Qlioblastoma, hızlı büyümesi, beyin toxumasına yaygın biçimde sızması və mevcut müalicəlere direnç geliştirmesi səbəbilə müalicəsi son derece güç bir beyin şişidür. Cerrahi, radyoterapi və temozolomid müalicəsine rağmen tümörün tekrarlama riski yüksəktir. Yeni dərmanların geliştirilmesini zorlaştıran başlıca sorunlardan biri, merkezi sinir sistemini dolaşımdaki maddelerden koruyan qan-beyin baryeridir. Bu baryer, kiçik moleküllerin böyük bölümünün və cetuximab gibi böyük biyolojik dərmanların beyne yeterli miktarda ulaşmasını engeller.

cetuximab, epidermal böyümə faktoru reseptorune, yani EGFR’ye bağlanan təxminən 150 kDa büyüklüğünde bir monoklonal antikordur. EGFR, Qlioblastomaların mühüm bir bölümünde çoğalmış və ya aşırı ifade edilmiş ola bilər. Bununla birlikdə cetuximabın moleküler büyüklüğü və qan-beyin baryerini geçememesi, ilacın Qlioblastomada etkili yoğunluklara ulaşmasını sınırlar.

Bu tədqiqatda tədqiqatçılar cetuximabı koruyarak taşıyabilecek, qan-beyin baryeri hüceyrəleriyle etkileşebilecek və Qlioblastoma hüceyrəlerine yönlenebilecek polimerik nanohissəciklər geliştirmiştir. nanohissəciklərin temelini, kitosan üzerine poli(metil metakrilat-ko-akrilik asit) zincirleri aşılanarak oluşturulan CPMA kopolimeri ilə sodyum aljinat arasındaki elektrostatik kompleksleşme oluşturmaktadır.

daşıyıcı sistemin yüzeyi, α_vβ₃ və α_vβ₅ integrinlerine bağlanabilen siklik cRGDfV peptidiyle işlevselleştirilmiştir. Bu integrinler hem qan-beyin baryeri endotelinde hem de Qlioblastoma hüceyrəlerinde bulunabildiği üçün sistem iki aşamalı bir hədəfləmə mantığına sahiptir. ilk aşamada peptit-integrin etkileşimi nanohissəciyin baryer hüceyrəleri tarafından alınmasını və hüceyrə içinden taşınmasını desteklemektedir. İkinci aşamada taşınan cetuximabın Qlioblastoma hüceyrəlerindeki EGFR sinyalini baskılaması amaçlanmaktadır.

nanohissəciklər T-bağlantılı bir mikroaxınlı sistemde, sulu ortamda və sürekli akış altında ikiqat öz-özünə düzülmə metoduyle üretilmiştir. hədəfləndirilmiş və cetuximab yüklü son formülasyonun dinamik ışık saçılımıyla ölçülen ortalama hidrodinamik diametrı 322 ± 24 nm, polidispersite indeksi 0,24 ± 0,02 və zeta potensialı -15 ± 2 mV tapılmışdır. Kriyojenik elektron mikroskobunda ise yüksək derecede hidratlanmış polimer tabakasının bulunmadığı geometrik çap təxminən 150 nm kimi görülmüştür.

cetuximab kapsullaşdırma səmərəliliyi %99,0 ± 0,7, nanohissəcik ağırlığına göre dərman yükləmə nisbəti ise %16,2 ± 0,07 kimi ölçülmüştür. SDS-PAGE nəticələrı, antikorun nanohissəcik içində bulunduğunu və karakteristik ağır və hafif zincirlerinin saptanabildiğini göstermiştir.

cetuximabın 48 saatlik salımı fizyolojik pH 7,4’te təxminən %29, daha asidik pH 6,5’te təxminən %21 olmuştur. Asidik ortamda daha hızlı salım beklenebileceği hâlde bu sistemde salım yavaşlamıştır. tədqiqatçılar bunu, asidik pH’da anyonik polimer bölgelerinin iyonlaşmasının azalması, polimer ağının daha az su alması və antikorun geçebileceği etkin gözeneklerin küçülmesiyle açıklamaktadır.

qan-beyin baryerini taklit etmek üçün kullanılan hCMEC/D3 insan beyin mikrovasküler endotel hüceyrəlerinde, bütün nanohissəcik gruplarında hüceyrə canlılığı 4 və 24 saat sonunda %70’in üzerinde qalmışdır. Hedefleyici peptit bulunan nanohissəciklərin hüceyrə daxilinə alınması, hedeflenmemiş formülasyonların təxminən iki katına ulaşmıştır. hüceyrəlerin 4 °C’de inkübe edilmesi alımı böyük ölçüde durdurmuş, 37 °C’de ise aydın alım görülmüştür. Bu nəticə, nanohissəcik girişinin pasif difüzyondan çok enerji gerektiren endositoz mekanizmalarına dayandığını desteklemektedir.

hədəfləndirilmiş cetuximab yüklü formülasyonun yapay qan-beyin baryeri modelindeki görünən keçiricilik əmsalı 8,40 ± 0,16 × 10^-7 cm/s tapılmışdır. Hedefleyici peptit içermeyen cetuximab yüklü sistemde bu dəyər 5,83 ± 0,26 × 10^-7 cm/s’dir. Böylece peptit işlevselleştirmesi baryer modeli boyunca taşınmayı təxminən %25-45 artırmıştır.

U87 Qlioblastoma hüceyrəlerinde hədəfləndirilmiş cetuximab yüklü nanohissəciklərin hüceyrə daxilinə alınması, 37 °C’de %17,37 ± 0,78 FITC-pozitif hüceyrə düzeyine ulaşmıştır. cetuximab içermeyen hədəfləndirilmiş nanohissəciklərda bu nisbət %11,40 ± 1,10’dur. En yüksək nanohissəcik yoğunluğunda və 24 saat sonunda U87 hüceyrə canlılığı %50’nin altına düşmüştür.

Bu nəticələr, nanohissəciklərin cetuximabı yüksək verimle kapsülleyebildiğini, integrin hədəfləmənin yapay baryer və Qlioblastoma hüceyrəlerinde alımı artırdığını və kapsüllenmiş antikorun U87 hüceyrəlerinde biyolojik etkisini koruduğunu düşündürmektedir. Lakin tədqiqat yalnızca hüceyrə kültürü düzeyindedir. nanohissəciklərin canlı bir organizmada qan-beyin baryerini geçip geçmediği, tümörde birikip birikmediği, sağlıklı organlara dağılımı, güvenliği və tümör büyümesi üzerindeki etkisi araştırılmamıştır.

