Ushbu tadqiqot, Qadimiy Xitoy tibbiyotida qo'llaniladigan Nauclea officinalis rastemining antiinflammatuar ta'siri uchun mas'ul bo'ladigan kimyoviy tarkibiy qismlar va bu qismlarning hujayra ichida qaysi proteinlar bilan bog'lanishi mumkinligini tekshiradi. Tadqiqotchilar bitta tahlil usuliga tayanmasdan, o'rniga shunga o'xshash reja bo'yicha farmakologiya, belgisiz miqdoriy proteomika, protein-protein o'zaro aloqa tahlili, molekulyar kenetlenish, molekulyar dinamika simulyatsiyasi, MM/PBSA bog'lanish erkini energiya hisoblari va hujayra madaniyati tajribalarini birgalikda keltirib chiqdi.

Adabiyotdan yig'ilgan 279 ta N. officinalis tarkibiy qismlar orasidan dori o'xshashligi mezonlarini qondirgan 210 ta tarkibiy qism uchun 980 ta mumkin bo'lgan protein maqsadi taxmin qilindi. Vosita bilan bog'liq 3.084 ta kasallik maqsadi bilan solishtirish qilishda 331 ta umumiy maqsad topildi. To'r tahlillari PARP1, DNMT1, MAPK1, TNF, EGFR, STAT3 va TLR4 kabi proteinlarni yuqori bog'langan tugunlar sifatida ko'rsatdi. LPS bilan inflamatsiya yaratilgan RAW264.7 sichqon makrofaglarida amalga oshirilgan proteomika tahlili N. officinalis ekstraktining ko'plab proteinning darajasini o'zgartirganligi ko'rsatdi; to'r farmakologiyasi va proteomika natijalari kesishuvidan PARP1 va DNMT1 ikkita asosiy potensial maqsad sifatida tanlandi.

Tuzilmaviy virtual tarama natijasida PARP1 uchun PP45_3 kodli Nauklefolina, DNMT1 uchun esa PP199_76 kodli Angustidin ajralib chiqdi. Tadqiqotda PP45_3–PARP1 kompleksi uchun bog'lanish erkini energiyasi −23,65 ± 4,99 kcal/mol, PP199_76–DNMT1 kompleksi uchun −24,23 ± 4,83 kcal/mol deb bildirildi. LPS bilan uyg'unlashtiruvchi makrofagalarda azot oksidi ishlab chiqarishini susutirish asosida tajribalarda PP45_3 uchun IC₅₀ 14,3 µM, PP199_76 uchun esa 9,3 µM deb hisoblandi.

Bu natijalari ikkita molekulani antiinflammatuar dori sifatida isbotlamaydi. Tadqiqot faqat bitta sichqon makrofag hujayra liniyasida, bitta inflamatsiya modeli va ko'p darajada azot oksidi ishlab chiqarishligi asosida biologik o'qish ishlatdi. PARP1 va DNMT1 bilan to'g'ridan-to'g'ri biokimyoviy maqsad o'zaro ta'siri, enzim inhibisyoni, genetik tasdiq, hayvon tajribasi, insan xavfsizligi yoki klinik samaradorligi ko'rsatilmadi. Bundan tashqari, tadqiqot hamkorlik baholashidan o'tmagan preprinttir.

Tadqiqotning asosiy muammosi nima?

Inflamatsiya, to'qimaning infeksiya, toksina, travma yoki boshqa zararli uyg'unfillarga qarshi rivojlantiradigan himoya reaksiyasidir. Qisqa vaqt uchun va nazorat qilish uchun foydalanuvchi bo'lishi mumkin; ammo ortiqcha, yetkisiz yoki uzoq vaqt bo'lsa, u to'qima shikastlanishi va kasallik uyg'unfillashning bir qismiga aylanishi mumkin. Tadqiqotning boshlanish nuqtasi, keng qo'llanilgan antiinflammatuar doralarning samarali bo'lishiga qaramay, gastrointestinal, kardiovaskuya, renal va gepatik tomoni ta'sirlari bilan bog'lanishi va shuning uchun tabiatdan kelib chiqqan yangi nomzodlarga ehtiyoj bo'lishidir.

Nauclea officinalis, Xitoyda "Dan Mu" nomi bilan tanilgan va an'anava qo'llaniladigan Rubiaceae oilasiga tegishli o'simlikdir. Oldingi tadqiqotlar bu o'simlikning xom ekstraktining LPS bilan uyg'unlashtiruvchi makrofagalarda azot oksidi, TNF-α va IL-6 kabi inflammatuar vositalarning ishlab chiqarilishini kamaytira olganligini; NF-κB signallash yo'lidagi IκB-α va p65 proteinlarining fosforilashini boshlaya olganligini bildirildi. Ammo xom ekstrakti, ko'plab kimyoviylar bir joyda bo'lgan murakkab aralashah. Xom ekstrakti samarali bo'lishi, qaysi tarkibiy qismni qaysi proteiniga bog'lanishi yoki qaysi molekulyar mexanizm asos bo'lganligini bir boshidan ko'rsatmaydi.

Tadqiqotning javob berishga harakat qilayotgan asosiy savoli shuning uchun quyidagicha: N. officinalis ichidagi yuzlab kimyoviy tarkibiy qismlar orasidan antiinflammatuar ta'sirga hissa qo'shishi mumkin bo'lgan aniq molekulalar va ularning mumkin bo'lgan protein maqsadlari sistemali tarzda aniqlash mumkinmi?

