Bu çalışma, geleneksel Çin tıbbında kullanılan Nauclea officinalis bitkisinin anti-enflamatuvar etkisinden hangi kimyasal bileşenlerin sorumlu olabileceğini ve bu bileşenlerin hücre içinde hangi proteinlerle ilişkili olabileceğini araştırmaktadır. Araştırmacılar tek bir analiz yöntemine dayanmak yerine ağ farmakolojisi, etiketsiz nicel proteomik, protein-protein etkileşim analizi, moleküler kenetlenme, moleküler dinamik simülasyonu, MM/PBSA bağlanma serbest enerjisi hesaplamaları ve hücre kültürü deneylerini bir araya getiren çok aşamalı bir tarama sistemi kurmuştur.

Literatürden derlenen 279 N. officinalis bileşeni arasından ilaç benzerliği ölçütlerini karşılayan 210 bileşen için 980 olası protein hedefi tahmin edilmiştir. İnflamasyonla ilişkilendirilen 3.084 hastalık hedefiyle yapılan karşılaştırmada 331 ortak hedef bulunmuştur. Ağ analizleri PARP1, DNMT1, MAPK1, TNF, EGFR, STAT3 ve TLR4 gibi proteinleri yüksek bağlantılı düğümler olarak göstermiştir. LPS ile inflamasyon oluşturulan RAW264.7 fare makrofajlarında gerçekleştirilen proteomik analiz ise N. officinalis özütünün çok sayıda proteinin düzeyini değiştirdiğini ortaya koymuş; ağ farmakolojisi ile proteomik sonuçların kesişiminden PARP1 ve DNMT1 iki temel potansiyel hedef olarak seçilmiştir.

Yapısal sanal tarama sonucunda PARP1 için PP45_3 kodlu Nauclefoline, DNMT1 için ise PP199_76 kodlu Angustidine öne çıkarılmıştır. Çalışmada PP45_3–PARP1 kompleksi için bağlanma serbest enerjisi −23,65 ± 4,99 kcal/mol, PP199_76–DNMT1 kompleksi için −24,23 ± 4,83 kcal/mol olarak bildirilmiştir. LPS ile uyarılmış makrofajlarda nitrik oksit üretiminin baskılanmasına dayanan deneylerde PP45_3 için IC₅₀ 14,3 µM, PP199_76 için ise 9,3 µM olarak hesaplanmıştır.

Bu sonuçlar iki molekülü anti-enflamatuvar ilaç olarak kanıtlamamaktadır. Çalışma yalnızca tek bir fare makrofaj hücre hattında, tek bir inflamasyon modeli ve büyük ölçüde nitrik oksit üretimine dayanan bir biyolojik okuma kullanmıştır. PARP1 ve DNMT1 ile doğrudan biyokimyasal hedef etkileşimi, enzim inhibisyonu, genetik doğrulama, hayvan deneyi, insan güvenliliği veya klinik etkinlik gösterilmemiştir. Ayrıca çalışma hakem değerlendirmesinden geçmemiş bir preprinttir.

Çalışmanın temel problemi nedir?

İnflamasyon, dokunun enfeksiyon, toksin, travma veya başka zararlı uyaranlara karşı geliştirdiği savunma yanıtıdır. Kısa süreli ve kontrollü olduğunda koruyucu olabilir; ancak aşırı, yetersiz veya uzun süreli hale geldiğinde doku hasarının ve hastalık ilerlemesinin bir parçasına dönüşebilir. Çalışmanın çıkış noktası, yaygın kullanılan anti-enflamatuvar ilaçların etkili olmalarına karşın gastrointestinal, kardiyovasküler, renal ve hepatik yan etkilerle ilişkilendirilebilmesi ve bu nedenle doğal kaynaklı yeni adaylara ihtiyaç duyulmasıdır.

Nauclea officinalis, Çin’de “Dan Mu” adıyla bilinen ve geleneksel olarak kullanılan Rubiaceae familyasına ait bir bitkidir. Önceki araştırmalar bu bitkinin ham özütünün LPS ile uyarılmış makrofajlarda nitrik oksit, TNF-α ve IL-6 gibi inflamatuvar aracıların üretimini azaltabildiğini; NF-κB sinyal yolundaki IκB-α ve p65 proteinlerinin fosforilasyonunu baskılayabildiğini bildirmiştir. Bununla birlikte ham özüt, çok sayıda kimyasalın birlikte bulunduğu karmaşık bir karışımdır. Ham özütün etkili olması, hangi bileşenin hangi proteine bağlandığını veya hangi moleküler mekanizmanın temel olduğunu tek başına göstermez.

Araştırmanın cevaplamaya çalıştığı ana soru bu nedenle şöyledir: N. officinalis içindeki yüzlerce kimyasal bileşen arasından anti-enflamatuvar etkiye katkıda bulunabilecek belirli moleküller ve bunların olası protein hedefleri sistematik biçimde belirlenebilir mi?

Literatürdeki boşluk

Çalışmaya göre daha önce N. officinalis ham özütü ve Strictosamide gibi sınırlı sayıdaki bileşen üzerinde anti-enflamatuvar araştırmalar yapılmıştır. Ancak bitkinin kimyasal çeşitliliğini, hastalıkla ilişkili protein ağlarını, hücresel proteom değişikliklerini ve moleküler bağlanma modellerini aynı araştırma çerçevesinde birleştiren bir “bileşen–hedef” haritası bulunmamaktadır.

Bu boşluk iki önemli sorun doğurmaktadır:

• Bir ham özütte gözlenen etkinin hangi saf moleküllerden kaynaklandığı kesin olarak bilinmemektedir.
• Aktif görünen moleküllerin hücre içinde doğrudan veya dolaylı olarak hangi proteinlerle ilişkili olduğu gösterilememektedir.

