Sembada Hitam qara düyü kəpəyinin xloroform ekstraktı (chloroform extract of black rice bran; CBRB), bu tədqiqatda Oryza sativa L. ‘Sembada Hitam’ sortunun kəpəyinin xloroformla ekstraksiya edilməsi ilə hazırlanmış və HepG2 qaraciyər xərçəngi hüceyrələrində in vitro şəraitdə sınaqdan keçirilmiş bitki mənşəli ekstraktdır. Tədqiqatçılar CBRB-nin təsirini üç eksperimental istiqamətdə araşdırmışlar: MTT testi ilə hüceyrə canlılığı/sitotoksiklik, wound-healing testi ilə hüceyrə miqrasiyası və Annexin V-FITC flow cytometry ilə hüceyrə ölümünün forması. CBRB-nin nəzərəçarpan təsirləri ümumən yüksək konsentrasiyalarda ortaya çıxmışdır. CBRB üçün IC₅₀ 24 saatda 1.265 μg/mL və 48 saatda 1.868 μg/mL olduğu halda, doxorubicin üçün müvafiq olaraq 0,44 və 0,18 μg/mL-dir. CBRB 1.500 μg/mL-də HepG2 miqrasiyasını əhəmiyyətli dərəcədə azaltmış və flow cytometry analizində %60,35±0,01 erkən apoptoz göstərmişdir. Buna baxmayaraq, tədqiqat yalnız HepG2 hüceyrə kulturasında aparılmışdır; insanlarda xərçəngin qarşısını aldığını və ya müalicə etdiyini, klinik təhlükəsizliyini və ya konkret molekulyar yolu sübut etmir.

48 saatlıq MTT testində CBRB 2.000 μg/mL-də HepG2 canlılığını %30,39±12,23-ə, 3.000 μg/mL-də %4,9±0,67-yə endirmişdir. Bunun əksinə, doxorubicin daha aşağı konsentrasiyalarda güclü sitotoksik təsir göstərmişdir. Mənbə buna görə CBRB-nin doxorubicin ilə müqayisədə daha aşağı sitotoksik potensiala malik olduğunu vurğulayır.

Hüceyrə miqrasiyası təcrübəsində 250, 500, 1.000 və 1.500 μg/mL CBRB sınaqdan keçirilmişdir. Gap closure və migration velocity göstəriciləri konsentrasiya artdıqca azalma meyli göstərmiş; aydın statistik miqrasiya basqılanması 1.500 μg/mL CBRB-də müşahidə edilmişdir. Doxorubicin 2 μg/mL də güclü migration inhibition göstərmişdir.

Flow cytometry təcrübəsində CBRB-nin 500, 1.000 və 1.500 μg/mL konsentrasiyaları 48 saat ərzində sınaqdan keçirilmişdir. CBRB 1.500 μg/mL-də erkən apoptoz %60,35±0,01-ə çatmış; eyni qrupda nekroz %2,45±0,06 kimi bildirilmişdir. Tədqiqatçılar hüceyrə ölümünün əsasən apoptosis ilə uyğun olduğunu bildirsələr də, intrinsic və ya extrinsic apoptotic pathway-nin mövcud təcrübələrlə müəyyən edilə bilmədiyini açıq şəkildə qəbul edirlər.

Tədqiqatın əsas problemi

Tədqiqat İndoneziyada yetişdirilən yerli qara düyü sortlarından biri olan ‘Sembada Hitam’ın kəpək hissəsindən əldə edilən xloroform ekstraktının hepatosellulyar karsinoma mənşəli HepG2 hüceyrələrində bioloji aktivlik göstərib-göstərmədiyini araşdırır.

Qara düyü kəpəyi mənbə ədəbiyyatı kontekstində anthocyaninlər, γ-oryzanol, polyphenollar, vitamin E izoformları və hydroxycinnamic acid kimi bioloji baxımdan maraqlı komponentlərlə əlaqələndirilir. Bununla belə, mövcud tədqiqat CBRB-nin kimyəvi tərkibini birbaşa analiz etməmişdir. Buna görə müşahidə olunan hüceyrəvi təsirdən hansı spesifik birləşmənin məsul olduğu eksperimental olaraq göstərilməmişdir.

Mənbənin əsas tədqiqat sualı üç hissəyə bölünə bilər:

• CBRB HepG2 hüceyrə canlılığını azaldırmı?
• CBRB HepG2 hüceyrələrinin səth üzərində miqrasiyasını azaldırmı?
• CBRB ilə yaranan hüceyrə ölümü apoptosis ilə əlaqəlidirmi?

HepG2 Hüceyrələri Bu Tədqiqatda Nəyi Təmsil Edir?

HepG2, bu tədqiqatda qara düyü kəpəyi ekstraktının antikanser potensialını laboratoriya şəraitində qiymətləndirmək üçün istifadə olunan hepatoma/hepatosellulyar karsinoma mənşəli insan hüceyrə xəttidir; HepG2 üzərində əldə edilən nəticələr hüceyrə kulturası modelinin cavabını göstərir və birbaşa insan xəstələrində müalicə effektivliyi və ya təhlükəsizliyi demək deyil.

Tədqiqatın müddəti və bioloji material

Tədqiqat 2022-ci ilin dekabrı ilə 2023-cü ilin oktyabrı arasında aparılmışdır.

HepG2 hüceyrələri Laboratory of Parasitology, Faculty of Medicine, Public Health, and Nursing, Universitas Gadjah Mada daxilində kulturaya alınmışdır.

