Aspirin, digoksin, amiodaron va furosemid — trombotsitlar faoliyati, yurakning qisqarish kuchi, yurak ritmi va organizmdagi suyuqlik yuki kabi turli yurak-qon tomir jarayonlarida qo‘llaniladigan to‘rtta faol moddadir. Kimyoviy tuzilishi va xromatografik xatti-harakati bir-biridan sezilarli darajada farq qiluvchi ushbu molekulalarning yagona tahlil sharoitida bir-biridan ajralgan holda miqdoriy aniqlanishi analitik uslubiyotni ishlab chiqish nuqtayi nazaridan oson vazifa emas.

P. Sankar va uning hamkasblari ushbu to‘rtta faol moddani yagona xromatografik tahlilda bir vaqtda aniqlash uchun izokratik teskari fazali yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi (RP-HPLC) usulini ishlab chiqdilar. Tadqiqotchilar ushbu usul nafaqat dori moddalarini aniqlashi, balki kislotali, ishqoriy, oksidlovchi, termik va fotolitik stress ostida hosil bo‘ladigan parchalanish (degradatsiya) mahsulotlaridan ham ularni ajrata olishini maqsad qildilar.

Ajratish himoyalovchi ustun bilan birga qo‘llanilgan 250 × 4,6 mm o‘lchamdagi va 5 µm zarracha hajmiga ega ACE C18 ustunida amalga oshirildi. Harakatchan faza komponentlari sifatida asetonitril, metanol va 0,05 foizli triflyorasetat kislotasi ishlatildi. Oqim tezligi 1,0 ml/daqiqa, inyeksiya hajmi 20 µl, ultrabinafsha (UB) aniqlash to‘lqin uzunligi 234 nm va umumiy tahlil davomiyligi 20 daqiqa deb ko‘rsatildi.

Ishlab chiqilgan sharoitlarda digoksin 3,918-daqiqada, aspirin 4,482-daqiqada, furosemid 4,852-daqiqada va amiodaron 14,282-daqiqada elutsiya bo‘ldi. Shu tariqa uchta faol modda xromatogrammaning dastlabki taxminan besh daqiqalik qismida, amiodaron esa ancha kechroq sohada qayd etildi.

Tadqiqotda 25–75 µg/ml oralig‘ida to‘g‘ri chiziqli javob olingani bildirildi. Determinatsiya koeffitsiyentlari (R²) digoksin uchun 1,0000, aspirin va amiodaron uchun 0,9999, furosemid uchun esa 0,9993 deb berildi. Ushbu qiymatlar o‘rganilgan konsentratsiya oralig‘ida cho‘qqi maydoni bilan analit konsentratsiyasi o‘rtasida kuchli to‘g‘ri chiziqli bog‘liqlik mavjudligini ko‘rsatadi.

Aniqlik (accuracy) sinovlarida 80, 100 va 120 foizlik qo‘shish darajalari qo‘llanildi. Jadvalda keltirilgan o‘rtacha qaytarib olish unumi (recovery) aspirin uchun 100,59–100,99%, digoksin uchun 100,24–101,27%, amiodaron uchun 100,57–101,15% va furosemid uchun 100,22–101,34% oralig‘ida bo‘ldi. Tegishli nisbiy standart og‘ish (%RSD) qiymatlarining barchasi 2 foizdan past darajada qoldi.

Kun ichidagi va kunlararo takrorlanuvchanlik (precision) sinovlarida ham %RSD qiymatlari 2 foizdan past deb topildi. Uslubning ustun harorati va aniqlash to‘lqin uzunligidagi kichik o‘zgarishlarga nisbatan chidamliligi baholangan mustahkamlik (robustness) tajribalarida RSD qiymatlari 0,10–0,91%, tahlil natijalari esa taxminan 98,00–101,75% oralig‘ida saqlandi.

Majburiy degradatsiya sinovlarining eng yaqqol natijasi ishqoriy sharoitda kuzatildi. 0,1 M NaOH ta’siridan so‘ng saqlanib qolgan miqdorlar aspirin uchun 85,74%, digoksin uchun 80,36%, amiodaron uchun 95,82% va furosemid uchun 90,53% bo‘ldi. Ushbu natijalar ichida ishqoriy stress ostida eng katta yo‘qotish digoksinda, undan keyin aspirinda qayd etildi.

Kislota, oksidlanish, harorat, xona sharoiti va UB nurlari ostidagi yo‘qotishlar ishqoriy sharoitga qaraganda ancha kam bo‘ldi. Standart va namuna eritmalarining 24 soatlik tahlilida dastlabki ko‘rsatkichga nisbatan o‘zgarish aspirin uchun 1,10%, digoksin uchun 0,84%, amiodaron uchun 0,37% va furosemid uchun 0,80% deb bildirildi.

Tadqiqot ushbu usul to‘rtta faol moddani yagona tahlilda ajrata olishini va asosiy validatsiya parametrlarida past o‘zgaruvchanlik ko‘rsatishini ta’kidlaydi. Shunga qaramay, harakatchan faza komponentlarining qanday hajmiy nisbatlarda aralashtirilgani matnda ochiq ko‘rsatilmagan. Ustun harorati metodologiya qismida 40°C, sharoitlar jadvalida esa “xona harorati” sifatida berilgan. Kalibrlash darajalari va takroriylik sonlari bo‘yicha ham matnning turli bo‘limlari orasida nomuvofiqliklar mavjud.

Shuningdek, degradatsiya mahsulotlarining alohida cho‘qqilar sifatida ajralgani ta’kidlangan bo‘lsa-da, ajralish koeffitsiyentlari (resolution), majburiy degradatsiya xromatogrammalari, cho‘qqi sofligi (peak purity) ko‘rsatkichlari va hosil bo‘lgan moddalarning kimyoviy tuzilishi taqdim etilmagan. Shu sababli usul istiqbolli analitik yondashuvni ko‘rsatsa-da, laboratoriyalararo to‘g‘ridan-to‘g‘ri qo‘llanilishidan oldin yetishmayotgan tafsilotlar oydinlashtirilishi va mustaqil validatsiya o‘tkazilishi lozim.