Qlioblastomanın müalicəsini zorlaştıran temel sorun

Qlioblastoma, erişkinlerde görülen en saldırgan birincil beyin tümörlerinden biridir. tədqiqatın giriş bölümünde aktarılan verilere göre malign gliomaların təxminən yarısını oluşturmakta və hızlı hüceyrə çoğalması, çevredeki beyin toxumasına yaygın sızma və müalicəlere dirençle karakterize edilmektedir.

Mevcut standart yaklaşım mümkün olan en geniş cerrahi çıkarımı, radyoterapiyi və temozolomid temelli kemoterapiyi içerir. Buna rağmen makalede aktarılan klinik literatüre göre medyan sağ qalma təxminən 12-15 ay düzeyinde kalmaktadır.

Qlioblastomanın müalicəye dirençli olmasında birden fazla etken bulunmaktadır:

• Tümör hüceyrəlerinin beyin toxumasınun içine mikroskobik uzantılar hâlinde yayılması,
• Aynı tümör içindeki hüceyrəlerin genetik və biyolojik kimi birbirinden farklı olması,
• Glioma kök hüceyrəsi benzeri hüceyrəlerin müalicə sonrasında hayatta kalabilmesi,
• Tümörün metabolik və genetik uyum yeteneği,
• EGFR, PI3K/Akt/mTOR və Ras/Raf/MEK/ERK gibi büyüme sinyallerinin etkinleşmesi,
• qan-beyin baryerinin sistemik dərmanların tümöre ulaşmasını engellemesi.

Bu tədqiqat tüm bu sorunların tamamını çözmeyi amaçlamamaktadır. tədqiqatın odak noktası, böyük bir biyolojik dərman olan cetuximabın qan-beyin baryeriyle karşılaşan taşıma sorununa yönelik bir nanoteknoloji platformu geliştirmektir.

qan-beyin baryeri neden bu kadar güclü bir engeldir?

qan-beyin baryeri, beyin kılcal damarlarını oluşturan endotel hüceyrəlerinin sıkı bağlantılarla birbirine bağlandığı özel bir biyolojik filtredir. Bu hüceyrəler, maddelerin kandan beyin toxumasına geçişini son derece sıkı biçimde düzenler.

tədqiqatın girişinde aktarılan literatüre göre baryer:

• Kiçik moleküllerin təxminən %98’ini,
• monoklonal antikorlar dâhil olmak üzere makromoleküllerin neredeyse tamamını

merkezi sinir sisteminin xaricində tutmaktadır.

Qlioblastoma kitlesinin merkezindeki damarlar kısmen geçirgen ola bilər. Buna karşın tümörün çevre beyin toxumasına sızan kenarları daha sağlam bir qan-beyin baryeri tarafından korunur. Tümör tekrarının sıklıkla bu sızıcı hüceyrəlerin kaldığı bölgelerde başlaması, yalnızca tümör çekirdeğine ulaşabilen müalicəlerin yetersiz kalmasına neden ola bilər.

cetuximab neden seçildi?

cetuximab, EGFR’nin hüceyrə dışı bölümüne bağlanan kimerik IgG1 sınıfı bir monoklonal antikordur. təxminən molekül büyüklüğü 150 kDa’dır.

EGFR’nin etkinleşmesi hüceyrə içində iki mühüm sinyal ağına bağlanmaktadır:

• PI3K/Akt/mTOR yolu: hüceyrənin hayatta kalması, enerji kullanımı, metabolik uyum və apoptozdan kaçışla əlaqəlidir.
• Ras/Raf/MEK/ERK yolu: hüceyrə çoğalması, göç, damar oluşumu və tümör büyümesini destekleyebilir.

tədqiqatda aktarılan arka plan bilgisine göre EGFR, Qlioblastomaların təxminən %40-45’inde çoğalmış və ya aşırı ifade edilmiş ola bilər. EGFRvIII adlı sürekli etkin mutant biçim de tümör büyümesini destekleyebilir.

cetuximab EGFR’ye bağlanarak ligandın reseptörü uyarmasını və aşağı akım büyüme sinyallerinin etkinleşmesini azalda bilər. Lakin Qlioblastomada asıl sorun antikorun moleküler hedefinin bulunmaması deyil, antikorun hedefe ulaşamamasıdır.

Bu tədqiqatda cetuximab yeni bir dərman kimi geliştirilmemiştir. Mevcut antikorun polimerik bir daşıyıcı içində kapsüllenerek beyin baryeri və Qlioblastoma hüceyrəlerine taşınması araştırılmıştır.

İki aşamalı hədəfləmə mantığı

nanohissəciyin yüzeyine bağlanan cRGDfV peptidi, α_vβ₃ və α_vβ₅ integrinlerine yüksək bağlanma eğilimi gösterebilen siklik bir RGD peptididir.

Bu integrinlerin iki farklı bölgede bulunması tədqiqatın hədəfləmə stratejisinin temelini oluşturur:

1. qan-beyin baryeri endotelinde hədəfləmə: Peptit-integrin etkileşiminin nanohissəciyin endotel hüceyrəsi tarafından alınmasını və transsitozla hüceyrənin diğer tarafına taşınmasını kolaylaştırması amaçlanır.
2. Qlioblastoma hüceyrəsinde hədəfləmə: Aynı peptidin tümör hüceyrəsindeki integrinlere bağlanarak nanohissəcik alımını artırması beklenir.
3. EGFR’nin baskılanması: Taşınan cetuximabın EGFR’ye bağlanarak tümör hüceyrəsindeki büyüme sinyallerini azaltması hedeflenir.

Bu nedenle sistem yalnızca bir “dərman kabı” değildir. nanohissəcik yüzeyindeki peptit biyolojik hədəfləmə funksiyası görürken, çekirdekteki cetuximab ayrı bir moleküler hedefe yönelmektedir.