Araştırmacılar bu iki sorunu çözmek için önce geniş bir aday havuzu oluşturmuş, ardından her aşamada aday sayısını azaltan bir eleme düzeni kurmuştur. Çalışmanın Şekil 1’de verilen iş akışı; ham özütün hücresel doğrulanması, ağ farmakolojisi, proteomik, sanal tarama ve saf bileşiklerin hücresel test edilmesi olmak üzere beş ana basamaktan oluşmaktadır.

279 bileşenden başlayan kimyasal tarama

Araştırmacılar PubMed, Web of Science, CNKI ve VIP gibi veri kaynaklarında Nisan 2025’e kadar yayımlanmış N. officinalis çalışmalarını taramış ve 279 kimyasal bileşenden oluşan bir kütüphane hazırlamıştır. Bu bileşenlerin:

• 199’u temel bir derleme çalışmasından alınmış ve “PP199_” önekiyle,
• 45’i başka bir kapsamlı çalışmadan alınmış ve “PP45_” önekiyle,
• 35’i ise diğer yayınlardan alınmış ve “PP35_” önekiyle

kodlanmıştır. Bu kodlar moleküllerin kimyasal adı değil, araştırma sırasında kullanılan kütüphane kimlikleridir.

SwissADME üzerinden yapılan ilaç benzerliği taramasında yüksek gastrointestinal emilim öngörüsü, 0,55’in üzerinde biyoyararlanım değeri ve Lipinski, Veber, Ghose, Muegge ve Egan filtrelerine uygunluk aranmıştır. Ayrıca çok sayıda analizde yanlış pozitif sonuç verebilen pan-assay interference compounds, yani PAINS yapıları elenmiştir. Tekrarlanan kayıtlar da çıkarıldığında 210 bileşen hedef tahminine alınmıştır.

Bu filtreler bir molekülün insanlarda etkili, güvenli veya klinik olarak kullanılabilir olduğunu kanıtlamaz. Yalnızca kimyasal özellikleri bakımından ilaç geliştirme açısından daha elverişli görünen adayları önceliklendirmeye yarar.

Ağ farmakolojisi: Bitki bileşenlerinden protein ağına

SwissTargetPrediction ile 210 bileşen için olası protein hedefleri tahmin edilmiş ve olasılık puanı 0,1’in altında kalan hedefler dışlanmıştır. Sonuçta 980 olası protein hedefi elde edilmiştir.

Hastalıkla ilişkili hedefler GeneCards, Therapeutic Target Database ve OMIM kaynaklarından toplanmıştır. Yöntem bölümünde hastalık aramasının genel “inflamasyon” teriminden ziyade, temsili inflamatuvar durum olarak “pneumonia”, yani pnömoni üzerinden yapıldığı belirtilmektedir. Bu arama 3.084 hastalık hedefi üretmiştir. Bitki bileşeni hedefleriyle hastalık hedefleri karşılaştırıldığında 331 ortak protein bulunmuştur.

Şekil 2’deki Venn diyagramı bu kesişimi gösterir. Büyük hastalık kümesinde yalnızca hastalık verilerinde bulunan 2.753 hedef, bitki tarafında yalnızca N. officinalis bileşenleriyle ilişkilendirilen 649 hedef ve ortada iki grubun ortak olduğu 331 hedef yer almaktadır. Bu ortaklık, 331 proteinin gerçekten tedavi hedefi olduğunu kanıtlamaz; yalnızca hem hastalık veri tabanlarında hem de kimyasal hedef tahminlerinde karşılaşılan adayları gösterir.

Zenginleştirme analizleri ne anlattı?

331 ortak hedef üzerinde Gene Ontology, KEGG ve Reactome zenginleştirme analizleri gerçekleştirilmiştir. Gene Ontology analizinde üç temel kategori incelenmiştir:

• Biyolojik süreçler: Makrofaj aktivasyonu, TNF sinyali, inflamatuvar yanıtın pozitif düzenlenmesi ve LPS’ye yanıt.
• Hücresel bileşenler: Hücre dışı alan, reseptör kompleksleri ve bağışıklıkla ilişkili hücresel yapılar.
• Moleküler işlevler: LPS bağışıklık reseptörü aktivitesi, sitokin bağlanması ve çeşitli sinyal proteinleriyle etkileşim.

KEGG ve Reactome analizleri TNF, NF-κB, Toll-benzeri reseptör, IL-17, doğal bağışıklık ve inflammazom yollarının öne çıktığını göstermiştir. Bu sonuç, N. officinalis bileşenlerinin tek bir proteinden ziyade birbirine bağlı bir inflamasyon ağıyla ilişkili olabileceği hipotezini desteklemektedir.

Protein-protein etkileşim ağı içinde MAPK1, TNF, PARP1, DNMT1, EGFR, STAT3 ve TLR4 gibi proteinler 30’un üzerinde bağlantı derecesine sahip merkez düğümler olarak belirlenmiştir. MCODE algoritması, puanı 3,5’in üzerinde olan beş alt ağ ve toplam 112 çekirdek hedef seçmiştir. Ancak ağdaki yüksek bağlantı derecesi, bir proteinin mutlaka doğrudan ilaç hedefi olduğu anlamına gelmez. Yüksek dereceli proteinler biyolojik ağlarda çok sayıda süreçle ilişkili oldukları için de öne çıkabilir.

Ham özütün hücre kültüründeki etkisi

Deneysel modelde RAW264.7 fare makrofajları kullanılmıştır. Hücrelere 1 µg/mL lipopolisakkarit, yani LPS uygulanmış ve 24 saat boyunca inflamatuvar yanıt oluşturulmuştur. LPS, özellikle Gram-negatif bakterilerin dış zarında bulunan bir bileşendir ve laboratuvar ortamında makrofajların inflamatuvar sinyal yollarını uyarmak için yaygın biçimde kullanılır.

