Бул изилдөө, геленексел Чин тыббында колдонулган Наужлеа оффижиналис биткисинин анти-енфламатувар еткисинден ханги кимясал компоненттерин сорумлу олабилежегини жана бул компоненттерин хүжре ичинде ханги протеинлерле илишкили олабилежегини изилдейт. Изилдөөчүлөр бир гана анализ ыкмаине даянмак ерине тармак фармакологиясы, етикетсиз нижел протеомика, белок-белок өз ара аракеттенүү анализи, молекулярдык докинг, молекулярдык динамика симуляциясы, MM/PBSA байланышуу эркин энергиясы хесапламалары жана клетка маданияты тажрыйбаларыни бир арая гетирен көп баскычтуу бир скрининг системасы курмуштур.

Литератүрден дерленен 279 Н. оффижиналис компоненти арасындан дарыга окшоштук критерийлерин каршылаян 210 компонент үчүн 980 мүмкүн болгон белок бута тахмин едилмиштир. Инфламасёнла илишкилендирилен 3.084 оору бутаийле япылан каршылаштырмада 331 орток бута табылган. Аг анализлери PARP1, DNMT1, MAPK1, TNF, EGFR, STAT3 жана TLR4 сыяктуу протеинлери жогорку баглантылы дүгүмлер катары көрсөткөн. LPS менен инфламасён олуштурулан RAW264.7 фаре макрофажларында герчеклештирилен протеомика анализ исе Н. оффижиналис өзүтүнүн көп сайыда протеинин деңгээлини дегиштирдигини ортая коймуш; тармак фармакологиясы менен протеомика натыйжаларын кесишиминден PARP1 жана DNMT1 ики негизги потансиел бута катары тандалган.

Япысал санал тарама сонужунда PARP1 үчүн ПП45_3 кодлу Наужлефолине, DNMT1 үчүн исе ПП199_76 кодлу Ангустидине өне чыкарылмыштыр. изилдөөда ПП45_3–PARP1 комплекси үчүн байланышуу эркин энергиясы −23,65 ± 4,99 кжал/мол, ПП199_76–DNMT1 комплекси үчүн −24,23 ± 4,83 кжал/мол катары билдирилген. LPS менен уярылмыш макрофажларда азот оксиди үретиминин баскыланмасына даянан денейлерде ПП45_3 үчүн ЫЖ₅₀ 14,3 µМ, ПП199_76 үчүн исе 9,3 µМ катары эсептелген.

бул натыйжалар ики молекүлү анти-енфламатувар дары катары далилдебейт. изилдөө гана бир гана фаре макрофаж хүжре хаттында, бир гана инфламасён модели жана чоң өлчүде азот оксиди үретимине даянан бир биёложик окума кулланмыштыр. PARP1 жана DNMT1 менен түздөн-түз биохимиялык бута еткилешими, фермент ингибициясы, генетикалык ырастоо, хайван денейи, адам коопсуздугу же клиникалык натыйжалуулук гөстерилмемиштир. Айрыжа изилдөө хакем дегерлендирмесинден гечмемиш бир препринт болуп саналат.

изилдөөнын негизги проблеми недир?

Инфламасён, тканьнун енфексиён, токсин, травма же башка зарарлы уяранлара каршы гелиштирдиги савунма янытыдыр. Кыса сүрели жана контроллү олдугунда коруюжу болушу мүмкүн; бирок ашыры, етерсиз же узун сүрели хале гелдигинде ткань хасарынын жана оору илерлемесинин бир парчасына дөнүшебилир. изилдөөнын чыкыш ноктасы, яйгын колдонулган анти-енфламатувар дарыларын еткили олмаларына каршын гастроинтестинал, кардиёваскүлер, ренал жана хепатик ян еткилерле илишкилендирилебилмеси жана бул себептен догал кайнаклы ени адайлара ихтияч дуюлмасыдыр.

Наужлеа оффижиналис, Чин’де “Дан Му” адыйла билинен жана геленексел катары колдонулган Рубиажеае фамилясына аит бир биткидир. Өнжеки араштырмалар бул биткинин хам өзүтүнүн LPS менен уярылмыш макрофажларда азот оксиди, TNF-α жана ЫЛ-6 сыяктуу инфламатувар аражыларын үретимини азалтабилдигини; NF-κB синял ёлундаки ЫκБ-α жана п65 протеинлеринин фосфориласёнуну баскылаябилдигини билдирмиштир. ушуну менен бирге хам өзүт, көп сайыда кимясалын бирге булундугу кармашык бир карышымдыр. Хам өзүтүн еткили олмасы, ханги компонентин ханги протеине багландыгыны же ханги молекүлер механизмнын негизги олдугуну тек башына гөстермез.

Араштырманын жевапламая чалыштыгы ана сору бул себептен төмөнкүдөй: Н. оффижиналис ичиндеки йүзлерже кимясал компонент арасындан анти-енфламатувар еткие каткыда булунабилежек белирли молекүллер жана бунларын оласы протеин буталари систематик бичимде белирленебилир ми?

Литератүрдеки бошлук

изилдөөя боюнча даха мурун Н. оффижиналис хам өзүтү жана Стрижтосамиде сыяктуу сынырлы сайыдаки компонент үзеринде анти-енфламатувар араштырмалар япылмыштыр. бирок биткинин кимясал чешитлилигини, оорула илишкили протеин агларыны, хүжресел протеом дегишикликлерини жана молекүлер багланма моделлерини ошол эле араштырма черчевесинде бирлештирен бир “компонент–бута” харитасы булунмамактадыр.

бул бошлук ики маанилүү сорун догурмактадыр:

• Бир хам өзүтте гөзленен еткинин ханги саф молекүллерден кайнакландыгы кесин катары билинмемектедир.
• Актиф гөрүнен молекүллерин хүжре ичинде түздөн-түз же долайлы катары ханги протеинлерле илишкили болгону гөстерилемемектедир.