Sembada Hitam qara düyüsü Ngaglik, Sleman, Special Region of Yogyakarta-dakı yerli fermerlərdən əldə edilmişdir. Mənbə sortun nomenclature məlumatını Indonesian Minister of Agriculture Decree No. 125/HK.540/C/03/2019 ilə əlaqələndirir.

Kloroform ekstraktı necə hazırlanıb?

Mənbədə ekstraksiya mərhələləri belə verilmişdir:

1. 10 g Sembada Hitam qara düyü kəpəyi tozu istifadə edildi.
2. Kəpək 100 mL chloroform içində həll edildi/paylandı.
3. Qarışıq periodik qarışdırma ilə 48 saat maceration prosesinə buraxıldı.
4. Ekstrakt Whatman No.1 filter paper ilə filtrasiya edildi.
5. Filtrat overnight remaceration prosesinə alındı.
6. Daha sonra solvent uzaqlaşdırılaraq paste-like solid ekstrakt əldə edildi.
7. Sınaq məhlulu CBRB-nin %1 DMSO içində həll edilməsi ilə hazırlandı.

Maceration, bitki materialının müəyyən müddət solvent içində saxlanaraq solventdə həll ola bilən komponentlərin materialdan ekstraksiya edilməsidir.

Kloroform burada ekstraksiya solventidir. Tədqiqatın discussion bölməsi kloroformu nonpolar extraction solvent kimi təsvir edir və polar solventlərlə müqayisədə bəzi phytochemical komponentlərin ekstraksiyasında daha az səmərəli ola biləcəyini müzakirə edir.

Mənbə extraction yield faizi vermir. Bundan əlavə, hazırlanmış CBRB-nin anthocyanin, cyanidin-3-glucoside, peonidin-3-glucoside və ya digər komponent konsentrasiyaları bu tədqiqatda analitik üsullarla ölçülməyib.

MTT üçün istifadə olunan CBRB konsentrasiyaları

CBRB aşağıdakı konsentrasiyalarda hazırlanmışdır:

7,8; 15,6; 31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1.000; 1.500; 2.000 və 3.000 μg/mL.

Bu geniş konsentrasiya diapazonu hüceyrə canlılığının doza bağlı dəyişməsini və IC₅₀ dəyərini araşdırmaq üçün istifadə edilmişdir.

MTT Testi və IC50 Nəyi Ölçür?

MTT testi metabolik aktiv hüceyrələrin MTT adlı tetrazolium birləşməsini rəngli formazan məhsullarına çevirmə qabiliyyətindən istifadə edərək canlı hüceyrə miqdarını dolayı yolla qiymətləndirən hüceyrə canlılığı testidir; IC₅₀ isə müəyyən edilmiş təcrübə şəraitində hüceyrə böyüməsini və ya canlılığını təxminən %50 azaltmaq üçün tələb olunan sınaq maddəsi konsentrasiyasını ifadə edir və daha aşağı IC₅₀ adətən daha yüksək sitotoksik potensiala işarə edir.

MTT təcrübə quruluşu

HepG2 hüceyrələri 96-well plate-ə:

\[ 1\times10^4\ \text{hücre/well} \]

sıxlığında əkilmişdir.

Kultura mühiti Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) olub:

• %10 fetal bovine serum (FBS),
• %2 penicillin–streptomycin,
• %0,5 amphotericin B

ehtiva etmişdir.

Hüceyrələr əvvəlcə %5 CO₂ incubator içində 24 saat inkubasiya edilmişdir.

Daha sonra kultura mühiti CBRB test məhlulları ilə əvəz edilmişdir.

Nəzarət qrupları niyə vacibdir?

MTT təcrübəsində üç əsas müqayisə tipi vardır:

• Cell control: Müalicə edilməmiş hüceyrələrin əsas canlılıq səviyyəsini göstərir.
• %1 DMSO control: Ekstraktı həll etmək üçün istifadə edilən DMSO-nun öz təsirini ayırmağa kömək edir.
• Doxorubicin: Antikanser təsiri məlum olan müsbət müqayisə maddəsi kimi istifadə edilmişdir.

Doxorubicin:

0,25; 0,5; 1; 2; 4 və 8 μg/mL

konsentrasiyalarında sınaqdan keçirilmişdir.

Bütün treatment və control qrupları 24 və 48 saatlıq şəraitdə qiymətləndirilmişdir.

MTT reaksiyası necə həyata keçirildi?

İnkubasiya sonunda hər well-ə 100 μL MTT məhlulu əlavə edilmiş və dörd saat inkubasiya edilmişdir.

Daha sonra reaksiya:

100 μL %10 sodium dodecyl sulfate (SDS)

əlavə edilməklə dayandırılmış və nümunələr overnight inkubasiya edilmişdir.

Nəticələr inverted microscope ilə müşahidə edilmiş, absorbance ölçümü ELISA microplate reader ilə:

\[ 595\ \text{nm} \]

dalğa uzunluğunda aparılmışdır.

Hüceyrə canlılığı formulu

Mənbədə istifadə olunan formul:

\[ \%\ \text{Cell Viability} = \frac{ A_{\text{treatment}}-A_{\text{medium}} }{ A_{\text{cell control}}-A_{\text{medium}} } \times100 \]

Burada:

• \(A_{\text{treatment}}\): treatment quyusunun absorbance dəyəri,
• \(A_{\text{medium}}\): hüceyrəsiz medium/background absorbance dəyəri,
• \(A_{\text{cell control}}\): untreated cell-control absorbance dəyəridir.

