Glioblastoma ni uvimbe wa ubongo ambao ni mgumu sana kutibu kwa sababu hukua kwa kasi, hujipenyeza kwa upana katika tishu za ubongo na huendeleza ukinzani dhidi ya matibabu yaliyopo. Hata baada ya upasuaji, radiotherapia na matibabu ya temozolomide, hatari ya uvimbe kujirudia hubaki kubwa. Mojawapo ya matatizo makuu yanayofanya ukuzaji wa dawa mpya uwe mgumu ni kizuizi cha damu na ubongo. Kizuizi hiki hulinda mfumo mkuu wa neva dhidi ya vitu vinavyozunguka kwenye damu. Pia huzuia sehemu kubwa ya molekuli ndogo na dawa kubwa za kibaolojia kama cetuximab kufika ubongoni kwa kiwango cha kutosha.

Cetuximab ni kingamwili monoklonali yenye ukubwa wa takribani 150 kDa inayofungamana na kipokezi cha epidermal growth factor, yaani EGFR. EGFR inaweza kuwa imeongezeka au kuonyeshwa kupita kiasi katika sehemu muhimu ya glioblastoma. Hata hivyo, ukubwa wa molekuli ya cetuximab na kutoweza kwake kuvuka kizuizi cha damu na ubongo hupunguza uwezo wa dawa kufikia viwango vyenye ufanisi katika glioblastoma.

Katika utafiti huu, watafiti walitengeneza nanopartikeli za polima zinazoweza kulinda na kubeba cetuximab, kuingiliana na seli za kizuizi cha damu na ubongo, na kuelekezwa kwenye seli za glioblastoma. Msingi wa nanopartikeli hizo ni ukompleksi wa kielektrostatiki kati ya kopolima ya CPMA, iliyoundwa kwa kupandikiza minyororo ya poli(methyl methacrylate-co-acrylic acid) juu ya chitosan, na sodium alginate.

Uso wa mfumo wa kubeba dawa ulifanywa uwe na utendaji kwa kutumia peptidi ya mviringo cRGDfV, ambayo inaweza kufungamana na integrini α_vβ₃ na α_vβ₅. Kwa kuwa integrini hizi zinaweza kuwepo kwenye endotheliamu ya kizuizi cha damu na ubongo na pia kwenye seli za glioblastoma, mfumo una mantiki ya ulengaji wa hatua mbili. Katika hatua ya kwanza, mwingiliano wa peptidi na integrini unalenga kusaidia nanopartikeli kuchukuliwa na seli za kizuizi na kusafirishwa kupitia ndani ya seli. Katika hatua ya pili, cetuximab iliyobebwa inalengwa kuzima ishara ya EGFR katika seli za glioblastoma.

Nanopartikeli zilitengenezwa katika mfumo wa mikrofluidiki wenye kiunganishi cha T, katika mazingira ya maji na chini ya mtiririko endelevu, kwa njia ya kujipanga mara mbili. Formulasheni ya mwisho iliyolengwa na iliyobeba cetuximab ilikuwa na kipenyo cha wastani cha haidrodinamiki cha 322 ± 24 nm kulingana na dynamic light scattering, polydispersity index ya 0,24 ± 0,02 na zeta potential ya -15 ± 2 mV. Katika hadubini ya elektroni ya kriyojeniki, kipenyo cha kijiometri kisichojumuisha tabaka la polima lililohidratiwa sana kilionekana kuwa takribani 150 nm.

Ufanisi wa kufungia cetuximab ndani ya chembe ulikuwa %99,0 ± 0,7, na uwiano wa mzigo wa dawa kulingana na uzito wa nanopartikeli ulikuwa %16,2 ± 0,07. Matokeo ya SDS-PAGE yalionyesha kuwa kingamwili ilikuwa ndani ya nanopartikeli na kwamba minyororo yake maalumu mizito na myepesi iliweza kugunduliwa.

Uachiliaji wa cetuximab kwa saa 48 ulikuwa takribani %29 katika pH ya kifizyolojia 7,4, na takribani %21 katika pH tindikali zaidi ya 6,5. Ingawa uachiliaji wa haraka zaidi ungeweza kutarajiwa katika mazingira tindikali, katika mfumo huu uachiliaji ulipungua. Watafiti walieleza hali hii kwa kupungua kwa ionization ya sehemu za polima za anioni katika pH tindikali, kupungua kwa uwezo wa mtandao wa polima kuchukua maji, na kupungua kwa matundu fanisi ambayo kingamwili inaweza kupita.

Katika seli za endotheliamu ndogo ya mishipa ya ubongo wa binadamu hCMEC/D3, zilizotumika kuiga kizuizi cha damu na ubongo, uhai wa seli katika makundi yote ya nanopartikeli uliendelea kuwa zaidi ya %70 baada ya saa 4 na 24. Nanopartikeli zilizokuwa na peptidi ya kulenga ziliingia ndani ya seli kwa kiwango kilichokaribia mara mbili ya formulasheni zisizolengwa. Kukuza seli katika 4 °C kulizuia kwa kiasi kikubwa uchukuaji wa nanopartikeli, ilhali katika 37 °C uchukuaji ulionekana wazi. Hili linaunga mkono kwamba kuingia kwa nanopartikeli kunategemea zaidi endocytosis inayohitaji nishati kuliko diffusion pasivu.

Kipengele cha upenyezaji kinachoonekana cha formulasheni iliyolengwa na iliyobeba cetuximab katika modeli bandia ya kizuizi cha damu na ubongo kilikuwa 8,40 ± 0,16 × 10^-7 cm/s. Katika mfumo uliobeba cetuximab lakini usio na peptidi ya kulenga, thamani hii ilikuwa 5,83 ± 0,26 × 10^-7 cm/s. Hivyo, utendaji wa peptidi uliongeza usafiri kupitia modeli ya kizuizi kwa takribani %25-45.

Katika seli za glioblastoma U87, uchukuaji wa nanopartikeli zilizolengwa na kubeba cetuximab ulifika kiwango cha %17,37 ± 0,78 ya seli FITC-chanya katika 37 °C. Katika nanopartikeli zilizolengwa zisizo na cetuximab, kiwango hiki kilikuwa %11,40 ± 1,10. Katika mkusanyiko mkubwa zaidi wa nanopartikeli na baada ya saa 24, uhai wa seli za U87 ulishuka chini ya %50.

