HT-LM1004, kimçidən təcrid edilmiş Lactiplantibacillus plantarum LM1004 ştamından istehsal olunan, fermentasiyadan sonra istiliklə inaktivləşdirilib qurudulmuş və canlı bakteriya ehtiva etməməsi nəzərdə tutulan mikrob preparatıdır. Tədqiqat HT-LM1004-ün immunitetə təsirini 8 həftəlik randomizə edilmiş, ikiqat kor, plasebo nəzarətli insan sınağı ilə; bağırsaq mikrobiomuna mümkün təsir mexanizmlərini isə ayrıca Simulated Human Intestinal Microbiome Ecosystem (SHIME®) sistemi ilə araşdırmışdır. Klinik sınaqda 120 nəfər 1:1 nisbətində randomizə edilmiş və birincili sonlanım olan təbii öldürücü hüceyrə, yəni natural killer (NK) hüceyrə aktivliyi, HT-LM1004 qrupunda plasebo ilə müqayisədə kovariatla düzəldilmiş analizlərdə əhəmiyyətli dərəcədə daha çox artmışdır. Bununla yanaşı, SHIME təcrübələri aşağı bolluqlu bəzi mikrob taksonlarının zənginləşdiyini, kolon bölgəsinə görə dəyişən mikrob müxtəlifliyi, öd turşusu və qısa zəncirli yağ turşusu dəyişikliklərinin yarandığını göstərmişdir.

İnsan sınağındakı ən güclü dəlil NK hüceyrə sitotoksikliyidir. ITT analizində HT-LM1004 ilə plasebo arasındakı düzəldilmiş başlanğıc-sonrası dəyişmə fərqi E:T 6,25:1 üçün 4,1883 (p=0,0136), 12,5:1 üçün 5,0487 (p=0,0139), 25:1 üçün 4,0441 (p=0,0465) və 50:1 üçün 4,1829 (p=0,0319) olaraq bildirilmişdir. PP analizində də dörd nisbətin hamısında əhəmiyyətli fərq görülmüşdür. Beləliklə, birincili sonlanımın müxtəlif NK hüceyrəsi/hədəf hüceyrə nisbətlərində və iki analiz populyasiyasında eyni istiqamətdə nəticə verdiyi görünür.

Lakin tədqiqat “HT-LM1004 infeksiyanın və ya xərçəngin qarşısını alır” nəticəsini birbaşa göstərmir. Klinik sınaq infeksiya tezliyini, xərçəng insidensini və ya uzunmüddətli xəstəlik riskini birincili klinik sonlanım kimi ölçməmişdir. Ölçülən əsas nəticə laboratoriyada qiymətləndirilən NK hüceyrə sitotoksikliyidir. NK hüceyrələrinin antiviral və şiş nəzarətindəki bioloji rolu səbəbilə müəlliflər potensial qoruyucu məna müzakirə edirlər; lakin bu bioloji məna ilə real xəstəliyin qarşısının alınması nəticəsi bir-birindən ayrılmalıdır.

SHIME hissəsi də klinik iştirakçıların öz bağırsaq mikrobiomunu izləyən insan mexanizm tədqiqatı deyil. Simulyator ayrıca sağlam nəcis donorlarından yaradılmış mikrob icmalarını nəzarət olunan in vitro kolon bölmələrində işlətmişdir. Buna görə SHIME-də görülən aşağı bolluqlu bakteriyalar, öd turşuları və SCFA dəyişikliklərinin klinik iştirakçılarda müşahidə olunan NK artımına birbaşa səbəb olduğu bu tədqiqat tərəfindən sübut edilməmişdir. Müəlliflər də mikrobiomun yenidən qurulması, metabolit dəyişiklikləri və NK aktivliyi arasındakı əlaqəni korrelyativ və mexanistik baxımdan mümkün əlaqə kimi qiymətləndirir və birbaşa səbəb-nəticə təsdiqinə ehtiyac olduğunu bildirirlər.

Təhlükəsizlik baxımından 8 həftəlik dövrdə müalicə qrupunda bildirilən yüngül tənəffüs sistemi şikayətləri %8,47 (5 nəfər), nəzarət qrupunda %6,67 (4 nəfər) olmuşdur; orta və ya ağır arzuolunmaz hadisə bildirilməmişdir. Mənbə bu hadisələrin keçici olduğunu və tədqiqat məhsulu ilə əlaqəli hesab edilmədiyini bildirir. Bununla belə, bu tapıntı yalnız tədqiqatın 8 həftəlik müddəti və seçilmiş yetkin nümunəsi üçün şərh edilməlidir; uzunmüddətli təhlükəsizlik və ya yaşlı və immunçatışmazlığı olan şəxslər üçün təhlükəsizlik birbaşa sınaqdan keçirilməmişdir.

HT-LM1004 Probiyotikdir, yoxsa Postbiyotik?

Mənbənin istehsal təsvirinə görə HT-LM1004 canlı probiyotik preparat deyil, fermentasiya ilə çoxaldıldıqdan sonra istiliklə tam inaktivləşdirilməsi nəzərdə tutulan L. plantarum LM1004 hüceyrələrindən və onların qorunmuş hüceyrəvi strukturlarından ibarət preparatdır; məqalənin girişində bu bioloji vəziyyət “postbiotic” anlayışı ilə izah edilir, lakin bəzi şəkil və müzakirə ifadələrində “probiotic supplementation” termini də işlədilir.

Probiyotik termini klassik olaraq kifayət qədər miqdarda verildikdə sahib orqanizmə sağlamlıq faydası təmin edən canlı mikroorqanizmlər üçün işlədilir. Postbiyotik isə canlı olmayan mikroorqanizmlərin və/və ya onların komponentlərinin sahib orqanizmə sağlamlıq faydası verən preparat şəklində istifadəsi anlayışını ifadə edir.

HT-LM1004 istehsalında məqsəd bakteriyanın canlı halda bağırsaqda kolonizasiya etməsi deyil. Mənbə fermentasiyadan sonra biokütlənin toplandığını, istilik işlənməsi ilə canlılığın aradan qaldırıldığını və qurudulduğunu bildirir. Hüceyrə divarı və hüceyrə zərfindəki peptidoqlikan, lipoteyxoik turşular və səth zülalları kimi strukturlar isə tamamilə yox olmaya bilər. Belə mikrob strukturları microbe-associated molecular patterns (MAMPs) adlandırılır və immun hüceyrələrindəki pattern recognition receptors (PRRs), məsələn Toll-like receptor 2 (TLR2), tərəfindən tanına bilər.