Surətdə medium mənşəli background siqnalı treatment ölçümündən çıxılır. Məxrəc isə untreated cell control-un background-corrected siqnalıdır. Beləliklə treatment hüceyrə canlılığı control ilə müqayisədə faizlə normallaşdırılır.

Məsələn, nəticə %100-ə yaxındırsa, treatment qrupunun metabolik siqnalı untreated control-a yaxındır. Daha aşağı dəyərlər treatment şəraitində daha aşağı hüceyrə canlılığı ilə uyğundur.

Lakin MTT birbaşa “neçə hüceyrə öldü” sayımı deyil; metabolik aktivliyə əsaslanan viability ölçümüdür.

IC50 necə müəyyən edildi?

Mənbə IC₅₀ dəyərlərinin probit analysis ilə hesablandığını bildirir.

Probit analysis, müəyyən doza/konsentrasiya ilə ikili və ya nisbət formasındakı bioloji cavab arasındakı əlaqəni modelləşdirmək üçün istifadə olunan statistik yanaşmadır. Burada məqsəd təxminən %50 growth inhibition səviyyəsinə uyğun konsentrasiyanı qiymətləndirməkdir.

Doxorubicin-in IC₅₀ dəyərlərinin CBRB-dən çox daha aşağı olması mənbənin təcrübə şəraitində doxorubicin-in HepG2 canlılığını azaltmaqda çox daha yüksək potency göstərdiyini ortaya qoyur.

Mənbədə iki fərqli sitotoksiklik təsnifatı niyə diqqət tələb edir?

Metod bölməsi iki ayrı şərh çərçivəsi təqdim edir.

ISO 10993-5 əsaslı izahda cell-growth inhibition dərəcəsi üzərindən non-cytotoxic, slight, mild, moderate və severe cytotoxicity sinifləri müəyyən edilir.

Eyni bölmədə mənbə US National Cancer Institute-a istinadla IC₅₀ dəyərlərini:

• <20 μg/mL: yüksək cytotoxicity,
• 21–200 μg/mL: moderate cytotoxicity,
• 201–500 μg/mL: low cytotoxicity,
• >500 μg/mL: non-cytotoxic activity

şəklində təsnif edir.

CBRB-nin IC₅₀ dəyərləri 1.265 və 1.868 μg/mL olduğuna görə bu ikinci hədd sistemində >500 μg/mL intervalındadır. Buna baxmayaraq Results bölməsi 1.500–3.000 μg/mL-dəki nəzərəçarpan hüceyrə canlılığı azalmasını “moderate cytotoxicity” kimi ifadə edir.

Bu iki ifadə fərqli metriklərə əsaslandığı üçün bir-birinin əvəzinə istifadə edilməməlidir: biri IC₅₀ potency təsnifatı, digəri isə yüksək konkret konsentrasiyalarda müşahidə olunan viability inhibition dərəcəsidir.

MTT testinin əsas ədədi nəticələri

Wound-Healing Testi Hüceyrə Miqrasiyasını Necə Ölçür?

Wound-healing və ya scratch assay, bir-birinə yaxın böyümüş hüceyrə təbəqəsində süni boşluq yaradıb bu boşluğun zamanla hüceyrələr tərəfindən nə dərəcədə bağlandığını izləməklə hüceyrəvi miqrasiya davranışını qiymətləndirən in vitro üsuldur; bu tədqiqatda ilkin scratch eni ilə 24 və 48 saat sonrakı en müqayisə edilərək gap closure faizi və migration velocity hesablanmışdır.

Scratch assay təcrübə quruluşu

HepG2 hüceyrələri 24-well plate-ə:

\[ 7.5\times10^3\ \text{hücre/well} \]

sıxlığında əkilmişdir.

Hüceyrələr 24 saat və ya təxminən %80 confluence əldə edilənə qədər inkubasiya edilmişdir.

Confluence, hüceyrələrin kultura səthinin nə qədərini örtdüyünü ifadə edir. %80 confluence, səthin böyük hissəsinin bir-birinə yaxın hüceyrələrlə örtüldüyü, lakin tam bağlanmadığı vəziyyəti bildirir.

Daha sonra kultura səthində sterile yellow pipette tip istifadə edilərək şaquli scratch yaradılmışdır.

İlkin görüntü 0 saat məlumatı kimi inverted microscope altında 4×10 magnification ilə qeydə alınmışdır.

Təcrübə səkkiz qrupdan ibarət olmuşdur:

• Control,
• %1 DMSO,
• Doxorubicin 1 μg/mL,
• Doxorubicin 2 μg/mL,
• CBRB 250 μg/mL,
• CBRB 500 μg/mL,
• CBRB 1.000 μg/mL,
• CBRB 1.500 μg/mL.

Görüntülər 24 və 48 saatın sonunda yenidən çəkilmişdir.

Gap closure formulu

\[ \text{Gap Closure} = \frac{i_l-i_f}{i_l}\times100\% \]

Burada:

• \(i_l\): 0 saat ilkin scratch/gap ölçüsü,
• \(i_f\): müvafiq inkubasiya müddətinin sonunda qalan gap ölçüsüdür.

İlkin boşluq böyük ölçüdə bağlanarsa \(i_f\) kiçilir və gap closure faizi artır. Hüceyrələrin boşluğu bağlaması basqılanarsa \(i_f\) daha böyük qalır və gap closure aşağı olur.

Migration velocity formulu

\[ \text{Velocity} = \frac{i_l-i_f}{\text{total time}} \]

Bu formul scratch enindəki dəyişikliyi keçən zamana bölür.