Adabiyotdagi boşluq

Tadqiqotga ko'ra ilgari N. officinalis xom ekstrakti va Striktosamid kabi cheklangan sonli tarkibiy qismlar ustida antiinflammatuar tadqiqotlar o'tkazilgan. Ammo o'simlikning kimyoviy ko'p türfliligi, kasallik bilan bog'liq protein to'rlari, hujayral proteom o'zgarishlari va molekulyar bog'lanish modellarini bir xil tadqiqot doirasida birlashtiradigan "tarkibiy qism–maqsad" xaritasi mavjud emas.

Bu boşluq ikkita muhim muammo doʻirilaydi:

• Xom ekstraktda kuzatilgan ta'sirni qaysi sof molekulalardan kelib chiqqanligi aniq bilinmaydi.
• Faol ko'rinishi keladigan molekulalarning hujayra ichida to'g'ridan-to'g'ri yoki bilvosita qaysi proteinlar bilan bog'langanligini ko'rsata olamaydi.

Tadqiqotchilar bu ikkita muammoni hal qilish uchun avvalo keng nomzodlar fondi yaratdi, so'ng har bir bosqichda nomzod sonini kamaytiradigan elim tartibini o'rnatdi. Tadqiqotning 1-rasmdagi iş jarayoni; xom ekstraktning hujayral tasdiqlanishi, to'r farmakologiyasi, proteomika, virtual tarama va sof tarkibiy qismlarning hujayral sinov qilish olmak bo'yicha beshta asosiy bosqichdan iborat.

279 tarkibiy qismdan boshlanadigan kimyoviy tarama

Tadqiqotchilar PubMed, Web of Science, CNKI va VIP kabi ma'lumotlar manbalariga Aprel 2025 yilgacha nashr etilgan N. officinalis tadqiqotlarini taraib, 279 ta kimyoviy tarkibiy qismlardan iborat kutubxona tayyorladi. Bu tarkibiy qismlarning:

• 199'i asosiy bitta yig'indilash tadqiqotidan olinib va "PP199_" prefixiga bilan,
• 45'i boshqa bir keng doiradagi tadqiqotdan olinib va "PP45_" prefixiga bilan,
• 35'i esa boshqa nashrlardan olinib va "PP35_" prefixiga bilan

kodlangandir. Bu kodlar molekulalarning kimyoviy nomi emas, tadqiqot paytida foydalaniladigan kutubxona shaxsiy raqamlaridir.

SwissADME orqali amalga oshirilgan dori o'xshashligi tarashida yuqori gastrointestinal so'rilish prognozi, 0,55 dan oshgan bioyararliligi qiymati va Lipinski, Veber, Xoz, Muegge va Egan filtrlariga muvofiqlik qidirildi. Bundan tashqari, ko'plab tahlillarda noto'g'ri musbat natijalarga sabab bo'ladigan pan-assay interference compounds, ya'ni PAINS tuzilmalari chuqur. Takrorlangan yozuvlarni ham olib tashlashda 210 ta tarkibiy qism maqsad taxmini uchun olingan.

Bu filtrlar molekulaning insonlarda samarali, xavfsiz yoki klinik jihatdan ishlatilish imkoni bo'lganligini isbotlamaydi. Faqat kimyoviy xususiyatlari jihatidan dori ishlab chiqish jihatidan yanada qulay ko'rinadigan nomzodlarni ustuvorlikka olishga yordam beradi.

To'r farmakologiyasi: O'simlik tarkibiy qismlaridan protein to'rini o'tish

SwissTargetPrediction bilan 210 ta tarkibiy qism uchun mumkin bo'lgan protein maqsadlari taxmin qilindi va ehtimollik bali 0,1 dan past maqsadlar chuqur. Natijada 980 ta mumkin bo'lgan protein maqsadi olingan.

Kasallik bilan bog'liq maqsadlar GeneCards, Therapeutic Target Database va OMIM manbalarindan yig'ildi. Usul bo'limida kasallik qidiruvining umumiy "inflamatsiya" atamasidan ko'ra, vakili inflammatuar holat sifatida "pnevmoniya", ya'ni o'pka yallig'ini orqali amalga oshirilganligini ko'rsatadi. Bu qidirish 3.084 ta kasallik maqsadi ishlab chiqdi. O'simlik tarkibiy qismlarning maqsadlari kasallik maqsadlari bilan solishtirish qilishda 331 ta umumiy protein topilgan.

2-rasmdagi Venn diagramasi bu kesishuvni ko'rsatadi. Katta kasallik to'plamida faqat kasallik ma'lumotlarida topilgan 2.753 ta maqsad, o'simlik tomonida faqat N. officinalis tarkibiy qismlari bilan bog'langan 649 ta maqsad va o'rtada ikkala guruhning umumiy bo'lgan 331 ta maqsad joylashgan. Bu umumiylik, 331 ta proteinni chinakam davolagich maqsadi deb isbotlamaydi; faqat ham kasallik ma'lumotlar tizimida ham kimyoviy maqsad tahminlarida uchraydigan nomzodlarni ko'rsatadi.

Boy qo'shish tahlillari nima aytdi?

331 ta umumiy maqsad ustida Gene Ontology, KEGG va Reactome boy qo'shish tahlillari o'tkazildi. Gene Ontology tahlilida uchta asosiy kategoriya o'rgandi:

• Biologik jarayonlar: Makrofag aktivatsiyasi, TNF signali, inflammatuar javobning ijobiy tartiblanishi va LPS ga javob.
• Hujayral komponentlar: Hujayra tashqarisi, reseptor majmualari va immunitet bilan bog'liq hujayral tuzilmalar.
• Molekulyar funktsiyalar: LPS immunitet reseptori faoliyati, sitoukin bog'lanishi va turli signalli proteinlari bilan o'zaro ta'sir.