Bu bioloji mexanizm “ölü bakteriya heç nə edə bilməz” kimi sadə düşüncənin niyə düzgün olmadığını izah edir. Mikroorqanizmin çoxalması üçün onun canlı olması lazımdır; lakin immun sistemin mikroorqanizmin hüceyrə divarını və ya səth molekullarını tanıması üçün onun canlı olmasına ehtiyac yoxdur.

LM1004 necə hazırlanıb?

Mənbədə LM1004-ün kimçidən təcrid edildiyi və ştam kimliyinin 16S rRNA gen sekvenslənməsi ilə təsdiqləndiyi bildirilir. İstehsal nəzarət olunan fermentasiya, biokütlənin toplanması, istiliklə inaktivləşdirmə və qurutma mərhələlərindən ibarət olmuşdur. Klinik tədqiqatda istifadə olunan partiya 20OTF8, SHIME təcrübəsində istifadə olunan partiya isə 10PTF6 olaraq bildirilmişdir. Müxtəlif platformalardakı materialın izlənə bilməsi üçün bu partiya nömrələrinin ayrı saxlandığı qeyd olunur.

Müzakirə bölməsindəki ətraflı istehsal təsvirində əvvəlcə qlükoza, soya peptonu və maya ekstraktı olan mühitdə 34 ± 0,5°C-də 6–8 saatlıq toxum kulturası hazırlanmış; sonra 1.800 L bioreaktorda %6,6 qlükoza, %1,3 soya peptonu, %1,5 maya ekstraktı və mineral duzları ehtiva edən mühitdə 34 ± 0,5°C-də 15–18 saat əsas fermentasiya aparılmışdır. Əsas fermentasiyada anaerob mühiti saxlamaq üçün azot qazından istifadə edilmişdir.

Bakteriya konsentrasiyası təxminən 1,6 × 10¹⁰ CFU/mL səviyyəsinə çatdıqda biokütlə 12.000 rpm sentrifuqalama ilə toplanmış, krioprotektorlarla qarışdırılmış və mənbədə bildirildiyi kimi 90°C-də 30 dəqiqə istilik işlənməsinə məruz qalmışdır. Son məhsul dondurularaq qurudulmuş və standartlaşdırılmışdır.

Doza məlumatındakı mənbədaxili fərq

Doza və kapsul tərkibi ilə bağlı mənbənin iki bölməsi tam eyni təsviri istifadə etmir. Metod bölməsi tədqiqat məhsulunu 500 mg/gün HT-LM1004 tozu ehtiva edən bir kapsul kimi təsvir edir və aktiv kapsulda əlavə aktiv maddə və ya neytral doldurucu olmadığını bildirir. Müzakirənin istehsal detalları hissəsində isə tozun 2 × 10¹¹ hüceyrə/g səviyyəsində standartlaşdırıldığı, gündəlik HT-LM1004 aktiv komponent miqdarının 0,1 g = 2 × 10¹⁰ hüceyrə ekvivalenti olduğu və bunun maltodekstrin və maqnezium stearat kimi köməkçi maddələrlə kapsulun ümumi çəkisinə tamamlandığı izah edilir.

Mənbə bu iki formulasiya təsviri arasındakı fərqi ayrıca izah etmir. Buna görə Verianla mətni bunlardan birini digərinin yerinə səssizcə “düzgün doza” kimi seçmir.

NK Hüceyrə Aktivliyi Necə Ölçüldü?

Tədqiqatın birincili sonlanımı iştirakçı qanından təcrid edilən NK hüceyrələrinin K562 hədəf hüceyrələrini öldürmə qabiliyyətindəki dəyişikliyin ⁵¹Cr-release sitotoksiklik üsulu ilə ölçülməsidir; bu üsul NK hüceyrəsinin yalnız sayını deyil, hədəf hüceyrə üzərində funksional öldürmə qabiliyyətini qiymətləndirməyi hədəfləyir.

NK hüceyrəsi nədir?

Natural killer (NK) hüceyrələri, anadangəlmə immun sisteminin sitotoksik limfositləridir. Xüsusilə virusla yoluxmuş və ya bədxassəli transformasiya göstərmiş hüceyrələri tanıyıb öldürə bilirlər. NK hüceyrəsinin hədəf hüceyrəni öldürmə mexanizmlərinə perforin və qranzim kimi sitotoksik molekulların buraxılması daxildir.

Bu tədqiqat NK hüceyrə sayındakı sadə dəyişikliyi birincili nəticə kimi istifadə etməmişdir. Əsas məqsəd NK hüceyrələrinin sitotoksik aktivliyindəki dəyişikliyi ölçməkdir.

K562 hədəf hüceyrələri niyə istifadə olunur?

K562, NK hüceyrə sitotoksiklik testlərində geniş istifadə olunan hədəf hüceyrə xəttidir. Təcrübədə iştirakçıların periferik qan mononuklear hüceyrələri əvvəlcə Lymphoprep™ ilə ayrılmış, sonra NK hüceyrələri MojoSort™ Human NK Cell Isolation Kit istifadə edilərək təcrid edilmişdir.

Hədəf K562 hüceyrələrinin NK hüceyrələri tərəfindən parçalanması ⁵¹Cr-release üsulu ilə qiymətləndirilmişdir. Mənbə bu tədqiqata məxsus hesablama formulunu ayrıca vermir, daha əvvəl yayımlanmış protokola istinad edir; buna görə Verianla mənbənin bildirmədiyi sitotoksiklik formulunu tədqiqat formulu kimi əlavə etmir.

E:T nisbəti nə deməkdir?

E:T, “effector-to-target”, yəni effektor hüceyrə/hədəf hüceyrə nisbətidir. Burada effektor NK hüceyrəsi, hədəf isə K562 hüceyrəsidir.

Məsələn, 6,25:1 nisbəti müəyyən assay quruluşunda hər bir hədəf hüceyrəyə qarşı daha az sayda NK effektor hüceyrəsinin olduğu şəraiti; 50:1 isə daha yüksək effektor/hədəf nisbətini təmsil edir. Hüceyrənin müxtəlif E:T nisbətlərində sınaqdan keçirilməsi sitotoksik aktivliyin yalnız bir eksperimental hüceyrə sıxlığında görülüb-görülmədiyini anlamağa kömək edir.

Mənbənin metod bölməsi 6,25:1, 12,5:1 və 25:1 nisbətlərini sadaladığı halda nəticə cədvəlləri 50:1 nisbətini də ehtiva edir. Buna görə 50:1 nəticəsi cədvəl məlumatı kimi qorunur, lakin metod bölməsində bu nisbətin niyə ayrıca göstərilmədiyi barədə fərziyyə edilmir.

Klinik sınaq kimlərdə aparıldı?

