunu göstermektedir.

Bütün nanoparçacıkların yüzey yükü negatiftir. Bu durum, pozitif kitosan bölgelerinin aljinat ve STPP ile kısmen nötrleşmesi ve dış bölgede anyonik polimer bileşenlerin bulunmasıyla ilişkilendirilmiştir.

DLS ve elektron mikroskobu neden farklı büyüklük gösterdi?

Dinamik ışık saçılımı, nanoparçacığın sıvı içindeki hidratlanmış hidrodinamik çapını ölçer. Polimer zincirlerinin çevresinde bulunan su tabakası da ölçüme dâhil olur.

Kriyojenik TEM görüntülerinde ise parçacığın daha doğrudan geometrik yapısı görülmüştür. PEC-PEP ve PEC-PEP@CET sistemlerinde geometrik çap yaklaşık 150 nm’dir.

Bu nedenle 322 nm’lik DLS çapı ile yaklaşık 150 nm’lik elektron mikroskobu çapı birbiriyle zorunlu olarak çelişmemektedir. Aradaki fark yüksek derecede su alan polimerik kabuğun hidrodinamik ölçüme katkısıyla açıklanmıştır.

Çekirdek-kabuk yapısı

Kriyo-TEM görüntülerinde parçacıklar küresel görünmüş; daha yoğun bir iç çekirdek ve daha düşük yoğunluklu, dokulu dış bölge ayırt edilmiştir.

HAADF-STEM ve element haritalaması:

• Karbon ve azotun CPMA bileşenlerinden,
• Sodyumun aljinattan,
• Fosforun STPP çapraz bağlayıcıdan,
• Oksijenin her iki polimerden

geldiğini göstermiştir.

Fosfor ve oksijen sinyalinin dış bölgede daha yoğun olması, aljinat ve STPP açısından zenginleşmiş bir kabuk yapısıyla uyumlu bulunmuştur.

Nanoparçacık kararlılığı

Hedeflendirilmiş cetuximab yüklü nanoparçacıklar 4 °C’de 21 gün boyunca izlenmiş, hidrodinamik çap ve PDI bakımından belirgin değişim görülmemiştir.

Bu sonuç kısa süreli fiziksel depolama kararlılığını destekler. Ancak uzun süreli raf ömrü, dondurup çözme, sterilizasyon, serum ortamı veya klinik ürün koşulları değerlendirilmemiştir.

Cetuximab salımı

Nanoparçacıklardan cetuximab salımı 37 °C’de iki farklı ortamda incelenmiştir:

• Kan dolaşımını taklit eden pH 7,4,
• Daha asidik tümör veya endozomal ortamı kısmen taklit eden pH 6,5.

Kırk sekiz saat sonunda:

• pH 7,4’te yaklaşık %29 salım,
• pH 6,5’te yaklaşık %21 salım

ölçülmüştür.

Asidik ortamda salımın daha düşük olması, bu sistemin asitle hızlanan bir taşıyıcı olmadığını göstermektedir. Makalede önerilen mekanizmaya göre pH azaldığında PAAc ve aljinat bölgelerinin iyonlaşması azalmakta, negatif yükler arasındaki itme zayıflamakta ve polimer matriksi daha az hidratlanmaktadır. Ağın etkin açıklığı küçüldüğü için büyük cetuximab molekülünün difüzyonu yavaşlamaktadır.

Higuchi modeli

Higuchi modeli salınan ilaç miktarının zamanın kareköküyle ilişkisini ifade eder:

\[ f_t = K_H t^{1/2} \]

Burada:

• f_t: t zamanına kadar salınan cetuximab yüzdesidir.
• K_H: Higuchi salım hız sabitidir.
• t: Zamandır.

Çalışmada:

• pH 7,4 için K_H = 4,233 %·saat^-1/2 ve R² = 0,98,
• pH 6,5 için K_H = 2,962 %·saat^-1/2 ve R² = 0,80

bulunmuştur.

pH 7,4’teki daha yüksek hız sabiti ve daha yüksek R² değeri, fizyolojik pH’daki salımın Higuchi tipi difüzyon davranışına daha iyi uyduğunu göstermektedir.