Изилдөөчүлөр бул ики соруну чөзмек үчүн мурун гениш бир адай хавузу олуштурмуш, ардындан ар бир ашамада адай сайысыны азалтан бир елеме дүзени курмуштур. изилдөөнын Шекил 1’де верилен иш акышы; хам өзүтүн хүжресел догруланмасы, тармак фармакологиясы, протеомика, санал тарама жана саф билешиклерин хүжресел тест едилмеси олмак үзере беш ана басамактан олушмактадыр.

279 компонентден башлаян кимясал тарама

Изилдөөчүлөр PubMed, Веб оф Сжиенже, ЖНКЫ жана ВЫП сыяктуу вери кайнакларында Нисан 2025’е кадар яйымланмыш Н. оффижиналис изилдөөларыны тарамыш жана 279 кимясал компонентден олушан бир күтүпхане хазырламыштыр. бул компоненттерин:

• 199’у негизги бир дерлеме изилдөөсындан алынмыш жана “ПП199_” өнекийле,
• 45’и башка бир капсамлы изилдөөдан алынмыш жана “ПП45_” өнекийле,
• 35’и исе дигер яйынлардан алынмыш жана “ПП35_” өнекийле

кодланмыштыр. бул кодлар молекүллерин кимясал ады дегил, араштырма сырасында колдонулган күтүпхане кимликлеридир.

SwissADME үзеринден япылан дарыга окшоштук тарамасында жогорку гастроинтестинал емилим өнгөрүсү, 0,55’ин үзеринде биёярарланым дегери жана Липински, Вебер, Гхосе, Муегге жана Еган филтрелерине уйгунлук аранмыштыр. Айрыжа көп сайыда анализде янлыш позитиф натыйжа веребилен пан-ассай интерференже жомпоундс, яни ПАЫНС япылары еленмиштир. Текрарланан кайытлар да чыкарылдыгында 210 компонент бута тахминине алынмыштыр.

бул филтрелер бир молекүлүн адамларда еткили, гүвенли же клиник катары кулланылабилир олдугуну далилдебейт. гана кимясал айрыкчари бакымындан дары гелиштирме ачысындан даха елверишли гөрүнен адайлары өнжеликлендирмее ярар.

тармак фармакологиясы: Битки компоненттеринден протеин агына

SwissTargetPrediction менен 210 компонент үчүн оласы протеин буталари тахмин едилмиш жана оласылык пуаны 0,1’ин алтында калан буталар дышланмыштыр. натыйжата 980 мүмкүн болгон белок бута алынган едилмиштир.

оорула илишкили буталар GeneCards, Тхерапеутиж Таргет Датабасе жана OMIM кайнакларындан топланмыштыр. ыкма бөлүмүнде оору арамасынын генел “инфламасён” териминден зияде, темсили инфламатувар дурум катары “пнеумониа”, яни пнөмони үзеринден япылдыгы белиртилмектедир. бул арама 3.084 оору бутаи үретмиштир. Битки компоненти буталарийле оору буталари каршылаштырылдыгында 331 ортак протеин табылган.

Шекил 2’деки Венн дияграмы бул кесишими гөстерир. чоң оору күмесинде гана оору верилеринде бар 2.753 бута, битки тарафында гана Н. оффижиналис компоненттерийле илишкилендирилен 649 бута жана ортада ики грубун ортак болгону 331 бута ер алмактадыр. бул ортаклык, 331 протеинин герчектен дарылоо бутаи олдугуну далилдебейт; гана хем оору вери табанларында хем де кимясал бута тахминлеринде каршылашылан адайлары гөстерир.

Зенгинлештирме анализлери не анлатты?

331 орток бута үзеринде Гене Онтологй, КЕГГ жана Реажтоме зенгинлештирме анализлери герчеклештирилмиштир. Гене Онтологй анализинде үч негизги категори изилденген:

• Биёложик сүречлер: Макрофаж активасёну, TNF синяли, инфламатувар янытын позитиф дүзенленмеси жана LPS’е яныт.
• Хүжресел компоненттер: Хүжре дышы алан, ресептөр комплекслери жана багышыклыкла илишкили хүжресел япылар.
• Молекүлер ишлевлер: LPS багышыклык ресептөрү активитеси, ситокин багланмасы жана чешитли синял протеинлерийле еткилешим.

КЕГГ жана Реажтоме анализлери TNF, NF-κB, Толл-бензери ресептөр, ЫЛ-17, догал багышыклык жана инфламмазом ёлларынын өне чыктыгыны көрсөткөн. бул натыйжа, Н. оффижиналис компоненттеринин бир гана протеинден зияде бирбирине баглы бир инфламасён агыйла илишкили олабилежеги хипотезини дестеклемектедир.

Протеин-протеин еткилешим агы ичинде MAPK1, TNF, PARP1, DNMT1, EGFR, STAT3 жана TLR4 сыяктуу протеинлер 30’ун үзеринде багланты дережесине сахип меркез дүгүмлер катары белирленмиштир. MCODE алгоритмасы, пуаны 3,5’ин үзеринде болгон беш алт аг жана топлам 112 чекирдек бута сечмиштир. бирок агдаки жогорку багланты дережеси, бир протеинин мутлака түздөн-түз дары бутаи болгону анламына гелмез. жогорку дережели протеинлер биёложик агларда көп сайыда сүречле илишкили олдуклары үчүн де өне чыкабилир.

Хам өзүтүн клетка маданиятындеки еткиси

Денейсел моделде RAW264.7 фаре макрофажлары колдонулган. Хүжрелере 1 µг/мЛ липополисаккарит, яни LPS уйгуланмыш жана 24 саат боюнжа инфламатувар яныт олуштурулмуштур. LPS, айрыкча Грам-негатиф бактерилерин дыш зарында бар бир компонентдир жана лаборатувар чөйрөында макрофажларын инфламатувар синял ёлларыны уярмак үчүн яйгын бичимде кулланылыр.

Хам өзүтүн хүжре жанлылыгы үзериндеки еткиси ЖЖК8 тестийле бааланган. Изилдөөчүлөр сонраки денейлерде гүчлү инфламасён баскыланмасы менен төмөн ситотоксисите арасында денге курмак амажыйла 100 µг/мЛ хам өзүт консантрасёнуну сечмиштир.