Mənbə velocity qrafikində vahidi μm/h kimi göstərir.

Hüceyrə miqrasiyasının nəticəsi

CBRB qrupunda konsentrasiya artdıqca gap closure və migration velocity dəyərləri azalma meyli göstərmişdir.

250–1.000 μg/mL intervalında mənbə əhəmiyyətli olmayan müqayisələr bildirir.

1.500 μg/mL CBRB isə gap closure və migration velocity-də əhəmiyyətli azalma göstərmişdir:

\[ p\le0.05 \]

Doxorubicin 2 μg/mL də 24 və 48 saat şəraitində aşağı gap closure və migration velocity yaratmışdır.

Bu nəticə CBRB-nin yüksək konsentrasiyada HepG2 hüceyrələrinin scratch sahəsini bağlama qabiliyyəti ilə əlaqəli miqrasiya davranışını azalda bildiyini göstərir.

Lakin scratch assay yalnız saf cell migration ölçümü deyil; hüceyrə canlılığı və proliferasiyasındakı güclü dəyişikliklər də gap closure nəticəsinə təsir edə bilər. Bu tədqiqatda CBRB 1.500 μg/mL eyni zamanda sitotoksik təsirin ortaya çıxmağa başladığı konsentrasiya intervalındadır. Buna görə migration inhibition ilə cytotoxicity tamamilə müstəqil mexanizmlər kimi qəbul edilməməlidir.

Flow Cytometry ilə Apoptoz Analizi Nəyi Göstərir?

Flow cytometry analizi Annexin V-FITC işarələnməsi ilə hüceyrə populyasiyasını viable, necrotic, early-apoptotic və late-apoptotic bölgələrə ayıraraq CBRB tətbiqindən sonra hüceyrə ölümünün hansı fenotiplə əlaqəli olduğunu qiymətləndirmişdir; mənbənin ən nəzərəçarpan nəticəsi 1.500 μg/mL CBRB-də %60,35±0,01 erkən apoptoz müşahidə edilməsidir.

Flow cytometry təcrübə şəraiti

HepG2 hüceyrələri 6-well plate-ə:

\[ 3\times10^5\ \text{hücre/well} \]

sıxlığında əkilmişdir.

İlkin inkubasiya şəraiti:

• 37°C,
• %5 CO₂,
• 24 saat.

Daha sonra kultura mühiti aşağıdakı treatment qrupları ilə əvəz edilmişdir:

• %1 DMSO,
• Doxorubicin 2 μg/mL,
• CBRB 500 μg/mL,
• CBRB 1.000 μg/mL,
• CBRB 1.500 μg/mL.

Treatment müddəti 48 saatdır.

Hüceyrələrə təxminən 30 dəqiqə Annexin V-FITC tətbiq edilmiş və ölçmələr FACS Calibur flow cytometer ilə aparılmışdır.

Dörd flow-cytometry bölgəsi

Mənbə dörd quadrant-ı belə adlandırır:

• Quadrant 1: Necrosis cells,
• Quadrant 2: Late apoptosis cells,
• Quadrant 3: Live cells,
• Quadrant 4: Early apoptosis cells.

Erkən apoptoz

CBRB konsentrasiyası yüksəldikcə early-apoptotic cell nisbətinin artma meyli müşahidə edilmişdir.

1.500 μg/mL CBRB-də:

\[ Early\ apoptosis=60.35\pm0.01\% \]

bildirilmiş və mənbə bu nəticəni digər qruplardan əhəmiyyətli dərəcədə fərqli kimi vermişdir:

\[ p\le0.05 \]

Nekroz

Mənbə:

Doxorubicin 2 μg/mL üçün:

\[ Necrosis=6.10\pm0.04\% \]

CBRB 1.500 μg/mL üçün:

\[ Necrosis=2.45\pm0.06\% \]

bildirir.

Lakin eyni paraqraf bu nəticələri “significant differences (p>0.05)” şəklində ifadə edir. Statistik terminologiya baxımından “significant” ilə p>0,05 ifadəsi bir-birinə uyğun gəlmir. Mənbədə exact corrected p-value olmadığı üçün Verianla bunu p≤0,05 olaraq dəyişmir.

Gec apoptoz

Doxorubicin 2 μg/mL qrupu:

\[ Late\ apoptosis=32.5\pm0.13\% \]

ilə mənbədə ən yüksək dəyəri göstərmişdir.

CBRB qruplarında konsentrasiya yüksəldikcə late apoptosis dəyərinin artdığı bildirilir; lakin Results bölməsi qruplar arasındakı late-apoptosis fərqlərinin:

\[ p>0.05 \]

olduğunu bildirir.

Abstract ilə Results arasındakı apoptoz fərqi

Abstract CBRB-nin 1.000 μg/mL-dən yuxarı konsentrasiyalarda “enhanced late apoptosis” göstərdiyini bildirir.

Bunun əksinə, ətraflı Results:

• 1.500 μg/mL-də early apoptosis üçün güclü və əhəmiyyətli artım,
• late apoptosis üçün artan meyl, lakin p>0,05

bildirir.

Buna görə tədqiqatın ən güclü və birbaşa statistik apoptoz nəticəsi 1.500 μg/mL CBRB-dəki early apoptosis artımıdır.

Flow cytometry hansı yolu sübut etmir?

Flow cytometry nəticəsi apoptosis ilə uyğun hüceyrə ölümünü göstərsə də, tədqiqatda:

• Bax,
• Bcl-2,
• Bcl-xL,
• caspase-3,
• caspase-7,
• caspase-9,
• p53,
• PI3K/Akt,
• Erk

ölçülməmişdir.