Korsmeyer-Peppas modeli

Korsmeyer-Peppas ilişkisi şu şekilde verilmiştir:

\[ f_t = K_{KP} t^n \]

Burada:

• f_t: Belirli zamana kadar salınan ilaç oranıdır.
• K_KP: Taşıyıcı yapısına bağlı salım sabitidir.
• t: Zamandır.
• n: Salım mekanizmasını tanımlamaya yardımcı olan difüzyon üssüdür.

Sonuçlar:

pH 7,4’te n değerinin yaklaşık 0,5 olması Fick tipi difüzyonla uyumludur. pH 6,5’te n değerinin 0,293’e düşmesi, antikor hareketinin polimer matriksi içinde daha fazla sınırlandığını düşündürmektedir.

Kan-beyin bariyeri modeli nasıl oluşturuldu?

Araştırmacılar insan beyin mikrovasküler endotelinden türetilmiş hCMEC/D3 hücre hattını kullanmıştır. Hücreler yarı geçirgen membranlı ekler üzerinde büyütülerek üst ve alt sıvı bölmeleri birbirinden ayıran bir hücre tabakası oluşturmuştur.

Deney koşulları arasında:

• Ek başına 60.000 hücre,
• 3,0 µm gözenekli membran,
• Bariyer sıkılığını artırmak için deneyden 24 saat önce 100 nM retinoik asit,
• Deney öncesinde 150-180 Ω·cm² TEER kabul aralığı

bulunmaktadır.

TEER, hücre tabakasının elektrik akımına karşı direncidir. Hücrelerin arasındaki sıkı bağlantılar güçlendikçe direnç yükselir. Çalışmada hücre tabakaları yaklaşık 160-170 Ω·cm² plato değerlerine ulaşmıştır.

Görünür geçirgenlik katsayısı

Nanoparçacıkların hücre tabakasını geçme hızı şu formülle hesaplanmıştır:

\[ P_{app} = \frac{dc}{dt} \times \frac{1}{A \times C_0} \]

Burada:

• P_app: Görünür geçirgenlik katsayısıdır ve cm/s birimiyle ifade edilmiştir.
• dc/dt: Hücre tabakasının diğer tarafına geçen madde miktarının zamana göre değişim hızıdır.
• A: Geçişin gerçekleştiği membran yüzey alanıdır.
• C₀: Verici bölmedeki başlangıç nanoparçacık yoğunluğudur.

P_app değeri büyüdükçe deney sistemindeki geçiş hızının arttığı kabul edilir. Ancak bu sayı canlı insandaki kan-beyin bariyeri geçirgenliğini doğrudan vermez.

Kan-beyin bariyeri geçirgenlik sonuçları

Hedefleyici peptit içeren sistemler, peptit içermeyen eşlerine göre yaklaşık %25-45 daha yüksek geçirgenlik göstermiştir.

Cetuximab yüklenmesinin hedefleme peptidi bulunmadığında belirgin bir taşıma avantajı sağlamaması önemlidir. Deneyde asıl geçirgenlik artışı antikor yükünden değil, PEP-integrin etkileşiminden kaynaklanmıştır.

Taşıma deneyinden sonra TEER değerlerinde hafif azalma gözlenmiştir. Ancak aynı azalma işlem yapılan kontrol hücrelerinde de ortaya çıkmış ve nanoparçacık gruplarında ek bir bariyer bozulması gösterilmemiştir. Bu bulgu nanoparçacıkların hücre tabakasını yalnızca fiziksel olarak parçalayarak geçmediği yorumunu desteklemektedir.

hCMEC/D3 hücre canlılığı

Nanoparçacıkların bariyer hücrelerine zarar verip vermediği MTT yöntemiyle değerlendirilmiştir. Hücreler:

• %0,01,
• %0,02,
• %0,03 ağırlık/hacim

nanoparçacık yoğunluklarına 4 veya 24 saat maruz bırakılmıştır.

Bütün formülasyonlarda hücre metabolik etkinliği ISO 10993-5 standardında in vitro sitotoksisite için kullanılan %70 sınırının üzerinde kalmıştır.