Ham özütün hücre canlılığı üzerindeki etkisi CCK8 testiyle değerlendirilmiştir. Araştırmacılar sonraki deneylerde güçlü inflamasyon baskılanması ile düşük sitotoksisite arasında denge kurmak amacıyla 100 µg/mL ham özüt konsantrasyonunu seçmiştir.

Şekil 3A’da konsantrasyon yükseldikçe hücre canlılığının azalma eğilimi görülmektedir. Bununla birlikte şekil üzerindeki istatistik işaretleri ile sonuç metni arasında açıklığa kavuşturulması gereken bir uyumsuzluk vardır. Metin, 200 µg/mL’de hücre canlılığının %91,47’ye düştüğünü ve farkın anlamlı olduğunu bildirirken; grafikte 200 ve 400 µg/mL değerleri “ns”, 600 µg/mL “*”, 800 µg/mL ise “***” olarak gösterilmektedir. Bu makalede iki sunumdan biri tercih edilerek düzeltilmemiş, çalışmadaki tutarsızlık olduğu gibi belirtilmiştir.

Nitrik oksit neden ölçüldü?

Makrofajlar LPS ile uyarıldığında indüklenebilir nitrik oksit sentaz üzerinden nitrik oksit üretimini artırabilir. Çalışmada nitrik oksit doğrudan ölçülmemiş; kültür ortamındaki daha kararlı nitrit ürünü Griess reaksiyonu ile belirlenmiştir. Bu nedenle grafiklerdeki “nitrit” düzeyi, hücrelerin nitrik oksit üretiminin dolaylı göstergesi olarak kullanılmıştır.

Ham özüt 12,5 µg/mL’den itibaren LPS ile yükselen nitrit düzeyini istatistiksel olarak azaltmıştır. Bildirilen anlamlılık düzeyleri şöyledir:

• 12,5 µg/mL: p < 0,05
• 25 µg/mL: p < 0,05
• 50 µg/mL: p < 0,01
• 100 µg/mL: p < 0,0001

Şekil 3B’de LPS grubunun nitrit düzeyinin yaklaşık 20 birim civarına yükseldiği, ham özüt dozu arttıkça bu değerin kademeli biçimde azaldığı görülmektedir. Araştırmacılar 100 µg/mL’yi sonraki proteomik deneyler için çalışma konsantrasyonu olarak belirlemiştir.

Bu sonuç yalnızca LPS ile uyarılmış RAW264.7 hücrelerinde nitrit üretiminin azaldığını göstermektedir. İnsanlardaki inflamatuvar hastalıkların tedavi edildiğini, bağışıklık sisteminin genel olarak baskılandığını veya klinik fayda sağlandığını göstermez.

Proteomik analiz: Binlerce proteinin birlikte izlenmesi

Ham özütün hücrede hangi proteinleri değiştirdiğini belirlemek için üç grup karşılaştırılmıştır:

1. İşlem uygulanmayan kontrol grubu,
2. 1 µg/mL LPS ile oluşturulan inflamasyon grubu,
3. 1 µg/mL LPS ve 100 µg/mL N. officinalis özütü verilen tedavi grubu.

Proteinler basınç döngüsü teknolojisiyle parçalanmış, Lys-C ve tripsin kullanılarak peptitlere ayrılmış ve UltiMate 3000–FAIMS–Orbitrap Exploris 480 LC–MS sistemiyle analiz edilmiştir. Çalışmada her grupta altı paralel örnek bulunduğu ve yaklaşık 4.300–4.600 proteinin tanımlandığı belirtilmektedir.

Ham verilerin işlenmesinde %50’den fazla eksik değere sahip proteinler çıkarılmış, kalan eksik değerler medyanla tamamlanmış, limma paketiyle kantil normalizasyonu yapılmış ve bolluk değerleri log₂ dönüşümüne tabi tutulmuştur. Diferansiyel proteinler için metinde düzeltilmiş p değerinin 0,05’in altında ve mutlak log₂ kat değişiminin 1,2’nin üzerinde olması eşik olarak verilmiştir.

Kat değişiminin mantığını açıklamak için kullanılan temel ilişki şöyledir; bu denklem çalışmada açık biçimde yazılmamış, yöntemin anlaşılması için burada verilmiştir:

\[ \log_2 FC = \log_2 \left( \frac{\text{Grup A ortalama protein bolluğu}}{\text{Grup B ortalama protein bolluğu}} \right) \]

Burada FC, “fold change” yani kat değişimidir. Pozitif log₂FC bir proteinin ilk grupta daha yüksek, negatif değer ise daha düşük olduğunu gösterir.

Çalışmanın yöntem metni “|log₂FC| > 1,2” ifadesini kullanırken Şekil 4 açıklamasında “FC = 1,2” yazılması ve tartışma bölümünde DNMT1 için 1,4 ve 1,24 gibi doğrusal FC değerlerinin verilmesi terminolojik bir belirsizlik oluşturmaktadır. Log₂FC ile doğrusal FC aynı ölçü değildir. Bu nedenle kullanılan kesin diferansiyel protein eşiğinin hakemli sürümde açıklığa kavuşturulması gerekir.

Proteomik grafiklerin anlattıkları

Şekil 4A’daki temel bileşen analizi, kontrol, inflamasyon ve tedavi örneklerinin proteom profillerinin ayrı kümeler oluşturduğunu göstermektedir. PC1 toplam varyansın %25,6’sını, PC2 ise %15,7’sini açıklamaktadır. Üç grubun ayrışması, LPS uygulamasının ve ham özüt tedavisinin protein örüntüsünde ölçülebilir değişiklikler oluşturduğunu desteklemektedir.

Şekil 4B’de üç grupta da benzer sayıda, yaklaşık 4.300–4.600 protein tanımlandığı görülmektedir. Bu, gruplar arasındaki ayrımın yalnızca bir grupta çok daha az protein ölçülmesinden kaynaklanmadığını düşündürmektedir.