Шекил 3А’да консантрасён йүкселдикче хүжре жанлылыгынын азалма егилими гөрүлмектедир. ушуну менен бирге шекил үзериндеки истатистик ишаретлери менен натыйжа метни арасында ачыклыга кавуштурулмасы герекен бир ылайык келүүсузлук вардыр. текст, 200 µг/мЛ’де хүжре жанлылыгынын %91,47’е дүштүгүнү жана фаркын анламлы олдугуну билдириркен; графикте 200 жана 400 µг/мЛ маанилери “нс”, 600 µг/мЛ “*”, 800 µг/мЛ исе “***” катары гөстерилмектедир. бул макаледе ики сунумдан бири тержих едилерек дүзелтилмемиш, изилдөөдаки тутарсызлык болгону сыяктуу белиртилмиштир.

азот оксиди неден өлчүлдү?

Макрофажлар LPS менен уярылдыгында индүкленебилир азот оксиди сентаз үзеринден азот оксиди үретимини артырабилир. изилдөөда азот оксиди түздөн-түз өлчүлмемиш; күлтүр чөйрөындаки даха карарлы нитрит үрүнү Гриесс реаксиёну менен белирленмиштир. бул себептен графиклердеки “нитрит” деңгээли, хүжрелерин азот оксиди үретиминин долайлы гөстергеси катары колдонулган.

Хам өзүт 12,5 µг/мЛ’ден итибарен LPS менен йүкселен нитрит деңгээлини истатистиксел катары азалтмыштыр. Билдирилен анламлылык дүзейлери төмөнкүдөй:

• 12,5 µг/мЛ: п &лт; 0,05
• 25 µг/мЛ: п &лт; 0,05
• 50 µг/мЛ: п &лт; 0,01
• 100 µг/мЛ: п &лт; 0,0001

Шекил 3Б’де LPS грубунун нитрит деңгээлинин яклашык 20 бирим живарына йүкселдиги, хам өзүт дозу арттыкча бул дегерин кадемели бичимде азалдыгы гөрүлмектедир. Изилдөөчүлөр 100 µг/мЛ’йи сонраки протеомика денейлер үчүн изилдөө консантрасёну катары белирлемиштир.

бул натыйжа гана LPS менен уярылмыш RAW264.7 хүжрелеринде нитрит үретиминин азалдыгыны гөстермектедир. адамлардаки инфламатувар ооруларын дарылоо едилдигини, багышыклык системанынин генел катары баскыландыгыны же клиник файда сагландыгыны гөстермез.

протеомика анализ: Бинлерже протеинин бирге изленмеси

Хам өзүтүн хүжреде ханги протеинлери дегиштирдигини белирлемек үчүн үч груп салыштырылган:

1. Ишлем уйгуланмаян контрол грубу,
2. 1 µг/мЛ LPS менен олуштурулан инфламасён грубу,
3. 1 µг/мЛ LPS жана 100 µг/мЛ Н. оффижиналис өзүтү верилен дарылоо грубу.

Протеинлер басынч дөнгүсү текноложисийле парчаланмыш, Лйс-Ж жана трипсин кулланыларак пептитлере айрылмыш жана УлтиМате 3000–ФАЫМС–Орбитрап Експлорис 480 ЛЖ–МС системийле анализ едилмиштир. изилдөөда ар бир групта алты паралел өрнек булундугу жана яклашык 4.300–4.600 протеинин танымландыгы белиртилмектедир.

Хам верилерин ишленмесинде %50’ден фазла ексик дегере сахип протеинлер чыкарылмыш, калан ексик дегерлер медянла тамамланмыш, лимма пакетийле кантил нормализасёну япылмыш жана боллук маанилери лог₂ дөнүшүмүне таби тутулмуштур. Диферансиел протеинлер үчүн метинде дүзелтилмиш п дегеринин 0,05’ин алтында жана мутлак лог₂ кат дегишиминин 1,2’нин үзеринде олмасы ешик катары берилген.

Кат дегишиминин мантыгыны ачыкламак үчүн колдонулган негизги илишки төмөнкүдөй; бул денклем изилдөөда ачык бичимде язылмамыш, ыкмаин анлашылмасы үчүн бурада берилген:

\[ \log_2 FC = \log_2 \left( \frac{\text{Grup A ortalama protein bolluğu}}{\text{Grup B ortalama protein bolluğu}} \right) \]

Бурада ФЖ, “фолд чанге” яни кат дегишимидир. Позитиф лог₂ФЖ бир протеинин илк групта даха жогорку, негатиф маани исе даха төмөн олдугуну гөстерир.

изилдөөнын ыкма метни “|лог₂ФЖ| &гт; 1,2” ифадесини кулланыркен Шекил 4 ачыкламасында “ФЖ = 1,2” язылмасы жана тартышма бөлүмүнде DNMT1 үчүн 1,4 жана 1,24 сыяктуу догрусал ФЖ дегерлеринин верилмеси терминоложик бир белгисиздик олуштурмактадыр. Лог₂ФЖ менен догрусал ФЖ ошол эле өлчү эмес. бул себептен колдонулган кесин диферансиел протеин ешигинин хакемли сүрүмде ачыклыга кавуштурулмасы герекир.

протеомика графиклерин анлаттыклары

Шекил 4А’даки негизги компонент анализи, контрол, инфламасён жана дарылоо өрнеклеринин протеом профиллеринин айры күмелер олуштурдугуну гөстермектедир. ПЖ1 топлам варянсын %25,6’сыны, ПЖ2 исе %15,7’сини ачыкламактадыр. Үч грубун айрышмасы, LPS уйгуламасынын жана хам өзүт дарылоосунин протеин өрүнтүсүнде өлчүлебилир дегишикликлер олуштурдугуну дестеклемектедир.