Matokeo haya yanaonyesha kuwa nanopartikeli zinaweza kufungia cetuximab kwa ufanisi mkubwa, kwamba ulengaji wa integrini huongeza uchukuaji katika modeli ya kizuizi na seli za glioblastoma, na kwamba kingamwili iliyofungiwa ndani bado huhifadhi athari yake ya kibaolojia katika seli za U87. Hata hivyo, utafiti huu uko katika kiwango cha utamaduni wa seli pekee. Haijachunguzwa kama nanopartikeli huvuka kizuizi cha damu na ubongo katika kiumbe hai, kama hukusanyika kwenye uvimbe, jinsi zinavyosambaa katika viungo vyenye afya, usalama wake, au athari zake kwa ukuaji wa uvimbe.

Tatizo kuu linalofanya glioblastoma iwe ngumu kutibu

Glioblastoma ni mojawapo ya uvimbe msingi wa ubongo wenye uchokozi mkubwa zaidi kwa watu wazima. Kwa mujibu wa data zilizonukuliwa katika utangulizi wa utafiti, inaunda takribani nusu ya glioma mbaya na ina sifa ya kuongezeka kwa seli haraka, kupenya kwa upana katika tishu za ubongo na ukinzani dhidi ya matibabu.

Mbinu ya sasa ya kawaida hujumuisha kuondoa uvimbe kwa upasuaji kwa kiwango kikubwa kinachowezekana, radiotherapia na chemotherapy inayotegemea temozolomide. Hata hivyo, kwa mujibu wa fasihi ya kliniki iliyonukuliwa, median survival hubaki takribani miezi 12-15.

Kuna sababu nyingi zinazochangia ukinzani wa glioblastoma dhidi ya matibabu:

• Seli za uvimbe kusambaa ndani ya tishu za ubongo kama mikono midogo ya kimaikroskopia,
• Seli ndani ya uvimbe mmoja kutofautiana kijeni na kibaiolojia,
• Seli zinazofanana na glioma stem cells kuweza kuendelea kuishi baada ya matibabu,
• Uwezo wa uvimbe kubadilika kimetaboliki na kijeni,
• Kuamilishwa kwa ishara za ukuaji kama EGFR, PI3K/Akt/mTOR na Ras/Raf/MEK/ERK,
• Kizuizi cha damu na ubongo kuzuia dawa za mfumo mzima kufikia uvimbe.

Utafiti huu haulengi kutatua matatizo haya yote. Lengo lake ni kutengeneza jukwaa la nanoteknolojia kwa ajili ya tatizo la usafirishaji wa cetuximab, dawa kubwa ya kibaolojia inayokutana na kizuizi cha damu na ubongo.

Kwa nini kizuizi cha damu na ubongo ni kikwazo chenye nguvu?

Kizuizi cha damu na ubongo ni kichujio maalumu cha kibaolojia ambapo seli za endotheliamu zinazounda kapilari za ubongo huunganishwa kwa tight junctions. Seli hizi hudhibiti kwa ukali sana uhamaji wa vitu kutoka damu kwenda kwenye tishu za ubongo.

Kulingana na fasihi iliyonukuliwa katika utangulizi, kizuizi hiki huzuia:

• takribani %98 ya molekuli ndogo,
• karibu makromolekuli zote, pamoja na kingamwili monoklonali,

kubaki nje ya mfumo mkuu wa neva.

Mishipa katika kiini cha uvimbe wa glioblastoma inaweza kuwa na upenyezaji fulani. Hata hivyo, kingo za uvimbe zinazopenya kwenye ubongo jirani hulindwa na kizuizi cha damu na ubongo kilicho imara zaidi. Kwa sababu kurudi kwa uvimbe mara nyingi huanza katika maeneo yenye seli hizi zilizosalia, matibabu yanayofika tu kwenye kiini cha uvimbe yanaweza kuwa hayatoshi.

Kwa nini cetuximab ilichaguliwa?

Cetuximab ni kingamwili monoklonali ya darasa la chimeric IgG1 inayofungamana na sehemu ya nje ya EGFR. Ukubwa wake wa takribani ni 150 kDa.

Kuamilishwa kwa EGFR huunganishwa na mitandao miwili muhimu ya ishara ndani ya seli:

• Njia ya PI3K/Akt/mTOR: inahusiana na uhai wa seli, matumizi ya nishati, kubadilika kimetaboliki na kuepuka apoptosis.
• Njia ya Ras/Raf/MEK/ERK: inaweza kusaidia kuongezeka kwa seli, uhamaji, angiogenesis na ukuaji wa uvimbe.

Kulingana na maelezo ya usuli katika utafiti, EGFR inaweza kuongezeka au kuonyeshwa kupita kiasi katika takribani %40-45 ya glioblastoma. Aina mutant inayofanya kazi kila wakati, EGFRvIII, pia inaweza kusaidia ukuaji wa uvimbe.

Cetuximab inaweza kupunguza kuamshwa kwa kipokezi na ligand na kupunguza ishara za ukuaji za chini yake kwa kufungamana na EGFR. Hata hivyo, katika glioblastoma tatizo kuu si kukosekana kwa shabaha ya molekuli; ni kingamwili kutofikia shabaha hiyo.

Katika utafiti huu, cetuximab haijatengenezwa kama dawa mpya. Badala yake, imechunguzwa ikiwa kingamwili iliyopo inaweza kufungwa ndani ya kibebaji cha polima na kusafirishwa kwenda kwenye kizuizi cha ubongo na seli za glioblastoma.

Mantiki ya ulengaji wa hatua mbili

Peptidi ya cRGDfV inayofungwa kwenye uso wa nanopartikeli ni peptidi ya RGD ya mzunguko inayoweza kuwa na mwelekeo wa juu wa kufungamana na integrini α_vβ₃ na α_vβ₅.

Uwepo wa integrini hizi katika maeneo mawili tofauti ndio msingi wa mkakati wa ulengaji:

1. Ulengaji katika endotheliamu ya kizuizi cha damu na ubongo: mwingiliano wa peptidi na integrini unalenga kurahisisha nanopartikeli kuchukuliwa na seli ya endotheliamu na kusafirishwa upande mwingine kwa transcytosis.
2. Ulengaji katika seli ya glioblastoma: peptidi hiyo hiyo inatarajiwa kufungamana na integrini za seli ya uvimbe na kuongeza uchukuaji wa nanopartikeli.
3. Kuzimwa kwa EGFR: cetuximab inayobebwa inalengwa kufungamana na EGFR na kupunguza ishara za ukuaji katika seli ya uvimbe.