İnflamasyon grubu kontrol grubuyla karşılaştırıldığında 1.288 farklı ifade edilen protein belirlenmiştir. Tedavi grubu inflamasyon grubuyla karşılaştırıldığında 712 protein değişmiştir. Venn diyagramında bu iki karşılaştırmanın 258 ortak diferansiyel proteini bulunduğu gösterilmektedir. Diyagramda ayrıca inflamasyon–kontrol karşılaştırmasına özgü 1.030, tedavi–inflamasyon karşılaştırmasına özgü 454 protein yer almaktadır.

Volkan grafiklerinde yatay eksen protein bolluğundaki değişimi, dikey eksen ise istatistiksel anlamlılığı temsil etmektedir. Grafiğin sağında kalan noktalar artan, solunda kalan noktalar azalan proteinleri göstermektedir. Bu grafikler tek tek proteinlerin biyolojik önemini kanıtlamaz; değişimin büyüklüğü ve istatistiksel desteği hakkında bir genel görünüm sağlar.

Tedavi ve inflamasyon grupları arasındaki farklı proteinler LPS yanıtı, sitokin aracılı sinyal, doğal bağışıklık, NF-κB sinyali, eikosanoid sentezi ve kompleman sistemi gibi süreçlerde zenginleşmiştir. Hücresel bileşenler arasında lipid damlacıkları ve mitokondri matriksi; moleküler işlevler arasında NADPH ve NF-κB bağlanması öne çıkmıştır.

PARP1 ve DNMT1 nasıl seçildi?

Proteomik diferansiyel proteinler üzerinde kurulan protein-protein etkileşim ağında MCODE puanı 5,882 olan ve 18 proteinden oluşan en yüksek puanlı modül seçilmiştir. Bu 18 protein, ağ farmakolojisinin oluşturduğu 112 çekirdek hedefle karşılaştırılmıştır. İki listenin kesişiminde yalnızca PARP1 ve DNMT1 kalmıştır.

PARP1, poli(ADP-riboz) polimeraz 1 proteinidir. Çalışmada DNA hasarı yanıtı, proinflamatuvar gen ifadesi ve mitokondriyle ilişkili hücre ölümü süreçleriyle bağlantısı üzerinden tartışılmıştır.

DNMT1, DNA sitozin-5-metiltransferaz 1 proteinidir. DNA metilasyon örüntülerinin korunmasında rol alır. Çalışma, daha önce DNMT1–PPAR-γ ekseni ile makrofajların proinflamatuvar fenotipe yönelmesi arasında ilişki bildiren araştırmalara atıfta bulunmaktadır.

Proteomik verilere göre DNMT1 inflamasyon grubunda kontrole kıyasla yükselmiş, N. officinalis tedavisinden sonra düşmüştür. Tartışma bölümünde bu değişimler sırasıyla FC = 1,4 ve FC = 1,24 olarak belirtilmiştir. PARP1’in ise tedavi grubunda inflamasyon grubuna göre FC = 1,3 düzeyinde azaldığı bildirilmiştir. Ancak bu FC değerlerinin yön işaretleri ve yöntem bölümündeki log₂FC eşiğiyle ilişkisi metinde yeterince açık değildir.

Bu aşamada PARP1 ve DNMT1 “doğrulanmış doğrudan hedefler” değil, ağ farmakolojisi ile proteomik verilerin kesişiminden belirlenen potansiyel hedeflerdir. Protein bolluğunun tedaviyle değişmesi, bitki bileşeninin o proteine doğrudan bağlandığını göstermez.

İnsan ve fare protein yapıları neden karşılaştırıldı?

Ağ farmakolojisi insan hastalık hedeflerine dayanırken hücre deneyleri fare kökenli RAW264.7 hücrelerinde gerçekleştirilmiştir. İnsan ve fare proteinleri benzer olsa da bağlanma ceplerindeki yapısal farklılıklar sanal tarama sonuçlarını etkileyebilir. Araştırmacılar bu nedenle kullanacakları yapıları geriye dönük moleküler kenetlenmeyle sınamıştır.

DNMT1 için insan yapısı PDB 6X9J, fare yapısı PDB 4DA4 olarak alınmıştır. Omurga RMSD değeri 2,71 Å bulunmuş ve iki yapı arasında dikkate değer bir geometrik farklılık olduğu belirtilmiştir. Aktif ve yalancı bileşiklerden oluşan sınama kümesinde:

• Fare DNMT1 yapısı için AUC 0,77 ve logAUC 0,17,
• İnsan DNMT1 yapısı için AUC 0,72 ve logAUC 0,03

elde edilmiştir. Özellikle erken sıralardaki aktif bileşikleri zenginleştirme performansını temsil eden logAUC nedeniyle fare DNMT1 yapısı seçilmiştir.

PARP1 için insan kristal yapısı PDB 7AAC kullanılmıştır. Deneysel fare PARP1 yapısı bulunmadığından bir homoloji modeli ve AlphaFold2 tahmini değerlendirilmiştir. İnsan yapısıyla fare AlphaFold2 modeli arasındaki RMSD 0,89 Å, insan yapısıyla homoloji modeli arasındaki RMSD 0,06 Å olarak verilmiştir. Üç yapının AUC değerleri birbirine yakın bulunmuş; deneysel doğrulama fare hücrelerinde yapıldığı için fare homoloji modeli tercih edilmiştir.

RMSD ve RMSF grafiklerini nasıl okumak gerekir?