Шекил 4Б’де үч групта да бензер сайыда, яклашык 4.300–4.600 протеин танымландыгы гөрүлмектедир. бул, груплар арасындаки айрымын гана бир групта көп даха аз протеин өлчөнүшүндөн кайнакланмадыгыны дүшүндүрмектедир.

Инфламасён грубу контрол грубуйла каршылаштырылдыгында 1.288 ар башка ифаде едилен протеин белирленмиштир. дарылоо грубу инфламасён грубуйла каршылаштырылдыгында 712 протеин дегишмиштир. Венн дияграмында бул ики каршылаштырманын 258 ортак диферансиел протеини булундугу гөстерилмектедир. Дияграмда айрыжа инфламасён–контрол каршылаштырмасына өзгү 1.030, дарылоо–инфламасён каршылаштырмасына өзгү 454 протеин ер алмактадыр.

Волкан графиклеринде ятай ексен протеин боллугундаки дегишими, дикей ексен исе истатистиксел анламлылыгы темсил етмектедир. Графигин сагында калан нокталар артан, солунда калан нокталар азалан протеинлери гөстермектедир. бул графиклер тек тек протеинлерин биёложик өнемини далилдебейт; дегишимин бүйүклүгү жана истатистиксел дестеги хаккында бир генел гөрүнүм саглар.

дарылоо жана инфламасён груплары арасындаки ар башка протеинлер LPS яныты, ситокин аражылы синял, догал багышыклык, NF-κB синяли, еикосаноид сентези жана комплеман системи сыяктуу сүречлерде зенгинлешмиштир. Хүжресел компоненттер арасында липид дамлажыклары жана митокондри матрикси; молекүлер ишлевлер арасында НАДПХ жана NF-κB багланмасы өне чыкмыштыр.

PARP1 жана DNMT1 насыл сечилди?

протеомика диферансиел протеинлер үзеринде курулан протеин-протеин еткилешим агында MCODE пуаны 5,882 болгон жана 18 протеинден олушан ен жогорку пуанлы модүл тандалган. бул 18 протеин, тармак фармакологиясынин олуштурдугу 112 чекирдек бутале салыштырылган. Ики листенин кесишиминде гана PARP1 жана DNMT1 калмыштыр.

PARP1, поли(АДП-рибоз) полимераз 1 протеинидир. изилдөөда DNA хасары яныты, проинфламатувар ген ифадеси жана митокондрийле илишкили хүжре өлүмү сүречлерийле баглантысы үзеринден тартышылмыштыр.

DNMT1, DNA ситозин-5-метилтрансфераз 1 протеинидир. DNA метиласён өрүнтүлеринин корунмасында рол алыр. изилдөө, даха мурун DNMT1–ППАР-γ ексени менен макрофажларын проинфламатувар фенотипе йөнелмеси арасында илишки билдирен араштырмалара атыфта булунмактадыр.

протеомика верилере боюнча DNMT1 инфламасён грубунда контроле кыясла йүкселмиш, Н. оффижиналис дарылоосунден кийин дүшмүштүр. Тартышма бөлүмүнде бул дегишимлер сырасыйла ФЖ = 1,4 жана ФЖ = 1,24 катары белиртилмиштир. PARP1’ин исе дарылоо грубунда инфламасён грубуна боюнча ФЖ = 1,3 деңгээлинде азалдыгы билдирилген. бирок бул ФЖ дегерлеринин йөн ишаретлери жана ыкма бөлүмүндеки лог₂ФЖ ешигийле илишкиси метинде етеринже ачык эмес.

бул ашамада PARP1 жана DNMT1 “догруланмыш түздөн-түз буталар” дегил, тармак фармакологиясы менен протеомика верилерин кесишиминден белирленен потансиел буталардир. Протеин боллугунун дарылоойле дегишмеси, битки компонентинин о протеине түздөн-түз багландыгыны гөстермез.

адам жана фаре протеин япылары неден каршылаштырылды?

тармак фармакологиясы адам оору буталарине даяныркен хүжре тажрыйбалары фаре көкенли RAW264.7 хүжрелеринде герчеклештирилмиштир. адам жана фаре протеинлери бензер олса да багланма жеплериндеки япысал фарклылыклар санал тарама натыйжаларыны еткилеебилир. Изилдөөчүлөр бул себептен кулланажаклары япылары герие дөнүк молекулярдык докингйле сынамыштыр.

DNMT1 үчүн адам япысы PDB 6Кс9Ж, фаре япысы PDB 4ДА4 катары алынмыштыр. Омурга RMSD дегери 2,71 Å булунмуш жана ики япы арасында диккате маани бир геометрик фарклылык болгону белиртилмиштир. Актиф жана яланжы билешиклерден олушан сынама күмесинде:

• Фаре DNMT1 япысы үчүн AUC 0,77 жана логАУЖ 0,17,
• адам DNMT1 япысы үчүн AUC 0,72 жана логАУЖ 0,03

алынган едилмиштир. айрыкча еркен сыралардаки актиф билешиклери зенгинлештирме перформансыны темсил еден логАУЖ неденийле фаре DNMT1 япысы тандалган.

PARP1 үчүн адам кристал япысы PDB 7ААЖ колдонулган. Денейсел фаре PARP1 япысы булунмадыгындан бир хомоложи модели жана АлпхаФолд2 тахмини бааланган. адам япысыйла фаре АлпхаФолд2 модели арасындаки RMSD 0,89 Å, адам япысыйла хомоложи модели арасындаки RMSD 0,06 Å катары берилген. Үч япынын AUC маанилери бирбирине якын булунмуш; денейсел догрулама фаре хүжрелеринде япылдыгы үчүн фаре хомоложи модели тержих едилмиштир.

RMSD жана РМСФ графиклерини насыл окумак герекир?