Bu molekulyar mexanizmlər Discussion bölməsində əvvəlki tədqiqatlar əsasında izah olunur. Mövcud tədqiqat CBRB-nin intrinsic və ya extrinsic apoptosis pathway-lərindən hansını aktivləşdirdiyini müəyyən etməmişdir.

Üç eksperimental istiqamət birlikdə necə oxunmalıdır?

Mənbə üç nəticə arasında bənzər konsentrasiya nümunəsi görür:

1. Yüksək CBRB konsentrasiyalarında hüceyrə canlılığı azalır.
2. 1.500 μg/mL ətrafında cell migration azalır.
3. 1.500 μg/mL-də early apoptosis nəzərəçarpan dərəcədə artır.

Bu nəticələr bioloji baxımdan bir-biri ilə uyğundur.

Lakin mənbə ayrıca correlation coefficient və ya formal correlation analysis vermir. Buna görə “correlation” ifadəsi burada üç assay-dəki oxşar nümunəni təsvir edən müəllif şərhi kimi qəbul edilməlidir.

Statistik analiz

Cytotoxicity, migration və apoptosis məlumatları:

• One-way Analysis of Variance (ANOVA),
• əhəmiyyətlilik həddi p≤0,05,
• əhəmiyyətli ANOVA-dan sonra Tukey Honestly Significant Difference (Tukey HSD),
• SPSS version 25

ilə analiz edilmişdir.

One-way ANOVA, birdən çox treatment qrupunun orta dəyərləri arasında ümumilikdə əhəmiyyətli fərq olub-olmadığını yoxlayır.

Tukey HSD, ANOVA ümumi fərq göstərdikdən sonra hansı qrup cütlərinin bir-birindən fərqləndiyini qiymətləndirən post-hoc multiple-comparison testidir.

Figure 1–3 caption-larında:

\[ n=3 \]

bildirilmişdir və fərqli hərflər p≤0,05 səviyyəsində əhəmiyyətli qrup fərqlərini göstərir.

Mənbə n=3 təkrarların bioloji müstəqil təkrar, texniki təkrar və ya başqa replication quruluşu olduğunu ətraflı açıqlamır.

Bu Tədqiqat Qara Düyü Kəpəyinin İnsanlarda Xərçəngi Müalicə Etdiyini Göstərirmi?

Xeyr. Tədqiqat yalnız laboratoriya şəraitində HepG2 hüceyrə xəttində CBRB-nin yüksək konsentrasiyalarda hüceyrə canlılığını, miqrasiyasını və apoptotik hüceyrə nisbətlərini dəyişdirə bildiyini göstərir; insanlarda sorulma, metabolizm, effektiv doza, toksiklik, şiş cavabı, klinik təhlükəsizlik və ya müalicə uğuru araşdırılmadığı üçün nəticələr insanlarda xərçəng müalicəsi və ya xərçəngdən qorunma sübutu kimi şərh edilə bilməz.

“Chemopreventive potential” nə deməkdir?

Müəlliflər nəticələri təbii chemopreventive-agent araşdırması çərçivəsində müzakirə edirlər.

Lakin HepG2 kulturasındakı cytotoxic, antimigratory və apoptotic activity namizəd ekstraktın bioloji aktivliyinə dair erkən laboratoriya sübutudur.

Bu tədqiqat:

• xərçəng inkişafının qarşısının alınmasını canlı orqanizmdə ölçməmişdir,
• metastasis yaranmasını heyvan və ya insan modelində ölçməmişdir,
• oral bioavailability-ni araşdırmamışdır,
• pharmacokinetic tədqiqat aparmamışdır,
• normal qaraciyər hüceyrələri ilə selectivity testi bildirməmişdir,
• insan təhlükəsizliyini qiymətləndirməmişdir.

Buna görə “potential” sözü kritik əhəmiyyət daşıyır.

“Safe for further development” ifadəsinin sərhədi

Discussion bölməsində apoptosis yolu ilə hüceyrə ölümünün ekstraktın təbii chemopreventive agent kimi daha da inkişaf etdirilməsi üçün təhlükəsiz olduğuna işarə etdiyi istiqamətində şərh vardır.

Lakin mövcud təcrübə:

• normal hepatocyte cytotoxicity,
• organ toxicity,
• genotoxicity,
• animal toxicity,
• human adverse effects

ölçmür.

Buna görə Verianla baxımından mövcud məlumatlar “təhlükəsiz olduğu göstərildi” nəticəsini dəstəkləmir. Təhlükəsizlik ayrıca təcrübələrlə doğrulanmalıdır.

Ekstraktın hansı komponenti təsirdən məsuldur?

Bu tədqiqat bunu müəyyən etməmişdir.

Discussion anthocyanins və digər phytochemical compounds-ı mümkün izahlar kimi müzakirə edir; lakin CBRB-nin:

• anthocyanin concentration,
• cyanidin-3-glucoside miqdarı,
• peonidin-3-glucoside miqdarı,
• digər aktiv compound profili

ölçülməmişdir.

Müəlliflər buna görə solvent fractionation, phytochemical characterization və molecular-mechanism studies təklif edirlər.

Ekstraksiya üsulu niyə məhdudiyyət yaradır?

Discussion bölməsində kloroformun nonpolar solvent olması səbəbindən bəzi phytochemical komponentləri polar solventlərlə müqayisədə daha aşağı səmərəliliklə çıxara biləcəyi müzakirə edilir.