Tadqiqot hal qilmoqchi bo‘lgan analitik muammo

Farmatsevtik sifat nazoratida faol moddaning shunchaki mavjudligini ko‘rsatish yetarli emas. Faol moddaning to‘g‘ri miqdorda bo‘lishi, boshqa komponentlar bilan aralashmasdan o‘lchanishi va vaqt o‘tishi bilan hosil bo‘lishi mumkin bo‘lgan parchalanish mahsulotlaridan ajratilishi talab etiladi.

Ayni bir dori shaklida yoki tahlil dasturida bir nechta faol modda mavjud bo‘lganda bu talab yanada murakkablashadi. Har bir molekula:

• Turlicha qutblilikka (polyarlik),
• Turlicha molekulyar hajmga,
• Turlicha kislota-asos xususiyatiga,
• Turlicha eruvchanlikka,
• Ustun yuzasi bilan turlicha o‘zaro ta’sir kuchiga ega bo‘lishi mumkin.

Shu sababli bitta molekulani yaxshi ajratadigan harakatchan faza sharoiti boshqa bir molekulaning juda erta chiqib ketishiga, cho‘qqilarning ustma-ust tushishiga yoki ustunda haddan tashqari uzoq ushlanib qolishiga olib kelishi mumkin.

Tadqiqotning asosiy vazifasi aspirin, digoksin, amiodaron va furosemidni bitta izokratik RP-HPLC tahlilida aniqlash imkonini beruvchi umumiy sharoitni topishdan iboratdir.

To‘rtta faol modda nima uchun bitta usulda jamlandi?

Tadqiqotning kirish qismida ushbu dorilar yurak-qon tomir kasalliklarida turli maqsadlarda qo‘llanilishi ta’kidlangan:

• Aspirin: Siklooksigenazani qaytmas tarzda bloklovchi va antitrombotsitar maqsadda ishlatiluvchi asetilsalitsil kislotasi.
• Digoksin: Na⁺/K⁺-ATFazani ingibitsiya qilib, miokard qisqarish kuchiga ta’sir etuvchi yurak glikozidi.
• Amiodaron: Keng ta’sir doirasiga ega III sinf antiaritmik dori vositasi.
• Furosemid: Yurak yetishmovchiligi va gipertoniya bilan bog‘liq suyuqlik to‘planishida ishlatiluvchi kuchli halqali diuretik.

1-rasmda to‘rtta molekulaning kimyoviy tuzilishi birgalikda ko‘rsatilgan. Aspirin nisbatan kichik aromatik tuzilishga ega bo‘lsa, digoksin yirik steroid yadro va qand qismlarini saqlaydi. Amiodaron yod saqlovchi keng aromatik strukturasi bilan, furosemid esa xlor, sulfanilamid va karbon kislotasi guruhlari bilan ajralib turadi.

Tadqiqot ushbu molekulyar farqlarni miqdoriy struktura-xromatografiya modeli bilan tahlil qilmagan. Shunday bo‘lsa-da, tuzilmalarning xilma-xilligi to‘rtta birikmani umumiy ustun va harakatchan faza sharoitida ajratish nima uchun uslubiy optimizatsiyani talab qilishini vizual ravishda ko‘rsatadi.

Adabiyotdagi ilmiy bo‘shliq qanday ta’riflangan?

Tadqiqotchilar aspirinning klopidogrel, rosuvastatin, prasugrel yoki boshqa moddalar bilan; furosemidning boshqa diuretiklar bilan birgalikdagi tahlili uchun turli HPLC usullari mavjudligini qayd etganlar. Digoksin va amiodaron uchun ham plazma, farmatsevtik preparatlar va erish sinovlarida HPLC yoki LC-MS/MS usullari e’lon qilingan.

Bunga qaramay, barcha to‘rtta dorini bitta RP-HPLC tahlilida bir vaqtda aniqlashga qaratilgan validatsiyalangan usul mavjud emasligi ilgari surilgan. Tadqiqotning yangilik da’vosi ayni shu nuqtaga tayanadi.

Ishlab chiqilgan usul yordamida laboratoriyada:

• To‘rtta alohida tahlil o‘rniga bitta tahlil o‘tkazish,
• Tahlil vaqtini qisqartirish,
• Erituvchilar sarfini kamaytirish,
• Ko‘p komponentli namunalarning sifat nazoratini osonlashtirish maqsad qilingan.

Biroq tadqiqotda laboratoriya xarajatlarining real qiyosi yoki usul boshiga erituvchi sarfi hisobi berilmagan. Xarajat va unumdorlik afzalliklari usulning to‘rtta komponentni bir tahlilda o‘lchay olishidan kelib chiqadigan amaliy xulosalardir.

RP-HPLC nimani anglatadi?

Yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasida namuna suyuq harakatchan faza yordamida mayda zarrachalar bilan to‘ldirilgan ustundan o‘tkaziladi. Namunadagi molekulalar ustunning qo‘zg‘almas fazasi bilan harakatchan faza o‘rtasida turlicha taqsimlangani sababli ustundan turli vaqtlarda chiqadi.

Teskari fazali HPLC da ustun yuzasi nisbatan gidrofob, harakatchan faza esa suv va organik erituvchilar aralashmasidan iborat bo‘ladi. Molekula ustun yuzasi bilan qanchalik kuchli ta’sirlashsa, ustunda shunchalik uzoq ushlanib qolishi mumkin. Shunga qaramay, ushlanish vaqti faqat gidrofoblikka bog‘liq emas; ionlanish holati, harakatchan faza tarkibi, harorat va molekulyar tuzilish ham natijaga ta’sir ko‘rsatadi.