Tədqiqata 19–75 yaş arasındakı qadın və kişilər daxil edilmişdir. Lakin “sağlam yetkin” ifadəsi ümumi əhalidən tam təsadüfi seçilmiş şəxslər demək deyil. İştirak üçün Perceived Stress Scale (PSS) balının ən azı 16 olması, periferik WBC sayının 3 × 10³ ilə 10 × 10³ hüceyrə/µL arasında olması və əvvəlki il ərzində ən azı iki yuxarı tənəffüs yolu infeksiyası tarixçəsinin olması tələb edilmişdir.

Müəlliflər bu meyarların nisbətən zəifləmiş immun başlanğıcı və ya fizioloji immun dalğalanmalara daha yüksək həssaslığı olan şəxsləri seçmək məqsədilə istifadə edildiyini izah edirlər. Buna görə nəticələrin heç bir stress və ya təkrarlanan yuxarı tənəffüs yolu infeksiyası tarixçəsi olmayan bütün sağlam yetkinlərə avtomatik olaraq eyni böyüklükdə tətbiq olunacağı fərz edilə bilməz.

Əsas xaricetmə meyarları BMI ≥30 kg/m², son iki ayda peyvənd, son iki ayda COVID-19 infeksiyası, immun sistemə təsir göstərə biləcək sistemik xəstəlik, son dörd həftədə immunomodulyator dərman və ya probiyotik istifadəsi, hamiləlik/əmizdirmə və tədqiqat məhsuluna allergiya kimi bildirilmişdir.

Randomizasiya və korlama

Cəmi 120 nəfər kompüter tərəfindən yaradılmış randomizasiya ardıcıllığı ilə 60 HT-LM1004 və 60 plasebo olmaqla 1:1 bölüşdürülmüşdür. Aktiv və plasebo kapsulları görünüş, çəki və qablaşdırma baxımından uyğunlaşdırılmış, həm iştirakçılar, həm də tədqiqatçılar qrup təyinatından xəbərsiz saxlanmışdır.

ITT və PP arasındakı fərq nədir?

Intention-to-treat (ITT) analizi randomizasiyadan sonra tədqiqat məhsulunu ən azı bir dəfə qəbul edən və ən azı bir başlanğıcdan sonrakı effektivlik ölçümü olan şəxsləri analiz etməyi nəzərdə tutur. Randomizasiyanın təmin etdiyi qrup müqayisə strukturunu mümkün qədər qoruduğu üçün klinik tədqiqatlarda əhəmiyyətlidir.

Per-protocol (PP) analizi isə ciddi protokol pozuntusu olmayan və mənbədə göstərilən ən azı %80 uyğunluq şərtini yerinə yetirən iştirakçıları ehtiva edir. PP analizi müdaxiləni protokola daha uyğun tamamlayan qrupa fokuslanarkən, ITT real klinik tədqiqat axınına daha yaxın analiz çərçivəsi təqdim edir.

Bu tədqiqatda birincili NK aktivliyi nəticəsi həm ITT, həm də PP analizində eyni ümumi istiqamətdə olmuşdur.

LOCF nədir?

ITT analizində çatışmayan məlumatlar üçün mənbə last observation carried forward (LOCF) yanaşmasından istifadə etdiyini bildirir. LOCF, iştirakçının sonrakı ölçümü yoxdursa mövcud son müşahidə dəyərinin irəli daşınması yanaşmasıdır. Bu üsul çatışmayan məlumat səbəbilə şəxsin analizdən tam çıxmasının qarşısını ala bilər; lakin real bioloji dəyərin dəyişmədiyini fərz edən güclü bir tətbiq olduğuna görə çatışmayan məlumat üsulunun özü də nəticələrin şərhinin bir hissəsidir.

ANCOVA niyə istifadə olunub?

Müalicə qrupunun başlanğıcda digər qrupdan bir qədər fərqli ola bilən dəyərlərini statistik olaraq nəzərə almaq üçün analysis of covariance (ANCOVA) istifadə oluna bilər. Mənbə həmçinin ITT başlanğıc xüsusiyyətlərində hiperlipidemiya tezliyində kiçik fərq olduğuna görə HLD vəziyyətini kovariat kimi modelə əlavə etmişdir.

Mənbə Cədvəl 1-də aşağıdakı modeli açıq şəkildə verir:

\[ \mathrm{CHANGE}=\alpha+\beta\cdot\mathrm{HLD}+\delta\cdot\mathrm{GROUP}+\varepsilon \]

CHANGE, fərdin müdaxilədən sonrakı dəyəri ilə başlanğıc dəyəri arasındakı fərqdir.

α, reqressiya sabitidir; digər dəyişənlərin referens dəyərində modelin başlanğıc səviyyəsini təmsil edir.

HLD, hiperlipidemiya vəziyyətidir: hiperlipidemiya varsa 1, yoxdursa 0 olaraq kodlaşdırılmışdır.

β, hiperlipidemiya vəziyyətinin CHANGE üzərindəki model əmsalıdır.

GROUP, HT-LM1004 qrupunda 1, plasebo/nəzarət qrupunda 0 olaraq kodlaşdırılmışdır.

δ, modelin əsas müalicə müqayisəsini təmsil edir. Mənbənin ifadəsiylə δ, kovariatla düzəldilmiş başlanğıc-sonrası dəyişmənin müalicə minus nəzarət fərqidir.

ε, model tərəfindən izah olunmayan qalıq dəyişkənliyi təmsil edən xəta terminidir.

Mənbə bəzi sonlanımlarda ordinary regression, bəzi dəyişənlərdə isə robust regression istifadə etmişdir. Robust regression adi xətti modelin kənar dəyərlərdən və ya paylanma xüsusiyyətlərindən həddindən artıq təsirlənməsini azaltmağa yönəlmiş reqressiya yanaşmasıdır.

NK aktivliyinin kovariatla düzəldilmiş nəticələri

Cədvəlin ən mühüm nöqtəsi dörd NK E:T şəraitinin hamısında PP və ITT müqayisələrinin p<0,05 olmasıdır. Buna görə tədqiqatın əsas klinik nəticəsi tək bir E:T nisbətinə və ya yalnız protokolu tam tamamlayan PP populyasiyasına əsaslanmır.

WBC üçün də PP və ITT analizlərində düzəldilmiş müalicə–nəzarət fərqi əhəmiyyətlidir. IL-12 isə ITT modelində p=0,0425 olduğu halda PP analizində p=0,1724-dür; buna görə IL-12 üçün “bütün analizlərdə ardıcıl əhəmiyyətli fərq” ifadəsi düzgün olmaz.

Sitokin nəticələri niyə daha ehtiyatla şərh edilməlidir?