KEGG va Reactome tahlillari TNF, NF-κB, Toll-o'xshash reseptor, IL-17, tabiiy immunitet va inflammasom yo'llarining chiqib turganligini ko'rsatdi. Bu natija, N. officinalis tarkibiy qismlarning bitta proteindan ko'ra o'zaro bog'lanib turadigan inflamatsiya to'ri bilan bog'lanishi mumkin bo'lganligini keltirib chiqaradi.

Protein-protein o'zaro ta'sir to'rida MAPK1, TNF, PARP1, DNMT1, EGFR, STAT3 va TLR4 kabi proteinlar 30'dan oshiq bog'lanish darajasiga ega markaziy tugunlar sifatida aniqland. MCODE algoritmi, bali 3,5'dan oshiq bo'lgan beshta to'plam va jami 112 asosiy maqsad tanladi. Ammo to'rdagi yuqori bog'lanish darajasi, protein mutlaqo to'g'ridan-to'g'ri dori maqsadi ekanligini anglatmaydi. Yuqori darajali proteinlar biologik to'rlarda ko'plab jarayonlar bilan bog'lani bo'lgani uchun ham oldinga surt olinishi mumkin.

Xom ekstraktning hujayra madaniyatidagi ta'siri

Tajriba modelida RAW264.7 sichqon makrofaglari ishlatildi. Hujayraga 1 µg/mL lipopolisakkarid, ya'ni LPS qo'llanildi va 24 soat davomida inflammatuar javob yaratildi. LPS, xususan Gram-manfiy bakteriyalarning tashqi qobig'ida joylashgan tarkibiy qism bo'lib, laboratoriya sharoitida makrofaglarning inflammatuar signalli yo'llarini uyg'untirish uchun keng qo'llanilyapti.

Xom ekstraktning hujayra tirikchiligi ustiga ta'siri CCK8 testicha baholand. Tadqiqotchilar keyingi tajribalarida kuchli inflamatsiya boshlash va past sitotoksiklik orasida balansni yaratish maqsadida 100 µg/mL xom ekstrakti konsentratsiyasini tanladi.

3-rasmdagi A'da konsentratsiya oshgamaganda hujayra tirikchiligi azalish tendentsiyasi ko'rinadi. Ammo rasmdagi statistik belgilari va natijaviy matnlar orasida oydinlashtirilishi kerak bo'lgan bir uyushtirmasizlik bor. Matn, 200 µg/mL'da hujayra tirikchiligi 91,47% tushdi va farq muhim ekanligini bildirganda; grafikda 200 va 400 µg/mL qiymatlari "ns", 600 µg/mL "*", 800 µg/mL esa "***" sifatida ko'rsatilgandir. Ushbu maqolada ikkala taqdimotdan biri tanlandi va ishlanmadi, tadqiqotdagi ziddiyat shunday qoldirilib berildi.

Azot oksidi nima uchun o'lchand?

Makrofaglar LPS bilan uyg'unlashtirilganda uyqun bo'ladigan azot oksid sintaz orqali azot oksid ishlab chiqarilishini oshirishi mumkin. Tadqiqotda azot oksid to'g'ridan-to'g'ri o'lchanmadi; madaniyat muhitidagi yanada barkaror nitrit mahsuloti Griess reaktsiyasi orqali aniqlandi. Shuning uchun grafiklar ustida "nitrit" darajasi, hujayralarda nitrik oksid ishlab chiqarilishining bilvosita ko'rsatgichi sifatida ishlatilgan.

Xom ekstrakti 12,5 µg/mL'dan boshlab LPS bilan ko'tarilgan nitrit darajasini statistik jihatdan kamaytirdi. Bildirilgan muhimlik darajalari quyidagicha:

• 12,5 µg/mL: p < 0,05
• 25 µg/mL: p < 0,05
• 50 µg/mL: p < 0,01
• 100 µg/mL: p < 0,0001

3-rasmdagi B'da LPS guruhi nitrit darajasining taxminan 20 birlikka ko'tarilgani, xom ekstrakti doza oshgamaganda bu qiymatning bosqichma-bosqich azalgani ko'rinadi. Tadqiqotchilar 100 µg/mL'ni keyingi proteomika tajribalar uchun ish konsentratsiyasi deb belgiladi.

Bu natija faqat LPS bilan uyg'unlashtirilgan RAW264.7 hujayralarida nitrit ishlab chiqarilishining azalganligi ko'rsatadi. Insonda inflammatuar kasalliklarga davolash, immunitet tizimining umumiy jihatdan boshlash yoki klinik fayda ko'rish ko'rsatilmadi.

Proteomika tahlili: Minglab proteinning birga kuzatilib jarayoni

Xom ekstraktning hujayradan qaysi proteinlarni o'zgartiganligi aniqlash uchun uchta guruh solishtirild:

1. Jarayon qo'llanilmagan nazorat guruhi,
2. 1 µg/mL LPS bilan yaratilgan inflamatsiya guruhi,
3. 1 µg/mL LPS va 100 µg/mL N. officinalis ekstrakti berilgan davo guruhi.

Proteinlar bosim aylanishi texnologiyasi yordamida parchalanib, Lys-C va tripsin yordamida peptidlarga ajratildi va UltiMate 3000–FAIMS–Orbitrap Exploris 480 LC–MS tizimi bilan analiz qilindi. Tadqiqotda har bir guruhda olti parallel namuna bo'lgan va taxminan 4.300–4.600 ta proteinning aniqlangan ekani ko'rsatildi.