Tadqiqotda C18 birikkan fazasiga ega ACE ustuni ishlatilgan. C18 atamasi silikagel yuzasiga uzun uglerod zanjirlari biriktirilgan teskari fazali ustun tuzilishini anglatadi.

Izokratik elutsiya nima degani?

Izokratik usulda harakatchan faza tarkibi butun tahlil davomida o‘zgarmas saqlanadi. Gradient usulida esa organik erituvchi yoki boshqa faza komponentlarining nisbati vaqt o‘tishi bilan o‘zgartirib boriladi.

Izokratik usullarni qo‘llash va asboblar o‘rtasida ko‘chirish nisbatan osonroq kechadi. Biroq juda turlicha tutilish xususiyatlariga ega moddalar ayni bir tahlilda bo‘lganda, erta chiqadigan moddalarning o‘zaro ajralishi bilan kech chiqadigan moddaning maqbul vaqtda elutsiya bo‘lishi o‘rtasida muvozanat o‘rnatish lozim.

Ushbu tadqiqotda digoksin, aspirin va furosemid dastlabki besh daqiqa ichida bir-biriga yaqin vaqtlarda chiqqan bo‘lsa, amiodaron 14,282-daqiqada elutsiya bo‘ldi. Izokratik sharoit ham erta chiquvchi uchlik guruhni ajratishni, ham amiodaronni 20 daqiqalik tahlil ichida chiqarib olishni ta’minlashi maqsad qilingan.

Qo‘llanilgan asbob va ustun tizimi

Tahlillar Shimadzu LC-40 seriyali HPLC tizimida o‘tkazildi. Tizim quyidagi qismlardan tashkil topgan:

• To‘rtlik nasos,
• DGU-40 onlayn degazatori,
• SPD-M40 fotodiodli matritsali detektori (PDA),
• SIL-40C avtosampler,
• LabSolutions 7.1 ma’lumotlarni yig‘ish va qayta ishlash dasturi.

Ajratish uchun himoyalovchi ustun bilan birga ACE C18 ustuni qo‘llanildi:

• Ustun uzunligi: 250 mm,
• Ichki diametri: 4,6 mm,
• Zarracha hajmi: 5 µm.

Harakatchan faza va erituvchilar

Tadqiqotda harakatchan faza komponentlari quyidagicha keltirilgan:

• 0,05 foizli triflyorasetat kislotasi (TFA),
• Asetonitril,
• Metanol.

Elutsiya izokratik tarzda bajarildi. Biroq PDF da ushbu uch komponentning yakuniy harakatchan faza ichidagi hajmiy nisbatlari berilmagan. “100% asetonitril”, “100% metanol” va “0,05% TFA” iboralari alohida erituvchi kanallarini tavsiflaydi; analitik tahlil paytida nasos orqali haydalgan aralashmaning aniq foizini ko‘rsatmaydi.

Ikkita alohida erituvchi (diluent) bildirilgan:

• Erituvchi A: Metanol:asetonitril, 50:50 hajm/hajm.
• Erituvchi B: Suv:asetonitril, 50:50 hajm/hajm.

Harakatchan faza ishlatishdan oldin ultratovush (sonikatsiya) bilan gazsizlantirilgani va 0,45 µm membranali filtrdan o‘tkazilgani qayd etilgan.

Xromatografik sharoitlar

Metodologiya bo‘limida bildirilgan asosiy sharoitlar quyidagilardir:

• Oqim tezligi: 1,0 ml/daqiqa,
• Inyeksiya hajmi: 20 µl,
• Aniqlash to‘lqin uzunligi: 234 nm,
• Umumiy tahlil vaqti: 20 daqiqa,
• Ustun harorati: metodologiya matnida 40°C.

Sharoitlar jadvalida ustun harorati “ambient”, ya’ni xona harorati deb yozilgan. Mustahkamlik tajribalarida 38 va 42°C qo‘llanilishi esa nominal harorat 40°C ekanligiga ishora qiladi. Bu tafovut usulni boshqa laboratoriyada aynan takrorlash uchun aniqlashtirilishi lozim.

Standart eritmalar qanday tayyorlandi?

Tadqiqotda aspirin, digoksin, amiodaron va furosemiddan alohida-alohida 25 mg tortib olinib, erituvchi A da eritilgani aytilgan. Matnda 50 ml erituvchi ishlatilgani va eritma konsentratsiyasi 0,5 mg/ml ekani yozilgan bo‘lsa-da, ayni jumlaning o‘zida 100 ml li o‘lchov kolbalari tilga olingan.

Agar 25 mg modda 50 ml ga yetkazilgan bo‘lsa:

\[ C=\frac{25\ \mathrm{mg}}{50\ \mathrm{mL}}=0{,}5\ \mathrm{mg/mL} \]

Bunda:

• C — asosiy (stok) eritmaning konsentratsiyasini,
• 25 mg — tortib olingan modda massasini,
• 50 mL — taxmin qilingan yakuniy hajmni bildiradi.

Matndagi 0,5 mg/ml qiymati 50 ml li hajmga to‘g‘ri keladi. Agar hajm 100 ml bo‘lganida konsentratsiya 0,25 mg/ml bo‘lar edi. Shu sababli o‘lchov kolbasi hajmi bilan ko‘rsatilgan konsentratsiya o‘rtasida noaniqlik mavjud.