Bununla birlikdə tədqiqat, canlı beyinde bu üç basamağın art arda gerçekleştiğini göstermemiştir. qan-beyin baryeri və Qlioblastoma hüceyrə deneyleri ayrı in vitro sistemlerde yürütülmüştür.

nanohissəciyin temel bileşenleri

CPMA kopolimeri

daşıyıcının katyonik bileşeni, kitosan omurgasına metil metakrilat və akrilik asit zincirleri aşılanarak oluşturulmuştur. Bu kopolimer makalede CPMA kimi kısaltılmıştır.

Nicel proton NMR nəticələrına göre kopolimerin bileşimi:

• Kitosan ilə toplam PMMA və PAAc bölümü arasında 73:27 ağırlık nisbəti,
• PMMA ilə PAAc arasında 63:37 ağırlık nisbəti

göstermiştir.

Kitosan pozitif yük taşıyan amin grupları sağlar. PMMA hidrofobik özelliklere, PAAc ise iyonlaşabilir karboksilik asit gruplarına katkıda bulunur. Bu yapı CPMA’nın kendi içində öz-düzenlenebilmesini və aljinatla elektrostatik kompleks oluşturmasını sağlar.

Sodyum aljinat

Aljinat negatif yüklü bir polisakkarittir. Pozitif yüklü kitosan bölgeleriyle etkileşerek polielektrolit kompleksin oluşmasına katkı sağlar. cetuximab, nanohissəcik oluşturulmadan əvvəl aljinat fazına eklenmiş və polimerler birleşirken yapının içində kapsüllenmiştir.

STPP çapraz bağlayıcı

Sodyum tripolifosfat, kitosanın pozitif yüklü bölgelerini iyonik kimi çapraz bağlamak və oluşan nanohissəciklərin fiziksel kararlılığını artırmak amacıyla kullanılmıştır.

PEP hədəfləmə bileşeni

tədqiqatda PEP adı verilen hedefleyici yapı:

• cRGDfV siklik peptidini,
• Sekiz etilen glikol biriminden oluşan PEG8 ara zincirini,
• Kopolimere bağlanmayı sağlayan terminal tiyol grubunu

içermektedir.

PEG ara zinciri peptidin polimer yüzeyinden dışarı uzanmasını və integrinlere bağlanabilecek esnek bir konum kazanmasını amaçlar.

hədəfləmə peptidi polimere nasıl bağlandı?

Peptidin CPMA’ya bağlanması iki kimyasal basamakta gerçekleştirilmiştir.

1. CPMA üzerindeki kitosan amin gruplarına, EDC/NHS kimyası kullanılarak 6-maleimidoheksanoik asit bağlanmıştır.
2. Tiyol uçlu cRGDfV-PEG-SH yapısı, maleimid-tiyol Michael katılma reaksiyonuyla bu ara bağlayıcıya eklenmiştir.

Proton NMR analizinde maleimid sinyalinin azalması və peptitle uyumlu yeni sinyalin ortaya çıkması, bağlanmayı desteklemiştir.

Nicel nəticələr:

• CPMA üzerindeki MHA modifikasyonu: %3 ağırlık/ağırlık,
• Ellman testiyle tiyol tüketimi: %85 ± 2,
• Son kopolimerde PEP içeriği: %4,3 ağırlık/ağırlık.

mikroaxınlı üretim neden kullanıldı?

Geleneksel kap içi üretimde polimerlerin karşılaşma sürəti, karışımın her noktasında aynı olmayabilir. Bu durum farklı büyüklükte və yapıda nanohissəciklərin oluşmasına yol açabilir.

tədqiqatçılar iki sıvı akışını kontrollü biçimde bir araya getiren T-bağlantılı bir mikroaxınlı cihaz kullanmıştır. Sistemde:

• Bir girişten %0,1 ağırlık/hacim CPMA və ya CPMA-PEP çözeltisi,
• Diğer girişten %0,09 ağırlık/hacim aljinat və gerektiğinde cetuximab karışımı

verilmiştir.

İki akışın sürəti ayrı ayrı 0,3 mL/dakika kimi ayarlanmış və çözeltilerin pH dəyəri 6,0’a getirilmiştir. Bu pH, katyonik və anyonik polimerlerin yeterli mutlak yüzey yüküne sahip olduğu, fakat çözünürlüğünü koruduğu koşul kimi seçilmiştir.

Akışlar birleştiğinde hızlı və homojen elektrostatik kompleksleşme meydana gelmiş, ardından STPP eklenerek yapı çapraz bağlanmıştır.

ikiqat öz-özünə düzülmə ne anlama geliyor?

tədqiqatdaki “double self-assembly”, yani ikiqat öz-özünə düzülmə kavramı iki ayrı yapısal süreci anlatır:

1. Amfifilik CPMA kopolimerinin kendi içindeki hidrofobik və hidrofilik bölgeler səbəbilə nanoölçekte düzenlenmesi,
2. Pozitif yüklü CPMA ilə negatif yüklü aljinatın birbiriyle elektrostatik kompleks oluşturması.

Bu iki süreç aynı üretim akışında gerçekleşerek cetuximabı çevreleyen çekirdek-kabuk benzeri bir polimerik yapı oluşturmuştur.

cetuximab kapsullaşdırma səmərəliliyi

tədqiqatda kapsullaşdırma səmərəliliyi bu formülle hesaplanmıştır:

\[ \%EE = \frac{\text{Toplam eklenen ilaç} - \text{Serbest ve kapsüllenmemiş ilaç}} {\text{Toplam eklenen ilaç}} \times 100 \]

Değişkenlerin anlamı:

• %EE: Eklenen cetuximabın yüzde kaçının nanohissəcik içində tutulduğunu gösteren kapsullaşdırma səmərəliliyidir.
• Toplam eklenen dərman: Üretimin başlangıcında sisteme verilen cetuximab miktarıdır.
• Serbest və kapsüllenmemiş dərman: nanohissəciklər çöktürüldükten sonra sıvı üst fazda kalan cetuximab miktarıdır.

nəticə %99,0 ± 0,7 tapılmışdır. Bu dəyər, başlangıçta eklenen cetuximabın neredeyse tamamının nanohissəcik fraksiyonuyla əlaqəli olduğunu göstərir.