молекулярдык динамика симуляциясында RMSD, бир протеин же лигандын заман ичинде башлангыч я да реферанс япыя боюнча не кадар ер дегиштирдигини өзетлер. изилдөөнын кулландыгы өлчүтүн мантыгыны ачыкламак үчүн негизги RMSD илишкиси төмөнкүдөй; денклем макаледе ачык бичимде верилмемиштир:

\[ \mathrm{RMSD}(t) = \sqrt{\frac{1}{N}\sum_{i=1}^{N}\left\|\mathbf{r}_i(t)-\mathbf{r}_i^{ref}\right\|^2} \]

Бурада:

• Н, каршылаштырылан атом сайысыны,
• р_и(т), и нумаралы атомун т анындаки конумуну,
• р_и^реф, ошол эле атомун реферанс конумуну

ифаде едер. RMSD’нин белирли бир дүзейде далгаланарак плато олуштурмасы системанын денгее яклашмыш олабилежегини дүшүндүрүр. бирок төмөн RMSD тек башына догру багланма, жогорку афините же биёложик инхибисён каныты эмес.

РМСФ исе ар бир амино асит калынтысынын симүласён боюнжа не кадар харекетли олдугуну гөстерир. жогорку РМСФ маанилери протеинин даха еснек бөлгелерине, төмөн дегерлер даха карарлы бөлгелере карата гелир. Шекил 5’теки 100 наносаниелик апо симүласёнлар, сечилен фаре DNMT1 жана фаре PARP1 хомоложи модели япыларынын генел катары карарлы бир сейир гөстердигини жана белирли бөлгелерде ерел еснеклик булундугуну ортая коймактадыр.

PARP1 үчүн ПП45_3 насыл сечилди?

279 компонент PARP1 япысына каршы QVina2 менен таранмыштыр. Багланма пуаны −11 кжал/мол’ден даха төмөн, яни хесапламая боюнча даха елверишли болгон 110 молекүл елле изилденген. Герчекчи гөрүнмеен багланма бичимлери чыкарылмыш жана уйгун хидрожен баглары гөстерен 10 билешик тандалган.

бул 10 протеин–лиганд комплекси үчүн 100 наносаниелик молекулярдык динамика симуляциясы япылмыштыр. Протеин омурга RMSD графиклеринде комплекслерин чоң бөлүгүнн апо PARP1’е бензер карарлылык гөстердиги билдирилген. Лигандын протеин омургасына боюнча RMSD графигинде ПП45_3, ПП199_188 жана ПП199_189 сыяктуу базы билешиклерин яклашык 0,2 нм чбаскычынде даха истикрарлы калдыгы гөрүлмүштүр. Системлерин айрыкча сон 40 наносаниеде карарлы хале гелдиги кабул едилмиш жана байланышуу эркин энергиясы бул бөлүмден эсептелген.

MM/PBSA ыкмаинин негизги мантыгы, комплекс дурумунун енержисини айрылмыш протеин жана лиганд дурумларыйла каршылаштырмактыр. изилдөөда ачык денклем верилмемиштир; ыкмаи ачыкламак үчүн генел илишки шу шекилде гөстерилебилир:

\[ \Delta G_{bağlanma} = G_{kompleks} - \left(G_{protein} + G_{ligand}\right) \]

Даха негатиф бир ΔГ дегери, колдонулган хесаплама модели ичинде даха елверишли багланмайы темсил едер. ушуну менен бирге MM/PBSA яклашык бир хесаплама ыкмаидир жана герчек денейсел багланма афинитесинин ерине гечмез.

PARP1 таблосунда ПП45_3 үчүн:

• молекулярдык докинг пуаны: −12,2 кжал/мол
• байланышуу эркин энергиясы: −23,65 ± 4,99 кжал/мол

билдирилген. ПП199_69 даха негатиф орточо дегере, −24,58 кжал/мол’е сахип олса да стандарт сапмасы ±19,07 кжал/мол болгону үчүн карарсыз кабул едилмиш жана сонраки денейлере алынмамыштыр. Изилдөөчүлөр бөйлеже ПП45_3’ү PARP1 үчүн өнжү адай катары сечмиштир.

Метинде байланышуу эркин энергиясынин “14 билешик” үчүн ениден сыраландыгы язылмасына каршын илгили шекил жана таблода 10 PARP1 адайы гөстерилмектедир. бул сан фаркы изилдөөнын ачыклыга кавуштурулмасы герекен ич тутарлылык нокталарындан биридир.

DNMT1 үчүн ПП199_76 насыл сечилди?

DNMT1 тарамасында кенетленме пуаны −10 кжал/мол’ден даха төмөн болгон ен ийи 23 билешик елле инжеленмиш жана еди адай тандалган. бул комплекслер де 100 наносание боюнжа симүле едилмиштир.

Протеин омурга RMSD дегерлеринин чогу апо протеинден төмөн гөрүнсе де лиганд RMSD анализи базы молекүллерин бута жебинден узаклаштыгыны көрсөткөн. ПП199_21, ПП199_40 жана ПП199_105 үчүн 1 нм’нин үзеринде харекет гөзленмиштир. Изилдөөчүлөр буну лигандын бута жебинден качмасы катары ёрумламыш жана гана протеин омургасынын карарлы гөрүнмесинин етерли олмадыгыны көрсөткөн.

Сон 40 наносаниелик йөрүнге үзеринден япылан багланма енержиси хесапламасында анлаты метни:

• ПП199_76 үчүн −24,23 ± 4,83 кжал/мол,
• ПП199_31 үчүн −25,33 ± 7,38 кжал/мол

дегерлерини вермектедир. ПП199_31’ин даха чоң стандарт сапма неденийле елендиги, ПП199_76’нын сечилдиги белиртилмиштир.

бирок Табло 2’де лиганд кимликлери анлаты жана Шекил 7 менен уюшмамактадыр. Таблода −24,23 ± 4,83 кжал/мол дегери ПП45_3’е, −25,33 ± 7,38 кжал/мол дегери исе ПП199_32’е язылмыштыр. Табло сатырларынын маанилүү бөлүмү PARP1 таблосундаки лиганд кимликлерини текрар етмектедир. буга карата башлык, өзет, натыйжа метни жана сон догрулама бөлүмү сечилен DNMT1 адайыны ПП199_76 катары танымламактадыр. бул макаледе табло дүзелтилмемиштир; препринтте бар кимлик уюшмазлыгы ачыкча катталган.