Kwa hiyo mfumo huu si “chombo cha dawa” tu. Peptidi kwenye uso wa nanopartikeli hufanya kazi ya ulengaji wa kibaolojia, huku cetuximab katika msingi ikielekezwa kwenye shabaha tofauti ya molekuli.

Hata hivyo, utafiti haujaonyesha kwamba hatua hizi tatu hutokea mfululizo ndani ya ubongo hai. Majaribio ya kizuizi cha damu na ubongo na majaribio ya seli za glioblastoma yalifanywa katika mifumo tofauti ya in vitro.

Vipengele vikuu vya nanopartikeli

Kopolima ya CPMA

Kipengele chenye chaji chanya cha kibebaji kiliundwa kwa kupandikiza minyororo ya methyl methacrylate na acrylic acid juu ya uti wa chitosan. Kopolima hii imefupishwa katika makala kama CPMA.

Kulingana na matokeo ya quantitative proton NMR, muundo wa kopolima ulikuwa:

• uwiano wa uzito wa chitosan dhidi ya jumla ya PMMA na PAAc wa 73:27,
• uwiano wa uzito wa PMMA dhidi ya PAAc wa 63:37.

Chitosan hutoa vikundi vya amini vyenye chaji chanya. PMMA huchangia tabia ya hydrophobic, na PAAc huchangia vikundi vya carboxylic acid vinavyoweza kuionika. Muundo huu huruhusu CPMA kujipanga na kuunda kompleksi ya kielektrostatiki na alginate.

Sodium alginate

Alginate ni polisakaridi yenye chaji hasi. Huchangia kuundwa kwa polyelectrolyte complex kwa kuingiliana na maeneo chanya ya chitosan. Cetuximab iliongezwa kwenye awamu ya alginate kabla nanopartikeli hazijaundwa na ikafungiwa ndani ya muundo wakati polima zilipoungana.

Kiunganishi cha STPP

Sodium tripolyphosphate ilitumika kuunganisha maeneo chanya ya chitosan kwa njia ya ioniki na kuongeza uthabiti wa kimwili wa nanopartikeli zilizoundwa.

Kipengele cha ulengaji PEP

Muundo wa ulengaji unaoitwa PEP katika utafiti huu una:

• peptidi ya mviringo cRGDfV,
• kijicheni cha kati cha PEG8 chenye vitengo nane vya ethylene glycol,
• kikundi cha mwisho cha thiol kinachowezesha kufungamana na kopolima.

Kijicheni cha PEG kinalenga kuifanya peptidi itoke nje ya uso wa polima na kupata nafasi inayonyumbulika ya kufungamana na integrini.

Peptidi ya kulenga iliunganishwaje na polima?

Kufungamanishwa kwa peptidi na CPMA kulifanyika katika hatua mbili za kikemia.

1. 6-maleimidohexanoic acid iliunganishwa kwenye vikundi vya amini vya chitosan katika CPMA kwa kutumia kemia ya EDC/NHS.
2. Muundo wa cRGDfV-PEG-SH wenye mwisho wa thiol uliunganishwa na kiunganishi hiki kupitia mmenyuko wa Michael addition kati ya maleimide na thiol.

Katika uchanganuzi wa proton NMR, kupungua kwa ishara ya maleimide na kuonekana kwa ishara mpya inayolingana na peptidi kuliunga mkono kufungamana.

Matokeo ya kiasi yalikuwa:

• mabadiliko ya MHA kwenye CPMA: %3 uzito/uzito,
• matumizi ya thiol kulingana na jaribio la Ellman: %85 ± 2,
• maudhui ya PEP katika kopolima ya mwisho: %4,3 uzito/uzito.

Kwa nini uzalishaji wa mikrofluidiki ulitumika?

Katika uzalishaji wa kawaida wa ndani ya chombo, kasi ya polima kukutana inaweza isiwe sawa katika kila sehemu ya mchanganyiko. Hii inaweza kusababisha nanopartikeli zenye ukubwa na muundo tofauti.

Watafiti walitumia kifaa cha mikrofluidiki chenye kiunganishi cha T kinachounganisha mikondo miwili ya kioevu kwa udhibiti. Katika mfumo huo:

• myeyusho wa %0,1 uzito/kiasi wa CPMA au CPMA-PEP uliingizwa kupitia mlango mmoja,
• mchanganyiko wa %0,09 uzito/kiasi wa alginate na, inapohitajika, cetuximab uliingizwa kupitia mlango mwingine.

Kasi ya kila mkondo iliwekwa 0,3 mL/dakika, na pH ya myeyusho iliwekwa 6,0. pH hii ilichaguliwa kama hali ambapo polima zenye chaji chanya na hasi zina chaji ya uso ya kutosha huku zikibaki mumunyifu.

Mikondo ilipoungana, ukompleksi wa kielektrostatiki wa haraka na ulio sare ulitokea; kisha STPP iliongezwa ili kuunganisha muundo.

Kujipanga mara mbili kunamaanisha nini?

Katika utafiti huu, “double self-assembly” inaeleza michakato miwili tofauti ya kimuundo:

1. CPMA ya amphiphilic kujipanga katika nanoscale kutokana na maeneo yake ya hydrophobic na hydrophilic,
2. CPMA yenye chaji chanya na alginate yenye chaji hasi kuunda kompleksi ya kielektrostatiki.

Michakato hii miwili ilitokea katika mtiririko mmoja wa uzalishaji na kuunda muundo wa polima unaofanana na core-shell unaozunguka cetuximab.

Ufanisi wa kufungia cetuximab

Katika utafiti, ufanisi wa kufungia dawa ndani ya chembe ulihesabiwa kwa fomula hii:

\[ \\%EE = \\frac{\\text{Toplam eklenen ilaç} - \\text{Serbest ve kapsüllenmemiş ilaç}} {\\text{Toplam eklenen ilaç}} \\times 100 \]

Maana ya vigeu:

• %EE: huonyesha ni asilimia ngapi ya cetuximab iliyoongezwa ilihifadhiwa ndani ya nanopartikeli.
• Toplam eklenen ilaç: ni kiasi cha cetuximab kilichowekwa mwanzoni mwa uzalishaji.
• Serbest ve kapsüllenmemiş ilaç: ni kiasi cha cetuximab kilichobaki katika supernatant baada ya nanopartikeli kutenganishwa.

Matokeo yalikuwa %99,0 ± 0,7. Thamani hii inaonyesha kuwa karibu cetuximab yote iliyoongezwa mwanzoni ilihusishwa na fraksheni ya nanopartikeli.