Bununla birlikdə metod antikoru birbaşa nanohissəciyin içində saymamış, üst sıvıda bulunmayan miktarı kapsüllenmiş qəbul etmiştir. SDS-PAGE analizi, nanohissəcik fraksiyonundaki antikor bantlarını göstererek bu dolaylı hesabı desteklemiştir.

dərman yükləmə nisbəti

dərman yükləmə nisbəti bu ilişkiyle hesaplanmıştır:

\[ \%DL = \frac{\text{Nanoparçacık içinde bulunan toplam ilaç miktarı}} {\text{Toplam nanoparçacık ağırlığı}} \times 100 \]

Burada:

• %DL: nanohissəcik kütlesinin yüzde kaçının cetuximabdan oluştuğunu gösterir.
• Toplam dərman miktarı: Kapsüllenmiş kimi hesaplanan cetuximab miktarıdır.
• Toplam nanohissəcik ağırlığı: Polimerler, çapraz bağlayıcı və dərman dâhil son daşıyıcı sistemin ağırlığıdır.

cetuximab yükleme nisbəti %16,2 ± 0,07 ağırlık/ağırlık tapılmışdır.

nanohissəciklərin büyüklüğü və yüzey özellikleri

PEC, hədəfləmə peptidi və cetuximab içermeyen temel polielektrolit kompleksidir. PEC-PEP, hədəfləmə peptidi eklenmiş boş daşıyıcıdır. PEC@CET, cetuximab yüklü fakat hədəfləmə peptidi bulunmayan sistemdir. PEC-PEP@CET ise hem PEP hədəfləmə ligandı hem de cetuximab içeren son formülasyondur.

cetuximabın eklenmesi hidrodinamik diametrı təxminən 265-270 nm’den 318-322 nm aralığına yükseltmiştir. PDI değerlerinin 0,20-0,27 aralığında kalması, büyüklük dağılımının tamamen tek tip olmasa da görece kontrollü olduğunu göstərir.

Bütün nanohissəciklərin yüzey yükü negatiftir. Bu durum, pozitif kitosan bölgelerinin aljinat və STPP ilə kısmen nötrleşmesi və dış bölgede anyonik polimer bileşenlerin bulunmasıyla ilişkilendirilmiştir.

DLS və elektron mikroskobu neden farklı büyüklük gösterdi?

Dinamik ışık saçılımı, nanohissəciyin sıvı içindeki hidratlanmış hidrodinamik diametrını ölçer. Polimer zincirlerinin çevresinde bulunan su tabakası da ölçüme dâhil olur.

Kriyojenik TEM görüntülerinde ise parçacığın daha birbaşa geometrik yapısı görülmüştür. PEC-PEP və PEC-PEP@CET sistemlerinde geometrik çap təxminən 150 nm’dir.

Bu nedenle 322 nm’lik DLS çapı ilə təxminən 150 nm’lik elektron mikroskobu çapı birbiriyle zorunlu kimi çelişmemektedir. Aradaki fərq yüksək derecede su alan polimerik kabuğun hidrodinamik ölçüme katkısıyla açıklanmıştır.

Çekirdek-kabuk yapısı

Kriyo-TEM görüntülerinde parçacıklar küresel görünmüş; daha yoğun bir iç çekirdek və daha aşağı yoğunluklu, dokulu dış bölge ayırt edilmiştir.

HAADF-STEM və element haritalaması:

• Karbon və azotun CPMA bileşenlerinden,
• Sodyumun aljinattan,
• Fosforun STPP çapraz bağlayıcıdan,
• Oksijenin her iki polimerden

geldiğini göstermiştir.

Fosfor və oksijen sinyalinin dış bölgede daha yoğun olması, aljinat və STPP açısından zenginleşmiş bir kabuk yapısıyla uyumlu tapılmışdır.

nanohissəcik kararlılığı

hədəfləndirilmiş cetuximab yüklü nanohissəciklər 4 °C’de 21 gün boyunca izlenmiş, hidrodinamik diametr və PDI bakımından aydın değişim görülmemiştir.

Bu nəticə kısa süreli fiziksel depolama kararlılığını destekler. Lakin uzun süreli raf ömrü, dondurup çözme, sterilizasyon, serum ortamı və ya klinik ürün koşulları qiymətləndirilməmişdir.

cetuximab salımı

nanohissəciklərdan cetuximab salımı 37 °C’de iki farklı ortamda incelenmiştir:

• qan dövranını taklit eden pH 7,4,
• daha asidik tümör və ya endozaomal ortamı kısmen taklit eden pH 6,5.

Kırk sekiz saat sonunda:

• pH 7,4’te təxminən %29 salım,
• pH 6,5’te təxminən %21 salım

ölçülmüştür.

Asidik ortamda salımın daha aşağı olması, bu sistemin asitle hızlanan bir daşıyıcı olmadığını göstərir. Makalede önerilen mekanizmaya göre pH azaldığında PAAc və aljinat bölgelerinin iyonlaşması azalmakta, negatif yükler arasındaki itme zayıflamakta və polimer matriksi daha az hidratlanmaktadır. Ağın etkin açıklığı küçüldüğü üçün böyük cetuximab molekülünün difüzyonu yavaşlamaktadır.

Higuchi modeli

Higuchi modeli salınan dərman miktarının zamanın kareköküyle ilişkisini ifade eder:

\[ f_t = K_H t^{1/2} \]

Burada:

• f_t: t zamanına kadar salınan cetuximab yüzdesidir.
• K_H: Higuchi salım sürət sabitidir.
• t: Zamandır.

tədqiqatda:

• pH 7,4 üçün K_H = 4,233 %·saat^-1/2 və R² = 0,98,
• pH 6,5 üçün K_H = 2,962 %·saat^-1/2 və R² = 0,80

tapılmışdır.

pH 7,4’teki daha yüksək sürət sabiti və daha yüksək R² dəyəri, fizyolojik pH’daki salımın Higuchi tipi difüzyon davranışına daha iyi uyduğunu göstərir.