Mənbə həmçinin ekstraktın 4°C-də saxlandığını, extraction prosesinin room temperature-da və hava ilə birbaşa təmasda həyata keçirildiyini bildirir.

Müəlliflər anthocyaninlərin işıq, rütubət, pH, temperatur və oksigendən təsirlənə bildiyini; extraction və storage şəraitinin phytochemical stability üzərində təsirli ola biləcəyini müzakirə edirlər.

Lakin anthocyanin miqdarı təcrübədən əvvəl və sonra birbaşa ölçülmədiyi üçün bu izah ölçülmüş degradation nəticəsi deyil, ədəbiyyata əsaslanan şərhdir.

Tədqiqatın Metodu və Nəticələri

Eksperimental dizaynın ümumi görünüşü

Figure 1 nə göstərir?

Mənbə Figure 1 HepG2 cell viability-ni 24 saatlıq panel A və 48 saatlıq panel B olmaqla iki paneldə göstərir.

Qrafikdə:

• Control,
• %1 DMSO,
• altı doxorubicin concentration,
• on bir CBRB concentration

müqayisə olunur.

Y oxu Cell Viability (%) dəyəridir.

Sütunlar mean±standard deviation formasındadır.

n=3-dür.

Sütunların üzərindəki fərqli hərflər p≤0,05 səviyyəsində statistik fərqləri təmsil edir.

Figure 1-in əsas elmi mesajı CBRB-nin aşağı və orta konsentrasiyalarının HepG2 viability üzərində məhdud təsir göstərməsi, nəzərəçarpan canlılıq azalmasının xüsusilə 1.500–3.000 μg/mL intervalında ortaya çıxmasıdır. Doxorubicin isə μg/mL səviyyəsində çox daha aşağı konsentrasiyalarda canlılığı azaldır.

Figure 2 nə göstərir?

Mənbə Figure 2 dörd paneldən ibarətdir:

• A: 24 saat Gap closure (%),
• B: 24 saat Velocity (μm/h),
• C: 48 saat Gap closure (%),
• D: 48 saat Velocity (μm/h).

Control və %1 DMSO qruplarında scratch sahəsinin bağlanması daha yüksəkdir.

Doxorubicin 2 μg/mL ilə CBRB 1.500 μg/mL aşağı gap closure və velocity göstərir.

CBRB konsentrasiyası yüksəldikcə hüceyrə migration göstəricilərində azalma meyli görünür.

Figure 2-nin bütün sütunlarının dəqiq ədədi dəyərləri Results prose-da verilmədiyi üçün Verianla qrafikdən təxmini dəyərləri dəqiq ölçüm kimi yenidən istehsal etmir.

Figure 3 nə göstərir?

Figure 3 flow-cytometry nəticələrinin dörd ayrı çıxışını göstərir:

• A: viable cells,
• B: necrosis,
• C: early apoptosis,
• D: late apoptosis.

Figure 3 görüntüsündə CBRB 1.500 μg/mL qrupunda viable-cell sütunu aşağı, early-apoptosis sütunu isə ən yüksək səviyyədədir.

Mənbə prose bu erkən-apoptoz dəyərini dəqiq olaraq:

\[ 60.35\pm0.01\% \]

şəklində bildirir.

Tədqiqatın dəstəklədiyi nəticələr

• CBRB HepG2 hüceyrələrində aşağı konsentrasiyalarda doxorubicin-dən çox daha aşağı cytotoxic potency göstərmişdir.
• CBRB-nin nəzərəçarpan cell-viability azalması xüsusilə 1.500–3.000 μg/mL kimi yüksək konsentrasiyalarda ortaya çıxmışdır.
• 48 saatda 2.000 μg/mL CBRB viability-ni %30,39±12,23-ə endirmişdir.
• 48 saatda 3.000 μg/mL CBRB viability %4,9±0,67-yə enmişdir.
• CBRB IC50 dəyəri 24 saatda 1.265 μg/mL, 48 saatda 1.868 μg/mL-dir.
• Doxorubicin IC50 dəyəri 24 saatda 0,44 μg/mL, 48 saatda 0,18 μg/mL-dir.
• 1.500 μg/mL CBRB HepG2 gap closure və migration velocity dəyərlərini əhəmiyyətli şəkildə azaltmışdır.
• 1.500 μg/mL CBRB-də early apoptosis %60,35±0,01 ilə nəzərəçarpan dərəcədə artmışdır.
• CBRB tətbiqindəki cell death pattern apoptosis ilə uyğundur.

Tədqiqatın birbaşa dəstəkləmədiyi nəticələr

• CBRB-nin insanlarda qaraciyər xərçəngini müalicə etdiyi göstərilməmişdir.
• CBRB-nin insanlarda xərçəngin qarşısını aldığı göstərilməmişdir.
• Təhlükəsiz insan dozası müəyyən edilməmişdir.
• Normal qaraciyər hüceyrələrinə qarşı selectivity birbaşa sınaqdan keçirilməmişdir.
• Heyvan modeli istifadə edilməmişdir.
• Clinical pharmacokinetics və ya bioavailability araşdırılmamışdır.
• CBRB-nin hansı chemical compound-unun təsirdən məsul olduğu müəyyən edilməmişdir.
• Anthocyanin concentration bu tədqiqatda ölçülməmişdir.
• Intrinsic və ya extrinsic apoptosis pathway təsdiqlənməmişdir.
• Microtubule disruption birbaşa ölçülməmişdir.
• RAS/RAF/MAPK, PI3K/Akt, Erk və ya caspase pathways mövcud təcrübə ilə təsdiqlənməmişdir.
• “Correlation” ifadəsi üçün ayrıca correlation coefficient dərc edilməmişdir.