Hata hivyo, njia hii haikuhesabu kingamwili moja kwa moja ndani ya nanopartikeli; ilichukulia kiasi kisichopatikana kwenye supernatant kuwa kimefungiwa. Uchanganuzi wa SDS-PAGE uliunga mkono hesabu hii isiyo ya moja kwa moja kwa kuonyesha bendi za kingamwili katika fraksheni ya nanopartikeli.

Uwiano wa mzigo wa dawa

Uwiano wa mzigo wa dawa ulihesabiwa kwa uhusiano huu:

\[ \\%DL = \\frac{\\text{Nanoparçacık içinde bulunan toplam ilaç miktarı}} {\\text{Toplam nanoparçacık ağırlığı}} \\times 100 \]

Hapa:

• %DL: huonyesha ni asilimia ngapi ya wingi wa nanopartikeli ni cetuximab.
• Toplam ilaç miktarı: ni kiasi cha cetuximab kilichokadiriwa kuwa kimefungiwa.
• Toplam nanoparçacık ağırlığı: ni uzito wa mfumo wa mwisho, pamoja na polima, kiunganishi na dawa.

Uwiano wa mzigo wa cetuximab ulikuwa %16,2 ± 0,07 uzito/uzito.

Ukubwa na sifa za uso wa nanopartikeli

PEC ni polyelectrolyte complex ya msingi isiyo na peptidi ya kulenga wala cetuximab. PEC-PEP ni kibebaji tupu kilichoongezewa peptidi ya kulenga. PEC@CET ni mfumo uliobeba cetuximab lakini hauna peptidi ya kulenga. PEC-PEP@CET ndiyo formulasheni ya mwisho yenye ligand ya kulenga PEP na cetuximab.

Kuongezwa kwa cetuximab kuliongeza kipenyo cha haidrodinamiki kutoka takribani 265-270 nm hadi 318-322 nm. Thamani za PDI kubaki kati ya 0,20-0,27 zinaonyesha kwamba usambazaji wa ukubwa si sare kabisa lakini umedhibitiwa kwa kiasi.

Nanopartikeli zote zina chaji hasi ya uso. Hii imehusishwa na sehemu chanya za chitosan kutopolezwa kwa sehemu na alginate na STPP, pamoja na kuwepo kwa vipengele vya polima vya anioni katika maeneo ya nje.

Kwa nini DLS na hadubini ya elektroni zilionyesha ukubwa tofauti?

Dynamic light scattering hupima kipenyo cha haidrodinamiki cha nanopartikeli katika kioevu. Tabaka la maji lililozunguka minyororo ya polima pia hujumuishwa katika kipimo.

Katika picha za cryogenic TEM, muundo wa kijiometri wa chembe huonekana moja kwa moja zaidi. Katika mifumo ya PEC-PEP na PEC-PEP@CET, kipenyo cha kijiometri kilikuwa takribani 150 nm.

Kwa hiyo kipenyo cha 322 nm cha DLS na kipenyo cha takribani 150 nm cha hadubini ya elektroni si lazima vipingane. Tofauti imeelezwa kwa mchango wa ganda la polima linalochukua maji mengi katika kipimo cha haidrodinamiki.

Muundo wa core-shell

Katika picha za cryo-TEM, chembe zilionekana kuwa za mviringo; kiini cha ndani chenye msongamano zaidi na eneo la nje lenye msongamano mdogo na muundo wa maandishi vilitofautishwa.

HAADF-STEM na ramani ya elementi zilionyesha kuwa:

• kaboni na nitrojeni zilitokana na vipengele vya CPMA,
• sodiamu ilitokana na alginate,
• fosforasi ilitokana na kiunganishi cha STPP,
• oksijeni ilitokana na polima zote mbili.

Ishara ya fosforasi na oksijeni kuwa nyingi zaidi kwenye sehemu ya nje ilionekana kuendana na ganda lililoboreshwa kwa alginate na STPP.

Uthabiti wa nanopartikeli

Nanopartikeli zilizolengwa na kubeba cetuximab zilifuatiliwa katika 4 °C kwa siku 21, na hakukuonekana mabadiliko makubwa katika kipenyo cha haidrodinamiki au PDI.

Matokeo haya yanaunga mkono uthabiti wa muda mfupi wa uhifadhi wa kimwili. Hata hivyo, maisha ya rafu ya muda mrefu, kugandisha na kuyeyusha, sterilization, mazingira ya serum au masharti ya bidhaa ya kliniki hayakutathminiwa.

Uachiliaji wa cetuximab

Uachiliaji wa cetuximab kutoka nanopartikeli ulichunguzwa katika 37 °C katika mazingira mawili:

• pH 7,4 inayofanana na mzunguko wa damu,
• pH 6,5 yenye utindikali zaidi inayofanana kwa sehemu na mazingira ya uvimbe au endosome.

Baada ya saa 48:

• takribani %29 ya uachiliaji katika pH 7,4,
• takribani %21 ya uachiliaji katika pH 6,5

ilipimwa.

Uachiliaji mdogo zaidi katika mazingira tindikali unaonyesha kuwa mfumo huu si kibebaji kinachoharakishwa na asidi. Kwa mujibu wa utaratibu uliopendekezwa, pH inapopungua, ionization ya sehemu za PAAc na alginate hupungua, msukumo kati ya chaji hasi hudhoofika, na matriksi ya polima hujidratisha kidogo. Kwa kuwa ufunguzi fanisi wa mtandao hupungua, diffusion ya molekuli kubwa ya cetuximab hupungua.

Modeli ya Higuchi

Modeli ya Higuchi huonyesha uhusiano kati ya kiasi cha dawa kilichoachiliwa na mzizi wa mraba wa muda:

\[ f_t = K_H t^{1/2} \]

Hapa:

• f_t: ni asilimia ya cetuximab iliyoachiliwa hadi muda t.
• K_H: ni konstanti ya kasi ya uachiliaji ya Higuchi.
• t: ni muda.

Katika utafiti:

• kwa pH 7,4, K_H = 4,233 %·saa^-1/2 na R² = 0,98,
• kwa pH 6,5, K_H = 2,962 %·saa^-1/2 na R² = 0,80

zilipatikana.

Kasi kubwa zaidi na R² kubwa zaidi katika pH 7,4 zinaonyesha kuwa uachiliaji katika pH ya kifizyolojia uliendana vizuri zaidi na tabia ya diffusion ya aina ya Higuchi.