Korsmeyer-Peppas modeli

Korsmeyer-Peppas ilişkisi bu şekilde verilmiştir:

\[ f_t = K_{KP} t^n \]

Burada:

• f_t: Belirli zamana kadar salınan dərman oranıdır.
• K_KP: daşıyıcı yapısına bağlı salım sabitidir.
• t: Zamandır.
• n: Salım mekanizmasını tanımlamaya yardımcı olan difüzyon üssüdür.

nəticələr:

pH 7,4’te n değerinin təxminən 0,5 olması Fick tipi difüzyonla uyumludur. pH 6,5’te n değerinin 0,293’e düşmesi, antikor hareketinin polimer matriksi içində daha fazla sınırlandığını düşündürmektedir.

qan-beyin baryeri modeli nasıl oluşturuldu?

tədqiqatçılar insan beyin mikrovasküler endotelinden türetilmiş hCMEC/D3 hüceyrə hattını kullanmıştır. hüceyrəler yarı geçirgen membranlı ekler üzerinde büyütülerek üst və alt sıvı bölmeleri birbirinden ayıran bir hüceyrə tabakası oluşturmuştur.

Deney koşulları arasında:

• Ek başına 60.000 hüceyrə,
• 3,0 µm gözenekli membran,
• baryer sıkılığını artırmak üçün deneyden 24 saat əvvəl 100 nM retinoik asit,
• Deney öncesinde 150-180 Ω·cm² TEER qəbul aralığı

bulunmaktadır.

TEER, hüceyrə tabakasının elektrik akımına karşı direncidir. hüceyrəlerin arasındaki sıkı bağlantılar güçlendikçe direnç yükselir. tədqiqatda hüceyrə tabakaları təxminən 160-170 Ω·cm² plato değerlerine ulaşmıştır.

görünən keçiricilik əmsalı

nanohissəciklərin hüceyrə tabakasını geçme sürəti bu formülle hesaplanmıştır:

\[ P_{app} = \frac{dc}{dt} \times \frac{1}{A \times C_0} \]

Burada:

• P_app: görünən keçiricilik əmsalıdır və cm/s birimiyle ifade edilmiştir.
• dc/dt: hüceyrə tabakasının diğer tarafına geçen madde miktarının zamana göre değişim hızıdır.
• A: Geçişin gerçekleştiği membran yüzey alanıdır.
• C₀: Verici bölmedeki başlanğıc nanohissəcik yoğunluğudur.

P_app dəyəri büyüdükçe deney sistemindeki geçiş hızının arttığı qəbul edilir. Lakin bu sayı canlı insandaki qan-beyin baryeri geçirgenliğini birbaşa vermez.

qan-beyin baryeri geçirgenlik nəticələrı

Hedefleyici peptit içeren sistemler, peptit içermeyen eşlerine göre təxminən %25-45 daha yüksək geçirgenlik göstermiştir.

cetuximab yüklenmesinin hədəfləmə peptidi bulunmadığında aydın bir taşıma avantajı sağlamaması mühümdir. Deneyde asıl geçirgenlik artışı antikor yükünden deyil, PEP-integrin etkileşiminden kaynaklanmıştır.

Taşıma deneyinden sonra TEER değerlerinde hafif azalma gözlenmiştir. Lakin aynı azalma işlem yapılan kontrol hüceyrəlerinde de ortaya çıkmış və nanohissəcik gruplarında ek bir baryer bozulması göstərilməmişdir. Bu bulgu nanohissəciklərin hüceyrə tabakasını yalnızca fiziksel kimi parçalayarak geçmediği yorumunu desteklemektedir.

hCMEC/D3 hüceyrə canlılığı

nanohissəciklərin baryer hüceyrəlerine zarar verip vermediği MTT metoduyle qiymətləndirilmişdir. hüceyrəler:

• %0,01,
• %0,02,
• %0,03 ağırlık/hacim

nanohissəcik yoğunluklarına 4 və ya 24 saat maruz bırakılmıştır.

Bütün formülasyonlarda hüceyrə metabolik etkinliği ISO 10993-5 standardında in vitro sitotoksisite üçün kullanılan %70 sınırının üzerinde qalmışdır.

PEP içeren bazı gruplarda 24 saatte metabolik etkinlikte hafif artış görülmüştür. müəlliflər bu sonucu hüceyrə çoğalması kimi yorumlamamış; RGD-integrin etkileşiminin hüceyrə yapışmasını və erken mitokondriyal etkinliği geçici kimi destekleyebileceğini belirtmiştir.

hüceyrə alımının sıcaklığa bağımlılığı

nanohissəciklərin hüceyrə daxilinə alınması 4 °C və 37 °C’de karşılaştırılmıştır.

4 °C’de hüceyrəsel enerjiye bağlı taşıma mekanizmaları yavaşladığı üçün bütün gruplarda alım son derece aşağı qalmışdır. 37 °C’de hüceyrə içi yeşil floresan sinyali aydın biçimde yükselmiştir.

Bu sıcaklık fərqi bu yorumu desteklemektedir:

• nanohissəciklər yalnızca hüceyrə yüzeyine yapışmamaktadır.
• hüceyrə zarından pasif biçimde süzülmemektedir.
• Enerji gerektiren endositoz mekanizmalarıyla içeri alınmaktadır.

Endotel hüceyrəlerindeki nicel alım nəticələrı

37 °C’de hedeflenmemiş PEC və PEC@CET formülasyonlarında FITC-pozitif hüceyrə nisbəti təxminən %3,0-6,4 aralığındadır.

PEP içeren PEC-PEP və PEC-PEP@CET sistemlerinde nisbət təxminən %8,4-11,6’ya yükselmiştir.

4 °C’de bütün gruplarda değerler %1’in altında qalmışdır.

Böylece PEP işlevselleştirmesi endotel hüceyrə alımını təxminən iki kat artırmıştır. Konfokal görüntülerde nanohissəcik sinyalinin çekirdek çevresinde yoğunlaşması da hüceyrə içi veziküler taşınmayla uyumlu tapılmışdır.

U87 Qlioblastoma hüceyrəlerinde alım

U87 hüceyrə hattı insan Qlioblastomasını temsil eden yaygın bir in vitro model kimi kullanılmıştır. hüceyrəler hədəfləndirilmiş nanohissəciklərla 4 °C və 37 °C’de inkübe edilmiştir.

4 °C’de hüceyrə içi FITC-pozitif nisbəti %3,93 və ya altında qalmışdır. 37 °C’de:

• PEC-PEP: %11,40 ± 1,10 FITC-pozitif hüceyrə,
• PEC-PEP@CET: %17,37 ± 0,78 FITC-pozitif hüceyrə

ölçülmüştür.

cetuximab yüklü hədəfləndirilmiş sistemin daha yüksək hüceyrə içi sinyali, integrin aracılı alıma ek kimi cetuximab-EGFR etkileşiminin nanohissəcik birikimine katkıda bulunabileceği şeklinde yorumlanmıştır.