Stok eritmadan 2,5 ml olinib, 50 ml gacha suyultirilgani bildirilgan. Agar boshlang‘ich stok 0,5 mg/ml deb olinsa, ishchi eritma konsentratsiyasi quyidagicha bo‘ladi:

\[ C_2=\frac{C_1V_1}{V_2} =\frac{0{,}5\ \mathrm{mg/mL}\times2{,}5\ \mathrm{mL}} {50\ \mathrm{mL}} =0{,}025\ \mathrm{mg/mL} \]

\[ 0{,}025\ \mathrm{mg/mL}=25\ \mu\mathrm{g/mL} \]

Bu qiymat tizim yaroqliligi tajribalarida keltirilgan 0,025 mg/ml standart konsentratsiyasi bilan to‘liq mos keladi.

Uslubiyotni optimallashtirishda qaysi sharoitlar sinab ko‘rildi?

2-rasmda uchta xromatografik sinov taqqoslangan.

Birinchi sinov: Fosfat buferi va asetonitril

20 mM kaliy digidroortofosfat buferi (pH 3,0) va asetonitril ishlatilgan dastlabki sharoitda:

• Nol chizig‘i (baseline) buzilgani,
• Nazariy tarelkalar soni past bo‘lgani,
• Cho‘qqi dumi (tailing) qoniqarsiz ekani qayd etildi.

Ikkinchi sinov: 0,1 foizli TFA

Asetonitril, metanol va 0,1 foizli triflyorasetat kislotasi ishlatilgan sharoitda moddalar juda erta elutsiya bo‘lgani va cho‘qqi shakllari talabga javob bermagani bildirildi.

Tanlangan sharoit: 0,05 foizli TFA

Asetonitril, metanol va 0,05 foizli triflyorasetat kislotasi ishlatilgan uchinchi sharoitda:

• Simmetrik cho‘qqilar,
• Maqbul ushlanish vaqtlari,
• Yuqori nazariy tarelkalar soni,
• Qabul qilinadigan dum ko‘rsatkichlari,
• Nol chizig‘ida to‘liq ajralgan cho‘qqilar olingani ma’lum qilindi.

2c-rasmda digoksin, aspirin va furosemid cho‘qqilari xromatogrammaning taxminan 4–5 daqiqalik tor qismida, amiodaron esa taxminan 14-daqiqada ko‘rinadi.

Ushlanish vaqtlari nimani ko‘rsatadi?

Aspirin bilan furosemid orasidagi ushlanish vaqti farqi atigi:

\[ 4{,}852-4{,}482=0{,}370\ \mathrm{daqiqa} \]

Digoksin bilan aspirin orasidagi farq esa:

\[ 4{,}482-3{,}918=0{,}564\ \mathrm{daqiqa} \]

bo‘ldi. Tadqiqotchilar cho‘qqilar nol chizig‘ida ajralganini bildirganlar. Shunga qaramay, tadqiqotda qo‘shni cho‘qqilar orasidagi raqamli ajralish koeffitsiyentlari (Rs) keltirilmagan. Ayniqsa, aspirin va furosemidning yaqinligi sababli ushbu qiymatlarning berilishi usulning ajratish quvvatini aniqroq ko‘rsatgan bo‘lar edi.

Tizim yaroqliligi nima uchun baholanadi?

Tizim yaroqliligi (system suitability) analitik namunalar tahlil qilinishidan oldin asbob, ustun va uslubiyot kutilgan darajada ishlayotganini tekshiradi. Tadqiqotda quyidagi parametrlar baholandi:

• Ushlanish vaqti,
• Cho‘qqi maydoni,
• Dum omili (tailing factor),
• Nazariy tarelkalar soni.

Matnda ushlanish vaqti va cho‘qqi maydoni uchun %RSD 2 foizdan past, dum omili 2 dan kichik va nazariy tarelkalar soni 500 dan katta ekani bildirilgan.

2-jadvalda esa dum omili va nazariy tarelkalar sonining mutlaq qiymatlari o‘rniga ushbu ko‘rsatkichlarning takrorlanuvchanlik %RSD qiymatlari berilgan. Shu sababli matndagi yaroqlilik da’vosi bilan mutlaq natijalarni jadvaldan to‘liq tekshirish imkoni yo‘q.

O‘ziga xoslik qanday baholandi?

O‘ziga xoslik (specificity) tajribasida:

• Bo‘sh erituvchi (blank),
• Plasebo,
• Standart,
• Namuna xromatogrammalari taqqoslandi.

3-rasmda bo‘sh erituvchi va plasebo xromatogrammalarida to‘rtta faol moddaning ushlanish vaqtlarida hech qanday xalaqit beruvchi cho‘qqilar yo‘qligi; standart va namuna xromatogrammalarida esa maqsadli cho‘qqilar aniq shakllangani ko‘rinadi.

Fotodiodli matritsali detektor yordamida cho‘qqi sofligi tekshirilgani aytilgan. Biroq raqamli cho‘qqi sofligi indeksi, soflik chegarasi yoki spektral taqqoslash natijalari berilmagan.

To‘g‘ri chiziqlilik qanday baholandi?

To‘g‘ri chiziqlilik (linearity) konsentratsiya oshgan sari asbob signali mutanosib ravishda ortib borishini ko‘rsatadi. Tadqiqotda kalibrlash egri chiziqlari konsentratsiyaga nisbatan o‘rtacha cho‘qqi maydoni grafigi asosida qurildi.

Klassik to‘g‘ri chiziqli kalibrlash tenglamasi:

\[ y=mx+b \]

ko‘rinishidadir.

• y — xromatografik cho‘qqi maydonini,
• x — analit konsentratsiyasini,
• m — qiyalikni (burchak koeffitsiyenti),
• b — ordinata o‘qini kesib o‘tish nuqtasini ifodalaydi.