PEP içeren bazı gruplarda 24 saatte metabolik etkinlikte hafif artış görülmüştür. Yazarlar bu sonucu hücre çoğalması olarak yorumlamamış; RGD-integrin etkileşiminin hücre yapışmasını ve erken mitokondriyal etkinliği geçici olarak destekleyebileceğini belirtmiştir.

Hücre alımının sıcaklığa bağımlılığı

Nanoparçacıkların hücre içine alınması 4 °C ve 37 °C’de karşılaştırılmıştır.

4 °C’de hücresel enerjiye bağlı taşıma mekanizmaları yavaşladığı için bütün gruplarda alım son derece düşük kalmıştır. 37 °C’de hücre içi yeşil floresan sinyali belirgin biçimde yükselmiştir.

Bu sıcaklık farkı şu yorumu desteklemektedir:

• Nanoparçacıklar yalnızca hücre yüzeyine yapışmamaktadır.
• Hücre zarından pasif biçimde süzülmemektedir.
• Enerji gerektiren endositoz mekanizmalarıyla içeri alınmaktadır.

Endotel hücrelerindeki nicel alım sonuçları

37 °C’de hedeflenmemiş PEC ve PEC@CET formülasyonlarında FITC-pozitif hücre oranı yaklaşık %3,0-6,4 aralığındadır.

PEP içeren PEC-PEP ve PEC-PEP@CET sistemlerinde oran yaklaşık %8,4-11,6’ya yükselmiştir.

4 °C’de bütün gruplarda değerler %1’in altında kalmıştır.

Böylece PEP işlevselleştirmesi endotel hücre alımını yaklaşık iki kat artırmıştır. Konfokal görüntülerde nanoparçacık sinyalinin çekirdek çevresinde yoğunlaşması da hücre içi veziküler taşınmayla uyumlu bulunmuştur.

U87 glioblastoma hücrelerinde alım

U87 hücre hattı insan glioblastomasını temsil eden yaygın bir in vitro model olarak kullanılmıştır. Hücreler hedeflendirilmiş nanoparçacıklarla 4 °C ve 37 °C’de inkübe edilmiştir.

4 °C’de hücre içi FITC-pozitif oranı %3,93 veya altında kalmıştır. 37 °C’de:

• PEC-PEP: %11,40 ± 1,10 FITC-pozitif hücre,
• PEC-PEP@CET: %17,37 ± 0,78 FITC-pozitif hücre

ölçülmüştür.

Cetuximab yüklü hedeflendirilmiş sistemin daha yüksek hücre içi sinyali, integrin aracılı alıma ek olarak cetuximab-EGFR etkileşiminin nanoparçacık birikimine katkıda bulunabileceği şeklinde yorumlanmıştır.

Z-yığını konfokal görüntüleme, yeşil sinyalin yalnızca hücre yüzeyinde değil, hücrenin farklı derinliklerinde bulunduğunu göstermiştir.

U87 hücre canlılığı

Glioblastoma hücreleri %0,01, %0,02 ve %0,03 ağırlık/hacim nanoparçacık yoğunluklarına 4 ve 24 saat maruz bırakılmıştır.

Cetuximab yüklü formülasyonlarda doza bağlı canlılık azalması görülmüştür. En güçlü azalma PEC-PEP@CET formülasyonunda ortaya çıkmıştır.

En yüksek konsantrasyonda ve 24 saat sonunda U87 hücre canlılığı %50’nin altına düşmüştür.

Bu sonuç cetuximabın kapsülleme sonrasında biyolojik etkisini tamamen kaybetmediğini düşündürmektedir. Bununla birlikte:

• Hücre canlılığı testi tümör küçülmesini ölçmez.
• Çalışmada canlı hayvan tümörü bulunmamaktadır.
• Serbest cetuximabla kapsamlı bir doğrudan etkinlik karşılaştırması sunulmamıştır.
• U87 hücre hattı gerçek glioblastomadaki bütün hücresel çeşitliliği temsil etmez.

Grafik özet ne anlatıyor?