Modeli ya Korsmeyer-Peppas

Uhusiano wa Korsmeyer-Peppas ulipewa kama:

\[ f_t = K_{KP} t^n \]

Hapa:

• f_t: ni sehemu ya dawa iliyoachiliwa hadi muda fulani.
• K_KP: ni konstanti ya uachiliaji inayotegemea muundo wa kibebaji.
• t: ni muda.
• n: ni eksponenti ya diffusion inayosaidia kutambua utaratibu wa uachiliaji.

Matokeo:

Katika pH 7,4, n karibu 0,5 inaendana na diffusion ya aina ya Fick. Katika pH 6,5, kushuka kwa n hadi 0,293 kunaonyesha kuwa mwendo wa kingamwili ndani ya matriksi ya polima umewekewa vizuizi zaidi.

Modeli ya kizuizi cha damu na ubongo iliundwaje?

Watafiti walitumia mstari wa seli hCMEC/D3 uliotokana na endotheliamu ndogo ya mishipa ya ubongo wa binadamu. Seli zilikuzwa juu ya insert zenye membrane nusu-penyezaji ili kuunda tabaka la seli linalotenganisha sehemu za juu na chini za kioevu.

Masharti ya majaribio yalijumuisha:

• seli 60.000 kwa kila insert,
• membrane yenye matundu 3,0 µm,
• 100 nM retinoic acid saa 24 kabla ya jaribio ili kuongeza ukakamavu wa kizuizi,
• kiwango cha kukubalika cha TEER cha 150-180 Ω·cm² kabla ya jaribio.

TEER ni upinzani wa tabaka la seli dhidi ya mkondo wa umeme. Tight junctions zinapokuwa imara zaidi, upinzani huongezeka. Katika utafiti, tabaka za seli zilifikia viwango vya plateau vya takribani 160-170 Ω·cm².

Kipengele cha upenyezaji kinachoonekana

Kasi ya nanopartikeli kuvuka tabaka la seli ilihesabiwa kwa fomula hii:

\[ P_{app} = \\frac{dc}{dt} \\times \\frac{1}{A \\times C_0} \]

Hapa:

• P_app: ni kipengele cha upenyezaji kinachoonekana na huonyeshwa kwa cm/s.
• dc/dt: ni kasi ya mabadiliko ya kiasi cha dutu kilichopita upande mwingine wa tabaka la seli.
• A: ni eneo la membrane ambapo upitishaji hutokea.
• C₀: ni mkusanyiko wa awali wa nanopartikeli katika sehemu ya mtoaji.

Thamani kubwa ya P_app huashiria kasi kubwa zaidi ya upitishaji katika mfumo wa majaribio. Hata hivyo, namba hii haitoi moja kwa moja upenyezaji wa kizuizi cha damu na ubongo katika binadamu hai.

Matokeo ya upenyezaji wa kizuizi cha damu na ubongo

Mifumo yenye peptidi ya kulenga ilionyesha upenyezaji mkubwa kwa takribani %25-45 kuliko mifumo sawia isiyo na peptidi.

Ni muhimu kwamba kupakia cetuximab hakukutoa faida ya usafirishaji iliyo wazi wakati peptidi ya kulenga haikuwepo. Katika jaribio, ongezeko kuu la upenyezaji lilitokana na mwingiliano wa PEP-integrini, si mzigo wa kingamwili.

Baada ya jaribio la usafiri, TEER ilipungua kidogo. Lakini upungufu huo pia ulionekana katika seli za udhibiti zilizofanyiwa mchakato, na hakukuonekana uharibifu wa ziada wa kizuizi katika makundi ya nanopartikeli. Hili linaunga mkono tafsiri kwamba nanopartikeli hazikuvuka tabaka la seli kwa kulivunja kimwili tu.

Uhai wa seli za hCMEC/D3

MTT ilitumika kuchunguza kama nanopartikeli zinaumiza seli za kizuizi. Seli ziliwekwa katika mikusanyiko ya nanopartikeli ya:

• %0,01,
• %0,02,
• %0,03 uzito/kiasi

kwa saa 4 au 24.

Katika formulasheni zote, shughuli ya kimetaboliki ya seli iliendelea kuwa juu ya kikomo cha %70 kinachotumiwa katika ISO 10993-5 kwa cytotoxicity ya in vitro.

Katika baadhi ya makundi yenye PEP, kulionekana ongezeko dogo la shughuli ya kimetaboliki baada ya saa 24. Waandishi hawakulitafsiri hili kama kuongezeka kwa seli; walisema mwingiliano wa RGD-integrini unaweza kusaidia kwa muda kushikamana kwa seli na shughuli ya mapema ya mitochondria.

Utegemezi wa joto katika uchukuaji wa seli

Uchukuaji wa nanopartikeli ndani ya seli ulilinganishwa katika 4 °C na 37 °C.

Katika 4 °C, taratibu za usafirishaji zinazotegemea nishati hupungua, hivyo uchukuaji katika makundi yote ulikuwa mdogo sana. Katika 37 °C, ishara ya fluorescence ya kijani ndani ya seli iliongezeka wazi.

Tofauti hii ya joto inaunga mkono tafsiri kwamba:

• Nanopartikeli hazishikamani tu na uso wa seli.
• Hazipenyezi kwa njia pasivu kupitia membrane ya seli.
• Zinaingizwa ndani kwa njia za endocytosis zinazohitaji nishati.

Matokeo ya kiasi ya uchukuaji katika seli za endotheliamu

Katika 37 °C, formulasheni zisizolengwa PEC na PEC@CET zilikuwa na takribani %3,0-6,4 ya seli FITC-chanya.

Mifumo yenye PEP, yaani PEC-PEP na PEC-PEP@CET, ilifikia takribani %8,4-11,6.

Katika 4 °C, thamani katika makundi yote zilibaki chini ya %1.

Hivyo, utendaji wa PEP uliongeza uchukuaji wa seli za endotheliamu kwa takribani mara mbili. Picha za confocal zilizoonyesha ishara ya nanopartikeli kujilimbikiza karibu na kiini pia ziliendana na usafirishaji wa ndani ya seli kupitia vesicles.

Uchukuaji katika seli za glioblastoma U87

Mstari wa seli U87 ulitumika kama modeli ya kawaida ya in vitro ya glioblastoma ya binadamu. Seli zilikuzwa na nanopartikeli zilizolengwa katika 4 °C na 37 °C.