Mənbə daxilində diqqət tələb edən hesabat nöqtələri

Tədqiqatın əsas güclü tərəfləri

Tədqiqat yalnız bir assay ilə kifayətlənməmiş; hüceyrə canlılığı, cell migration və cell-death phenotype olmaqla üç bioloji səviyyəni birlikdə qiymətləndirmişdir.

Doxorubicin və solvent-control qrupları istifadə edilmişdir.

24 və 48 saatlıq zaman nöqtələri cytotoxicity və migration təcrübələrində birlikdə araşdırılmışdır.

Viability üçün IC₅₀, migration üçün gap closure/velocity və apoptosis üçün flow-cytometric cell-state paylanması kimi bir-birindən fərqli ölçüm növləri istifadə edilmişdir.

Əsas məhdudiyyətlər

Tək hüceyrə xətti: Nəticələr yalnız HepG2 hüceyrə xəttində əldə edilmişdir.

Normal hüceyrə müqayisəsi yoxdur: Cancer-cell selectivity haqqında birbaşa nəticə çıxarıla bilməz.

Yüksək CBRB konsentrasiyaları: Nəzərəçarpan activity əsasən 1.500 μg/mL və yuxarı yüksək konsentrasiyalarda ortaya çıxmışdır.

Phytochemical characterization yoxdur: Ekstraktdakı aktiv komponentlər kəmiyyətcə müəyyən edilməmişdir.

Nonpolar extraction: Müəlliflər kloroform ekstraksiyasının bəzi phytochemicals üçün məhdudlaşdırıcı ola biləcəyini bildirirlər.

Molecular pathway analysis yoxdur: Apoptosis və migration üzərində hansı spesifik molekulyar yolun məsul olduğu müəyyən edilməmişdir.

In vitro sərhədi: Absorption, metabolism, systemic toxicity və in vivo tumor response qiymətləndirilməmişdir.

Replication təfərrüatı: Figurlar n=3 göstərir, lakin təkrarların texniki/bioloji quruluşu tam izah edilmir.

Extract yield bildirilməyib: 10 g kəpəkdən əldə edilən yekun ekstrakt miqdarı/faizi verilmir.

Cell-line reproducibility təfərrüatları: Mənbə HepG2 culture location məlumatını verir; cell-line catalog number, authentication və ya mycoplasma-testing məlumatı bildirilmir.

Mənbə daxilində statistik dil: Necrosis bölməsində “significant” ilə p>0,05 eyni cümlədə istifadə olunmuşdur.

Gələcək tədqiqat istiqaməti

Müəlliflərin birbaşa təklif etdiyi növbəti tədqiqatlar:

• solvent fractionation,
• active compound isolation,
• phytochemical characterization,
• molecular mechanism analysis

üzərində cəmlənir.

Məqsəd CBRB daxilində müşahidə olunan biological activity-dən hansı komponentlərin məsul olduğunu müəyyən etmək və Sembada Hitam qara düyü kəpəyinin chemopreventive potential-ını daha nəzarətli şəkildə qiymətləndirməkdir.

Mənbə və Metod Qeydi

Orijinal tədqiqat: Anticancer Potential of Chloroform Extract from Black Rice (Oryza sativa L. ‘Sembada Hitam’) Bran Against HepG2 Liver Cancer Cells.

Müəlliflər: Bima Mahendra, Nabila Ramiza Puteri, Yekti Asih Purwestri, Sekar Rahayu, Ardaning Nuriliani.

Müəllif sırası: Mənbə PDF və cari rəsmi jurnal metadata-sındakı sıra qorunub.

Bərabər töhfə: Mənbədə equal-contribution bəyanatı yoxdur.

Məsul müəllif: Ardaning Nuriliani.

Qurum 1: Department of Tropical Biology, Faculty of Biology, Universitas Gadjah Mada, Sleman, Yogyakarta 55281, Indonesia.

Qurum 2: Department of Biomedical Science, Faculty of Medicine, Public Health, and Nursing, Universitas Gadjah Mada, Sleman, Yogyakarta 55281, Indonesia.

Qurum 3: Master Program, Faculty of Biology, Universitas Gadjah Mada, Sleman, Yogyakarta 55281, Indonesia.

Jurnal: HAYATI Journal of Biosciences.

Nəşriyyat strukturu: Department of Biology, Bogor Agricultural University/IPB University və Indonesian Society for Biology.

Cild / nömrə: Vol. 33 No. 6.

Nömrə tarixi: November 2026.

Səhifələr: 1403–1413.

DOI: 10.4308/hjb.33.6.1403-1413.

ISSN: 1978-3019.

EISSN: 2086-4094.

Mənbə növü: Short Communication.

Rəy prosesi: HAYATI Journal of Biosciences double-blind peer review tətbiq edir. Jurnal siyasəti Short Communication növünün Research Article ilə eyni dərinlikdə review aldığını bildirir.

Received: September 19, 2025.

Received in revised form: July 17, 2026.

Accepted: September 8, 2026.

PDF Available Online: October 1, 2026.

Rəsmi web metadata-sındakı Published tarixi: November 1, 2026.

Tarix qeydi: PDF-nin Available Online tarixi ilə jurnalın issue/publication metadata tarixi fərqli nəşr mərhələlərini göstərir.