Ham ma'lumotlarning qayta ishlanishida 50% dan ko'p yo'qotilgan qiymatga ega proteinlar olib tashlandi, qolgan yo'qotilganlar mediana bilan to'ldirildi, limma paketiga bilan kvantil normallashtirish o'tkazildi va mavjud qiymatlari log₂ o'zgartirildi. Differentsiallashuvchi proteinlar uchun metinda to'g'rilangan p qiymatining 0,05 dan past va mutlaq log₂ kat o'zgarishining 1,2'dan oshgan bo'lishi chegara sifatida berilgan.

Kat o'zgarishining mantiqini tushuntirish uchun foydalaniladigan asosiy bog'lanish quyidagicha; bu tenglama tadqiqotda ochiq tarzda yozilmagan, usulni tushunish uchun shu yerda berilgan:

\[ \log_2 FC = \log_2 \left( \frac{\text{Guruh A o'rtacha protein miqdori}}{\text{Guruh B o'rtacha protein miqdori}} \right) \]

Bunda FC, "fold change" ya'ni kat o'zgarishi. Ijobiy log₂FC bitta proteinni birinchi guruhda yanada yuqori, manfiy qiymat esa yanada past bo'lganini ko'rsatadi.

Tadqiqotning usuli metni "|log₂FC| > 1,2" ifodasini ishlatayotganda 4-rasmdagi tushuntirish "FC = 1,2" yozilishi va muhokama bo'limida DNMT1 uchun 1,4 va 1,24 kabi to'g'ri FC qiymatlari berilishi terminologik bir noaniqlikni keltirib chiqaradi. Log₂FC va to'g'ri FC bir xil tadbir emas. Shuning uchun foydalaniladigan aniq differensiallashuvchi protein chegara hakemli shunga kiritilgan tahririda oydinlashtirilishi kerak.

Proteomika grafiklar qilagan narsalari

4-rasmdagi A'dagi asosiy komponent tahlili, nazorat, inflamatsiya va davolash namunalarining proteom profillarining alohida to'plamlarni tuzishini ko'rsatadi. PC1 jami o'zgarishning 25,6%'ni, PC2 esa 15,7%'ni tushuntiradi. Uchta guruhing ajralib chiqishi, LPS qo'llashning va xom ekstrakti davosining protein naqshida o'lchanuvchi o'zgarishlarni keltirib chiqarishini qo'llab-quvvatlaydi.

4-rasmdagi B'da uchta guruhda ham o'xshash sonli, taxminan 4.300–4.600 ta protein aniqlangani ko'rinadi. Bu, guruhlor orasidagi farqni faqat bitta guruhda ancha kichik protein o'lchanib qolmasligi natijasidir deb oylantiradi.

Inflamatsiya guruhi nazorat guruhi bilan solishtirild'aganda 1.288 ta boshqacha ifodalangan protein aniqlandi. Davolash guruhi inflamatsiya guruhi bilan solishtirild'aganda 712 ta protein o'zgardi. Venn diagramasida bu ikkita solishtirish 258 ta umumiy differensiallashuvchi proteinni toping ko'rsatilgan. Diagramada bundan tashqari inflamatsiya–nazorat solishtirmasiga xos 1.030, davolash–inflamatsiya solishtirmasiga xos 454 ta protein joylashgan.

Vulkan grafiklar'da gorizontal o'q protein miqdorida o'zgarishni, vertikal o'q esa statistik muhimlikni ifodalaydi. Grafikaning o'ng tomonida qolgan nuqtalar ko'paygan, chap tomonida qolgan nuqtalar kamaygan proteinlarni ko'rsatadi. Bu grafiklar birgina proteinlarning biologik muhimligini isbotlamaydi; o'zgarishnining kattaliği va statistik qo'llab-quvvalash haqida umumiy ko'rinish beradi.

Davolash va inflamatsiya guruhlar orasidagi boshqacha proteinlar LPS javob, sitoukin vositalashuvchi signali, tabiiy immunitet, NF-κB signali, eykosanoid sintezi va komplementa tizimi kabi jarayonlarda boy qo'shilgan. Hujayral komponentlar orasida lipid tomchilari va mitoxondriya matriksi; molekulyar funktsiyalar orasida NADPH va NF-κB bog'lanishi oldinga surt olingan.

PARP1 va DNMT1 qanday tanlandi?

Proteomika differensiallashuvchi proteinlar ustiga qo'rilgan protein-protein o'zaro ta'sir to'rida MCODE bali 5,882 bo'lgan va 18 ta proteindan iborat eng yuqori balinchi modul tanlandi. Bu 18 ta protein, to'r farmakologiyasi yasaydigan 112 ta asosiy maqsad bilan solishtirildi. Ikkita daftarning kesishuvida faqat PARP1 va DNMT1 qoldi.

PARP1, poli(ADP-riboz) polimeraz 1 protinidir. Tadqiqotda DNK shikastlanish javob, proinflammatuar gen ifodalanishi va mitoxondriya bilan bog'liq hujayra o'limi jarayonlari bilan bog'lanishi orqali muhokama qilindi.

DNMT1, DNK sitozin-5-metiltransfetraz 1 protinidir. DNK metilasyon naqshini himoya qilishda rol o'ynaydi. Tadqiqot, avvala DNMT1–PPAR-γ o'qi va makrofaglarning proinflammatuar fenotipga qaralib oqilishini bog'laydigan tadqiqotlarga murojaat qildi.