Ики өнжү билешигин кимлиги

Биткисел матерялин хазырланмасында 30 кг хавада курутулмуш гөвде жана япрак колдонулган. Матерял ода сыжаклыгында %85 етанолле үч кез, ар бир сеферинде бир хафта боюнжа екстракте едилмиштир. Хам өзүт су ичинде сүспансе едилмиш; петрол етери жана етил асетатла фраксиёнлара айрылмыштыр. Силика жел, РП-18, Сепхадекс ЛХ-20 жана яры препаратиф ХПЛЖ басамакларынын ардындан 18,3 мг ПП199_76 жана 39,2 мг ПП45_3 алынган едилмиштир.

изилдөөнын гиришинде геленексел дрог куру гөвде жана көк катары танымланыркен деней бөлүмүнде гөвде жана япракларын кулланылдыгы белиртилмектедир. Биткинин колдонулган кысмы кимясал профили еткилеебилежегинден бул фаркын ачыкланмасы герекир.

Өнгөрүлен протеин–лиганд багланмалары

Сон 100 наносаниелик симүласёнларын темсили япылары инжелендигинде:

• ПП45_3’үн PARP1 актиф бөлгесинде Е762, Н766 жана С863 калынтыларыйла үч хидрожен багы олуштурдугу,
• ПП199_76’нын DNMT1 актиф бөлгесинде Е1269 жана Р1315 калынтыларыйла ики хидрожен багы олуштурдугу

билдирилген. Шекил 8Б бул баглары сары чизгилерле гөстермектедир. бул моделлер, молекүллерин бута жеплеринде насыл конумланабилежегине илишкин япысал бир хипотез саглар. бирок моделде хидрожен багы гөрүлмеси, герчек биёложик чөйрөда түздөн-түз багланманын же фермент ингибициясынун герчеклештигини далилдебейт.

Саф билешиклерин хүжресел анти-енфламатувар натыйжалары

ПП45_3 жана ПП199_76, LPS менен уярылмыш RAW264.7 макрофажларында Гриесс тести кулланыларак бааланган. ар бир ики молекүл де доз арттыкча нитрит үретимини азалтмыштыр. изилдөөда хесапланан яры максимум инхибитөр консантрасёнлар төмөнкүдөй:

ЫЖ₅₀, бир биёложик янытын башлангыч менен ен жогорку инхибисён арасындаки ярысына улашылан консантрасёндур. Даха төмөн ЫЖ₅₀ дегери ошол эле деней системи жана ошол эле консантрасён бирими ичинде даха жогорку гөрүнүр гүже ишарет едер.

Бурада маанилүү бир каршылаштырма соруну булунмактадыр. Саф билешиклерин ЫЖ₅₀ маанилери µМ, хам өзүтүн дегери исе µг/мЛ жинсинден берилген. Айрыжа хам өзүт көп сайыда молекүлүн карышымыдыр. бул себептен саф билешиклерле хам өзүтүн “кач кат даха гүчлү” болгону түздөн-түз бул дегерлерден хесапланамаз.

ыкма бөлүмүнде жана Шекил 8 ексенлеринде саф билешиклерин уйгулама консантрасёнлары 6,25–100 µг/мЛ катары гөстерилиркен натыйжаларда ЫЖ₅₀ маанилери µМ катары сунулмуштур. Күтлесел консантрасёндан молар консантрасёна дөнүшүм япылмыш болушу мүмкүн; бирок дөнүшүм ыкмаи жана доз–яныт хесабынын айрынтылары метинде верилмемиштир. бул бирим фаркынын хакемли сүрүмде ачыкланмасы герекир.

изилдөөнын гүчлү йөнлери

• көп баскычтуу яклашым: Тек башына молекулярдык докинге гүвенилмемиш; тармак фармакологиясы, протеомика, герие дөнүк япы дегерлендирмеси, молекүлер динамик, багланма енержиси жана хүжре денейи бир арая гетирилмиштир.
• Гениш кимясал күтүпхане: Литератүрде билдирилен 279 билешик систематик катары дерленмиштир.
• Хам өзүт менен саф молекүл арасында багланты курулмасы: мурун өзүтүн хүжре үзериндеки еткиси гөстерилмиш, ардындан ики саф билешик изоле едилерек тест едилмиштир.
• адам–фаре япы фаркынын диккате алынмасы: Хүжре моделинин фаре көкенли олмасы неденийле протеин япыларынын санал тарама перформансы айрыжа бааланган.
• Карарсыз адайларын еленмеси: гана ен негатиф кенетленме пуанлары сечилмемиш; чоң RMSD же жогорку енержи белирсизлиги гөстерен адайлар дышланмыштыр.
• Кимясал кимлик жана изоласён билгисинин верилмеси: Өнжү молекүллерин адлары, ЖАС нумаралары, молекүлер формүллери жана изоласён сүречлери рапорланмыштыр.