Çalışmanın ilk sayfasındaki grafik özet, geliştirme sürecini dört bağlantılı aşama hâlinde göstermektedir:

1. CPMA kopolimerine maleimid bağlayıcı ve cRGDfV peptidinin eklenmesi,
2. CPMA-PEP ile cetuximab içeren aljinatın T-bağlantılı mikroakışkan çipte birleştirilmesi,
3. Nanoparçacığın integrin aracılı endositoz ve transsitozla kan-beyin bariyeri hücresini geçmesi,
4. Glioblastoma hücresinde integrin hedeflemesi ve cetuximab aracılı EGFR baskılanması.

Grafik özet, araştırmanın önerdiği bütün mekanizmayı tek bir şemada birleştirmektedir. Ancak bu mekanizmanın tamamı tek ve bütünleşik bir canlı modelde gösterilmemiştir. Bariyer geçişi ve tümör hücresi etkisi ayrı hücre kültürü deneyleriyle değerlendirilmiştir.

Şekil 1: Polimer sentez yolu

Şekil 1 üç kimyasal aşamayı göstermektedir:

• Kitosan üzerine MMA ve akrilik asit zincirlerinin aşılanması,
• CPMA’ya maleimid içeren MHA bağlanması,
• Tiyol uçlu cRGDfV-PEG yapısının maleimid grubuna eklenmesi.

Bu şema nanoparçacığın kendisini değil, hedefleyici polimer bileşeninin nasıl oluşturulduğunu açıklamaktadır.

Şekil 2: Fizikokimyasal karakterizasyon

Şekil 2’nin farklı panelleri şu bilgileri vermektedir:

• DLS eğrileri: Cetuximab yüklendiğinde parçacık büyüklüğü dağılımının daha büyük çapa kaydığını gösterir.
• Zeta potansiyeli grafiği: Pozitif CPMA’dan negatif aljinata ve orta derecede negatif son nanoparçacığa doğru yüzey yükü dönüşümünü gösterir.
• SDS-PAGE: Cetuximabın üst sıvıda serbest kalmadığını, nanoparçacık fraksiyonunda bulunduğunu destekler.
• Kriyo-TEM: Yaklaşık 150 nm’lik küresel, çekirdek-kabuk benzeri yapı gösterir.
• Salım grafiği: pH 7,4’te salımın pH 6,5’ten daha yüksek olduğunu gösterir.

Şekil 3: Kan-beyin bariyeri hücre deneyleri

Şekil 3’te:

• Endotel hücre canlılığı,
• 4 °C ve 37 °C’de konfokal hücre görüntüleri,
• Akış görüntüleme sitometrisiyle hücre içi floresan,
• FITC-pozitif hücre oranı,
• Görünür geçirgenlik katsayısı

birlikte sunulmuştur.

Grafiklerin ortak mesajı, PEP hedefleme ligandının hücre alımını ve bariyer modelindeki taşınmayı artırdığı, ancak hücre tabakasını ek olarak bozmadığıdır.

Şekil 4: Glioblastoma hücre deneyleri

Şekil 4, U87 hücrelerindeki alım ve canlılık sonuçlarını göstermektedir. 37 °C’de özellikle PEC-PEP@CET grubunda güçlü hücre içi yeşil floresan görülmüştür. Nicel analiz de aynı grubun en yüksek FITC-pozitif hücre oranına sahip olduğunu göstermiştir.

Canlılık grafiğinde cetuximab içermeyen taşıyıcılarla cetuximab yüklü sistemler ayrışmaktadır. Antikor yüklü gruplar canlılığı daha fazla azaltmış, hedeflendirilmiş cetuximab formülasyonu en güçlü etkiyi göstermiştir.