Serum TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12 və IL-15 səviyyələri dəstəkləyici mexanistik biomarkerlər kimi ölçülmüşdür. Müəlliflər fərdlərarası sitokin dəyişkənliyinin yüksək olduğunu və bu nəticələrin birincili effektivlik nəticəsi kimi görülməməli olduğunu bildirirlər.

Bundan əlavə, sitokin p dəyərləri üçün formal çoxsaylı müqayisə düzəlişi aparılmamışdır. Çox sayda müstəqil statistik test aparıldıqda yalnız p<0,05 həddinin təkrar-təkrar istifadəsi təsadüfən əhəmiyyətli nəticə əldə etmə ehtimalını artıra bilər. Müəlliflər düzəliş etməmək qərarını sağlam kohortda mümkün bioloji meylləri qaçırmamaq və Tip II xəta riskini azaltmaq məqsədi ilə izah edir; buna görə sitokin tapıntılarını kəşfiyyat xarakterli və dəstəkləyici kimi təqdim edirlər.

SHIME İnsan Bağırsağı ilə Eynidirmi?

Xeyr. SHIME®, real insan kolonunun müxtəlif bölmələrindəki pH, temperatur, anaerob mühit və mikrob fermentasiyası şəraitini nəzarətli şəkildə təqlid edən in vitro bağırsaq ekosistemi modelidir; canlı insanın bağırsaq epiteli, qan dövranı, immun sistemi, hormonal sistemi və bütün sahib–mikrob qarşılıqlı təsirlərini tam şəkildə ehtiva etmir.

SHIME quruluşu necə yaradılıb?

Tədqiqatda iki paralel SHIME vahidi istifadə edilmişdir. Bir vahid müalicəsiz nəzarət, digər vahid HT-LM1004 tətbiq olunan təcrübə vahididir. Hər sistem kolonun üç bölgəsini təmsil edən qabları ehtiva edir:

• AC: ascending colon — qalxan/proksimal kolon.
• TC: transverse colon — transvers kolon.
• DC: descending colon — enən/distal kolon.

Sistem 37°C-də saxlanılmış, pH davamlı nəzarətdə tutulmuş və anaerob qazla oksigensiz bağırsaq mühiti təqlid edilmişdir. Standart qida mühitində arabinoqalaktan, pektin, ksilan, nişasta, qlükoza, maya ekstraktı, pepton, musin və L-sistein HCl kimi komponentlər olmuşdur. Pankreatik məhlul NaHCO₃, pankreatin və oxgall ehtiva etmişdir.

Nəcis inokulumu sağlam qadın və kişi donorların 1:1 nisbətində materialından hazırlanmış; AC, TC və DC bölmələrinin işçi həcminin %5-i nisbətində inokulyasiya edilmişdir.

Təcrübə üç dövrə bölünmüşdür: 1 həftə stabilizasiya, 4 həftə HT-LM1004 müdaxiləsi və 1,5 həftə müdaxilədən sonrakı müşahidə/yuma dövrü.

SHIME-də HT-LM1004 dozası 0,1 g, yəni mənbədə 2 × 10¹⁰ hüceyrə ekvivalenti kimi göstərilmiş; 10 mL steril distillə olunmuş suda suspenziya edilərək həftədə beş gün saat 10:30-da müalicə vahidinin AC2 bölməsinə verilmişdir.

Nümunələr Pre, Mid, End və Post olmaqla dörd zaman nöqtəsində toplanmışdır. Mənbə nümunə götürmənin gündəlik dozadan əvvəl saat 10:00-da aparılmasının yalnız qısamüddətli dərhal-sonra təsiri deyil, yığılan ekosistem təsirini qiymətləndirməyi hədəflədiyini bildirir.

SHIME təcrübəsinin mənbə axınını göstərən müstəqil sxem

16S rRNA analizi nəyi ölçür?

16S rRNA geninin dəyişkən bölgələri bakteriyaların taksonomik təsnifatı üçün istifadə edilə bilər. Tədqiqatda V4 hiperdəyişkən bölgəsi hədəflənmiş və 515–806 bölgəsini əhatə edən praymerlər istifadə edilmişdir. Mənbə gözlənilən amplikon uzunluğunu 359 bp olaraq bildirir.

DNA QIAamp DNA Mini Kit ilə təcrid edilmiş, Qubit 4 ilə miqdarı ölçülmüş, 0,8% agaroz gel elektroforezi ilə bütövlüyü yoxlanmış və A260/A280 nisbəti ilə saflığı qiymətləndirilmişdir.

Kitabxanalar Illumina Nextera XT adapterləri ilə hazırlanmış, AMPure XP ilə təmizlənmiş, %10 PhiX əlavə edilmiş və mənbədə Illumina iSeq100 platformasında paired-end sekvensləmə aparıldığı bildirilmişdir. Sekvenslər QIIME 2 əsaslı pipeline ilə demultipleksləşdirmə, keyfiyyət filtri, xəta düzəltmə və taksonomik təsnifat mərhələlərindən keçirilmişdir.

Alfa və beta müxtəliflik nə deməkdir?

Alfa müxtəliflik, tək nümunə və ya ekosistem bölməsinin öz daxilindəki mikrob müxtəlifliyini ifadə edir. Tədqiqatda observed features/OTU, ACE, Chao1, Jackknife, Shannon, Simpson, NPShannon və filogenetik müxtəliflik kimi metriklər istifadə edilmişdir.

Richness, yəni zənginlik, neçə fərqli xüsusiyyət/takson olduğuna daha çox fokuslanır. Shannon və oxşar müxtəliflik indeksləri isə yalnız neçə növ olduğunu deyil, icmadakı paylanmanın nə qədər balanslı olduğunu da nəzərə ala bilər.

Filogenetik müxtəliflik, yalnız takson sayını deyil, mikroorqanizmlərin təkamül baxımından bir-birindən nə qədər fərqli olduğunu da nəzərə alır.

Beta müxtəliflik isə iki icmanın bir-birinə nə qədər oxşadığını və ya fərqləndiyini qiymətləndirir. Mənbə weighted UniFrac istifadə etmiş və icmaların çoxölçülü fərqlərini vizual olaraq xülasələmək üçün Principal Coordinate Analysis (PCoA) tətbiq etmişdir.

Mikrobiom müxtəlifliyində nə baş verdi?

AC-də richness ölçüləri boyunca əhəmiyyətli dəyişiklik görülməmişdir. Bunun əksinə, TC-də müdaxilənin sonunda və DC-də Post vaxtında richness artımı müşahidə edilmişdir.

Shannon, Simpson, NPShannon və filogenetik müxtəliflik baxımından AC-də daha davamlı artım meyli görünərkən TC və DC-də müxtəliflik indeksləri zaman ərzində eyni şəkildə dəyişməmişdir.