Moleküler dinamik simülasyonunda RMSD, bir protein veya ligandın zaman içinde başlangıç ya da referans yapıya göre ne kadar yer değiştirdiğini özetler. Çalışmanın kullandığı ölçütün mantığını açıklamak için temel RMSD ilişkisi şöyledir; denklem makalede açık biçimde verilmemiştir:

\[ \mathrm{RMSD}(t) = \sqrt{\frac{1}{N}\sum_{i=1}^{N}\left\|\mathbf{r}_i(t)-\mathbf{r}_i^{ref}\right\|^2} \]

Burada:

• N, karşılaştırılan atom sayısını,
• r_i(t), i numaralı atomun t anındaki konumunu,
• r_i^ref, aynı atomun referans konumunu

ifade eder. RMSD’nin belirli bir düzeyde dalgalanarak plato oluşturması sistemin dengeye yaklaşmış olabileceğini düşündürür. Ancak düşük RMSD tek başına doğru bağlanma, yüksek afinite veya biyolojik inhibisyon kanıtı değildir.

RMSF ise her amino asit kalıntısının simülasyon boyunca ne kadar hareketli olduğunu gösterir. Yüksek RMSF değerleri proteinin daha esnek bölgelerine, düşük değerler daha kararlı bölgelere karşılık gelir. Şekil 5’teki 100 nanosaniyelik apo simülasyonlar, seçilen fare DNMT1 ve fare PARP1 homoloji modeli yapılarının genel olarak kararlı bir seyir gösterdiğini ve belirli bölgelerde yerel esneklik bulunduğunu ortaya koymaktadır.

PARP1 için PP45_3 nasıl seçildi?

279 bileşen PARP1 yapısına karşı QVina2 ile taranmıştır. Bağlanma puanı −11 kcal/mol’den daha düşük, yani hesaplamaya göre daha elverişli olan 110 molekül elle incelenmiştir. Gerçekçi görünmeyen bağlanma biçimleri çıkarılmış ve uygun hidrojen bağları gösteren 10 bileşik seçilmiştir.

Bu 10 protein–ligand kompleksi için 100 nanosaniyelik moleküler dinamik simülasyonu yapılmıştır. Protein omurga RMSD grafiklerinde komplekslerin büyük bölümünün apo PARP1’e benzer kararlılık gösterdiği bildirilmiştir. Ligandın protein omurgasına göre RMSD grafiğinde PP45_3, PP199_188 ve PP199_189 gibi bazı bileşiklerin yaklaşık 0,2 nm çevresinde daha istikrarlı kaldığı görülmüştür. Sistemlerin özellikle son 40 nanosaniyede kararlı hale geldiği kabul edilmiş ve bağlanma serbest enerjisi bu bölümden hesaplanmıştır.

MM/PBSA yönteminin temel mantığı, kompleks durumunun enerjisini ayrılmış protein ve ligand durumlarıyla karşılaştırmaktır. Çalışmada açık denklem verilmemiştir; yöntemi açıklamak için genel ilişki şu şekilde gösterilebilir:

\[ \Delta G_{bağlanma} = G_{kompleks} - \left(G_{protein} + G_{ligand}\right) \]

Daha negatif bir ΔG değeri, kullanılan hesaplama modeli içinde daha elverişli bağlanmayı temsil eder. Bununla birlikte MM/PBSA yaklaşık bir hesaplama yöntemidir ve gerçek deneysel bağlanma afinitesinin yerine geçmez.

PARP1 tablosunda PP45_3 için:

• Moleküler kenetlenme puanı: −12,2 kcal/mol
• Bağlanma serbest enerjisi: −23,65 ± 4,99 kcal/mol

bildirilmiştir. PP199_69 daha negatif ortalama değere, −24,58 kcal/mol’e sahip olsa da standart sapması ±19,07 kcal/mol olduğu için kararsız kabul edilmiş ve sonraki deneylere alınmamıştır. Araştırmacılar böylece PP45_3’ü PARP1 için öncü aday olarak seçmiştir.

Metinde bağlanma serbest enerjisinin “14 bileşik” için yeniden sıralandığı yazılmasına karşın ilgili şekil ve tabloda 10 PARP1 adayı gösterilmektedir. Bu sayı farkı çalışmanın açıklığa kavuşturulması gereken iç tutarlılık noktalarından biridir.

DNMT1 için PP199_76 nasıl seçildi?

DNMT1 taramasında kenetlenme puanı −10 kcal/mol’den daha düşük olan en iyi 23 bileşik elle incelenmiş ve yedi aday seçilmiştir. Bu kompleksler de 100 nanosaniye boyunca simüle edilmiştir.

Protein omurga RMSD değerlerinin çoğu apo proteinden düşük görünse de ligand RMSD analizi bazı moleküllerin hedef cebinden uzaklaştığını göstermiştir. PP199_21, PP199_40 ve PP199_105 için 1 nm’nin üzerinde hareket gözlenmiştir. Araştırmacılar bunu ligandın hedef cebinden kaçması olarak yorumlamış ve yalnızca protein omurgasının kararlı görünmesinin yeterli olmadığını göstermiştir.

Son 40 nanosaniyelik yörünge üzerinden yapılan bağlanma enerjisi hesaplamasında anlatı metni:

• PP199_76 için −24,23 ± 4,83 kcal/mol,
• PP199_31 için −25,33 ± 7,38 kcal/mol

değerlerini vermektedir. PP199_31’in daha büyük standart sapma nedeniyle elendiği, PP199_76’nın seçildiği belirtilmiştir.

Ancak Tablo 2’de ligand kimlikleri anlatı ve Şekil 7 ile uyuşmamaktadır. Tabloda −24,23 ± 4,83 kcal/mol değeri PP45_3’e, −25,33 ± 7,38 kcal/mol değeri ise PP199_32’ye yazılmıştır. Tablo satırlarının önemli bölümü PARP1 tablosundaki ligand kimliklerini tekrar etmektedir. Buna karşılık başlık, özet, sonuç metni ve son doğrulama bölümü seçilen DNMT1 adayını PP199_76 olarak tanımlamaktadır. Bu makalede tablo düzeltilmemiştir; preprintte bulunan kimlik uyuşmazlığı açıkça kaydedilmiştir.