Tadqiqotda keltirilgan tenglamalar:

Digoksin:

\[ y=38\,752{,}7697x+15\,272{,}2000 \]

\[ R^2=1{,}0000 \]

Aspirin:

\[ y=14\,066{,}7087x-17\,834{,}8000 \]

\[ R^2=0{,}9999 \]

Furosemid:

\[ y=108\,966{,}1435x+664\,621{,}6000 \]

\[ R^2=0{,}9993 \]

Amiodaron:

\[ y=29\,556{,}5918x-18\,371{,}2000 \]

\[ R^2=0{,}9999 \]

Determinatsiya koeffitsiyentlarining (R²) barchasi 0,999 dan yuqori. Bu qiymatlar tahlil qilingan konsentratsiya oralig‘ida cho‘qqi maydoni konsentratsiyaga qat’iy to‘g‘ri mutanosib ekanligini tasdiqlaydi.

Shu bilan birga, metodologiya qismida 50–150 darajalarini qamragan 10 ta kalibrlash nuqtasi, natijalar bo‘limida esa 25–75 µg/ml oralig‘idagi oltita suyultirish haqida so‘z boradi. Kalibrlash darajalari soni va ularning aniq konsentratsiyalari matn davomida bir xil berilmagan.

To‘g‘rilik va qaytarib olish unumi nimani o‘lchaydi?

To‘g‘rilik (accuracy) usul orqali topilgan miqdorning ma’lum yoki nazariy haqiqiy qiymatga qanchalik yaqinligini ko‘rsatadi. Tadqiqotda 80, 100 va 120 foizlik qo‘shish darajalari ishlatildi va har bir daraja uch martadan tahlil qilindi.

Qaytarib olish unumining matematik mohiyati quyidagicha:

\[ \text{Qaytarib olish darajasi (\%)}= \frac{\text{o‘lchangan miqdor}} {\text{qo‘shilgan nazariy miqdor}} \times100 \]

100 foizga yaqin natija usul qo‘shilgan moddani to‘liq aniqlay olishini bildiradi.

2-jadvalda keltirilgan natijalar:

Natijalar matnida keltirilgan qaytarib olish oraliqlari ushbu jadvaldagi qiymatlardan kengroqdir. Masalan, aspirin uchun matnda 99,81–101,84% oralig‘i yozilgan bo‘lsa, jadvalda 100,59–100,99% ko‘rinadi. Xom o‘lchov ma’lumotlari berilmagani sababli bu farq boshqa takroriyliklarga tegishlimi yoki hisobotdagi xatolikmi, aniqlab bo‘lmaydi.

Takrorlanuvchanlik va %RSD

Takrorlanuvchanlik (precision) ayni bir xil sharoitda o‘tkazilgan takroriy o‘lchovlarning bir-biriga qanchalik yaqinligini baholaydi. Tadqiqotda kun ichidagi takrorlanuvchanlik va kunlararo oraliq aniqlik o‘rganildi.

Tadqiqotda aniq ko‘rsatilgan %RSD formulasi:

\[ \%RSD= \frac{s}{\bar{x}} \times100 \]

Bunda:

• s — o‘lchovlarning standart og‘ishini,
• \bar{x} — o‘lchovlarning o‘rtacha arifmetik qiymatini,
• RSD — nisbiy standart og‘ishni bildiradi.

RSD qanchalik kichik bo‘lsa, o‘lchovlarning o‘rtacha qiymat atrofida tarqalishi shunchalik tor bo‘ladi.

Natijalar matnida furosemidning kun ichidagi RSD qiymati 0,94% deb yozilgan bo‘lsa, 2-jadvalda 0,79% ko‘rsatilgan. Har ikki qiymat ham qabul qilingan 2 foizlik chegaradan past, biroq hisobot bir xil emas.

Mustahkamlik tajribasi nimani ko‘rsatadi?

Mustahkamlik (robustness) uslubiyot parametrlariga qasddan kiritilgan kichik o‘zgarishlarning natijaga qanchalik ta’sir qilishini baholaydi.

Tadqiqotda:

• Ustun harorati 38 va 42°C ga o‘zgartirildi,
• Aniqlash to‘lqin uzunligi 233 va 237 nm sifatida qo‘llanildi.

Nominal harorat 40°C deb olinsa, 38 va 42°C o‘zgarishlari ±2°C ga mos keladi. Nominal to‘lqin uzunligi 234 nm bo‘lgani holda 233 va 237 nm qiymatlari teng ±2 nm o‘zgarishni hosil qilmaydi. Matndagi “±2 nm” tavsifi bilan jadvaldagi qiymatlar nomuvofiqdir.

Barcha mustahkamlik sharoitlarida:

• RSD qiymatlari 0,10–0,91%,
• Tahlil natijalari 98,00–101,75% oralig‘ida qoldi.

Eng past natija digoksinning 233 nm sharoitida 98,00% ga tushganida, eng yuqori natija esa aspirinning 237 nm sharoitida 101,75% ga yetganida kuzatildi.

Majburiy degradatsiya tahlili nima uchun o‘tkazildi?

Barqarorlikni ko‘rsata oluvchi (stability-indicating) analitik usul asosiy faol modda cho‘qqisini saqlash davomida hosil bo‘ladigan parchalanish mahsulotlaridan ajrata olishi shart. Shu sababli dori moddalari og‘ir sharoitlarga duchor qilinadi.

Qo‘llanilgan stress omillari:

• Kislotali stress: 0,1 N HCl,
• Ishqoriy stress: 0,1 M NaOH,
• Oksidlovchi stress: 0,1 foizli H₂O₂,
• Termik stress: 105°C da 2 soat,
• Xona sharoiti: Xona haroratida 2 kun,
• Fotolitik stress: 254 nm da 7 kun,
• Fotolitik stress: 366 nm da 7 kun.

Degradatsiya jadvalini qanday tushunish kerak?