Proteomika ma'lumotlar bo'yicha DNMT1 inflamatsiya guruhida nazoratga nisbatan ko'tarilgan, N. officinalis davosidan keyin tushgan. Muhokama bo'limida bu o'zgarishlar ketma-ketlik bo'yicha FC = 1,4 va FC = 1,24 deb ko'rsatilgan. PARP1'ning davoli guruhida inflamatsiya guruhiga nisbatan FC = 1,3 darajasida tushganligi bildirilgan. Ammo bu FC qiymatlari yo'naliş belgilari va usul bo'limidagi log₂FC chegara bilan bog'lanishi metinda etarli ravishda oydin emas.

Ushbu bosqichda PARP1 va DNMT1 "tasdiqlanmish to'g'ridan-to'g'ri maqsadlar" emas, to'r farmakologiyasi va proteomika ma'lumotlarning kesishuvidan aniqlangan potensial maqsadlardir. Protein miqdori davoli bilan o'zgarishi, o'simlik tarkibiy qismning o'sha proteiniga to'g'ridan-to'g'ri bog'langanligini ko'rsatmaydi.

Insan va sichqon protein tuzilishlari nima uchun solishtirild?

To'r farmakologiyasi insan kasallik maqsadlari asosida bo'lsa, hujayra tajriba RAW264.7 sichqon manbasli hujayralar'da o'tkazildi. Insan va sichqon proteinlari o'xshash bo'lsa ham bog'lanish chuqurlarida struktural farqlar virtual tarama natijalari ta'sir ko'rsatishi mumkin. Tadqiqotchilar shu sababli foydalanayotgan tuzilmalarni orqaga qarab molekulyar bog'lanish bilan sinab ko'rdi.

DNMT1 uchun insan tuzilmasi PDB 6X9J, sichqon tuzilmasi PDB 4DA4 sifatida olingan. Umurtqaviy RMSD qiymati 2,71 Å topilgan va ikkita tuzilma orasida diqqatga sazovor geometrik farq bo'lganligini ko'rsatilgan. Faol va soxta bileşikler'dan iborat sinov to'plamida:

• Sichqon DNMT1 tuzilmasi uchun AUC 0,77 va logAUC 0,17,
• Insan DNMT1 tuzilmasi uchun AUC 0,72 va logAUC 0,03

olingan. Xususan erkli darajalaridagi faol bileşikler'ni boy qo'shish samaradorligini ifodaladigan logAUC sababli sichqon DNMT1 tuzilmasi tanlandi.

PARP1 uchun insan kristall tuzilmasi PDB 7AAC ishlatilgan. Tajribaviy sichqon PARP1 tuzilmasi topilmadi, shuning uchun homologiya modeli va AlphaFold2 taxmini baholand. Insan tuzilmasi bilan sichqon AlphaFold2 modeli orasidagi RMSD 0,89 Å, insan tuzilmasi bilan homologiya modeli orasidagi RMSD 0,06 Å deb berilgan. Uchta tuzilmanin AUC qiymatlari bir-biriga yaqin topilgan; tajriba tasdiqlanishi sichqon hujayralarida amalga oshirilgani uchun sichqon homologiya modeli tanlandi.

RMSD va RMSF grafiklarni qanday o'qish kerak?

Molekulyar dinamika simulyatsiyasida RMSD, protein yoki ligandining vaqt davomida boshlanish yoki taqqoslash tuzilmasiga nisbatan ne'chaqadar joyi o'zgarganligini yig'ib oladi. Tadqiqotning foydalanayotgan mezonini tushuntirish uchun asosiy RMSD bog'lanishi quyidagicha; tenglama maqolada ochiq tarzda berilmadi:

\[ \mathrm{RMSD}(t) = \sqrt{\frac{1}{N}\sum_{i=1}^{N}\left\|\mathbf{r}_i(t)-\mathbf{r}_i^{ref}\right\|^2} \]

Buning uchun:

• N, taqqoslangan atom sonini,
• r_i(t), i raqami bo'lgan atomning t ânında ko'shnashi,
• r_i^ref, bir xil atomning taqqoslash ko'shnashi

ifodalaydi. RMSD'ning muayyan darajada to'lqin ostida platforma tuzish tiziemning muvozanatga yaqinlashgan bo'lishi mumkinligini oylantiradi. Ammo past RMSD yoki atolgan bog'lanish, yuqori affinity yoki biologik inhibisyon isboti emas.

RMSF esa har bir amino asid qoldiqning simulyatsiya davomida ne'chaqadar harakatli bo'lganligini ko'rsatadi. Yuqori RMSF qiymatlari proteinning yanada esli bölümlariga, past qiymatlari yanada barkaror bölümlariga mos keladi. 5-rasmdagi 100 nanosekundlik apo simulyatsiyalar, tanlangan sichqon DNMT1 va sichqon PARP1 homologiya modeli tuzilmalarining umumiy barkaror jaryoni ko'rsatish va muayyan bölümlarida mahalliy egilubkalikni bildirganligi ko'rsatadi.

PARP1 uchun PP45_3 qanday tanlandi?

279 ta bileşik PARP1 tuzilmasiga qarshi QVina2 bilan taraib chiqilgan. Bog'lanish bali −11 kcal/mol'dan past, ya'ni hisobga ko'ra yanada qulay bo'lgan 110 ta molekula qo'lda o'rganib chiqilgan. Haqiqiy ko'rinadigan bo'lmagan bog'lanish biçimlari olib tashlandi va to'g'ri vodorod bog'lanishlarini ko'rsatan 10 ta bileşik tanlandi.