изилдөөнын сынырлылыклары

• Хакемлик ёктур: Макале бир препринт болуп саналат жана багымсыз рецензиядан өтө элек.
• Тек хүжре модели колдонулган: Булгулар гана LPS менен уярылмыш RAW264.7 фаре макрофажларына даянмактадыр.
• Тек негизги инфламасён гөстергеси вардыр: Саф билешиклерин денейсел дегерлендирмеси агырлыклы катары нитрит үретимине даянмыштыр.
• Саф билешик ситотоксиситеси ачыкча гөстерилмемиштир: Хам өзүт үчүн ЖЖК8 анализи верилмиш, бирок ПП45_3 жана ПП199_76 үчүн бир убакта хүжре жанлылыгы натыйжалары сунулмамыштыр. Нитрит азалмасынын хүжре сайысындан багымсыз олдугунун айрыжа гөстерилмеси герекир.
• түздөн-түз бута догруламасы ёктур: PARP1 жана DNMT1 ензим активитеси, саф протеин багланмасы, термал кайма, йүзей плазмон резонансы, изотермал титрасён калориметриси же бензери ыкмалерле догруланмамыштыр.
• генетикалык ырастоо ёктур: PARP1 же DNMT1 сустурма, ашыры ифаде я да куртарма тажрыйбаларыйле билешик еткисинин бул буталаре багымлы болгону гөстерилмемиштир.
• Хайван денейи ёктур: Фармакокинетик, биёярарланым, доз, токсисите жана организма деңгээлиндеки анти-енфламатувар етки дегерлендирилмемиштир.
• Клиник вери ёктур: адамларда гүвенлилик же еткинлик хаккында натыйжа чыкарыламаз.
• оору буталаринин капсамы сынырлыдыр: Генел инфламасён ерине пнөмони буталаринин темсили инфламатувар вери күмеси катары кулланылмасы башка инфламасён түрлерине генелленебилирлиги сынырлаябилир.
• көп компонентли синержи инжеленмемиштир: Хам өзүттеки билешиклерин бирбирини гүчлендирмеси, зайыфлатмасы же метаболизмайы дегиштирмеси дегерлендирилмемиштир.
• текст жана таблолар арасында тутарсызлыклар вардыр: DNMT1 адайларынын кимликлери, протеомика ешик танымлары, ситотоксисите истатистиклери жана консантрасён биримлеринде ачыклык геректирен фарклылыклар булунмактадыр.

изилдөө не сөйлүёр?

• Н. оффижиналис хам өзүтү, белирленен хүжре модели жана доз аралыгында LPS менен йүкселен нитрит үретимини азалтмыштыр.
• Хам өзүт дарылоосу RAW264.7 хүжрелеринин протеом профилинде белиргин дегишикликлерле илишкилендирилмиштир.
• тармак фармакологиясы жана протеомика кесишими PARP1 менен DNMT1’и потансиел буталар катары өнжеликлендирмиштир.
• Хесапламалы моделлер ПП45_3’үн PARP1’е, ПП199_76’нын DNMT1’е багланабилежек япысал айрыкчар ташыдыгыны өнгөрмүштүр.
• Ики саф билешик LPS менен уярылмыш макрофажларда нитрит үретимини консантрасёна баглы бичимде азалтмыштыр.

изилдөө не сөйлемиёр?

• ПП45_3 же ПП199_76’нын адамларда анти-енфламатувар дары олдугуну көрсөтпөйт.
• бул билешиклерин PARP1 жана DNMT1’и түздөн-түз инхибе еттигини денейсел катары далилдебейт.
• Ханги инфламатувар ооруларда еткили олажагыны белирлемемектедир.
• Гүвенли доз, токсик доз, метаболизма, ткань дагылымы же дары еткилешими билгиси сунмамактадыр.
• Хам битки үрүнлеринин түкетилмесинин ошол эле еткийи олуштуражагыны көрсөтпөйт.
• жаныбарларда же адамларда дарылоо, корунма я да оору герилемеси каныты сунмамактадыр.

Гечмиш, бугүн жана гележек ачысындан өнеми

Гечмиште догал үрүн араштырмалары чогунлукла хам өзүтүн белирли бир хүжресел яныты азалтып азалтмадыгына одакланыёрду. Бул изилдөө, хам өзүт булгусуну кимясал күтүпхане, протеин агы, протеом жана молекүлер япы дүзейлерине ташыярак ханги компоненттерин даха деталдуу инжеленмеси геректигини белирлемее изилдөөктадыр.

Бугүн ачысындан изилдөөнын дегери, йүзлерже догал билешиги түздөн-түз денейсел катары тест етмек ерине хесапламалы жана омик ыкмалерле даха кичине бир адай грубуна индиргемесидир. Бөйлеже пахалы жана заман алыжы денейлер, өнжеликлендирилмиш молекүллер үзеринде ёгунлаштырылабилир.

Гележекте ПП45_3 жана ПП199_76 үчүн өнжеликле түздөн-түз протеин багланма жана ензим инхибисён тажрыйбалары япылмасы герекир. Ардындан бута багымлылыгынын генетик ыкмалерле гөстерилмеси, ар башка адам жана хайван хүжрелеринде догрулама, даха гениш ситокин панеллери, токсисите тестлери, фармакокинетик анализлер жана хайван инфламасён моделлери герекежектир. бул ашамалар башарылы олмадан молекүллерин дары адайы же дарылоо сеченеги катары дегерлендирилмеси еркен олажактыр.

Гүнделик яшам ачысындан араштырма, биткисел бир өзүтүн түздөн-түз дары катары кулланылмасыны өнермектен зияде догал кайнакларын модерн дары кешфинде насыл систематик бичимде инжеленебилежегини гөстермектедир. Биткиде бар йүзлерже компонент мурун вери табанларыйла сүзүлмүш, кийин хүжресел протеин дегишимлерийле каршылаштырылмыш, ардындан атом деңгээлинде симүле едилмиш жана сон катары хүжре денейине ташынмыштыр. бул сүреч, геленексел кулланым билгиси менен чагдаш молекүлер араштырма арасында билимсел бир көпрү курма гиришимидир.

Изилдөөнүн ыкмасы жана жыйынтыктары

Араштырма иш акышы

клетка маданияты жана биёложик тестлер

• Хүжре хатты: RAW264.7 фаре макрофажы
• Күлтүр чөйрөы: %10 фетал сыгыр серуму жана %1 пенисилин–стрептомисин ичерен ДМЕМ
• Инкүбасён: 37 °Ж, %5 ЖО₂
• Инфламасён уяраны: 1 µг/мЛ LPS
• Уярым сүреси: 24 саат
• Хүжре жанлылыгы: ЖЖК8, 450 нм абсорбанс
• Нитрит анализи: Гриесс реаксиёну, 540 нм абсорбанс
• Шекил ачыкламаларына боюнча груп башына өрнек саны: н = 6