Çalışmanın güçlü yönleri

• Cetuximab gibi büyük bir monoklonal antikor %99’a yakın verimle kapsüllenmiştir.
• Polimer sentezi NMR, FTIR ve Ellman testi gibi tamamlayıcı yöntemlerle doğrulanmıştır.
• Nanoparçacıklar kontrollü mikroakışkan ortamda üretilmiştir.
• DLS, zeta potansiyeli, SDS-PAGE, kriyo-TEM ve element haritalaması birlikte kullanılmıştır.
• Hedefleme peptidinin etkisi, peptit içermeyen eş formülasyonlarla karşılaştırılmıştır.
• Kan-beyin bariyeri hücrelerinde hem canlılık hem alım hem de geçirgenlik değerlendirilmiştir.
• U87 hücrelerinde konfokal mikroskopi, Z-yığını ve görüntülemeli akış sitometrisi kullanılmıştır.
• 4 °C ve 37 °C karşılaştırması enerjiye bağlı hücre alımını desteklemiştir.
• Cetuximabın kapsülleme sonrasında biyolojik etkisini koruduğuna yönelik hücre canlılığı verisi sunulmuştur.
• Salım verileri iki farklı matematiksel modelle analiz edilmiştir.
• İstatistiklerde çoklu karşılaştırma düzeltmeleri uygulanmıştır.

Çalışmanın sınırlılıkları

• Preprinttir: Hakem değerlendirmesinden geçmemiştir.
• Yalnızca in vitro çalışmadır: Canlı hayvan veya insan verisi yoktur.
• Gerçek kan-beyin bariyeri bütünüyle modellenmemiştir: hCMEC/D3 tek katman modeli perisit, astrosit, mikroglia, kan akımı ve bağışıklık sistemini içermez.
• Kan-beyin tümör bariyeri ayrı olarak modellenmemiştir.
• Bariyer ve tümör deneyleri birbirinden ayrıdır: Nanoparçacığın aynı deneyde bariyeri geçip ardından tümör hücresini öldürdüğü gösterilmemiştir.
• U87 tek hücre hattıdır: Glioblastomanın genetik heterojenliğini, kök hücre benzeri hücrelerini ve hasta farklılıklarını temsil etmez.
• Üç boyutlu tümör organoidi kullanılmamıştır.
• İn vivo biyodağılım bilinmemektedir: Nanoparçacığın karaciğer, dalak, böbrek veya diğer dokularda birikip birikmeyeceği değerlendirilmemiştir.
• Dolaşım süresi ve farmakokinetik ölçülmemiştir.
• Bağışıklık yanıtı değerlendirilmemiştir.
• Serbest cetuximabla kapsamlı doğrudan karşılaştırma sınırlıdır.
• EGFR sinyal yolundaki değişim doğrudan ölçülmemiştir: Hücre canlılığı azalması EGFR baskılanmasıyla uyumlu olsa da PI3K/Akt veya ERK fosforilasyonu raporlanmamıştır.
• Tümör büyümesi veya hayvan sağkalımı ölçülmemiştir.
• 48 saatte cetuximabın büyük bölümü salınmamıştır: Bunun uzun dönemde terapötik kullanılabilirliği bilinmemektedir.
• Fiziksel kararlılık yalnızca 21 gün ve 4 °C koşulunda değerlendirilmiştir.
• Deneylerin çoğu üç bağımsız tekrarla yürütülmüştür: İstatistiksel tahminler küçük laboratuvar tekrarlarına dayanmaktadır.
• P_app artışı in vivo beyin geçişi kanıtı değildir.
• Nanoparçacıkların klinik ölçekte üretilebilirliği değerlendirilmemiştir.

Çalışma ne söylüyor?

• CPMA ve aljinat temelli polielektrolit kompleks nanoparçacıklar cetuximabı yüksek verimle kapsülleyebilmiştir.
• Hedeflendirilmiş cetuximab yüklü formülasyonun hidrodinamik çapı yaklaşık 322 nm’dir.
• Kriyo-TEM görüntülerinde yaklaşık 150 nm geometrik büyüklükte çekirdek-kabuk benzeri yapılar görülmüştür.
• Nanoparçacıklar 4 °C’de 21 gün boyunca büyüklük bakımından kararlı kalmıştır.
• Cetuximab salımı pH 7,4’te pH 6,5’e göre daha hızlıdır.
• PEP hedefleme peptidi endotel ve U87 hücrelerindeki nanoparçacık alımını artırmıştır.
• Hücre alımı enerjiye bağımlıdır.
• PEP işlevselleştirmesi yapay kan-beyin bariyeri modelindeki P_app değerini artırmıştır.
• Nanoparçacıklar hCMEC/D3 hücrelerinde test edilen koşullarda %70 canlılık sınırının üzerinde kalmıştır.
• Hedeflendirilmiş cetuximab yüklü sistem U87 hücrelerinde en güçlü canlılık azalmasını oluşturmuştur.