Bu 10 ta protein–ligand kompleksi uchun 100 nanosekundlik molekulyar dinamika simulyatsiyasi o'tkazilgan. Protein umurtqaviy RMSD grafiklarida komplekslarin kattalikning apo PARP1'ga o'xshash barkoratlik ko'rsatgani bildirilgan. Ligandning protein umurtqasiga nisbatan RMSD grafikda PP45_3, PP199_188 va PP199_189 kabi ba'zi bileşiklar taxminan 0,2 nm chechraklida yanada barkorat qolgan. Tizimlar, xususan oxirgi 40 nanosekundda barkorat bo'ladi deb qabul qilindi va bog'lanish erkini energiyasi bu bo'limdan hisobla'n.

MM/PBSA usulining asosiy mantiq, kompleks holatining energiyasini ajratilgan protein va ligand holatlar bilan taqqoslashdir. Tadqiqotda ochiq tenglama berilmadi; usulni tushuntirish uchun umumiy bog'lanish shunday ko'rsatildi:

\[ \Delta G_{bog'lanish} = G_{kompleks} - \left(G_{protein} + G_{ligand}\right) \]

Yanada manfiy ΔG qiymati, foydalaniladigan hisob modeli ichida yanada qulay bog'lanishni ifodalaydi. Ammo MM/PBSA taxminan hisob usuli va haqiqiy tajribaviy bog'lanish affinity o'rniga chiqmaydi.

PARP1 jadvalida PP45_3 uchun:

• Molekulyar bog'lanish bali: −12,2 kcal/mol
• Bog'lanish erkini energiyasi: −23,65 ± 4,99 kcal/mol

bildirilgan. PP199_69 yanada manfiy o'rtacha qiymati −24,58 kcal/mol'ga ega bo'lsa ham standart sapmasho ±19,07 kcal/mol bo'lgani uchun barkorat hisoblab, keyingi tajribalarga olinmadi. Tadqiqotchilar shu tarzda PP45_3'ni PARP1 uchun ustun nomzod sifatida tanladi.

Metinda bog'lanish erkini energiyasining "14 ta bileşik" uchun qayta saralangani yozilganda ilgali rasma va jadvallarda 10 ta PARP1 nomzodi ko'rsatilganligi. Bu raqam farqi tadqiqotning oydinlashtirilishi kerak bo'lgan ichki uyumiga doir nuqtalardan biridir.

DNMT1 uchun PP199_76 qanday tanlandi?

DNMT1 tarashi'da bog'lanish bali −10 kcal/mol'dan past bo'lgan eng yaxshi 23 ta bileşik qo'lda o'rgandi va yetti nomzod tanlandi. Bu komplekslar ham 100 nanosekundlik vaqt davomida simulyatsiya qilindi.

Protein umurtqaviy RMSD qiymatlari koʻplab protozni apo proteindan past ko'rinadigan bo'lsa ham ligand RMSD tahlili ba'zi molekulalarning maqsad chuquridan uzoqlashganligini ko'rsatgan. PP199_21, PP199_40 va PP199_105 uchun 1 nm'dan oshgan harakat kuzatilgan. Tadqiqotchilar buning ligandni maqsad chuquridan qocha ketish deb talqin qildi va faqat protein umurtqasini barkorat ko'rinadigan bo'lish etarli emasligini ko'rsatdi.

Oxirgi 40 nanosekundlik orbitasi'dan amalga oshirilgan bog'lanish energiyasi hisob'ida suhumarufi:

• PP199_76 uchun −24,23 ± 4,83 kcal/mol,
• PP199_31 uchun −25,33 ± 7,38 kcal/mol

qiymatlari bering. PP199_31'ni yanada katta standart sapmasho sababli olib tashlangani, PP199_76'ni tanlagani ko'rsatilgan.

Ammo Jadvalni 2'da ligand shaxsiyatlar suhumarufni va 7-rasma mos kelmaydi. Jadvaldа −24,23 ± 4,83 kcal/mol qiymati PP45_3'ga, −25,33 ± 7,38 kcal/mol qiymati esa PP199_32'ga yozilgan. Jadvali qatorlar'ni muhim qismini PARP1 jadvaldi ligand shaxsiyatlarni takrorlaydi. Shunga qarama-qarshi sarlavha, xulosa, natijaviy matn va oxirgi tasdiq bo'limi tanlangan DNMT1 nomzodini PP199_76 deb ta'rif qiladi. Ushbu maqolada jadval o'zgartirilmadi; preprinti'nda topilgan shaxsiy uyumsizlik ochiq tarzda yozilgan.

Ikkita ustun bileşik'ning shaxsiyati

Bitkili materiali tayyorlash bo'yicha 30 kg havoda quritilgan poyasi va barglar ishlatildi. Material xona harorati'da 85% etanollagi uchta marta, har safar bitta hafta davomida ekstrakte qilindi. Xom ekstrakti suvda suspenziya; petrol eteri va etil asetasta fraksiyalarga ajratildi. Silika jeli, RP-18, Sephadex LH-20 va yarim tayyorlamasi HPLC bosqichlarining orbrasida 18,3 mg PP199_76 va 39,2 mg PP45_3 olingan.

Tadqiqotning kirishi'nda an'anavi drog quritilgan poyasi va ildiz sifatida ta'rif qilsa, tajriba bo'limida poyasi va barglar'ni ishlatgani ko'rsatilgan. O'simlikning foydalaniladigan qismi kimyoviy profil ta'sir ko'rsatishi mumkinligidan shu farqning tushuntirilishi kerak.