İki öncü bileşiğin kimliği

Bitkisel materyalin hazırlanmasında 30 kg havada kurutulmuş gövde ve yaprak kullanılmıştır. Materyal oda sıcaklığında %85 etanolle üç kez, her seferinde bir hafta boyunca ekstrakte edilmiştir. Ham özüt su içinde süspanse edilmiş; petrol eteri ve etil asetatla fraksiyonlara ayrılmıştır. Silika jel, RP-18, Sephadex LH-20 ve yarı preparatif HPLC basamaklarının ardından 18,3 mg PP199_76 ve 39,2 mg PP45_3 elde edilmiştir.

Çalışmanın girişinde geleneksel drog kuru gövde ve kök olarak tanımlanırken deney bölümünde gövde ve yaprakların kullanıldığı belirtilmektedir. Bitkinin kullanılan kısmı kimyasal profili etkileyebileceğinden bu farkın açıklanması gerekir.

Öngörülen protein–ligand bağlanmaları

Son 100 nanosaniyelik simülasyonların temsili yapıları incelendiğinde:

• PP45_3’ün PARP1 aktif bölgesinde E762, N766 ve S863 kalıntılarıyla üç hidrojen bağı oluşturduğu,
• PP199_76’nın DNMT1 aktif bölgesinde E1269 ve R1315 kalıntılarıyla iki hidrojen bağı oluşturduğu

bildirilmiştir. Şekil 8B bu bağları sarı çizgilerle göstermektedir. Bu modeller, moleküllerin hedef ceplerinde nasıl konumlanabileceğine ilişkin yapısal bir hipotez sağlar. Ancak modelde hidrojen bağı görülmesi, gerçek biyolojik ortamda doğrudan bağlanmanın veya enzim inhibisyonunun gerçekleştiğini kanıtlamaz.

Saf bileşiklerin hücresel anti-enflamatuvar sonuçları

PP45_3 ve PP199_76, LPS ile uyarılmış RAW264.7 makrofajlarında Griess testi kullanılarak değerlendirilmiştir. Her iki molekül de doz arttıkça nitrit üretimini azaltmıştır. Çalışmada hesaplanan yarı maksimum inhibitör konsantrasyonlar şöyledir:

IC₅₀, bir biyolojik yanıtın başlangıç ile en yüksek inhibisyon arasındaki yarısına ulaşılan konsantrasyondur. Daha düşük IC₅₀ değeri aynı deney sistemi ve aynı konsantrasyon birimi içinde daha yüksek görünür güce işaret eder.

Burada önemli bir karşılaştırma sorunu bulunmaktadır. Saf bileşiklerin IC₅₀ değerleri µM, ham özütün değeri ise µg/mL cinsinden verilmiştir. Ayrıca ham özüt çok sayıda molekülün karışımıdır. Bu nedenle saf bileşiklerle ham özütün “kaç kat daha güçlü” olduğu doğrudan bu değerlerden hesaplanamaz.

Yöntem bölümünde ve Şekil 8 eksenlerinde saf bileşiklerin uygulama konsantrasyonları 6,25–100 µg/mL olarak gösterilirken sonuçlarda IC₅₀ değerleri µM olarak sunulmuştur. Kütlesel konsantrasyondan molar konsantrasyona dönüşüm yapılmış olabilir; ancak dönüşüm yöntemi ve doz–yanıt hesabının ayrıntıları metinde verilmemiştir. Bu birim farkının hakemli sürümde açıklanması gerekir.

Çalışmanın güçlü yönleri

• Çok aşamalı yaklaşım: Tek başına moleküler kenetlenmeye güvenilmemiş; ağ farmakolojisi, proteomik, geriye dönük yapı değerlendirmesi, moleküler dinamik, bağlanma enerjisi ve hücre deneyi bir araya getirilmiştir.
• Geniş kimyasal kütüphane: Literatürde bildirilen 279 bileşik sistematik olarak derlenmiştir.
• Ham özüt ile saf molekül arasında bağlantı kurulması: Önce özütün hücre üzerindeki etkisi gösterilmiş, ardından iki saf bileşik izole edilerek test edilmiştir.
• İnsan–fare yapı farkının dikkate alınması: Hücre modelinin fare kökenli olması nedeniyle protein yapılarının sanal tarama performansı ayrıca değerlendirilmiştir.
• Kararsız adayların elenmesi: Yalnızca en negatif kenetlenme puanları seçilmemiş; büyük RMSD veya yüksek enerji belirsizliği gösteren adaylar dışlanmıştır.
• Kimyasal kimlik ve izolasyon bilgisinin verilmesi: Öncü moleküllerin adları, CAS numaraları, moleküler formülleri ve izolasyon süreçleri raporlanmıştır.