4-jadvaldagi qiymatlar parchalangan qismni emas, stressdan so‘ng o‘lchangan qolgan dori miqdori foizini ko‘rsatadi. Taxminiy yo‘qotishni quyidagicha hisoblash mumkin:

\[ \text{Taxminiy yo‘qotish (\%)}= 100-\text{qolgan miqdor (\%)} \]

Ishqoriy stress nima sababdan ajralib turadi?

Ishqoriy sharoitda hisoblangan taxminiy yo‘qotishlar:

• Digoksin: 19,64%,
• Aspirin: 14,26%,
• Furosemid: 9,47%,
• Amiodaron: 4,18% ni tashkil etdi.

Shu tariqa to‘rtta dori uchun ham eng kuchli yo‘qotish ishqoriy muhitda sodir bo‘ldi. Digoksin va aspirin ayniqsa sezilarli darajada parchalandi.

Tadqiqot ushbu yo‘qotishlar natijasida hosil bo‘lgan degradatsiya mahsulotlarining kimyoviy tuzilishini aniqlamagan. Natijalar faqat qaysi dori qaysi sharoitda ko‘proq kamayganini ko‘rsatadi.

Barqarorlikni ko‘rsatuvchi usul da’vosining chegarasi

Tadqiqotchilar asosiy moddalar degradatsiya mahsulotlaridan to‘liq ajralganini ta’kidlaydilar. Biroq PDF da:

• Majburiy degradatsiyaning alohida xromatogrammalari,
• Asosiy cho‘qqi bilan eng yaqin parchalanish cho‘qqisi orasidagi ajralish (Rs) qiymatlari,
• PDA cho‘qqi sofligi natijalari,
• Massalar balansi (mass balance),
• Degradatsiya mahsulotlarining kimyoviy tuzilishi keltirilmagan.

Shu sababli keltirilgan ma’lumotlar dori miqdori stress ostida kamayganini tasdiqlaydi; biroq parchalanish mahsulotlaridan to‘liq ajralish isboti qisqacha bayon darajasida qolgan.

Eritma barqarorligi

Standart va namuna eritmalari 0, 6, 12, 18 va 24 soatlik intervallarda tekshirildi. Jadval sarlavhasida bitta ustun “8-soat” deb ko‘rinsa-da, taqqoslash ustunida “0–18 soat” yozilgani bu nuqta 18-soat ekanligini anglatadi.

Qabul qilinish mezoni ±2 foiz bo‘lib, barcha natijalar ushbu oraliqda qoldi. 24 soatdagi eng katta o‘zgarish aspirinda 1,10% bo‘ldi.

Uslubiyot qaysi maqsad uchun ishlab chiqilgan?

Tadqiqotchilar usul farmatsevtik dori shakllarining sifat nazorati va barqarorligini baholash uchun mo‘ljallanganini bildiradilar.

Ushbu tadqiqot quyidagi maqsadlarga qaratilmagan:

• Bemor qonida digoksin yoki amiodaron miqdorini o‘lchash,
• Terapevtik dori monitoringi (TDM),
• Farmakokinetik tahlillar,
• Bioekvivalentlik tadqiqotlari,
• Dorilarning klinik samaradorligini qiyoslash,
• Bemorga individual doza belgilash.

Plazma, qon zardobi, siydik yoki boshqa biologik namunalar tahlil qilinmagani sababli ushbu usulni biologik namunalarda to‘g‘ridan-to‘g‘ri qo‘llash mumkin degan xulosa chiqarib bo‘lmaydi.

O‘tmish nuqtayi nazaridan ahamiyati

Oldingi xromatografik ishlar asosan ushbu dorilarning bittasini yoki cheklangan juftliklarini o‘rgangan edi. Ushbu tadqiqot to‘rtta turli yurak-qon tomir dori moddasini umumiy C18 ustuni va bitta izokratik tahlilda o‘lchash bo‘yicha metodologik dizaynni taqdim etadi.

Bugungi kun nuqtayi nazaridan ahamiyati

Bitta tahlilda bir nechta faol moddani aniqlash sifat nazorati laboratoriyalarida asboblar vaqti va tahlil bosqichlarini qisqartirishga xizmat qilishi mumkin. 20 daqiqalik bitta tahlilda to‘rtta cho‘qqi olish alohida usullar o‘rniga yagona analitik platforma yaratish uchun qulay boshlang‘ich nuqtadir.

Shu bilan birga, usulni boshqa joyda qo‘llashning asosiy sharti harakatchan faza nisbatlari va namuna tayyorlash tafsilotlarining to‘liq berilishidir. Mavjud preprintda ushbu tafsilotlarning ayrimlari tushirib qoldirilgan yoki nomuvofiq yozilgan.

Kelgusida bajarilishi lozim bo‘lgan ishlar

• Harakatchan fazadagi TFA, asetonitril va metanol nisbatlari aniq ko‘rsatilishi lozim.
• Ustun harorati xona haroratimi yoki 40°C ekani aniqlashtirilishi kerak.
• Kalibrlash darajalari soni va aniq konsentratsiyalari to‘g‘rilanishi zarur.
• Stok eritmaning yakuniy hajmi va haqiqiy konsentratsiyasi aniq yozilishi lozim.
• Tizim yaroqliligi uchun mutlaq tarelka soni va dum omillari berilishi kerak.
• Qo‘shni cho‘qqilarning ajralish koeffitsiyentlari (Rs) hisoblanishi zarur.
• LOD va LOQ qiymatlari aniqlanishi va taqdim etilishi lozim.
• Majburiy degradatsiya xromatogrammalari va raqamli cho‘qqi sofligi natijalari qo‘shilishi kerak.
• Degradatsiyada massalar balansi baholanishi lozim.
• Mustaqil laboratoriya yoki turli partiyadagi ustunlar bilan uslubiy ko‘chirish sinovi o‘tkazilishi kerak.
• Haqiqiy farmatsevtik mahsulotlarda namuna tayyorlash va matritsa ta’siri batafsil tekshirilishi lozim.