Oqlanadigan protein–ligand bog'lanishlari

Oxirgi 100 nanosekundlik simulyatsiya'lar temsil tuzilmasini o'rganganda:

• PP45_3'ning PARP1 faol bölümida E762, N766 va S863 qoldiqlar bilan uchta vodorod bog'lanishi tuzgani,
• PP199_76'ning DNMT1 faol bölümida E1269 va R1315 qoldiqlar bilan ikkita vodorod bog'lanishi tuzgani

bildirilgan. 8-rasmdagi B'shi bu bog'lanishlarni sariq chiziqlar bilan ko'rsatadi. Bu modellar, molekulalarning maqsad chuqurda qanday pozitsiya olishi mumkinligiga nisbatan strukturaviy gipoteza beradi. Ammo modelda vodorod bog'lanishi ko'rinishi, haqiqiy biologik muhitda to'g'ridan-to'g'ri bog'lanishning yoki enzim inhibisyonining o'tkazilganligini isbotlamaydi.

Sof bileşiklar'ning hujayral antiinflammatuar natijalari

PP45_3 va PP199_76, LPS bilan uyg'unlashtiruvchi RAW264.7 makrofagalar'da Griess testi ishlatib baholand. Har ikkala molekula ham doza oshgamaganda nitrit ishlab chiqarish kamaytardi. Tadqiqotda hisoblab chiqilgan yarqaida maksimum inhibitor konsentratsiyalari quyidaguchi:

IC₅₀, biologik javobning boshlanishi va eng yuqori inhibisyon orasidagi yarmiga yetilgan konsentratsiya. Yanada past IC₅₀ qiymati bir xil tajriba tizimi va bir xil konsentratsiya birligi ichida yanada yuqori ko'ringan kuchga ishora qiladi.

Bu yerda muhim bir solishtirish muammosi bor. Sof bileşiklar'ning IC₅₀ qiymatlari µM, xom ekstraktning qiymati esa µg/mL cinsidan berilgan. Bundan tashqari, xom ekstrakti ko'plab molekulalarning aralashah. Shuning uchun sof bileşiklar bilan xom ekstraktning "ne'chaqadar kuchli" bo'lgani bu qiymatlari'dan to'g'ridan-to'g'ri hisoblab chiqilmaydi.

Usul bo'limida va 8-rasmdagi o'qlarda sof bileşiklar'ning qo'llash konsentratsiyalari 6,25–100 µg/mL sifatida ko'rsatilganda natijalar'da IC₅₀ qiymatlari µM sifatida sundarilgan. Kutlesal konsentratsiya'dan molar konsentratsiya'ga o'zgarish amalga oshirilgan bo'lishi mumkin; lekin o'zgarish usuli va doza–javob hisobi metinda berilmadi. Bu birligi farq'ni hakemli shunga kiritilgan tahririda oydinlashtirilishi kerak.

Tadqiqotning kuchli tomonlari

• Ko'p bosqichli o'z hali: Faqat molekulyar bog'lanishga tayanilmadi; to'r farmakologiyasi, proteomika, orqaga qarab tuzilma baholash, molekulyar dinamika, bog'lanish energiyasi va hujayra tajriba birga keltirilgan.
• Keng kimyoviy kutubxona: Adabiyotda bildirilgan 279 ta bileşik sistemli tarzda o'z jarayon'da jami qilindi.
• Xom ekstrakti bilan sof molekula orasida bog'lanish yaratish: Birinchi ektrakni hujayra ustiga ta'siri ko'rsatilgan, so'ng ikkita sof bileşik izolatsiya qilindi va sinov qilindi.
• Insan–sichqon tuzilma farqini olaymi: Hujayra modelli sichqon manbasli bo'lgan uchun protein tuzilmalarning virtual tarama samaradorligi alohida baholand.
• Barkorat bo'lmagan nomzodlarning olib tashlash: Faqat eng manfiy bog'lanish baallari tanlanmadi; katta RMSD yoki yuqori energiya noaniqligini ko'rsatadigan nomzodlar tashqari qoldi.
• Kimyoviy shaxsiyat va izolatsiya ma'lumot'ning berilishi: Ustun molekulalar'ning isimlari, CAS raqamlari, molekulyar formulalari va izolatsiya jarayonlari bildirilgan.