Z-yığını konfokal görüntüleme, yeşil sinyalin yalnızca hüceyrə yüzeyinde deyil, hüceyrənin farklı derinliklerinde bulunduğunu göstermiştir.

U87 hüceyrə canlılığı

Qlioblastoma hüceyrəleri %0,01, %0,02 və %0,03 ağırlık/hacim nanohissəcik yoğunluklarına 4 və 24 saat maruz bırakılmıştır.

cetuximab yüklü formülasyonlarda dozaa bağlı canlılık azalması görülmüştür. En güclü azalma PEC-PEP@CET formülasyonunda ortaya çıkmıştır.

En yüksək konsantrasyonda və 24 saat sonunda U87 hüceyrə canlılığı %50’nin altına düşmüştür.

Bu nəticə cetuximabın kapsülleme sonrasında biyolojik etkisini tamamen kaybetmediğini düşündürmektedir. Bununla birlikdə:

• hüceyrə canlılığı testi tümör küçülmesini ölçmez.
• tədqiqatda canlı heyvan tümörü bulunmamaktadır.
• Serbest cetuximabla kapsamlı bir birbaşa etkinlik müqayisəsı sunulmamıştır.
• U87 hüceyrə hattı gerçek Qlioblastomadaki bütün hüceyrəsel çeşitliliği temsil etmez.

Qrafik özet ne anlatıyor?

tədqiqatın ilk sayfasındaki qrafik özet, geliştirme sürecini dört bağlantılı aşama hâlinde göstərir:

1. CPMA kopolimerine maleimid bağlayıcı və cRGDfV peptidinin eklenmesi,
2. CPMA-PEP ilə cetuximab içeren aljinatın T-bağlantılı mikroaxınlı çipte birleştirilmesi,
3. nanohissəciyin integrin aracılı endositoz və transsitozla qan-beyin baryeri hüceyrəsini geçmesi,
4. Qlioblastoma hüceyrəsinde integrin hədəfləməsi və cetuximab aracılı EGFR baskılanması.

Qrafik özet, tədqiqatın önerdiği bütün mekanizmayı tek bir şemada birleştirmektedir. Lakin bu mekanizmanın tamamı tek və bütünleşik bir canlı modelde göstərilməmişdir. baryer geçişi və tümör hüceyrəsi etkisi ayrı hüceyrə kültürü deneyleriyle qiymətləndirilmişdir.

Şəkil 1: Polimer sentez yolu

Şəkil 1 üç kimyasal aşamayı göstərir:

• Kitosan üzerine MMA və akrilik asit zincirlerinin aşılanması,
• CPMA’ya maleimid içeren MHA bağlanması,
• Tiyol uçlu cRGDfV-PEG yapısının maleimid grubuna eklenmesi.

Bu şema nanohissəciyin kendisini deyil, hedefleyici polimer bileşeninin nasıl oluşturulduğunu açıklamaktadır.

Şəkil 2: Fizikokimyasal karakterizasyon

Şəkil 2’nin farklı panelleri bu bilgileri vermektedir:

• DLS eğrileri: cetuximab yüklendiğinde parçacık büyüklüğü dağılımının daha böyük çapa kaydığını gösterir.
• zeta potensialı grafiği: Pozitif CPMA’dan negatif aljinata və orta derecede negatif son nanoparçacığa doğru yüzey yükü dönüşümünü gösterir.
• SDS-PAGE: cetuximabın üst sıvıda serbest kalmadığını, nanohissəcik fraksiyonunda bulunduğunu destekler.
• Kriyo-TEM: təxminən 150 nm’lik küresel, çekirdek-kabuk benzeri yapı gösterir.
• Salım grafiği: pH 7,4’te salımın pH 6,5’ten daha yüksək olduğunu gösterir.

Şəkil 3: qan-beyin baryeri hüceyrə deneyleri

Şəkil 3’te:

• Endotel hüceyrə canlılığı,
• 4 °C və 37 °C’de konfokal hüceyrə görüntüleri,
• Akış görüntüleme sitometrisiyle hüceyrə içi floresan,
• FITC-pozitif hüceyrə nisbəti,
• görünən keçiricilik əmsalı

birlikdə sunulmuştur.

Grafiklerin ortak mesajı, PEP hədəfləmə ligandının hüceyrə alımını və baryer modelindeki taşınmayı artırdığı, lakin hüceyrə tabakasını ek kimi bozmadığıdır.

Şəkil 4: Qlioblastoma hüceyrə deneyleri

Şəkil 4, U87 hüceyrəlerindeki alım və canlılık nəticələrını göstərir. 37 °C’de özellikle PEC-PEP@CET grubunda güclü hüceyrə içi yeşil floresan görülmüştür. Nicel analiz de aynı grubun en yüksək FITC-pozitif hüceyrə oranına sahip olduğunu göstermiştir.

Canlılık grafiğinde cetuximab içermeyen daşıyıcılarla cetuximab yüklü sistemler ayrışmaktadır. Antikor yüklü gruplar canlılığı daha fazla azaltmış, hədəfləndirilmiş cetuximab formülasyonu en güclü etkiyi göstermiştir.

Tədqiqatın güclü tərəfləri

• cetuximab gibi böyük bir monoklonal antikor %99’a yakın verimle kapsüllenmiştir.
• Polimer sentezi NMR, FTIR və Ellman testi gibi tamamlayıcı metodlerle doğrulanmıştır.
• nanohissəciklər kontrollü mikroaxınlı ortamda üretilmiştir.
• DLS, zeta potensialı, SDS-PAGE, kriyo-TEM və element haritalaması birlikdə kullanılmıştır.
• hədəfləmə peptidinin etkisi, peptit içermeyen eş formülasyonlarla karşılaştırılmıştır.
• qan-beyin baryeri hüceyrəlerinde hem canlılık hem alım hem de geçirgenlik qiymətləndirilmişdir.
• U87 hüceyrəlerinde konfokal mikroskopi, Z-yığını və görüntülemeli akış sitometrisi kullanılmıştır.
• 4 °C və 37 °C müqayisəsı enerjiye bağlı hüceyrə alımını desteklemiştir.
• cetuximabın kapsülleme sonrasında biyolojik etkisini koruduğuna yönelik hüceyrə canlılığı verisi sunulmuştur.
• Salım verileri iki farklı matematiksel modelle analiz edilmiştir.
• İstatistiklerde çoklu müqayisə düzeltmeleri tətbiq edilmişdir.