протеомика ыкма

• Хүжре парчалама жана индиргеме/алкиласён: Барожйжлер 2320ЕКсТ басынч дөнгүсү текноложиси
• Протеин синдирими: Лйс-Ж, ардындан трипсин
• Пептит айырма: Ж18 колон, 80 дакикалык ЛЖ градяны
• Күтле спектрометриси: ФАЫМС–Орбитрап Експлорис 480
• МС1 тарама аралыгы: м/з 350–1.500
• МС1 чөзүнүрлүгү: 60.000
• МС/МС чөзүнүрлүгү: 15.000
• ХЖД чарпышма енержиси: %30
• Ексик вери филтреси: %50’ден фазла ексик протеинлерин чыкарылмасы
• Калан ексиклер: медянла тамамлама
• Нормализасён: лимма кантил нормализасёну
• Истатистик: догрусал моделлер жана ампирик Баес яклашымы
• Метинде верилен диферансиел протеин ешиги: дүзелтилмиш п &лт; 0,05 жана |лог₂ФЖ| &гт; 1,2

протеомика булгулар

Молекүлер дожкинг жана динамик параметрелери

• Дожкинг язылымы: QVina2
• PARP1 ексхаустивенесс дегери: 12
• DNMT1 ексхаустивенесс дегери: 36
• Протеин хазырлама: су молекүллеринин чыкарылмасы, полар хидрожен жана Коллман йүклеринин екленмеси
• Лиганд геометриси: RDKit жана MMFF94 куввет аланы
• Молекүлер динамик: GROMACS 2024.1
• Протеин куввет аланы: CHARMM36m
• Лиганд куввет аланы: CGenFF
• Протонасён дуруму: PROPKA, pH 7,4
• Чөзүжү кутусу: протеин–куту сыныры арасында 1,5 нм месафе
• Денгелеме: 100 пс НВТ жана 100 пс НПТ
• Үретим симүласёну: 100 нс
• Енержи кайыт аралыгы: 10 пс
• Багланма енержиси: сон 40 нс үзеринден гмкс_ММПБСА 1.6.3

PARP1 адайларынын хесапламалы натыйжалары

ПП199_69’ун орточо енержиси даха негатиф олмасына рагмен белирсизлигинин көп жогорку олмасы неденийле ПП45_3 тандалган.

DNMT1 адайынын хесапламалы сонужу

Вери ноту: Юкарыдаки дегерлер натыйжа анлатысы жана адай сечиминден актарылмыштыр. Препринттеки Табло 2, бул маанилери ПП45_3 жана ПП199_32 кимликлерийле гөстермектедир. Табло менен анлаты арасындаки бул уюшмазлык дүзелтилмеден рапорланмыштыр.

натыйжаларын текник өзети

бул табло, изилдөөнын адай сечимини өзетлемектедир. БФЕ жана хидрожен баглары хесапламалы натыйжалардыр; ЫЖ₅₀ маанилери исе LPS менен уярылмыш фаре макрофажларында нитрит үретиминин баскыланмасына даянмактадыр. бул үч вери түрү бирге бир адайлык хипотези олуштурур, факат түздөн-түз бута инхибисёнуну же клиник натыйжалуулугу далилдебейт.

Булак жана ыкма эскертүүсү

бул ичерик, Тонг Ванг, Жунжие Тонг, Жингйинг Чен, Жонг Ксие, Янхуи Фу жана Чангбин Ю тарафындан хазырланан “Дисжоверй оф Анти-инфламматорй Жонституентс фром Наужлеа оффижиналис Таргетинг PARP1 анд DNMT1” башлыклы изилдөөя даянмактадыр.

изилдөө, SSRN үзеринде електроник копясы сунулан бир препринт араштырма макалесидир. Метнин ар бир сайфасында “Тхис препринт ресеарч папер хас нот беен пеер ревиевед” жана “Препринт нот пеер ревиевед” уярылары булунмактадыр. изилдөө рецензиядан өтө элек. Метинде догруланабилир бир DOI, хакемли дерги кабулү же нихаи яйын билгиси верилмемиштир.

Араштырма; клетка маданияты денейи, етикетсиз нижел протеомика, тармак фармакологиясы, белок-белок өз ара аракеттенүү анализи, герие дөнүк жана илерие дөнүк молекүлер дожкинг, хомоложи моделлеме, АлпхаФолд2 япысы, 100 наносаниелик молекүлер динамик симүласёнлары жана MM/PBSA байланышуу эркин энергиясы хесапламаларыны бирлештирмектедир.

изилдөө клиник араштырма эмес. Хайван денейи, адам денейи, клиникалык натыйжалуулук, адам коопсуздугу, фармакокинетик же дарылоо гарантиси сунмамактадыр. ПП45_3 жана ПП199_76 үчүн билдирилен анти-енфламатувар булгулар, LPS менен уярылмыш RAW264.7 фаре макрофажларында нитрит үретиминин азалмасына даянмактадыр.

PARP1 жана DNMT1 түздөн-түз биохимиялык багланма же ензим инхибисён тажрыйбаларыйле догруланмамыштыр. бул протеинлер тармак фармакологиясы, протеомика кесишим жана билгисаяр моделлемеси сонужунда потансиел буталар катары белирленмиштир. Долайысыйла “ПП45_3 PARP1’и, ПП199_76 DNMT1’и кесин катары инхибе едер” бичиминде бир натыйжа куруламаз.

Препринтте Табло 2’деки лиганд кимликлери менен натыйжа анлатысы арасында, хүжре жанлылыгы метни менен Шекил 3’теки истатистик ишаретлери арасында, протеомика ФЖ жана лог₂ФЖ ифаделеринде, саф билешик консантрасён биримлеринде жана колдонулган битки кысымларынын танымында базы ич тутарлылык сорунлары булунмактадыр. бул ичерикте сөз конусу нокталар дүзелтилмемиш, дегиштирилмемиш же гизленмемиш; окуюжунун верилери догру багламда дегерлендиребилмеси үчүн ачыкча белиртилмиштир.

бул макале гана йүкленен билимсел изилдөөдаки ыкмалере, шекиллере, таблолара, сайысал верилере жана язарларын ёрумларына даяныларак хазырланмыштыр. изилдөөда булунмаян клиник, коммерциялык же дарылоо едижи иддиалар екленмемиштир.