Əlavə analizdə dörd həftəlik müdaxilənin sonunda AC filogenetik müxtəlifliyi HT-LM1004 qrupunda nəzarətlə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə yüksək olmuşdur (p=0,0099). PCoA analizi nəzarət və HT-LM1004 mikrob icmalarının ayrışdığını göstərmiş, mənbə beta-set analizində p<0,05 bildirmişdir.

Müəlliflər bu nümunəni proksimal kolonda əvvəlcə müxtəliflik/bərabərlik dəyişiklikləri, daha distal TC və DC-də isə aşağı bolluqlu taksonların daha sonra zənginləşməsi kimi şərh edirlər. Bununla belə, bu “proksimaldan distala gradient” şərhinin SHIME sisteminə aid olduğunu və insan bağırsağında eyni trayektoriyanın birbaşa ölçülmədiyini unutmaq olmaz.

Aşağı bolluqlu bakteriyalar niyə əhəmiyyətli ola bilər?

Bakteriyanın bağırsaqda aşağı nisbətdə olması onun bioloji baxımdan əhəmiyyətsiz olması demək deyil. Aşağı bolluqlu bəzi taksonlar müəyyən metabolik çevrilmələrdə və ya ekosistem şəbəkələrində funksional rola malik ola bilər.

Mənbə TC-də Clostridia, Dialisteraceae və Lentilactobacillus; DC-də Bacteroidales, Rikenellaceae, Lactonifactor və Christensenella kimi aşağı bolluqlu taksonların zənginləşməsini müzakirə edir. Bu taksonların “faydalı” funksiyaları bu təcrübədə ayrıca birbaşa sınaqdan keçirilməyib; müəlliflər onların sağlamlıq, baryer, SCFA istehsalı və ya metabolik funksiyalarla əlaqəsini əvvəlki ədəbiyyata əsaslanaraq şərh edirlər.

Metabolomika necə aparılıb?

Metabolomik analizdə kolon bölmələrindən alınan kultura mayesi Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS) ilə analiz edilmişdir.

Metabolit siqnalları ümumi ion xromatoqramına (TIC) görə normallaşdırılmışdır. Kimyəvi təsnifatda NPClassifier və ClassyFire istifadə edilmiş, NPClassifier nəticəsinə üstünlük verilmiş və təsnifat etibarlılığı üçün ehtimal ≥0,8 şərti istifadə edilmişdir.

Metabolik dəyişiklikləri qiymətləndirmək üçün mixed-design ANOVA tətbiq edilmişdir. Zaman, yəni Pre–Mid–End–Post, təkrarlı/within faktor; nəzarət–HT-LM1004 şərti isə between faktor kimi istifadə edilmişdir. Mənbə p<0,05 ilə yanaşı yüksək partial eta squared (η_p²) dəyərlərini də dispersiya üzərində təsirin göstəricisi kimi qiymətləndirmişdir.

Metabolomikada neçə xüsusiyyət müəyyən edildi?

Buradakı “feature” sayı birbaşa eyni sayda dəqiq kimliyi təsdiqlənmiş müstəqil metabolit olduğu demək deyil. LC-MS/MS məlumat emalı zamanı müəyyən kütlə/yük, retensiya vaxtı və siqnal xüsusiyyətlərinə malik analitik siqnallar çıxarılır; bunların bir hissəsi standart kitabxanalarla uyğunlaşdırılarkən qalan bəzi xüsusiyyətlərin kimyəvi sinfi təxmin alətləri ilə annotate edilmişdir.

Öd turşularında nə dəyişdi?

AC-də xolik turşu və müəyyən chenodeoxycholic acid siqnalları kimi birincili öd turşularında artımlar bildirilmişdir.

TC-də daha aydın metabolik yenidənqurma görülmüş və 3-oxocholate ilə müxtəlif ikincili öd turşusu/əlaqəli törəmə siqnallarında artım bildirilmişdir. Bəzi birincili öd turşusu siqnalları isə nisbi olaraq azalmışdır.

DC-də dəyişiklik yalnız öd turşuları ilə məhdudlaşmır. Bəzi ikincili öd turşuları ilə birlikdə müxtəlif öd turşusu olmayan metabolitlərdə də artım müşahidə edilmişdir.

Müəlliflər xüsusilə birincili–ikincili öd turşusu balansındakı dəyişikliklərin bağırsaq mikrob metabolizmasının yenidən təşkil olunduğunu düşündürdüyünü müzakirə edirlər. Öd turşularının FXR və TGR5 kimi reseptorlar vasitəsilə immun funksiyalarla əlaqəli olması bu metabolik nəticələrin NK tapıntısı ilə mümkün mexanistik əlaqəsinin əsasını təşkil edir. Lakin bu reseptor yolları mövcud insan sınağında birbaşa ölçülməyib.

SCFA nədir?

Short-chain fatty acids (SCFAs), bağırsaq mikroorqanizmlərinin fermentasiya proseslərində yarada bildiyi qısa zəncirli üzvi turşulardır. Tədqiqat dörd SCFA-nı kəmiyyətcə qiymətləndirmişdir: sirkə turşusu, propion turşusu, butir turşusu və valer turşusu.

SCFA analizi headspace GC-MS ilə aparılmışdır. Nümunələr NaCl və %2 sulfat turşusu ilə hazırlanmış; sirkə, propion, butir və valer turşusu üçün 1–100 mg/L standart məhlullardan istifadə edilərək kalibrasiya əyriləri qurulmuşdur. Metabolit kimliyi retensiya vaxtı və kütlə spektrinin autentik standartlarla müqayisəsi ilə müəyyən edilmişdir.

SCFA-larda hansı zaman nümunəsi görüldü?

AC-də SCFA səviyyələri Mid nöqtəsində azalmış, End və Post nöqtələrində başlanğıca yaxın və ya başlanğıcdan yuxarı səviyyələrə qayıtmışdır.

TC-də SCFA konsentrasiyaları Mid və End dövrlərində yüksəlmiş, müdaxilə dayandırıldıqdan sonrakı Post mərhələsində başlanğıca yaxınlaşma meyli göstərmişdir.

DC-də də oxşar şəkildə Mid və End dövrlərində yüksəlmə, Post dövründə isə qismən geridönüş görülmüşdür.

Bu nəticələr “HT-LM1004 bütün kolonda SCFA-nı davamlı artırdı” kimi sadələşdirilə bilməz. Təsir kolon bölgəsinə və zamana bağlıdır; xüsusilə AC-nin orta dövrdəki istiqaməti TC və DC-dən fərqlidir.