Katika 4 °C, kiwango cha FITC-chanya ndani ya seli kilikuwa %3,93 au chini. Katika 37 °C:

• PEC-PEP: %11,40 ± 1,10 ya seli FITC-chanya,
• PEC-PEP@CET: %17,37 ± 0,78 ya seli FITC-chanya

kilipimwa.

Ishara ya juu zaidi ya ndani ya seli katika mfumo uliolengwa na kubeba cetuximab ilitafsiriwa kuwa huenda mwingiliano wa cetuximab-EGFR pia unachangia mkusanyiko wa nanopartikeli, pamoja na uchukuaji unaoongozwa na integrini.

Upigaji picha wa z-stack confocal ulionyesha kuwa ishara ya kijani haikuwa kwenye uso wa seli tu, bali pia katika kina tofauti za seli.

Uhai wa seli za U87

Seli za glioblastoma ziliwekwa katika mikusanyiko ya %0,01, %0,02 na %0,03 uzito/kiasi ya nanopartikeli kwa saa 4 na 24.

Katika formulasheni zilizobeba cetuximab, kulionekana kupungua kwa uhai wa seli kulikotegemea dozi. Upungufu mkubwa zaidi ulionekana katika formulasheni ya PEC-PEP@CET.

Katika mkusanyiko wa juu zaidi na baada ya saa 24, uhai wa seli za U87 ulishuka chini ya %50.

Matokeo haya yanaonyesha kuwa cetuximab haikupoteza kikamilifu athari yake ya kibaolojia baada ya kufungiwa ndani. Hata hivyo:

• jaribio la uhai wa seli halipimi kupungua kwa uvimbe,
• hakuna uvimbe wa mnyama hai katika utafiti,
• hakuna ulinganisho mpana wa moja kwa moja na cetuximab huru,
• mstari wa U87 hauwakilishi utofauti wote wa seli katika glioblastoma halisi.

Muhtasari wa picha unaeleza nini?

Muhtasari wa picha kwenye ukurasa wa kwanza unaonyesha mchakato katika hatua nne zilizounganishwa:

1. Kuongeza kiunganishi cha maleimide na peptidi cRGDfV kwenye kopolima ya CPMA,
2. Kuunganisha CPMA-PEP na alginate iliyo na cetuximab kwenye chipu ya mikrofluidiki ya kiunganishi cha T,
3. Nanopartikeli kuvuka seli ya kizuizi cha damu na ubongo kwa endocytosis na transcytosis zinazopatanishwa na integrini,
4. Ulengaji wa integrini na kuzimwa kwa EGFR kupitia cetuximab katika seli ya glioblastoma.

Muhtasari huu unaunganisha utaratibu wote uliopendekezwa na utafiti katika mchoro mmoja. Hata hivyo, utaratibu mzima haukuonyeshwa katika modeli moja jumuishi ya kiumbe hai. Upitishaji wa kizuizi na athari kwenye seli za uvimbe vilitathminiwa kwa majaribio tofauti ya utamaduni wa seli.

Kielelezo 1: Njia ya usanisi wa polima

Kielelezo 1 kinaonyesha hatua tatu za kikemia:

• kupandikiza minyororo ya MMA na acrylic acid juu ya chitosan,
• kuunganisha MHA yenye maleimide na CPMA,
• kuongeza muundo wa cRGDfV-PEG wenye thiol kwenye kikundi cha maleimide.

Mchoro huu hauelezi nanopartikeli yenyewe, bali jinsi kipengele cha polima cha kulenga kilivyoundwa.

Kielelezo 2: Uchambuzi wa kifizikia na kikemia

Paneli tofauti za Kielelezo 2 zinatoa taarifa hizi:

• Miviringo ya DLS: zinaonyesha kuwa wakati cetuximab inapopakiwa, usambazaji wa ukubwa husogea kwenda kipenyo kikubwa zaidi.
• Grafu ya zeta potential: inaonyesha mabadiliko ya chaji ya uso kutoka CPMA chanya kwenda alginate hasi na nanopartikeli ya mwisho yenye hasi ya wastani.
• SDS-PAGE: inaunga mkono kwamba cetuximab haikubaki huru kwenye supernatant bali ilikuwa kwenye fraksheni ya nanopartikeli.
• Cryo-TEM: inaonyesha muundo wa mviringo wa takribani 150 nm unaofanana na core-shell.
• Grafu ya uachiliaji: inaonyesha kuwa uachiliaji katika pH 7,4 ni mkubwa kuliko katika pH 6,5.

Kielelezo 3: Majaribio ya seli za kizuizi cha damu na ubongo

Kielelezo 3 kinaonyesha kwa pamoja:

• uhai wa seli za endotheliamu,
• picha za confocal za seli katika 4 °C na 37 °C,
• fluorescence ya ndani ya seli kwa imaging flow cytometry,
• kiwango cha seli FITC-chanya,
• kipengele cha upenyezaji kinachoonekana.

Ujumbe wa pamoja wa grafu ni kwamba ligand ya kulenga PEP huongeza uchukuaji wa seli na usafiri katika modeli ya kizuizi, lakini haivunji tabaka la seli kwa ziada.

Kielelezo 4: Majaribio ya seli za glioblastoma

Kielelezo 4 kinaonyesha matokeo ya uchukuaji na uhai katika seli za U87. Katika 37 °C, ishara kali ya kijani ndani ya seli ilionekana hasa katika kundi la PEC-PEP@CET. Uchambuzi wa kiasi pia ulionyesha kuwa kundi hilo lilikuwa na kiwango cha juu zaidi cha seli FITC-chanya.

Katika grafu ya uhai, vibebaji visivyo na cetuximab vilitofautiana na mifumo iliyobeba cetuximab. Makundi yaliyobeba kingamwili yalipunguza uhai zaidi, na formulasheni iliyolengwa ya cetuximab ilionyesha athari kubwa zaidi.