Çalışma ne söylemiyor?

• Nanoparçacıkların insan kan-beyin bariyerini geçtiği kanıtlanmamıştır.
• Glioblastoma hastalarında tümöre ulaştığı gösterilmemiştir.
• Cetuximabın klinik glioblastoma tedavisinde etkili hâle geldiği kanıtlanmamıştır.
• Nanoparçacıkların sağkalımı uzattığı gösterilmemiştir.
• Mevcut cerrahi, radyoterapi veya temozolomid tedavisinin yerini alabileceği söylenemez.
• İnsanlarda güvenli doz belirlenmemiştir.
• Uzun dönem toksisite veya bağışıklık güvenliği gösterilmemiştir.
• Tüm glioblastomaların EGFR veya α_vβ₃/α_vβ₅ hedeflemesine yanıt vereceği kanıtlanmamıştır.
• U87 hücre canlılığındaki azalma klinik tümör yanıtı değildir.
• P_app değerleri doğrudan beyin dokusundaki ilaç yoğunluğunu göstermez.

Geçmiş, bugün ve gelecek açısından önemi

Geçmişte monoklonal antikorlar çoğunlukla beyin dışındaki tümörlerde değerlendirilmiş, kan-beyin bariyeri nedeniyle glioblastomada kullanım alanları sınırlı kalmıştır. Bu çalışma, büyük biyolojik moleküllerin sulu ortamda polielektrolit kompleksler içine yerleştirilebileceğini ve bariyer hücrelerindeki reseptörler kullanılarak taşınmasının artırılabileceğini göstermektedir.

Bugün açısından çalışmanın en önemli katkısı, üç ayrı teknolojik bileşeni aynı platformda birleştirmesidir:

• Mikroakışkan ve kontrollü nanoparçacık üretimi,
• İntegrin hedefli bariyer ve tümör hücresi alımı,
• EGFR hedefli monoklonal antikor taşınması.

Gelecekte araştırılması gereken basamaklar şunlardır:

• Astrosit ve perisit içeren daha gelişmiş kan-beyin bariyeri modelleri,
• Kan-beyin bariyeri ile glioblastoma hücrelerinin aynı sistemde bulunduğu ortak kültürler,
• Üç boyutlu glioblastoma organoidleri,
• Farklı EGFR ve integrin düzeylerine sahip glioblastoma hücreleri,
• Tümör taşıyan hayvanlarda beyin dağılımı,
• Nanoparçacıkların kanda kalma süresi ve organ dağılımı,
• Bağışıklık ve uzun dönem güvenlik değerlendirmeleri,
• Serbest cetuximab ve standart tedavilerle doğrudan karşılaştırma,
• Temozolomid ve radyoterapiyle kombinasyon deneyleri,
• Üretimin büyütülmesi ve seri üretim tekrarlanabilirliği.

Gündelik yaşam ve klinik gelecek açısından anlamı

Glioblastomada ilaç geliştirme sorunu yalnızca güçlü bir kanser ilacı bulmak değildir. İlacın beynin doğru bölgesine, yeterli yoğunlukta ve sağlıklı dokuya en az zarar verecek biçimde ulaştırılması gerekir.

Bu çalışma, “ilaç etkili mi?” sorusuna ek olarak “ilaç hedefe ulaşabiliyor mu?” sorusunun da tedavinin temel parçası olduğunu göstermektedir.

Nanoparçacık yaklaşımı gelecekte başarılı olursa büyük antikorların veya başka biyolojik ilaçların beyin tümörlerine taşınması için yeni seçenekler sağlayabilir. Ancak mevcut çalışma laboratuvar ölçeğindedir. Glioblastoma hastalarının tedavisini bugün değiştiren bir sonuç veya uygulanabilir klinik ürün sunmamaktadır.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Çalışma tasarımının teknik özeti

Üretim koşulları

Polimer işlevselleştirme sonuçları

Cetuximab yükleme ve fiziksel özellikler

Cetuximab salım sonuçları

hCMEC/D3 kan-beyin bariyeri modeli sonuçları

Görünür geçirgenlik sonuçları

U87 glioblastoma hücresi sonuçları

İstatistiksel yöntem

Deneylerin çoğu en az üç bağımsız tekrarla gerçekleştirilmiş ve sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak bildirilmiştir.