Klinik NK Artımı ilə SHIME Mikrobiom Dəyişiklikləri Arasında Səbəbiyyət Sübut Edilibmi?

Xeyr. İnsan sınağında NK aktivliyi ölçülmüş, mikrobiom və metabolit mexanizmi isə ayrıca in vitro SHIME ekosistemində araşdırılmışdır; eyni klinik iştirakçılarda mikrobiom dəyişimi → metabolit dəyişimi → NK aktivliyi şəklində fərdi vasitəçilik zənciri ölçülmədiyi üçün SHIME tapıntıları klinik NK artımının birbaşa səbəbi kimi qəbul edilə bilməz.

Bu fərq məqalənin elmi şərhində mərkəzi əhəmiyyət daşıyır. Mənbə mexanistik model təklif edir: HT-LM1004-ün istiliklə qorunmuş hüceyrə komponentləri birbaşa PRR/TLR siqnallaşmasına təsir edə bilər; eyni zamanda bağırsaq mikrob icması və mikrob metabolit istehsalı dəyişə bilər; öd turşuları və SCFA-lar immun sistemlə qarşılıqlı təsir göstərə bilər. Lakin mövcud tədqiqat bu zəncirin bütün addımlarını vahid səbəbiyyət təcrübəsində göstərmir.

Mənbə açıq şəkildə hətta mikrobiom və metabolomik məlumat dəstləri arasında birbaşa mexanistik əlaqə qurulmadığını, müəyyən taksonların zənginləşməsi ilə SCFA və öd turşusu yollarındakı dəyişikliklərin immun artımı ilə potensial əlaqə təklif etdiyini bildirir.

Buna görə düzgün elmi ifadə “HT-LM1004 klinik sınaqda NK hüceyrə aktivliyini artırdı və ayrıca SHIME modelində buna bioloji izah verə biləcək mikrobiom/metabolit dəyişiklikləri müşahidə edildi” şəklindədir. “HT-LM1004 NK aktivliyini məhz bu bakteriyaları artırmaqla qəti şəkildə yüksəltdi” ifadəsi mövcud eksperimental dizaynın sübut sərhədini aşır.

Birbaşa hüceyrə mexanizmi ölçülübmü?

Mənbə istiliklə inaktivləşdirilmiş hüceyrələrin peptidoqlikan, lipoteyxoik turşu və səth zülallarının PRR/TLR strukturları ilə qarşılıqlı təsirə girib MAPK, AP-1 və NF-κB kimi yolları aktivləşdirə biləcəyini; bunun perforin, granzyme B və IFN-γ kimi sitotoksik effektorlarla əlaqəli ola biləcəyini müzakirə edir.

Lakin müəlliflər mövcud tədqiqatın bu siqnal yollarını birbaşa sınaqdan keçirmədiyini xüsusi olaraq qeyd edirlər. Buna görə TLR2/MAPK/NF-κB mexanizmi mövcud tədqiqatın birbaşa ölçülmüş klinik mexanizmi deyil, əvvəlki tədqiqatlarla dəstəklənən mümkün bioloji izahdır.

NK artımı geniş sistemik iltihab deməkdirmi?

Tədqiqatda NK sitotoksikliyi əhəmiyyətli artsa da IFN-γ və TNF-α kimi serum sitokinlərində əhəmiyyətli müalicə–nəzarət artımları görülməmişdir. Müəlliflər bunu NK effektor funksiyasının artmasının mütləq qan dövranındakı bütün iltihabi sitokinlərdə geniş sistemik artım yaratmasının lazım olmadığı kimi şərh edirlər.

Bu nəticə “HT-LM1004 heç bir iltihabi təsir yaratmır” kimi qəti ümumiləşdirməyə çevrilməməlidir. Ölçüm müəyyən serum sitokinləri və səkkiz həftəlik eksperimental şərtlərlə məhduddur.

Təhlükəsizlik nəticələri

Yüngül hadisələrin öskürək və rinoreya kimi tipik soyuqdəymə əlamətlərindən ibarət olduğu, keçici olduğu və tədqiqat məhsulu ilə əlaqəli hesab edilmədiyi bildirilib. Hematologiya, biokimya, lipid, elektrolit, böyrək indeksləri, CRP/ESR və həyati göstəricilər ümumilikdə klinik baxımdan əhəmiyyətli müalicə mənşəli problem göstərməmişdir.

Bəzi laboratoriya dəyərlərində qrupdaxili statistik dəyişikliklər görülsə də bunların klinik simptomla əlaqəli olmadığı və müalicə–nəzarət arasında əhəmiyyətli fərq yaratmadığı bildirilmişdir. Statistik əhəmiyyətliliklə klinik əhəmiyyətliliyin eyni şey olmadığı burada vacibdir.

Tədqiqatın dəstəklədiyi nəticələr

• Seçilmiş yetkin nümunəsində 8 həftəlik HT-LM1004 istifadəsi birincili sonlanım olan NK hüceyrə sitotoksikliyində plasebo ilə müqayisədə daha böyük artımla əlaqəlidir.
• NK nəticəsi bildirilən dörd E:T nisbətində və həm ITT, həm də PP düzəldilmiş analizlərində əhəmiyyətlidir.
• WBC dəyişməsində də PP və ITT düzəldilmiş müalicə–nəzarət fərqi əhəmiyyətlidir.
• 8 həftəlik klinik tədqiqat müddətində tədqiqat məhsuluna aid edilmiş ciddi təhlükəsizlik siqnalı bildirilməyib.
• Ayrıca SHIME sistemində HT-LM1004 mikrob müxtəlifliyini, aşağı bolluqlu taksonların paylanmasını, öd turşusu profillərini və SCFA istehsalını kolon bölgəsinə və zamana bağlı şəkildə dəyişmişdir.
• Bu in vitro tapıntılar klinik NK nəticəsi ilə uyğun ola biləcək mexanistik hipotezlər təqdim edir.

Tədqiqatın dəstəkləmədiyi nəticələr

• HT-LM1004-ün insanlarda virus infeksiyalarının qarşısını aldığı bu təcrübədə göstərilməyib.
• Xərçəngin inkişafını və ya şişin təkrarlanmasını azaltdığı göstərilməyib.
• Yaşlı və ya immunçatışmazlığı olan şəxslərdə effektivlik və təhlükəsizlik birbaşa sınaqdan keçirilməyib.
• Uzunmüddətli istifadənin təhlükəsizliyi səkkiz həftəlik tədqiqatdan çıxarıla bilməz.
• SHIME-də görülən mikrobiom dəyişikliklərinin klinik iştirakçılarda eyni şəkildə baş verdiyi göstərilməyib.
• İnsan nəcisində mikrobiom və ya SCFA dəyişiklikləri bu klinik tədqiqatın mexanistik sonlanımı kimi göstərilməyib.
• Müəyyən bakteriyaların zənginləşməsinin NK artımına birbaşa səbəb olduğu sübut edilməyib.
• Öd turşusu və ya SCFA dəyişikliklərinin NK aktivliyindəki artımı vasitəçilik analizi ilə izah etdiyi göstərilməyib.
• Kəşfiyyat xarakterli sitokin nəticələri birincili NK nəticəsi ilə eyni sübut səviyyəsində deyil.
• Tədqiqat məhsulu xəstəliyin müalicəsi və ya təsdiqlənmiş immunoterapiya kimi qiymətləndirilməməlidir.