Uimara wa utafiti

• Cetuximab, kingamwili monoklonali kubwa, ilifungiwa kwa ufanisi unaokaribia %99.
• Usanisi wa polima ulithibitishwa kwa njia zinazokamilishana kama NMR, FTIR na jaribio la Ellman.
• Nanopartikeli zilitengenezwa katika mazingira ya mikrofluidiki yaliyodhibitiwa.
• DLS, zeta potential, SDS-PAGE, cryo-TEM na ramani ya elementi zilitumika kwa pamoja.
• Athari ya peptidi ya kulenga ililinganishwa na formulasheni sawia zisizo na peptidi.
• Katika seli za kizuizi cha damu na ubongo, uhai, uchukuaji na upenyezaji vilitathminiwa.
• Katika seli za U87, confocal microscopy, z-stack na imaging flow cytometry zilitumika.
• Ulinganisho wa 4 °C na 37 °C uliunga mkono uchukuaji wa seli unaotegemea nishati.
• Data ya uhai wa seli iliashiria kwamba cetuximab huhifadhi athari yake ya kibaolojia baada ya kufungiwa ndani.
• Data ya uachiliaji ilichambuliwa kwa modeli mbili za hisabati.
• Marekebisho ya kulinganisha mara nyingi yalitumika katika takwimu.

Mapungufu ya utafiti

• Ni preprint: haujapitia tathmini ya rika.
• Ni utafiti wa in vitro pekee: hakuna data ya mnyama hai au binadamu.
• Kizuizi halisi cha damu na ubongo hakijaigwa kikamilifu: modeli ya tabaka moja ya hCMEC/D3 haina pericytes, astrocytes, microglia, mtiririko wa damu au mfumo wa kinga.
• Kizuizi cha damu na ubongo cha uvimbe hakijaigwa kando.
• Majaribio ya kizuizi na uvimbe yametenganishwa: haikuonyeshwa katika jaribio moja kwamba nanopartikeli huvuka kizuizi na kisha kuua seli za uvimbe.
• U87 ni mstari mmoja wa seli: hauwakilishi heterogeneity ya kijeni ya glioblastoma, seli zinazofanana na stem cells au tofauti za wagonjwa.
• Organoidi ya uvimbe ya pande tatu haikutumika.
• Biodistribution ya in vivo haijulikani: haikutathminiwa kama nanopartikeli hukusanyika kwenye ini, wengu, figo au tishu nyingine.
• Muda wa mzunguko na pharmacokinetics havikupimwa.
• Mwitikio wa kinga haukutathminiwa.
• Ulinganisho mpana wa moja kwa moja na cetuximab huru ni mdogo.
• Mabadiliko ya njia ya ishara ya EGFR hayakupimwa moja kwa moja: kupungua kwa uhai wa seli kunaweza kuendana na kuzimwa kwa EGFR, lakini phosphorylation ya PI3K/Akt au ERK haikuripotiwa.
• Ukuaji wa uvimbe au survival ya mnyama haukupimwa.
• Sehemu kubwa ya cetuximab haikuachiliwa ndani ya saa 48: matumizi yake ya muda mrefu ya tiba hayajulikani.
• Uthabiti wa kimwili ulitathminiwa kwa siku 21 tu na katika 4 °C.
• Majaribio mengi yalifanywa kwa marudio huru matatu: makadirio ya takwimu yanategemea marudio madogo ya maabara.
• Ongezeko la P_app si ushahidi wa kuvuka ubongo in vivo.
• Uzalishaji wa nanopartikeli katika kiwango cha kliniki haujatathminiwa.

Utafiti unasema nini?

• Nanopartikeli za polyelectrolyte complex zinazotegemea CPMA na alginate ziliweza kufungia cetuximab kwa ufanisi mkubwa.
• Kipenyo cha haidrodinamiki cha formulasheni iliyolengwa na kubeba cetuximab ni takribani 322 nm.
• Picha za cryo-TEM zilionyesha miundo inayofanana na core-shell yenye ukubwa wa kijiometri wa takribani 150 nm.
• Nanopartikeli zilibaki thabiti kwa ukubwa katika 4 °C kwa siku 21.
• Uachiliaji wa cetuximab ni wa haraka zaidi katika pH 7,4 kuliko pH 6,5.
• Peptidi ya kulenga PEP iliongeza uchukuaji wa nanopartikeli katika seli za endotheliamu na U87.
• Uchukuaji wa seli unategemea nishati.
• Utendaji wa PEP uliongeza thamani ya P_app katika modeli bandia ya kizuizi cha damu na ubongo.
• Nanopartikeli zilibaki juu ya kikomo cha uhai wa %70 katika seli za hCMEC/D3 chini ya masharti yaliyopimwa.
• Mfumo uliolengwa na kubeba cetuximab ulisababisha upungufu mkubwa zaidi wa uhai wa seli za U87.

Utafiti haussemi nini?

• Haijathibitishwa kuwa nanopartikeli huvuka kizuizi cha damu na ubongo cha binadamu.
• Haijaonyeshwa kuwa hufika kwenye uvimbe kwa wagonjwa wa glioblastoma.
• Haijathibitishwa kuwa cetuximab imekuwa tiba yenye ufanisi kliniki kwa glioblastoma.
• Haijaonyeshwa kuwa nanopartikeli huongeza muda wa kuishi.
• Haiwezi kusemwa kuwa zinaweza kuchukua nafasi ya upasuaji, radiotherapia au temozolomide.
• Dozi salama kwa binadamu haijabainishwa.
• Toxicity ya muda mrefu au usalama wa kinga haujaonyeshwa.
• Haijathibitishwa kuwa glioblastoma zote zitajibu ulengaji wa EGFR au α_vβ₃/α_vβ₅.
• Kupungua kwa uhai wa seli za U87 si mwitikio wa uvimbe wa kliniki.
• Thamani za P_app hazionyeshi moja kwa moja mkusanyiko wa dawa katika tishu za ubongo.

Umuhimu wake kwa zamani, sasa na baadaye

Hapo awali, kingamwili monoklonali zilitathminiwa zaidi katika uvimbe ulio nje ya ubongo, na matumizi yake katika glioblastoma yalibaki machache kutokana na kizuizi cha damu na ubongo. Utafiti huu unaonyesha kuwa molekuli kubwa za kibaolojia zinaweza kuwekwa ndani ya polyelectrolyte complexes katika mazingira ya maji na usafiri wake unaweza kuongezwa kwa kutumia vipokezi vya seli za kizuizi.

Kwa sasa, mchango muhimu zaidi wa utafiti huu ni kuunganisha vipengele vitatu vya kiteknolojia kwenye jukwaa moja:

• uzalishaji wa mikrofluidiki na uliodhibitiwa wa nanopartikeli,
• uchukuaji wa seli za kizuizi na uvimbe unaolengwa kupitia integrini,
• usafirishaji wa kingamwili monoklonali inayolenga EGFR.