Tadqiqotning kuchli tomonlari

• Kimyoviy tuzilishi turlicha to‘rtta faol modda bitta tahlilda jamlangan.
• Turli harakatchan faza va oqim sharoitlari taqqoslanib, optimallashtirish o‘tkazilgan.
• Fotodiodli matritsali detektorga ega zamonaviy HPLC tizimi qo‘llanilgan.
• Bo‘sh erituvchi, plasebo, standart va namuna xromatogrammalari solishtirilgan.
• To‘g‘ri chiziqlilik, to‘g‘rilik, takrorlanuvchanlik va mustahkamlik tajribalari o‘tkazilgan.
• Kislota, ishqor, oksidlanish, harorat, xona sharoiti va ikkita UB to‘lqin uzunligini o‘z ichiga olgan majburiy stress sinovlari bajarilgan.
• 24 soatlik eritma barqarorligi tekshirilgan.
• Kalibrlash determinatsiya koeffitsiyentlarining barchasi 0,999 dan yuqori bo‘lgan.
• Qaytarib olish va takrorlanuvchanlik tajribalarida %RSD qiymatlari 2 foizdan past bo‘lgan.
• Usul 20 daqiqalik qisqa izokratik tahlilni taqdim etadi.

Tadqiqotning cheklovlari

• Tadqiqot ilmiy taqrizdan o‘tmagan preprint hisoblanadi.
• Harakatchan faza komponentlarining yakuniy aralashma nisbatlari berilmagan.
• Ustun harorati matnda 40°C, jadvalda esa xona harorati deb yozilgan.
• Stok eritma uchun 50 ml va 100 ml tushunchalari bitta jumlada aralashib ketgan.
• To‘g‘ri chiziqlilik bo‘limida 10 ta daraja va oltita suyultirish alohida-alohida qayd etilgan.
• Kalibrlash standartlarining to‘liq konsentratsiyalar qatori berilmagan.
• Tizim yaroqliligi uchun matnda beshta, jadvallarda oltita takroriylik ko‘rsatilgan.
• Mutlaq nazariy tarelka soni va dum omili qiymatlari berilmagan.
• Cho‘qqilar orasidagi raqamli ajralish (resolution) qiymatlari keltirilmagan.
• Raqamli cho‘qqi sofligi natijalari taqdim etilmagan.
• Sezgirlik tilga olingan bo‘lsa-da, LOD va LOQ natijalari yo‘q.
• To‘g‘rilik bo‘limidagi matnli oraliqlar bilan 2-jadvaldagi qiymatlar to‘liq mos kelmaydi.
• Furosemidning kun ichidagi takrorlanuvchanlik ko‘rsatkichi matn va jadvalda turlicha berilgan.
• Mustahkamlikda “±2 nm” aytilgani holda 233 va 237 nm ishlatilgan.
• Majburiy degradatsiya mahsulotlarining kimyoviy tuzilishi aniqlanmagan.
• Degradatsiya xromatogrammalari taqdim etilmagan.
• Degradatsiyada massalar balansi baholanmagan.
• Standartlarning tozalik darajasi va sertifikatlangan metrologik zanjiri ko‘rsatilmagan.
• Muayyan tijoriy dori shaklining aniq tarkibi va real mahsulot miqdoriy tahlili berilmagan.
• Biologik namunalar yoki klinik bemorlar o‘rganilmagan.

Tadqiqot nima demoqda?

• To‘rtta faol modda ACE C18 ustunida bitta izokratik tahlilda aniqlandi.
• Digoksin, aspirin va furosemid dastlabki besh daqiqada; amiodaron 14,282-daqiqada elutsiya bo‘ldi.
• Umumiy tahlil vaqti 20 daqiqani tashkil etadi.
• 234 nm to‘lqin uzunligida to‘rtta modda uchun o‘lchash mumkin bo‘lgan cho‘qqilar olindi.
• 25–75 µg/ml deb bildirilgan oraliqda kuchli to‘g‘ri chiziqli javob qayd etildi.
• To‘g‘rilik va takrorlanuvchanlik natijalarida past RSD qiymatlari olindi.
• Harorat va to‘lqin uzunligidagi kichik o‘zgarishlar natijalarga keskin ta’sir qilmadi.
• Ishqoriy stress to‘rtta dori uchun ham boshqa stresslarga qaraganda eng ko‘p yo‘qotishni keltirib chiqardi.
• Eritmalarning 24 soat ichidagi o‘zgarishi 2 foizdan past bo‘lib qoldi.

Tadqiqot nima demayapti?

• Usul bemor qonida dori monitoringi (TDM) o‘tkazishga yaroqli ekanligini ko‘rsatmayapti.
• To‘rtta dorini birga klinik qo‘llash xavfsiz yoki samarali ekanligini baholamayapti.
• Dorilarning klinik dozalari yoki davolash natijalarini solishtirmayapti.
• Degradatsiya mahsulotlarining kimyoviy tuzilishini ochib bermayapti.
• Harakatchan faza nisbatlari berilmagani bois usulni to‘liq qayta takrorlash kafolatini taqdim etmayapti.
• Qo‘shni cho‘qqilarning raqamli ajralish koeffitsiyentlarini ko‘rsatmayapti.
• Usulning o‘ta past konsentratsiyalardagi LOD va LOQ chegaralarini bermayapti.
• Barcha farmatsevtik yordamchi moddalar ishtirokida xalaqitsiz ishlashini isbotlamayapti.
• Usul turli laboratoriyalarda yoki boshqa HPLC tizimlarida tasdiqlanganini ko‘rsatmayapti.