Tədqiqatın məhdudiyyətləri

• preprintdir: rəyçi qiymətləndirməsindən keçməmişdir.
• Yalnızca in vitro tədqiqatdır: Canlı heyvan və ya insan verisi yoxdur.
• Gerçek qan-beyin baryeri bütünüyle modellenmemiştir: hCMEC/D3 tek katman modeli perisit, astrosit, mikroglia, kan akımı və bağışıklık sistemini içermez.
• qan-beyin şiş baryeri ayrı kimi modellenmemiştir.
• baryer və tümör deneyleri birbirinden ayrıdır: nanohissəciyin aynı deneyde baryeri geçip ardından tümör hüceyrəsini öldürdüğü göstərilməmişdir.
• U87 tek hüceyrə hattıdır: Qlioblastomanın genetik heterojenliğini, kök hüceyrə benzeri hüceyrəlerini və xəstə farklılıklarını temsil etmez.
• Üç boyutlu tümör organoidi kullanılmamıştır.
• İn vivo biyodağılım bilinsultmektedir: nanohissəciyin karaciğer, dalak, böbrek və ya diğer dokularda birikip birikmeyeceği qiymətləndirilməmişdir.
• Dolaşım süresi və farmakokinetik ölçülmemiştir.
• Bağışıklık yanıtı qiymətləndirilməmişdir.
• Serbest cetuximabla kapsamlı birbaşa müqayisə sınırlıdır.
• EGFR sinyal yolundaki değişim birbaşa ölçülmemiştir: hüceyrə canlılığı azalması EGFR baskılanmasıyla uyumlu olsa da PI3K/Akt və ya ERK fosforilasyonu raporlanmamıştır.
• Tümör büyümesi və ya heyvan sağ qalmaı ölçülmemiştir.
• 48 saatte cetuximabın böyük bölümü salınmamıştır: Bunun uzun dönemde terapötik kullanılabilirliği bilinsultmektedir.
• Fiziksel kararlılık yalnızca 21 gün və 4 °C koşulunda qiymətləndirilmişdir.
• Deneylerin çoğu üç müstəqil tekrarla yürütülmüştür: İstatistiksel tahminler kiçik laboratuvar tekrarlarına dayanmaktadır.
• P_app artışı in vivo beyin geçişi sübutı değildir.
• nanohissəciklərin klinik ölçekte üretilebilirliği qiymətləndirilməmişdir.

Tədqiqat nə deyir?

• CPMA və aljinat temelli polielektrolit kompleks nanohissəciklər cetuximabı yüksək verimle kapsülleyebilmiştir.
• hədəfləndirilmiş cetuximab yüklü formülasyonun hidrodinamik diametrı təxminən 322 nm’dir.
• Kriyo-TEM görüntülerinde təxminən 150 nm geometrik büyüklükte çekirdek-kabuk benzeri yapılar görülmüştür.
• nanohissəciklər 4 °C’de 21 gün boyunca büyüklük bakımından kararlı qalmışdır.
• cetuximab salımı pH 7,4’te pH 6,5’e göre daha hızlıdır.
• PEP hədəfləmə peptidi endotel və U87 hüceyrəlerindeki nanohissəcik alımını artırmıştır.
• hüceyrə alımı enerjiye bağımlıdır.
• PEP işlevselleştirmesi yapay qan-beyin baryeri modelindeki P_app değerini artırmıştır.
• nanohissəciklər hCMEC/D3 hüceyrəlerinde test edilen koşullarda %70 canlılık sınırının üzerinde qalmışdır.
• hədəfləndirilmiş cetuximab yüklü sistem U87 hüceyrəlerinde en güclü canlılık azalmasını oluşturmuştur.

Tədqiqat nə demir?

• nanohissəciklərin insan qan-beyin baryerini geçtiği sübutlanmamıştır.
• Qlioblastoma xəstələrında tümöre ulaştığı göstərilməmişdir.
• cetuximabın klinik Qlioblastoma müalicəsinde etkili hâle geldiği sübutlanmamıştır.
• nanohissəciklərin sağ qalmaı uzattığı göstərilməmişdir.
• Mevcut cerrahi, radyoterapi və ya temozolomid müalicəsinin yerini alabileceği söylenemez.
• insanlarda güvenli doza müəyyən edilməmişdir.
• Uzun dönem toksisite və ya bağışıklık güvenliği göstərilməmişdir.
• Tüm Qlioblastomaların EGFR və ya α_vβ₃/α_vβ₅ hədəfləməsine yanıt vereceği sübutlanmamıştır.
• U87 hüceyrə canlılığındaki azalma klinik tümör yanıtı değildir.
• P_app dəyərləri birbaşa beyin toxumasındaki dərman yoğunluğunu göstermez.

Keçmiş, bu gün və gələcək baxımından əhəmiyyəti

Geçmişte monoklonal antikorlar çoğunlukla beyin dışındaki tümörlerde değerlendirilmiş, qan-beyin baryeri səbəbilə Qlioblastomada kullanım alanları sınırlı qalmışdır. Bu tədqiqat, böyük biyolojik moleküllerin sulu ortamda polielektrolit kompleksler içine yerleştirilebileceğini və baryer hüceyrəlerindeki reseptörler kullanılarak taşınmasının artırılabileceğini göstərir.

Bugün açısından tədqiqatın en mühüm katkısı, üç ayrı teknolojik bileşeni aynı platformda birleştirmesidir:

• mikroaxınlı və kontrollü nanohissəcik üretimi,
• İntegrin hedefli baryer və tümör hüceyrəsi alımı,
• EGFR hedefli monoklonal antikor taşınması.