Hatua zinazohitaji kuchunguzwa baadaye ni:

• modeli za kizuizi cha damu na ubongo zilizoendelea zaidi zenye astrocytes na pericytes,
• co-cultures zenye kizuizi cha damu na ubongo pamoja na seli za glioblastoma katika mfumo mmoja,
• organoidi za glioblastoma za pande tatu,
• seli za glioblastoma zenye viwango tofauti vya EGFR na integrini,
• usambazaji wa ubongo kwa wanyama wenye uvimbe,
• muda wa kukaa kwa nanopartikeli katika damu na usambazaji wake kwenye viungo,
• tathmini za kinga na usalama wa muda mrefu,
• ulinganisho wa moja kwa moja na cetuximab huru na matibabu ya kawaida,
• majaribio ya mchanganyiko na temozolomide na radiotherapia,
• kuongeza uzalishaji na kurudiwa kwa uzalishaji wa viwandani.

Maana yake kwa maisha ya kila siku na mustakabali wa kliniki

Tatizo la maendeleo ya dawa katika glioblastoma si tu kupata dawa kali ya saratani. Dawa lazima ifike katika sehemu sahihi ya ubongo, kwa mkusanyiko wa kutosha na kwa kuleta madhara kidogo iwezekanavyo kwa tishu zenye afya.

Utafiti huu unaonyesha kuwa pamoja na swali “dawa ina athari?” swali “dawa inafika kwenye shabaha?” pia ni sehemu ya msingi ya tiba.

Ikiwa mbinu ya nanopartikeli itathibitishwa kwa mafanikio baadaye, inaweza kutoa chaguo mpya za kubeba kingamwili kubwa au dawa nyingine za kibaolojia kwenda kwenye uvimbe wa ubongo. Hata hivyo, utafiti uliopo ni wa kiwango cha maabara. Hautoi matokeo yanayobadilisha matibabu ya wagonjwa wa glioblastoma leo au bidhaa ya kliniki inayoweza kutumika.

Mbinu na Matokeo ya Utafiti

Muhtasari wa kiufundi wa muundo wa utafiti

Masharti ya uzalishaji

Matokeo ya kufanya polima iwe na utendaji

Upakiaji wa cetuximab na sifa za kimwili

Matokeo ya uachiliaji wa cetuximab

Matokeo ya modeli ya hCMEC/D3 ya kizuizi cha damu na ubongo

Matokeo ya upenyezaji unaoonekana

Matokeo ya seli za glioblastoma U87

Mbinu ya takwimu

Majaribio mengi yalifanywa kwa angalau marudio huru matatu, na matokeo yaliripotiwa kama wastani ± mkengeuko sanifu.

Katika ulinganisho wa makundi, one-way au two-way ANOVA ilitumika kulingana na muundo wa jaribio. Ulinganisho mwingi ulitathminiwa kwa:

• marekebisho ya Benjamini-Krieger-Yekutieli false discovery rate au
• jaribio la Tukey multiple comparison

.

p iliyorekebishwa iliyo chini ya 0,05 ilikubaliwa kama mpaka wa umuhimu wa kitakwimu.

Maelezo ya Chanzo na Mbinu

Maudhui haya yanatokana na utafiti wa Dhiraj Mishra, Marcelo Calderón, Ana Beloqui na Alejandro Sosnik wenye kichwa “Cetuximab-Loaded Self-Assembled Polymeric Nanoparticles for the Integrin-Targeted Therapy of Glioblastoma”.

Waandishi wanahusishwa na vitengo vya utafiti vya Technion – Israel Institute of Technology, University of the Basque Country UPV/EHU, POLYMAT na IKERBASQUE.

Utafiti huu si jaribio la kliniki lililofanywa kwa binadamu. Hauna jaribio la wanyama wala tiba ya uvimbe katika kiumbe hai. Ni utafiti wa preclinical, in vitro na wa majaribio ya nanoteknolojia uliofanywa katika seli za endotheliamu ndogo ya mishipa ya ubongo wa binadamu hCMEC/D3 na mstari wa seli za glioblastoma ya binadamu U87.

Utafiti umechapishwa kama preprint kwenye SSRN. Katika maandishi kuna kauli wazi: “This preprint research paper has not been peer reviewed”. Kwa hiyo, utafiti haujapitia tathmini ya rika.

Utafiti uliungwa mkono na mradi wa TheraTools, “Innovative Tools to Treat and Model Complex Cancer Environments”, kupitia programu ya HORIZON-MSCA-2021-DN-01. Waandishi hawakuripoti mgongano unaojulikana wa maslahi au uhusiano binafsi unaoweza kuathiri kazi.

Imeelezwa kuwa michoro ya nanopartikeli iliandaliwa kwa BioRender, uchambuzi wa data na grafu kwa GraphPad Prism, na michoro ya miundo ya kemikali kwa ChemDraw.

Ufanisi wa kufungia cetuximab ulihesabiwa kwa njia isiyo ya moja kwa moja kutoka kiasi cha kingamwili huru kilichopimwa kwenye supernatant ya nanopartikeli; uchambuzi wa SDS-PAGE uliunga mkono kuwa kingamwili iko katika fraksheni ya nanopartikeli.

Upitishaji wa kizuizi cha damu na ubongo ulihesabiwa katika modeli ya in vitro iliyotumia seli za hCMEC/D3 zilizokuzwa juu ya membrane nusu-penyezaji. Thamani za P_app hazipaswi kufasiriwa kama kiasi halisi cha cetuximab kinachovuka kwenda ubongo wa binadamu.

Kupungua kwa uhai wa seli za U87 hutoa ishara ya athari ya antitumor ya in vitro. Matokeo haya hayamaanishi kupungua kwa uvimbe kliniki, udhibiti wa ugonjwa, faida ya survival au mafanikio ya tiba.

Utafiti haukutathmini muda wa mzunguko wa nanopartikeli katika kiumbe hai, usambazaji wake kwenye ubongo, mkusanyiko wake kwenye uvimbe, sumu kwa viungo, mwitikio wa kinga au usalama wa muda mrefu.

Makala hii imeandaliwa tu kwa msingi wa mbinu ya usanisi, fomula, vipimo vya kifizikia na kikemia, picha za hadubini ya elektroni, majaribio ya seli, uchambuzi wa upenyezaji, matokeo ya namba na tafsiri za waandishi zilizowasilishwa katika PDF iliyopakiwa. Haijaongezwa madai yasiyokuwamo kwenye PDF kuhusu pendekezo la tiba ya kliniki, ufanisi kwa binadamu, dhamana ya survival au kuwepo kwa dawa iliyo tayari kutumika kwa glioblastoma.