Çalışmanın sınırlılıkları

• Hakemlik yoktur: Makale bir preprinttir ve bağımsız hakem değerlendirmesinden geçmemiştir.
• Tek hücre modeli kullanılmıştır: Bulgular yalnızca LPS ile uyarılmış RAW264.7 fare makrofajlarına dayanmaktadır.
• Tek temel inflamasyon göstergesi vardır: Saf bileşiklerin deneysel değerlendirmesi ağırlıklı olarak nitrit üretimine dayanmıştır.
• Saf bileşik sitotoksisitesi açıkça gösterilmemiştir: Ham özüt için CCK8 analizi verilmiş, ancak PP45_3 ve PP199_76 için eş zamanlı hücre canlılığı sonuçları sunulmamıştır. Nitrit azalmasının hücre sayısından bağımsız olduğunun ayrıca gösterilmesi gerekir.
• Doğrudan hedef doğrulaması yoktur: PARP1 ve DNMT1 enzim aktivitesi, saf protein bağlanması, termal kayma, yüzey plazmon rezonansı, izotermal titrasyon kalorimetrisi veya benzeri yöntemlerle doğrulanmamıştır.
• Genetik doğrulama yoktur: PARP1 veya DNMT1 susturma, aşırı ifade ya da kurtarma deneyleriyle bileşik etkisinin bu hedeflere bağımlı olduğu gösterilmemiştir.
• Hayvan deneyi yoktur: Farmakokinetik, biyoyararlanım, doz, toksisite ve organizma düzeyindeki anti-enflamatuvar etki değerlendirilmemiştir.
• Klinik veri yoktur: İnsanlarda güvenlilik veya etkinlik hakkında sonuç çıkarılamaz.
• Hastalık hedeflerinin kapsamı sınırlıdır: Genel inflamasyon yerine pnömoni hedeflerinin temsili inflamatuvar veri kümesi olarak kullanılması başka inflamasyon türlerine genellenebilirliği sınırlayabilir.
• Çok bileşenli sinerji incelenmemiştir: Ham özütteki bileşiklerin birbirini güçlendirmesi, zayıflatması veya metabolizmayı değiştirmesi değerlendirilmemiştir.
• Metin ve tablolar arasında tutarsızlıklar vardır: DNMT1 adaylarının kimlikleri, proteomik eşik tanımları, sitotoksisite istatistikleri ve konsantrasyon birimlerinde açıklık gerektiren farklılıklar bulunmaktadır.

Çalışma ne söylüyor?

• N. officinalis ham özütü, belirlenen hücre modeli ve doz aralığında LPS ile yükselen nitrit üretimini azaltmıştır.
• Ham özüt tedavisi RAW264.7 hücrelerinin proteom profilinde belirgin değişikliklerle ilişkilendirilmiştir.
• Ağ farmakolojisi ve proteomik kesişimi PARP1 ile DNMT1’i potansiyel hedefler olarak önceliklendirmiştir.
• Hesaplamalı modeller PP45_3’ün PARP1’e, PP199_76’nın DNMT1’e bağlanabilecek yapısal özellikler taşıdığını öngörmüştür.
• İki saf bileşik LPS ile uyarılmış makrofajlarda nitrit üretimini konsantrasyona bağlı biçimde azaltmıştır.

Çalışma ne söylemiyor?

• PP45_3 veya PP199_76’nın insanlarda anti-enflamatuvar ilaç olduğunu göstermemektedir.
• Bu bileşiklerin PARP1 ve DNMT1’i doğrudan inhibe ettiğini deneysel olarak kanıtlamamaktadır.
• Hangi inflamatuvar hastalıklarda etkili olacağını belirlememektedir.
• Güvenli doz, toksik doz, metabolizma, doku dağılımı veya ilaç etkileşimi bilgisi sunmamaktadır.
• Ham bitki ürünlerinin tüketilmesinin aynı etkiyi oluşturacağını göstermemektedir.
• Hayvanlarda veya insanlarda tedavi, korunma ya da hastalık gerilemesi kanıtı sunmamaktadır.

Geçmiş, bugün ve gelecek açısından önemi

Geçmişte doğal ürün araştırmaları çoğunlukla ham özütün belirli bir hücresel yanıtı azaltıp azaltmadığına odaklanıyordu. Bu çalışma, ham özüt bulgusunu kimyasal kütüphane, protein ağı, proteom ve moleküler yapı düzeylerine taşıyarak hangi bileşenlerin daha ayrıntılı incelenmesi gerektiğini belirlemeye çalışmaktadır.

Bugün açısından çalışmanın değeri, yüzlerce doğal bileşiği doğrudan deneysel olarak test etmek yerine hesaplamalı ve omik yöntemlerle daha küçük bir aday grubuna indirgemesidir. Böylece pahalı ve zaman alıcı deneyler, önceliklendirilmiş moleküller üzerinde yoğunlaştırılabilir.

Gelecekte PP45_3 ve PP199_76 için öncelikle doğrudan protein bağlanma ve enzim inhibisyon deneyleri yapılması gerekir. Ardından hedef bağımlılığının genetik yöntemlerle gösterilmesi, farklı insan ve hayvan hücrelerinde doğrulama, daha geniş sitokin panelleri, toksisite testleri, farmakokinetik analizler ve hayvan inflamasyon modelleri gerekecektir. Bu aşamalar başarılı olmadan moleküllerin ilaç adayı veya tedavi seçeneği olarak değerlendirilmesi erken olacaktır.

Gündelik yaşam açısından araştırma, bitkisel bir özütün doğrudan ilaç olarak kullanılmasını önermekten ziyade doğal kaynakların modern ilaç keşfinde nasıl sistematik biçimde incelenebileceğini göstermektedir. Bitkide bulunan yüzlerce bileşen önce veri tabanlarıyla süzülmüş, sonra hücresel protein değişimleriyle karşılaştırılmış, ardından atom düzeyinde simüle edilmiş ve son olarak hücre deneyine taşınmıştır. Bu süreç, geleneksel kullanım bilgisi ile çağdaş moleküler araştırma arasında bilimsel bir köprü kurma girişimidir.