Lisenziya: Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License (CC BY-NC 4.0).

Preprint: Mənbə PDF və doğrulanmış rəsmi qeyddə ayrıca preprint göstərilmir.

Tədqiqat müddəti: December 2022 – October 2023.

Tədqiqat növü: Experimental in vitro cell-culture study.

Hüceyrə xətti: HepG2.

Bitki materialı: Oryza sativa L. ‘Sembada Hitam’ black rice bran.

Material mənbəyi: Local farmers, Ngaglik, Sleman, Special Region of Yogyakarta, Indonesia.

Ekstraksiya: 10 g bran powder + 100 mL chloroform; 48 saat maceration; Whatman No.1 filtration; overnight remaceration; evaporation to paste-like solid.

Test solventi: %1 DMSO.

MTT CBRB konsentrasiyaları: 7,8; 15,6; 31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1.000; 1.500; 2.000; 3.000 μg/mL.

Doxorubicin MTT konsentrasiyaları: 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8 μg/mL.

MTT cell seeding: 1×10⁴ cells/well, 96-well plate.

MTT culture medium: DMEM + %10 FBS + %2 penicillin–streptomycin + %0,5 amphotericin B.

MTT reaction: 100 μL MTT, 4 saat; 100 μL %10 SDS, overnight.

Absorbance: 595 nm, ELISA microplate reader.

IC50 üsulu: Probit analysis.

CBRB IC50: 1.265 μg/mL at 24 h; 1.868 μg/mL at 48 h.

Doxorubicin IC50: 0,44 μg/mL at 24 h; 0,18 μg/mL at 48 h.

48 h CBRB viability: 2.000 μg/mL → %30,39±12,23; 3.000 μg/mL → %4,9±0,67.

Wound-healing cell seeding: 7,5×10³ cells/well, 24-well plate.

Wound-healing CBRB: 250, 500, 1.000, 1.500 μg/mL.

Wound-healing doxorubicin: 1 və 2 μg/mL.

Migration ölçmələri: Gap closure (%) və velocity (μm/h).

Migration nəticəsi: 1.500 μg/mL CBRB-də əhəmiyyətli reduction; p≤0,05.

Flow-cytometry cell seeding: 3×10⁵ cells/well, 6-well plate.

Flow-cytometry treatment: %1 DMSO, doxorubicin 2 μg/mL və CBRB 500, 1.000, 1.500 μg/mL.

Flow-cytometry treatment müddəti: 48 saat.

Reagent: Annexin V-FITC; təxminən 30 dəqiqə.

Cihaz: FACS Calibur flow cytometer.

CBRB 1.500 μg/mL early apoptosis: %60,35±0,01.

CBRB 1.500 μg/mL necrosis: %2,45±0,06.

Doxorubicin 2 μg/mL necrosis: %6,10±0,04.

Doxorubicin 2 μg/mL late apoptosis: %32,5±0,13.

Statistika: One-way ANOVA, p≤0,05; significant result-dan sonra Tukey HSD; SPSS version 25.

Replication: Figure 1–3 caption-ları n=3 göstərir; texniki və ya bioloji təkrar quruluşu ətraflı açıqlanmır.

Funding: Doctoral Competency Grant (Hibah Kompetensi Doktor) 2023, Universitas Gadjah Mada; Assignment Letter No. 7743/UN1.P.II/Dit-Lit/PT.01.03/2023.

Ethical approval: Ethics Committee of the Faculty of Medicine, Public Health, and Nursing, Universitas Gadjah Mada; Ref. No. KE/FK/1299/EC/2022.

Data Availability: Mənbə PDF-də ayrıca data-availability statement yoxdur.

Conflict of Interest: Mənbə PDF-də ayrıca conflict-of-interest statement yoxdur.

CRediT / Author Contributions: Mənbə PDF-də ayrıca author-contribution/CRediT bölməsi yoxdur.

Phytochemical quantification: Tədqiqatda CBRB-nin anthocyanin və ya digər aktiv compound miqdarları birbaşa ölçülməmişdir.

Molecular pathway analysis: Aparılmayıb; intrinsic/extrinsic apoptosis pathway müəyyən edilməyib.

Normal-cell selectivity: Mənbədə normal hepatocyte comparison bildirilmir.

In vivo / clinical validation: Yoxdur.

Əsas şərh sərhədi: Nəticələr yalnız istifadə olunan HepG2 in vitro şəraiti üçün keçərlidir; insanlarda xərçəng müalicəsi, xərçəngdən qorunma və ya təhlükəsiz istehlak/doza nəticəsi yaratmır.

Mənbə daxilində hesabat qeydi 1: Abstract late-apoptosis artımını vurğuladığı halda Results ən güclü əhəmiyyətli nəticəni early apoptosis üçün verir; late apoptosis üçün p>0,05 bildirilmişdir.

Mənbə daxilində hesabat qeydi 2: Necrosis Results cümləsində “significant differences (p>0.05)” ifadəsi vardır.

Mənbə daxilində hesabat qeydi 3: CBRB yüksək konsentrasiyalardakı viability inhibition baxımından “moderate cytotoxicity” kimi xarakterizə olunduğu halda, mənbənin verdiyi IC50 təsnifatında >500 μg/mL ayrıca potency kateqoriyasına uyğun gəlir.

Mənbə daxilində hesabat qeydi 4: Discussion bir yerdə HeLa-nı “breast cancer cells” kimi adlandırdığı halda Introduction HeLa-nı human cervical cancer cell line kimi təsvir edir.