Tadqiqot usullari va natijalari

Texnik uslubiyot xulosasi

Ushlanish va tizim yaroqliligi natijalari

Jadvalda mutlaq nazariy tarelka soni va dum omili o‘rniga ushbu parametrlar takrorlanuvchanligiga tegishli %RSD qiymatlari keltirilgan.

To‘g‘ri chiziqlilik natijalari

To‘g‘rilik va takrorlanuvchanlik xulosasi

Mustahkamlik natijalari xulosasi

Stress sharoitlaridagi taxminiy yo‘qotishlar

Ushbu yo‘qotish qiymatlari tadqiqotda bildirilgan qolgan miqdorlarni 100 dan ayirish orqali hisoblangan. Ular degradatsiya mahsulotlarining aniq miqdori yoki tuzilishini to‘g‘ridan-to‘g‘ri ifodalamaydi.

Rasmlarning ilmiy mazmuni

Texnik natijalarning umumiy xulosasi

• Barcha to‘rtta analit yagona C18 ustunida va 234 nm aniqlash sharoitida o‘lchandi.
• Dastlabki uchta cho‘qqi bir-biriga yaqin bo‘lsa-da, tadqiqotchilar nol chizig‘i ajralishini qayd etdilar.
• Amiodaron boshqa uch moddadan ancha kechroq elutsiya bo‘ldi.
• Kalibrlash egri chiziqlari o‘rganilgan oraliqda yuqori to‘g‘ri chiziqlilik ko‘rsatdi.
• Qaytarib olish unumlari taxminan 100 foiz atrofida bo‘ldi.
• Kun ichidagi va kunlararo takrorlanuvchanlik past o‘zgaruvchanlikni namoyon etdi.
• Harorat va to‘lqin uzunligidagi kichik o‘zgarishlar natijalarga sezilarli ta’sir qilmadi.
• Eng og‘ir majburiy degradatsiya sharoiti ishqoriy muhit bo‘ldi.
• Eritmalar 24 soat davomida 2 foizlik o‘zgarish chegarasida barqaror qoldi.
• Harakatchan faza nisbati, tizim yaroqliligining mutlaq sonlari va stress xromatogrammalari usulni qayta takrorlash uchun yetishmayotgan asosiy ma’lumotlardir.

Manba va uslubiyot eslatmasi

Ushbu sharh P. Sankar, S. Padmavathi, Vijayan, S. Anbazhagan va K. Reeta Vijayarani tomonidan tayyorlangan “Analytical method development and validation of simultaneous estimation of aspirin, digoxin, amiodarone, and furosemide by RP-HPLC” nomli ilmiy ishga asoslanadi.

Tadqiqot aspirin, digoksin, amiodaron va furosemidni ayni bir xromatografik tahlilda aniqlash uchun izokratik RP-HPLC usulini ishlab chiqqan va uning analitik ko‘rsatkichlarini baholagan preprint maqoladir.

Matnda ochiqchasiga “This preprint research paper has not been peer reviewed” ogohlantirishi keltirilgan. Shu sababli tadqiqot ilmiy taqrizdan o‘tmagan. PDF da maqolaning jurnal tomonidan qabul qilingani yoki rasmiy nashr etilgani haqida ma’lumot berilmagan.

Mualliflar usul ICH Q2(R1) yo‘riqnomasi asosida tizim yaroqliligi, o‘ziga xoslik, to‘g‘ri chiziqlilik, to‘g‘rilik, takrorlanuvchanlik va mustahkamlik bo‘yicha baholanganini bildirganlar. Kislotali, ishqoriy, oksidlovchi, termik, xona sharoiti va fotolitik stress tajribalari ham o‘tkazilgan.

Tadqiqot klinik sinov emas. Bemor, qon, plazma, zardob yoki boshqa biologik namunalar tekshirilmagan. Dorilarning davolash samaradorligi, birga qo‘llash xavfsizligi, dozalari yoki qondagi miqdorlari baholanmagan.

Usul farmatsevtik sifat nazorati uchun ishlab chiqilgan. Digoksinning tor terapevtik diapazoni kirish qismida tilga olingan bo‘lsa-da, taklif etilgan usul terapevtik dori monitoringi uchun tasdiqlangan biologik namuna usuli emas.

Tadqiqot harakatchan faza 0,05 foizli triflyorasetat kislotasi, asetonitril va metanoldan iboratligini ta’kidlaydi; biroq komponentlarning yakuniy hajmiy nisbatlarini bermagan. Ustun harorati, stok eritma hajmi, kalibrlash darajalari va takroriylik sonlari bo‘yicha matnda tafovutlar mavjud.

Degradatsiya mahsulotlari asosiy cho‘qqilardan ajralgani aytilgan bo‘lsa-da, degradatsiya xromatogrammalari, cho‘qqi sofligi qiymatlari, ajralish koeffitsiyentlari va parchalanish mahsulotlarining kimyoviy tuzilishi keltirilmagan. Shu sababli barqarorlikni ko‘rsatuvchi usul da’vosi preprint ma’lumotlari doirasida ehtiyotkorlik bilan baholanishi lozim.

Mualliflar tashqi moliyalashtirish va manfaatlar to‘qnashuvi yo‘qligini, tadqiqot ma’lumotlari maqola ichida taqdim etilganini bildirganlar.

Ushbu sharh faqatgina yukini, tadqiqot ma’lumotlari maqola ichida taqdim etilganini bildirganlar.

Ushbu sharh faqatgina yuklangan PDF dagi uslubiyot izohlari, xromatogrammalar, jadvallar, raqamli natijalar va mualliflar talqinlariga tayanib tayyorlangan. PDF da mavjud bo‘lmagan klinik muvaffaqiyat, bemorlar xavfsizligi, laboratoriyalararo tasdiqlangan samaradorlik yoki barcha farmatsevtik mahsulotlarda qo‘llash kafolati da’volari qo‘shilmagan.