Çalışmanın Yöntemi ve Bulguları

Araştırma iş akışı

Hücre kültürü ve biyolojik testler

• Hücre hattı: RAW264.7 fare makrofajı
• Kültür ortamı: %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin–streptomisin içeren DMEM
• İnkübasyon: 37 °C, %5 CO₂
• İnflamasyon uyaranı: 1 µg/mL LPS
• Uyarım süresi: 24 saat
• Hücre canlılığı: CCK8, 450 nm absorbans
• Nitrit analizi: Griess reaksiyonu, 540 nm absorbans
• Şekil açıklamalarına göre grup başına örnek sayısı: n = 6

Proteomik yöntem

• Hücre parçalama ve indirgeme/alkilasyon: Barocycler 2320EXT basınç döngüsü teknolojisi
• Protein sindirimi: Lys-C, ardından tripsin
• Peptit ayırma: C18 kolon, 80 dakikalık LC gradyanı
• Kütle spektrometrisi: FAIMS–Orbitrap Exploris 480
• MS1 tarama aralığı: m/z 350–1.500
• MS1 çözünürlüğü: 60.000
• MS/MS çözünürlüğü: 15.000
• HCD çarpışma enerjisi: %30
• Eksik veri filtresi: %50’den fazla eksik proteinlerin çıkarılması
• Kalan eksikler: medyanla tamamlama
• Normalizasyon: limma kantil normalizasyonu
• İstatistik: doğrusal modeller ve ampirik Bayes yaklaşımı
• Metinde verilen diferansiyel protein eşiği: düzeltilmiş p < 0,05 ve |log₂FC| > 1,2

Proteomik bulgular

Moleküler docking ve dinamik parametreleri

• Docking yazılımı: QVina2
• PARP1 exhaustiveness değeri: 12
• DNMT1 exhaustiveness değeri: 36
• Protein hazırlama: su moleküllerinin çıkarılması, polar hidrojen ve Kollman yüklerinin eklenmesi
• Ligand geometrisi: RDKit ve MMFF94 kuvvet alanı
• Moleküler dinamik: GROMACS 2024.1
• Protein kuvvet alanı: CHARMM36m
• Ligand kuvvet alanı: CGenFF
• Protonasyon durumu: PROPKA, pH 7,4
• Çözücü kutusu: protein–kutu sınırı arasında 1,5 nm mesafe
• Dengeleme: 100 ps NVT ve 100 ps NPT
• Üretim simülasyonu: 100 ns
• Enerji kayıt aralığı: 10 ps
• Bağlanma enerjisi: son 40 ns üzerinden gmx_MMPBSA 1.6.3

PARP1 adaylarının hesaplamalı sonuçları

PP199_69’un ortalama enerjisi daha negatif olmasına rağmen belirsizliğinin çok yüksek olması nedeniyle PP45_3 seçilmiştir.

DNMT1 adayının hesaplamalı sonucu

Veri notu: Yukarıdaki değerler sonuç anlatısı ve aday seçiminden aktarılmıştır. Preprintteki Tablo 2, bu değerleri PP45_3 ve PP199_32 kimlikleriyle göstermektedir. Tablo ile anlatı arasındaki bu uyuşmazlık düzeltilmeden raporlanmıştır.

Sonuçların teknik özeti

Bu tablo, çalışmanın aday seçimini özetlemektedir. BFE ve hidrojen bağları hesaplamalı sonuçlardır; IC₅₀ değerleri ise LPS ile uyarılmış fare makrofajlarında nitrit üretiminin baskılanmasına dayanmaktadır. Bu üç veri türü birlikte bir adaylık hipotezi oluşturur, fakat doğrudan hedef inhibisyonunu veya klinik etkinliği kanıtlamaz.

Kaynak ve Yöntem Notu

Bu içerik, Tong Wang, Junjie Tong, Jingying Chen, Cong Xie, Yanhui Fu ve Changbin Yu tarafından hazırlanan “Discovery of Anti-inflammatory Constituents from Nauclea officinalis Targeting PARP1 and DNMT1” başlıklı çalışmaya dayanmaktadır.

Çalışma, SSRN üzerinde elektronik kopyası sunulan bir preprint araştırma makalesidir. Metnin her sayfasında “This preprint research paper has not been peer reviewed” ve “Preprint not peer reviewed” uyarıları bulunmaktadır. Çalışma hakem değerlendirmesinden geçmemiştir. Metinde doğrulanabilir bir DOI, hakemli dergi kabulü veya nihai yayın bilgisi verilmemiştir.

Araştırma; hücre kültürü deneyi, etiketsiz nicel proteomik, ağ farmakolojisi, protein-protein etkileşim analizi, geriye dönük ve ileriye dönük moleküler docking, homoloji modelleme, AlphaFold2 yapısı, 100 nanosaniyelik moleküler dinamik simülasyonları ve MM/PBSA bağlanma serbest enerjisi hesaplamalarını birleştirmektedir.

Çalışma klinik araştırma değildir. Hayvan deneyi, insan deneyi, klinik etkinlik, insan güvenliliği, farmakokinetik veya tedavi garantisi sunmamaktadır. PP45_3 ve PP199_76 için bildirilen anti-enflamatuvar bulgular, LPS ile uyarılmış RAW264.7 fare makrofajlarında nitrit üretiminin azalmasına dayanmaktadır.

PARP1 ve DNMT1 doğrudan biyokimyasal bağlanma veya enzim inhibisyon deneyleriyle doğrulanmamıştır. Bu proteinler ağ farmakolojisi, proteomik kesişim ve bilgisayar modellemesi sonucunda potansiyel hedefler olarak belirlenmiştir. Dolayısıyla “PP45_3 PARP1’i, PP199_76 DNMT1’i kesin olarak inhibe eder” biçiminde bir sonuç kurulamaz.

Preprintte Tablo 2’deki ligand kimlikleri ile sonuç anlatısı arasında, hücre canlılığı metni ile Şekil 3’teki istatistik işaretleri arasında, proteomik FC ve log₂FC ifadelerinde, saf bileşik konsantrasyon birimlerinde ve kullanılan bitki kısımlarının tanımında bazı iç tutarlılık sorunları bulunmaktadır. Bu içerikte söz konusu noktalar düzeltilmemiş, değiştirilmemiş veya gizlenmemiş; okuyucunun verileri doğru bağlamda değerlendirebilmesi için açıkça belirtilmiştir.

Bu makale yalnızca yüklenen bilimsel çalışmadaki yöntemlere, şekillere, tablolara, sayısal verilere ve yazarların yorumlarına dayanılarak hazırlanmıştır. Çalışmada bulunmayan klinik, ticari veya tedavi edici iddialar eklenmemiştir.