Tadqiqotning cheklash lari

• Hakemlik yo'q: Maqola preprinti va mustaqil hakem baholash'dan o'tmagan.
• Bitta hujayra modeli ishlatilgan: Topilgan'liklar faqat LPS bilan uyg'unlashtiruvchi RAW264.7 sichqon makrofag hujayralar liniyasiga asos qilib.
• Bitta asosiy inflamatsiya belgi bor: Sof bileşiklar'ning tajriba'da baholash nitrit ishlab chiqarish bilga asosiyra qildi.
• Sof bileşik sitotoksiklik ochiq tarzda ko'rsatilmadi: Xom ekstrakti uchun CCK8 tahlili berilgan, lekin PP45_3 va PP199_76 uchun bir vaqt hujayra tirikchilik natijalari sundarilmadi. Nitrit kamaytirish hujayralar sonidan mustaqil bo'lganligini alohida ko'rsatish kerak.
• To'g'ridan-to'g'ri maqsad tasdiqlanish yo'q: PARP1 va DNMT1 enzim faoliyati, sof protein bog'lanish, termal siljish, yuzaki plazmon rezonans, izotermla titrasion kalorimetriya yoki shunga o'xshash usullar bilan tasdiqlanmadi.
• Genetik tasdiqlansh yo'q: PARP1 yoki DNMT1 sushturish, ortiqcha ifoda yoki sog'ish tajribasi'da bileşik ta'siri bu maqsadlari'na bog'lanishini ko'rsatilmadi.
• Hayvon tajriba yo'q: Farmakokinetika, bioyararliligi, doza, toksiklik va organism darajasidagi antiinflammatuar ta'sir baholand.
• Klinik ma'lumot yo'q: Insonda xavfsizlik yoki samaradorlik haqida xulosiga chiqilmaydi.
• Kasallik maqsad'ning ko'lamni cheklang: Umumiy inflamatsiya o'rniga pnevmoniya maqsad'larning tamlsi inflammatuar ma'lumot to'plami sifatida qo'llanish boshqa inflamatsiya turli'na umumiylik imkonini cheklashi mumkin.
• Ko'p bileşikli sinergia'nni o'rganilmadi: Xom ekstrakti'ndagi bileşiklar birlashuvining o'zaro kuchaytirish, zayflash yoki metabolizm o'zgarti'rish baholandi.
• Matn va jadvallari orasida uyumsizlik: DNMT1 nomzod'larning shaxsiyatlari, proteomika chegara ta'riflari, sitotoksiklik statistika va konsentratsiya birligi'nda oydinlik talab eda farq found'ni toping.

Tadqiqot nima aytmoqda?

• N. officinalis xom ekstrakti, aniq hujayra modeli va doza diapazoni'nda LPS bilan ko'tarilgan nitrit ishlab chiqarish kamaytirgan.
• Xom ekstrakti davolash RAW264.7 hujayralar'ning proteom profilida muhim o'zgarish'lar bilan bog'langan.
• To'r farmakologiyasi va proteomika kesishimi PARP1 va DNMT1'ni potensial maqsadlar deb ustuvor qildi.
• Hisob modellar PP45_3'ning PARP1'ga, PP199_76'ning DNMT1'ga bog'lanishi mumkin bo'lgan tuzilmaviy xususiyatlari ko'rsatdi.
• Ikkita sof bileşik LPS bilan uyg'unlashtiruvchi makrofaglar'da nitrit ishlab chiqarish konsentratsiya'ga bog'liq tarzda kamaytirgan.

Tadqiqot nima aytmasa?

• PP45_3 yoki PP199_76'ning insonda antiinflammatuar dori bo'lganligini ko'rsatmaydi.
• Bu bileşiklar'ning PARP1 va DNMT1'ni to'g'ridan-to'g'ri inhibit qilganligini tajriba'da isbotladi.
• Qaysi inflammatuar kasallik'larda samarali bo'lish aniq qilmaydi.
• Xavfsiz doza, toksik doza, metabolizm, to'qima taqsimoti yoki dori o'zaro ta'sir ma'lumoti bermaydi.
• Xom o'simlik mahsulot'larining boshli ishlatish bir xil ta'sirni yaratishi ko'rsatmaydi.
• Hayvonlar yoki insonda davolash, himoya yoki kasallik bekati'rish isboti bermaydi.

Haqiqiy, bugun va kelajak jihatidan muhimi

Haqiqiy tadqiqotlar tabiiy mahsulot'larning koʻplab xom ekstrakti muayyan hujayral javob kamaytira olmasligiga yo'naltirilgan. Ushbu tadqiqot, xom ekstrakti topilishini kimyoviy kutubxona, protein to'ri, proteom va molekulyar tuzilma darajasisidan yanada etib qilishga harakat qilmoqda qaysi bileşiklar batafsil o'rganish kerakligini o'rnatadi.

Bugun jihatidan tadqiqotning qiymati, yuzlab tabiiy bileşiklar'ni to'g'ridan-to'g'ri tajriba bilan sinov qilish o'rniga hisob va omik usullar bilan yanada kichik nomzod guruhiga kamaytirishi'dir. Shu tarzda qimmat va vaqt oladigan tajribalar, ustuvor qilingan molekulalar ustiga jamlanadi.

Kelajakda PP45_3 va PP199_76 uchun birinchi to'g'ridan-to'g'ri protein bog'lanish va enzim inhibisyon tajribalari amalga oshirilish kerak. Shundan so'ng maqsad bog'lanishi genetik usullar'da ko'rsatilish, boshqa insan va hayvon hujayralari'nda tasdiq, yanada keng sitoukin panellari, toksiklik testlari, farmakokinetik tahlillar va hayvon inflamatsiya modellari kerak bo'ladi. Bu bosqichlar muvaffaqiyatli bo'lmagunga qadar molekulalar'ning dori nomzodi yoki davolash imkoni sifatida baholash ertalabada bo'ladi.

Kundalik hayot jihatidan tadqiqot, bitkili ekstrakti to'g'ridan-to'g'ri dori sifatida qo'llanishni taklif qilmasdan ko'ra tabiiy manbalarning yanada zamonaviy dori kashfida qanday sistemli tarzda o'rganimkanligi ko'rsatadi. O'simlikda topilgan yuzlab bileşiklar birinchi ma'lumot tizimlar'da filtrlandi, shundan so'ng hujayral protein o'zgarishi bilan solishtirish qilindi, keyinche atom darajasida simulyatsiya qilindi va nihoyat hujayral tajriba keltirilgan. Bu jarayon, an'anavi bilim bilan zamonaviy molekulyar tadqiqot orasida ilmiy ko'prik yasash urinishi'dir.

Teknik shuning uchun va usul-sharoit buzilganlari