Gelecekte araştırılması gereken basamaklar şunlardır:

• Astrosit və perisit içeren daha gelişmiş qan-beyin baryeri modelleri,
• qan-beyin baryeri ilə Qlioblastoma hüceyrəlerinin aynı sistemde bulunduğu ortak kültürler,
• Üç boyutlu Qlioblastoma organoidleri,
• Farklı EGFR və integrin düzeylerine sahip Qlioblastoma hüceyrəleri,
• Tümör taşıyan heyvanlarda beyin dağılımı,
• nanohissəciklərin kanda kalma süresi və orqan dağılımı,
• Bağışıklık və uzun dönem güvenlik qiymətləndirməleri,
• Serbest cetuximab və standart müalicəlerle birbaşa müqayisə,
• Temozolomid və radyoterapiyle kombinasyon deneyleri,
• Üretimin büyütülmesi və seri üretim tekrarlanabilirliği.

gündəlik həyat və klinik gelecek açısından anlamı

Qlioblastomada dərman geliştirme sorunu yalnızca güclü bir kanser ilacı bulmak değildir. İlacın beynin doğru bölgesine, yeterli yoğunlukta və sağlıklı dokuya en az zarar verecek biçimde ulaştırılması lazımdır.

Bu tədqiqat, “dərman etkili mi?” sorusuna ek kimi “dərman hedefe ulaşabiliyor mu?” sorusunun da müalicənin temel parçası olduğunu göstərir.

nanohissəcik yaklaşımı gelecekte başarılı olursa böyük antikorların və ya başka biyolojik dərmanların beyin tümörlerine taşınması üçün yeni seçenekler sağlayabilir. Lakin mevcut tədqiqat laboratuvar ölçeğindedir. Qlioblastoma xəstələrının müalicəsini bugün değiştiren bir nəticə və ya uygulanabilir klinik ürün sunmamaktadır.

Tədqiqatın Metodu və Nəticələri

tədqiqat tasarımının texniki özeti

Üretim koşulları

Polimer işlevselleştirme nəticələrı

cetuximab yükleme və fiziksel özellikler

cetuximab salım nəticələrı

hCMEC/D3 qan-beyin baryeri modeli nəticələrı

Görünür geçirgenlik nəticələrı

U87 Qlioblastoma hüceyrəsi nəticələrı

İstatistiksel metod

Deneylerin çoğu en az üç müstəqil tekrarla gerçekleştirilmiş və nəticələr ortalama ± standart sapma kimi bildirilmiştir.

Qrup müqayisəlarında deney tasarımına göre tek yönlü və ya iki yönlü ANOVA kullanılmıştır. Çoklu müqayisəlar:

• Benjamini-Krieger-Yekutieli yanlış keşif nisbəti düzeltmesi və ya
• Tukey çoklu müqayisə testi

ilə qiymətləndirilmişdir.

Düzeltilmiş p değerinin 0,05’in altında olması istatistiksel əhəmiyyətlilık sınırı kimi qəbul edilmiştir.

Mənbə və Metod Qeydi

Bu məzmun, Dhiraj Mishra, Marcelo Calderón, Ana Beloqui və Alejandro Sosnik tarafından hazırlanan “Cetuximab-Loaded Self-Assembled Polymeric Nanoparticles for the Integrin-Targeted Therapy of Glioblastoma” başlıklı tədqiqatya dayanmaktadır.

müəlliflər Technion – Israel Institute of Technology, University of the Basque Country UPV/EHU, POLYMAT və IKERBASQUE bünyesindeki tədqiqat birimleriyle əlaqəlidir.

tədqiqat insanlarda yürütülmüş klinik tədqiqat değildir. heyvan deneyi və ya canlı orqanizmda tümör müalicəsi de içermemektedir. hCMEC/D3 insan beyin mikrovasküler endotel hüceyrəleri ilə U87 insan Qlioblastoma hüceyrə hattında yürütülen preklinik, in vitro deneysel nanoteknoloji tədqiqatsıdır.

tədqiqat SSRN’de yayımlanmış bir preprintdir. Metinde açıkça “This preprint research paper has not been peer reviewed” ifadesi bulunmaktadır. Dolayısıyla tədqiqat rəyçi qiymətləndirməsindən keçməmişdir.

tədqiqat TheraTools, “Innovative Tools to Treat and Model Complex Cancer Environments” projesi kapsamında HORIZON-MSCA-2021-DN-01 programı tarafından desteklenmiştir. müəlliflər bilinen bir çıkar çatışması və ya tədqiqatyı etkileyebilecek kişisel ilişki bildirmemiştir.

nanohissəcik şemalarının hazırlanmasında BioRender, məlumat analizi və grafikler üçün GraphPad Prism, kimyasal yapı çizimleri üçün ChemDraw kullanıldığı belirtilmiştir.

cetuximab kapsullaşdırma səmərəliliyi, nanohissəcik üst sıvısında ölçülen serbest antikor miktarından dolaylı kimi hesaplanmış; SDS-PAGE analizi antikorun nanohissəcik fraksiyonunda bulunduğunu desteklemiştir.

qan-beyin baryeri geçişi, yarı geçirgen membran üzerinde büyütülen hCMEC/D3 hüceyrəlerinin kullanıldığı in vitro modelde hesaplanmıştır. Elde edilen P_app dəyərləri gerçek insan beynine geçen cetuximab miktarı kimi yorumlanmamalıdır.

U87 hüceyrə canlılığındaki azalma, in vitro antitümör etkinlik sinyali sunmaktadır. Bu nəticə klinik tümör küçülmesi, xəstəlık kontrolü, sağ qalma yararı və ya müalicə başarısı anlamına gelmemektedir.

tədqiqatda nanohissəciklərin canlı orqanizmdaki dolaşım süresi, beyin dağılımı, tümör birikimi, orqan toksisitesi, bağışıklık yanıtı və ya uzun dönem güvenliği qiymətləndirilməmişdir.

Bu məqalə yalnızca yüklenen PDF’de sunulan sentez metodu, formüller, fizikokimyasal ölçümler, elektron mikroskobu görüntüleri, hüceyrə deneyleri, geçirgenlik analizleri, sayısal nəticələr və müəlliflərın yorumları temel alınarak hazırlanmıştır. PDF’de bulunmayan klinik müalicə önerisi, insanlarda etkinlik iddiası, sağ qalma garantisi və ya Qlioblastoma üçün kullanıma hazır dərman bulunduğu yönünde bir nəticə eklenmemiştir.