Tədqiqatın əsas məhdudiyyətləri

Birinci məhdudiyyət: Klinik populyasiya seçilmiş sağlam yetkinlərdən ibarətdir. Yaşlı, immun sistemi basdırılmış və ya ciddi xroniki xəstəliyi olan populyasiyalara ümumiləşdirmə aparıla bilməz.

İkinci məhdudiyyət: SHIME fiziki-kimyəvi və mikrob bağırsaq şərtlərini təqlid edir, lakin real insan bağırsağındakı epitel, immun sistemi, qan dövranı, sinir sistemi və sahib metabolizminin bütün qarşılıqlı təsirlərini ehtiva etmir.

Üçüncü məhdudiyyət: Klinik NK nəticəsi ilə in vitro mikrobiom/metabolit nəticəsi birbaşa səbəbiyyətlə əlaqələndirilməyib.

Dördüncü məhdudiyyət: Səkkiz həftəlik klinik müdaxilə və 1,5 həftəlik SHIME müdaxilə sonrası müşahidə uzunmüddətli təsirin davamlılığını göstərmir.

Beşinci məhdudiyyət: Sitokin analizləri kəşfiyyat xarakterlidir və formal çoxsaylı müqayisə düzəlişi tətbiq olunmayıb.

Altıncı məhdudiyyət: SHIME sistemində görülən SCFA və mikrobiom nümunələrinin insan nəcisində və ya insan bağırsaq nümunələrində təsdiqlənməsinə ehtiyac var.

Yeddinci məhdudiyyət: Mənbə daxilində kapsul dozası/formulasiyası və bildirilən NK E:T nisbətləri barədə bölmələrarası fərq vardır; bu detallar reproduksiya və ya klinik tətbiq məqsədilə istifadə edilməzdən əvvəl orijinal protokol/supplementary material ilə ayrıca doğrulanmalıdır.

Tədqiqatın Metodu və Nəticələri

Klinik tədqiqat dizaynı

Statistik testlər

Davamlı dəyişənlər orta ± standart sapma, kateqorik dəyişənlər say və faiz kimi təqdim edilmişdir. Normal paylanmanın qiymətləndirilməsində Shapiro–Wilk testi istifadə edilmişdir.

Qrupdaxili başlanğıc–8-ci həftə müqayisələri normal paylanan dəyişənlərdə paired t-test, normal olmayan dəyişənlərdə Wilcoxon signed-rank test ilə aparılmışdır.

Qruplararası müqayisələr ANCOVA/reqressiya modelləri ilə aparılmış və başlanğıc fərqlərinin təsiri kovariatlarla nəzarət edilməyə çalışılmışdır.

Mənbə bəzi dəyişənlərdə ordinary regression, bəzilərində robust regression istifadə etmişdir. p<0,05 statistik əhəmiyyətlilik həddi kimi qəbul edilmişdir.

SHIME tədqiqat dizaynı

16S rRNA nəticələri

Mənbə AC-də müəyyən müxtəliflik indekslərində davamlı artım, TC-də End və DC-də Post vaxtlarında richness artımı bildirir. Dörd həftəlik müdaxilənin sonunda AC filogenetik müxtəliflik fərqi HT-LM1004 lehinə əhəmiyyətlidir (p=0,0099). PCoA və beta-set analizləri də nəzarət və müalicə icmalarının strukturunda ayrışma göstərmişdir.

Metabolomik nəticələr

Metabolomik nəticələr kolon bölgəsinə xasdır. AC-də birincili öd turşusu dəyişiklikləri daha aydın; TC-də ikincili öd turşusu çevrilmələri daha aydın; DC-də isə öd turşularından kənar metabolitləri də əhatə edən daha geniş metabolik yenidənqurma bildirilmişdir.

Bu regional fərq HT-LM1004-ün bağırsaq boyunca vahid tipli metabolik təsir yaratmadığını göstərir.

SCFA nəticələri

AC-də Mid dövründəki azalmadan sonra End/Post dövründə bərpa; TC və DC-də isə müdaxilə zamanı artım və Post dövründə başlanğıca doğru qismən geridönüş görülmüşdür. Beləliklə, SCFA cavabının həm zamana, həm də kolon bölgəsinə bağlı olduğu müəyyən edilmişdir.

Klinik və in vitro nəticələrin birlikdə şərhi

Klinik sınaq HT-LM1004 ilə NK hüceyrə aktivliyinin artdığını göstərir. SHIME isə eyni preparatın nəzarətli bağırsaq ekosistemində mikrob icmasını və metabolit profillərini dəyişə bildiyini göstərir.

Bu iki nəticə birlikdə HT-LM1004-ün həm mikrob hüceyrə komponentləri vasitəsilə birbaşa immun tanınma yollarına, həm də mikrobiom–metabolit oxuna təsir göstərə biləcəyi hipotezini dəstəkləyir. Lakin mənbə tədqiqatın dizaynı bu iki yolun insanlarda hansı nisbətdə töhfə verdiyini və ya birinin digərinə vasitəçilik edib-etmədiyini hesablaya bilmir.

Gələcək tədqiqatlar

Mənbə daha müxtəlif iştirakçı qrupları, daha uzun müdaxilə və izləmə dövrləri və birbaşa səbəbiyyət testləri təklif edir. Xüsusilə SHIME-də müşahidə olunan SCFA və mikrobiom dəyişikliklərinin klinik iştirakçıların nəcis və ya bağırsaq nümunələrində müqayisə edilməsi simulyator tapıntılarının fizioloji etibarlılığını təsdiqləmək üçün əhəmiyyətlidir.

Müəlliflər həmçinin immun hüceyrə fenotipləşdirməsi və transkriptomika kimi üsulların TLR/MAPK/NF-κB kimi təklif olunan birbaşa hüceyrə mexanizmlərinin təsdiqlənməsində istifadə oluna biləcəyini müzakirə edirlər.