Grup karşılaştırmalarında deney tasarımına göre tek yönlü veya iki yönlü ANOVA kullanılmıştır. Çoklu karşılaştırmalar:

• Benjamini-Krieger-Yekutieli yanlış keşif oranı düzeltmesi veya
• Tukey çoklu karşılaştırma testi

ile değerlendirilmiştir.

Düzeltilmiş p değerinin 0,05’in altında olması istatistiksel anlamlılık sınırı olarak kabul edilmiştir.

Kaynak ve Yöntem Notu

Bu içerik, Dhiraj Mishra, Marcelo Calderón, Ana Beloqui ve Alejandro Sosnik tarafından hazırlanan “Cetuximab-Loaded Self-Assembled Polymeric Nanoparticles for the Integrin-Targeted Therapy of Glioblastoma” başlıklı çalışmaya dayanmaktadır.

Yazarlar Technion – Israel Institute of Technology, University of the Basque Country UPV/EHU, POLYMAT ve IKERBASQUE bünyesindeki araştırma birimleriyle ilişkilidir.

Çalışma insanlarda yürütülmüş klinik araştırma değildir. Hayvan deneyi veya canlı organizmada tümör tedavisi de içermemektedir. hCMEC/D3 insan beyin mikrovasküler endotel hücreleri ile U87 insan glioblastoma hücre hattında yürütülen preklinik, in vitro deneysel nanoteknoloji çalışmasıdır.

Çalışma SSRN’de yayımlanmış bir preprinttir. Metinde açıkça “This preprint research paper has not been peer reviewed” ifadesi bulunmaktadır. Dolayısıyla çalışma hakem değerlendirmesinden geçmemiştir.

Çalışma TheraTools, “Innovative Tools to Treat and Model Complex Cancer Environments” projesi kapsamında HORIZON-MSCA-2021-DN-01 programı tarafından desteklenmiştir. Yazarlar bilinen bir çıkar çatışması veya çalışmayı etkileyebilecek kişisel ilişki bildirmemiştir.

Nanoparçacık şemalarının hazırlanmasında BioRender, veri analizi ve grafikler için GraphPad Prism, kimyasal yapı çizimleri için ChemDraw kullanıldığı belirtilmiştir.

Cetuximab kapsülleme verimliliği, nanoparçacık üst sıvısında ölçülen serbest antikor miktarından dolaylı olarak hesaplanmış; SDS-PAGE analizi antikorun nanoparçacık fraksiyonunda bulunduğunu desteklemiştir.

Kan-beyin bariyeri geçişi, yarı geçirgen membran üzerinde büyütülen hCMEC/D3 hücrelerinin kullanıldığı in vitro modelde hesaplanmıştır. Elde edilen P_app değerleri gerçek insan beynine geçen cetuximab miktarı olarak yorumlanmamalıdır.

U87 hücre canlılığındaki azalma, in vitro antitümör etkinlik sinyali sunmaktadır. Bu sonuç klinik tümör küçülmesi, hastalık kontrolü, sağkalım yararı veya tedavi başarısı anlamına gelmemektedir.

Çalışmada nanoparçacıkların canlı organizmadaki dolaşım süresi, beyin dağılımı, tümör birikimi, organ toksisitesi, bağışıklık yanıtı veya uzun dönem güvenliği değerlendirilmemiştir.

Bu makale yalnızca yüklenen PDF’de sunulan sentez yöntemi, formüller, fizikokimyasal ölçümler, elektron mikroskobu görüntüleri, hücre deneyleri, geçirgenlik analizleri, sayısal sonuçlar ve yazarların yorumları temel alınarak hazırlanmıştır. PDF’de bulunmayan klinik tedavi önerisi, insanlarda etkinlik iddiası, sağkalım garantisi veya glioblastoma için kullanıma hazır ilaç bulunduğu yönünde bir sonuç eklenmemiştir.