Mənbə və Metod Qeydi

Orijinal tədqiqat: Microbiome-Modulating Effects of Heat-Treated Lactiplantibacillus plantarum LM1004 and Its Enhancement of NK Cell Activity: Evidence from a Clinical Trial and a Simulated Human Intestinal Microbiome Ecosystem

Müəlliflər: Sukyung Kim; Hoonhee Seo; Tae-Rahk Kim; Md Abdur Rahim; Hanieh Tajdozian; Youjin Yoon; Sujin Jo; Md Sarower Hossen Shuvo; Indrajeet Barman; Chaeeun Park; Saebim Lee; Sangwon Lee; Min Hyung Cho; Jangho Ha; Hansol Hong; Sohee An; SungJune Chu; Minn Sohn; Yoo Kyung Ahn; Yoon Ju So; Sungsue Rheem; Seong-Ho Han; Ho-Yeon Song.

Bərabər töhfə: Sukyung Kim və Hoonhee Seo mənbədə bərabər töhfəli müəlliflər kimi işarələnmişdir.

Corresponding authors: Seong-Ho Han və Ho-Yeon Song.

Qurumlar: LactoMason Co., Ltd.; Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, Soonchunhyang University; K-Microbiome Institute, Soonchunhyang University; Department of Family Medicine, College of Medicine, Dong-A University; Bioinformatics and Molecular Design Research Center (BMDRC), Yonsei University; Division of Big Data Science, Korea University.

İnstitusional maraq konteksti: Mənbədə bəzi müəlliflərin tədqiqat preparatını istehsal edən LactoMason Co., Ltd. ilə afiliyasiyaya malik olduğu görünür. Məqalə eyni zamanda “authors have no financial conflicts of interest to declare” bəyanatını verir. Bu iki məlumat birlikdə və dəyişdirilmədən qorunmalıdır.

Jurnal: Journal of Microbiology and Biotechnology.

Cild / məqalə no: Volume 36, e2604046.

DOI: 10.4014/jmb.2604.04046

Mənbə növü: Jurnalda yayımlanmış eksperimental tədqiqat; randomizə nəzarətli insan sınağı ilə ayrıca in vitro SHIME ekosistem təcrübəsini birləşdirir. PDF-in ilk səhifəsindəki yuxarı tip etiketi “Review” kimi görünür; bu etiket sənəddəki yeni eksperimental Methods/Results strukturu ilə uyğunsuz biblioqrafik detal kimi qorunub.

Qəbul üçün təqdim: 17 Aprel 2026.

Qəbul: 28 İyun 2026.

Yayım tarixi fərqi: PDF ilk səhifədə “Published: July 23, 2026” məlumatını verir. PubMed/Crossref e-yayım metadata qeydi 3 İyul 2026 tarixini göstərir. İki tarix arasındakı fərq səssizcə aradan qaldırılmayıb.

Lisenziya: Creative Commons Attribution (CC BY). PDF məqalənin açıq girişli olduğunu və CC BY şərtləri altında yayıldığını bildirir.

Maliyyələşmə: National Research Foundation of Korea tərəfindən MSIT maliyyələşməsi (RS-2023-00219563); MOTIE industrial innovation infrastructure construction project (P0021516); Ministry of SMEs and Startups Korea Technology Development Program for SMEs (S3373174) və Soonchunhyang University Research Fund dəstəyi bildirilmişdir.

Məlumat əlçatanlığı: Məqalədə təqdim olunan məlumatların və tədqiqatı dəstəkləyən əsas məlumat dəstlərinin corresponding author-dan əsaslandırılmış sorğu əsasında əldə oluna biləcəyi bildirilir.

Maraq toqquşması: Mənbə maliyyə maraq toqquşması olmadığını bəyan edir.

Etika və qeydiyyat: Klinik tədqiqat Dong-A University Hospital IRB təsdiqi DAUHIRB-23-152 altında aparılmış və ClinicalTrials.gov-da NCT07433855 kimi qeydiyyata alınmışdır. Nəcis nümunələri üçün Seoul National University Bundang Hospital IRB No. B-1810-497-308; genom/metabolom və süni həzm sistemi tədqiqatları üçün Soonchunhyang University layihə/etika qeydi 202406-SB-067 / 202406-SB-067-01 bildirilmişdir.

Məlumatlandırılmış razılıq: Klinik iştirakçılardan yazılı məlumatlandırılmış razılıq alınmışdır.

Birincili klinik sonlanım: Başlanğıcdan 8-ci həftəyə NK hüceyrə aktivliyində dəyişiklik.

Statistik analiz: SPSS 26 və SAS 9.4; paired t-test və ya Wilcoxon signed-rank test; ANCOVA/reqression; p<0,05; ITT və PP analizləri; ITT çatışmayan məlumatlarında LOCF.

Mənbədaxili E:T fərqi: Metod bölməsi 6,25:1, 12,5:1 və 25:1 nisbətlərini göstərdiyi halda klinik nəticə cədvəlləri 50:1 nisbətini də bildirir.

Mənbədaxili doza/formulasiya fərqi: Metod bölməsi 500 mg/gün HT-LM1004 tozu və doldurucu maddə olmadığını söylədiyi halda müzakirənin ətraflı istehsal təsviri 0,1 g standart HT-LM1004 aktiv komponentinin köməkçi maddələrlə ümumi kapsul çəkisinə tamamlandığını bildirir. Mənbə bu fərqin səbəbini izah etmir.

Klinik mexanizm sərhədi: Klinik iştirakçılarda SHIME-dəki mikrobiom və metabolomik zəncir birbaşa ölçülməyib. Mikrobiom/metabolit dəyişiklikləri ilə NK aktivliyinin artması arasındakı birbaşa səbəbiyyət sübut edilməyib.

SHIME sərhədi: Sistem insan kolonunun mikrob və fiziki-kimyəvi şərtlərini modelləşdirən in vitro ekosistemdir; real insan immun sistemini və bütün sahib fiziologiyasını yenidən yaratmır.

Sitokin analizi sərhədi: Sitokinlər kəşfiyyat xarakterli/dəstəkləyici biomarkerlərdir və formal çoxsaylı test düzəlişi tətbiq edilməyib.

Müəllif töhfələri: Conceptualization: T.-R.K., S.-H.H., H.-Y.S.; ilk layihə: S.K. və H.S.; review/editing: S.K., H.S., M.A.R., T.-R.K., S.-H.H., H.-Y.S.; supervision: T.-R.K., S.-H.H., H.-Y.S.; funding acquisition: T.-R.K. və H.-Y.S. Mənbə həmçinin metodologiya, araşdırma, formal analiz, resurslar, vizuallaşdırma və layihə idarəetməsi töhfələrini ətraflı CRediT formatında verir.